Name: Przygotowanie zdysocjowanych kultur neuronów korowych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-12-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 2 s
Description: Poznaj metodę przygotowania zdysocjowanych kultur neuronów korowych myszy do badań elektrofizjologicznych i obrazowania wapnia. Technika ta umożliwia studiowanie rozwoju neuronów in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Przygotowania przed dniem hodowli:
<ul>
<li>Przygotować sterylny roztwór do sekcji (DS).</li>
<li>Przygotować NBM/B27 (pożywkę Neurobasal z dodatkami B27).</li>
<li>Autoklawować ddH2O i wysterylizować szkiełka podstawowe, jeśli jest to konieczne.</li>
<li>Pokryć naczynia do hodowli tkankowej lub szkiełka podstawowe poli-D-lizyną.</li>
</ul>
Powlekanie poli-D-lizyną:
Przygotować dzień przed hodowlą w warunkach sterylnych.
<ul>
<li>Odmrozić alikwot 10X PDL i umieścić na lodzie.</li>
<li>Do 1 ml PDL dodać 9 ml sterylnej wody ultrafiltrowanej i dokładnie wymieszać (1X).</li>
<li>Powierzchnie pokryć 1X PDL przez noc w temperaturze pokojowej w następujący sposób: 
<ul>
<li>szklane szkiełka nakrywkowe (Bellco Glass, Inc. Kat. nr 1943-00012): 75 µl/szkiełko &nbsp;LUB</li>
<li>płytka hodowlana 24-dołkowa: 300 µl/dołek &nbsp;LUB</li>
<li>szalka hodowlana 35 mm: 1 ml/szalka</li>
</ul>
</li>
<li>Przepłukać 5 razy sterylną wodą (do odsysania cieczy użyć sterylnych pipet Pasteura).</li>
<li>Usunąć wodę, aż powierzchnia będzie całkowicie sucha.</li>
</ul>
Procedura hodowli (wykonywana w komorze z laminarnym przepływem powietrza w warunkach sterylnych)
<ol>
<li>Wytnij blok agaru i przyklej go do bloku podporowego mikrotomu Vibraslicer (Campden Instruments Ltd.) za pomocą superglue.</li>
<li>W przypadku użycia płodów myszy z późnego etapu embrionalnego (E17-18), uśmierć samicę, usuń macicę i wyjmij poszczególne płody z worków płodowych. Umieść płody w sterylnej szalce Petriego i kontynuuj zgodnie z opisem poniżej.</li>
<li>Wykonaj dekapitację płodu lub szczenięcia myszy (zgodnie z wytycznymi zatwierdzonymi przez lokalną komisję ds. etyki doświadczeń na zwierzętach).</li>
<li>Usuń skórę oraz czaszkę i umieść mózg na dysku z papieru filtrującego Whatman w 60-milimetrowej szalce Petriego wypełnionej zimnym DS.</li>
<li>Odetnij móżdżek za pomocą sterylnego ostrza do golenia.</li>
<li>Podnieś mózg za pomocą szpatułki i odsącz nadmiar płynu na papierze filtrującym, a następnie przenieś mózg na blok podporowy Vibraslicer i przyklej go (stroną ogonową do góry, a częścią brzuszną skierowaną w stronę agaru).</li>
<li>Wypełnij komorę zimnym DS. Ustaw przełącznik prędkości na 8-9.</li>
<li>Wycinaj sekcje o grubości 200-400 µm, zaczynając od opuszki węchowej. Gdy ostrze Vibraslicera wejdzie w korę, zacznij wycinać koronalne sekcje o grubości 600µm. Mózg myszy E17-18 zazwyczaj daje 3-4 użyteczne plastry, natomiast mózg myszy P0 daje 4-5 użytecznych plastrów.</li>
<li>Przenieś plastry mózgu do 35-milimetrowej szalki Petriego oznaczonej jako DS 2, używając odwrotnego końca niepodłączonej szklanej pipety Pasteura o pojemności 10 ml.</li>
<li>Wypreparuj korę i usuń opony mózgowe za pomocą szklanych igieł wykonanych z rurek kapilarnych.</li>
<li>Pokrój fragmenty kory na małe kawałki o długości 0,5-1 mm.</li>
<li>Przefiltruj ES przez filtr 0,2 µm przymocowany do strzykawki 5 cc do 35-milimetrowej szalki Petriego.</li>
<li>Przenieś fragmenty tkanki korowej do szalki Petriego zawierającej przefiltrowany ES.</li>
<li>Inkubuj w temperaturze 37°C przez 30 min.</li>
</ol>
W międzyczasie:
<ol>
<li>Wyczyścić dygestorium, Vibraslicer oraz narzędzia do sekcji.</li>
<li>Dodać 5 ml ciepłego pożywki NBM/B27 do szalki Petriego o średnicy 60 mm.</li>
</ol>
Po 30 min. inkubacji:
<ol>
<li>Przenieś tkankę do 10 ml DS. Pozostaw do osiadania przez 1 min.</li>
<li>Przenieś tkankę do pierwszej probówki Hi, wymieszaj ruchem wirowym i pozostaw do osiadania przez 2-3 min.</li>
<li>Przenieś do drugiej probówki Hi. Powtórz czynności opisane powyżej.</li>
<li>Przenieś do pierwszej probówki Li. Powtórz czynności opisane powyżej.</li>
<li>Przenieś do drugiej probówki Li. Powtórz czynności opisane powyżej.</li>
<li>Przenieś do trzeciej probówki Li. Powtórz czynności opisane powyżej.</li>
<li>Przenieś tkankę do szalki 60 mm z medium.</li>
</ol>
Pod mikroskopem stereoskopowym:
<ol>
<li>Oczyścić tkankę z zanieczyszczeń i utrzeć każdy fragment, delikatnie przepuszczając go przez dociąganą pipetę szklaną (stosując coraz mniejsze średnice otworu), aby rozluźnić tkankę.</li>
<li>Przenieść zawiesinę komórkową do stożkowej probówki 15 ml zawierającej pozostałą część NBM+B27 (przygotować łącznie 13 ml dla płytki 24-dołkowej lub 11 ml dla 5 naczyń hodowlanych 35 mm. Wymieszać delikatnie i odczekać, aż większe fragmenty tkanki opadną na dno).</li>
<li>Przenieść zawiesinę komórkową (0,5 ml/dołek dla płytki 24-dołkowej lub 2 ml/naczynie hodowlane 35 mm).</li>
<li>W przypadku użycia szklanych lamellek, dodać 80 µl zawiesiny komórkowej na jedną lamelkę i pozostawić na 1 h w inkubatorze do hodowli tkankowych, aby komórki przylgnęły, przed zalaniem komory dodatkową pożywką NBM/B27.</li>
<li>Hodowle utrzymywać w temperaturze 37°C i 5% CO2.</li>
</ol>
Następnego dnia
Płytka 24-dołkowa: Do każdego dołka dodać 0,5 ml pożywki NBM/B27 kondycjonowanej przez komórki nieneuronalne (cNBM/B27; protokół przygotowania pożywki cNBM/B27 znajduje się poniżej)
Szalki 35 mm: zastąpić 0,5 ml pożywką cNBM/B27.
Utrzymuj kulturę, wymieniając 0.5ml pożywki na świeże cNBM/B27 co 2-3 dni.
Choć pożywka nie sprzyja proliferacji komórek glejowych, w razie potrzeby w 3.–5. dniu hodowli można traktować kultury 5µM FDU (5-fluoro-2’-deoksyurydyna, Sigma F0503), aby dodatkowo zredukować liczbę komórek glejowych.
PRZYGOTOWANIE do sekcji i hodowli
Sterylizować narzędzia sekcyjne w 70% EtOH lub poddać je autoklawowaniu:
<ul>
<li>Nożyczki (średnie i małe) Szpatułki (średnie i małe)</li>
<li>Pincety (średnie i małe) Żyletka</li>
<li>Ostrze do wibrotomu Kąpiel buforowa</li>
<li>Mały metalowy klin do ostrza Podpora do mózgu</li>
</ul>
Pozostałe materiały:
<ul>
<li>Szalki Petriego (60 mm)</li>
<li>Szalki Petriego (35 mm)</li>
<li>Papier filtracyjny</li>
<li>Pipeta szklana 10 ml</li>
<li>Sterylne pipety jednorazowe, 5, 10 i 25 ml</li>
<li>Filtr strzykawkowy, 0.2 µm</li>
<li>Strzykawka 5 cc</li>
<li>Probówki do wirowania, 15 ml</li>
<li>Sterylne szklane pipety Pasteura</li>
<li>Naczynia hodowlane pokryte PDL lub szklane szkiełka nakrywki</li>
</ul>
Oznakuj sześć probówek wirówkowych o pojemności 15 ml i przygotuj je zgodnie z poniższą instrukcją:
Probówka nr 1: Roztwór enzymu:
Dodaj 50 U papainy (Worthington LS 03126) do 5 ml DS zawierającego:
<ul>
<li>100µl L-cysteiny (0,8mg)</li>
<li>7 µl 0,1N NaOH</li>
<li>50 µl APV (5mM)</li>
</ul>
Pozostawić roztwór w temperaturze pokojowej do czasu, aż stanie się przejrzysty. Należy pamiętać, że roztwór enzymu początkowo będzie mętny i musi stać się przejrzysty przed użyciem.
&nbsp;
Probówki nr 2 i 3: Inhibitor enzymu Hi:
3 ml DS + 300 µl BSA/Ti + 30 µl APV (5mM).
Mieszaj delikatnie, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza, a następnie podziel na dwie alikwoty po 1.5ml.
&nbsp;
Probówki nr 4 - 6: Niskie stężenie inhibitora enzymu:
8 ml DS + 80 µl BSA/Ti + 80 µl APV (5mM).
Mieszaj delikatnie, aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza, a następnie podziel na trzy aliquoty po 2,6 ml.
&nbsp;
Umieść probówki ponumerowane od #2 do #6 w lodzie. Probówkę #1 (roztwór enzymu) pozostaw w temperaturze pokojowej.
ROZTWORY I ALIKWOTY
<ul>
<li>Roztwór A (bufor solny) Sigma Formuła waga 500 ml [stęż.]</li>
<li>Chlorek sodu NaCl S-9625 58,45 80,0g 137mM</li>
<li>Chlorek potasu KCl P-4504 74,56 4,0g 5,4mM</li>
<li>Fosforan sodu dwuzasadowy bezwodny Na2HPO4 S-0876 142,0 0,24g 0,17mM</li>
<li>Fosforan potasu jednozasadowy bezwodny KH2PO4 P-5379 136,09 0,3g 0,22mM</li>
</ul>
Odważyć wszystkie składniki i mieszać do całkowitego rozpuszczenia w 400 ml ultrafiltrowanej wody. Doprowadzić objętość końcową do 500 ml. Przenieść do czystej butelki i autoklawować. Przechowywać w temperaturze 4°C i oznaczyć jako „DS Solution A”.
<ul>
<li>Roztwór B (Hepes) Formuła Sigma waga 250 ml [stęż.]</li>
<li>Hepes Hepes H-3375 283.3 20.97g 9.9mM</li>
</ul>
Dodać wodę ultrafiltrowaną do objętości 200 ml. Mieszać do całkowitego rozpuszczenia, a następnie uzupełnić objętość końcową do 250 ml. Przenieść do czystej butelki i wysterylizować w autoklawie. Przechowywać w temperaturze 4°C i oznakować jako „DS Solution B”.
<ul>
<li>Roztwór roboczy 500 ml [stęż.]</li>
<li>Woda ultrafiltrowana 400 ml</li>
<li>Roztwór stokowy A 25 ml</li>
<li>Roztwór stokowy B 14 ml</li>
<li>D (+)-Glucose Sigma G-8270 3.0 g 33.3mM</li>
<li>Sacharoza Sigma S-0389 7.5 g 43.8 mM</li>
</ul>
Dostosować pH do 7.4 za pomocą 1N NaOH. Uzupełnić końcową objętość do 500 ml wodą ultrafiltrowaną. Przelać do czystej szklanej butelki i wysterylizować w autoklawie. Przechowywać w temperaturze 4°C. Oznakować jako „Roztwór do sekcji”.
Przygotowanie poli-D-lizyny:
<ol>
<li>Przygotować 10-krotny roztwór zapasu poli-D-lizyny (PDL; Sigma P-7280) w sterylnym H2O o stężeniu 1mg/ml.</li>
<li>Przygotować alikwoty po 1,0 ml. Roztwór ten można przechowywać w temperaturze -20°C do 3 miesięcy.</li>
</ol>
POŚRZYWKI
<ol>
<li>Dodać 10ml suplementu B-27 (Gibco 17504-044) do butelki zawierającej 500 ml NBM (Neurobasal Medium, Gibco 21103-049).</li>
<li>Przygotować alikwoty po 40 ml i przechowywać w temperaturze 4°C.</li>
</ol>
APV
<ol>
<li>Do fiolki zawierającej 10 mg APV (kwas 2-amino-5-fosfonopentanowy, Sigma A-5282) dodać 10 ml sterylnej H2O i dokładnie wymieszać.</li>
<li>Przygotować aliquoty o objętości 180 µl i przechowywać w temperaturze -20°C.</li>
</ol>
BSA/Ti
<ol>
<li>Rozpuścić 1 g BSA (albuminy wołowej, Sigma A-7030) oraz 1 g inhibitora trypsyny (Sigma T-9253) w 10 ml DS.</li>
<li>Dostosować pH do wartości 7.4 za pomocą 1N NaOH.</li>
<li>Zsterylizować, filtrując przez filtr strzykawkowy 0.2 µm.</li>
<li>Podzielić na aliquoty po 400 µl i przechowywać w temperaturze -20°C.</li>
</ol>
L-CYSTEINA
W probówce Eppendorfa rozpuścić 0,6 mg L-Cysteine (Sigma C-7755) w 200 µl DS.
AGAR (4%)
<ol>
<li>Rozpuścić 4 g Bacto Agar (Difco 0140-01) w 100 ml sterylnej wody. Przechowywać w temperaturze 4°C do momentu użycia do hodowli.</li>
<li>Podgrzać agar w kuchence mikrofalowej do stopienia, a następnie przelać do 35 mm szalki Petriego. Pozostawić do ostygnięcia i spolimeryzowania.</li>
</ol>
PAPAINA (Worthington LS 03126)
KULTURY NIE-NEURONALNE W BUTELKACH HODOWLANYCH NUNC
POKRYWANIE BUTELEK KULTUROWYCH (4 butelki Nunc)
<ol>
<li>Do każdej z 3 probówek zawierających 10X PDL dodać 9 mL sterylnej wody, aby przygotować 1X PDL.</li>
<li>Przenieść 30 ml 1X PDL do pierwszej butelki.</li>
<li>Delikatnie poruszać naczyniem, aż wszystkie powierzchnie wzrostu zostaną pokryte. Pozostawić na 1 min.</li>
<li>Przenieść 1X PDL do drugiej butelki. Pozostawić na 1 min.</li>
<li>Powtórzyć czynność z trzecią i czwartą butelką.</li>
<li>Wypłukać wszystkie cztery butelki 2 razy, używając 150 ml sterylnej H2O.</li>
</ol>
PRZYGOTOWANIE ROZTWORU ENZYMU (ES):
<ol>
<li>W probówce wirówkowej o pojemności 0,6 ml odważyć 0,8 mg L-Cysteine (Sigma C7755), dodać 150ml DS i mieszać w wortexie aż do rozpuszczenia kryształów.</li>
<li>Przenieść 5 ml DS do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, a następnie dodać 150ml L-Cysteine.</li>
<li>Dodać 50 jednostek Papain (Worthington LS 03126).</li>
<li>Dodać 7ml 0,1N NaOH.</li>
</ol>
PRZYGOTOWAĆ MEM (GIBCO # 11090-081)
<ol>
<li>Odbierz 65 ml z butelki 500 ml MEM. Odstaw 10 ml do przygotowania glukozy.</li>
<li>Dodaj 5 ml Pen/Strep (Gibco #15070-063).</li>
<li>Dodaj 10 ml 1M Glucose (Sigma G-8270) (1.8 g/ 10 ml MEM)</li>
<li>Dodaj 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (Gibco # 16140-071) lub surowicy z cieląt (Omega BC-04).</li>
<li>Dokładnie wymieszaj, podziel na alikwoty i przechowuj w temperaturze 4°C.</li>
</ol>
PODŁOŻE NEUROBASAL/SUPLEMENT B-27 (NBM/B27) NBM, 500 ml (Gibco #21103-049); B-27 (50X), 10 ml (Gibco #17504-044)
<ol>
<li>Przenieś całą zawartość ampułki z B-27 do butelki z NBM i wymieszaj.</li>
<li>Rozdziel na alikwoty i przechowuj w temperaturze 4°C.</li>
</ol>
DYSEKCJA TKANKI MÓZGOWEJ
<ol>
<li>Osuszyć narzędzia sekcyjne z 70% EtOH przed przystąpieniem do sekcji.</li>
<li>Przenieść 10 ml DS do każdej z probówek o pojemności 3-15 ml.</li>
<li>Wybrać szczenięta myszy (P0 – P3); do 4 butelek potrzebne będą trzy mózgi.</li>
<li>Dodać zimny DS do szalki Petriego o średnicy 35 mm.</li>
<li>Dokonać dekapitacji szczenięcia myszy i wypreparować mózgi.</li>
<li>Umieścić mózgi w szalce Petriego zawierającej zimny DS.</li>
<li>Posiekać tkankę na kawałki wystarczająco małe, aby mogły przejść przez szklaną pipetę.</li>
</ol>
DYSOCJACJA ENZYMÓW
<ol>
<li>Za pomocą pipety Pasteura usunąć z szalki jak najwięcej DS.</li>
<li>Przefiltrować ES przez filtr 0,2 µm i strzykawkę 5 cc.</li>
<li>Przenieść ES do szalki z tkanką.</li>
<li>Inkubować tkankę w inkubatorze w temperaturze 37°C (bez CO2) przez 30 min.</li>
</ol>
PRANIE TKANKI
<ol>
<li>Przenieś tkankę za pomocą pipety szklanej do pierwszej probówki z DS, dbając o to, aby pobrać jak najmniej ES.</li>
<li>Wiruj przez 30 sec przy 1500 rpm.</li>
<li>Przenieś tkankę i powtórz procedurę jeszcze dwa razy.</li>
</ol>
TRYTURACJA
<ol>
<li>Do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml nalać 38 ml MEM/FBS</li>
<li>Do szalki 35 mm dodać 3 ml MEM/FBS i przenieść do niej tkankę.</li>
<li>Rozdzielić tkankę poprzez delikatne triturowanie jej za pomocą końcówki do pipety eppendorfa o pojemności 1000µl.</li>
<li>Przenieść zawiesinę komórkową do probówki zawierającej 38 ml MEM/FBS i dokładnie wymieszać.</li>
</ol>
WYSIEWANIE
<ol>
<li>Ustaw butelki hodowlane pionowo, aby uzyskać równe ilości zawiesiny komórkowej i pożywki w każdej butelce.</li>
<li>Wlej 90 ml MEM/FBS do każdej butelki hodowlanej.</li>
<li>Dodaj 10 ml zawiesiny komórkowej do każdej butelki.</li>
<li>Oznacz: Non-Neuronal, inicjały i data. Inkubuj w temperaturze 37°C i 5% CO2.</li>
</ol>
KARMIENIE
<ol>
<li>W 3. lub 4. dniu zasil komórki ciepłym MEM/FBS (odlej całą pożywkę i zastąp ją 100 ml MEM/FBS). Hodowle mogą potrzebować od 7 do 10 dni, aby osiągnąć konfluencję.</li>
<li>W 7.–10. dniu wymień pożywkę na NBM/B27.</li>
<li>Następnego dnia zbierz pożywkę. Przefiltruj ją przez filtr 0.22µm.</li>
<li>Przygotuj aliquoty po 40 ml i zasil hodowlę MEM/FBS.</li>
<li>Przez kolejne 2 lub 3 dni wymieniaj pożywkę na NBM/B27.</li>
<li>Następnego dnia zbierz pożywkę&nbsp;i powtórz procedurę.</li>
<li>Zbieraj pożywkę przez około 2 tygodnie.</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

<table><tbody><tr><td>5-fluoro-2&amp;rsquo;-deoksyurydyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Vibraslicer</td><td>Campden Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>D (+)-glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>Suplement B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka Neurobasal (NBM)</td><td>Invitrogen</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 2-amino-5-fosfonopentanowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5282</td><td></td></tr><tr><td>Albumin wołowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9253</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu, roztwór 1N</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>L-cysteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7755</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Difco Laboratories</td><td>0140-01</td><td></td></tr><tr><td>Papaina</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS 03126</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny filtr strzykawkowy 0,2 &amp;mu;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>DDA02025S0</td><td></td></tr><tr><td>Szklane laminki, nr 1, 12 mm</td><td>Bellco Glass</td><td>1943-00012</td><td></td></tr><tr><td>Minimalna pożywka niezbędna (MEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11090-081</td><td>z solami Earle&amp;rsquo;a, bez L-glutaminy, wymagana do hodowli kultur nieneuronalnych</td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td>do kultur nieneuronalnych</td></tr><tr><td>Płodowa surowica wołowa</td><td>Invitrogen</td><td>16140-071</td><td>wymagana do kultur nieneuronalnych</td></tr><tr><td>Butelka do hodowli tkankowej Nunclon &quot;Triple Flask&quot;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-25</td><td>Stosowana do kultur nieneuronalnych. Butelki te są bardzo wygodne przy przygotowywaniu &quot;kondycjonowanej pożywki Neurobasal/B27&quot;, jednak można użyć dowolnych innych butelek lub naczyń do hodowli tkankowej.</td></tr><tr><td>Szklane naczynia &quot;do obrazowania&quot;</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td>Naczynia hodowlane o średnicy 35 mm ze szklanym dnem, idealne do obrazowania wapnia lub sodu przy użyciu odwróconego układu obrazowania. Jednakże są kosztowne!</td></tr></tbody></table>

przygotowanie dysocjowanych kultur neuronów korowych myszy

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

Niniejszy film przeprowadzi Państwa przez proces generowania kultur neuronów korowych z mózgu myszy w późnym stadium embrionalnym oraz wczesnym okresie postnatalnym. Kultury te mogą być wykorzystywane w wielu zastosowaniach, w tym w immunocytochemii, biochemii, elektrofizjologii, obrazowaniu wapnia i sodu oraz w izolacji białek i/lub RNA. Stanowią one również platformę do badania rozwoju neuronalnego zwierząt transgenicznych posiadających letalną mutację genu w późnym stadium embrionalnym lub w okresie postnatalnym. Procedura jest stosunkowo prosta, wymaga pewnego doświadczenia w technikach hodowli tkankowych i nie powinna zająć więcej niż od dwóch do trzech godzin przy odpowiednim przygotowaniu. Staranna separacja kory mózgowej od traktu włókien wzgórzowo-korowych pozwoli ograniczyć liczbę niepożądanych komórek nieneuronalnych. Aby zwiększyć wydajność uzyskiwania komórek neuronalnych, należy delikatnie utrzeć fragmenty tkanki korowej po etapie inkubacji z enzymem. Jest to niezbędne, aby zapobiec niepotrzebnemu uszkodzeniu komórek i przedwczesnej śmierci neuronów. Ponieważ kultury te są utrzymywane bez dodatku komórek zasilających (feeder cells) z gleju, oferują one dodatkową zaletę w postaci wzrostu kultur wzbogaconych w neurony.

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę generowania kultur neuronalnych z kory mózgu myszy w późnym stadium embrionalnym i wczesnym okresie postnatalnym. Kultury te mogą być wykorzystywane do immunocytochemii, biochemii, elektrofizjologii, obrazowania wapnia i sodu, a także stanowią platformę do badania rozwoju neuronalnego zwierząt transgenicznych posiadających postnatalnie letalną mutację genu.

Przygotowanie dysocjowanych kultur neuronów korowych myszy

Niniejszy film przeprowadzi Państwa przez proces generowania kultur neuronów korowych z mózgu myszy w późnym stadium embrionalnym oraz we wczesnym okresie postnatalnym. Kultury te...

Dzień dobry, nazywam się Hilgenberg. Pracuję na Uniwersytecie Kalifornijskim w Irvine w Katedrze Anatomii i Neurobiologii. Dzisiaj opowiem Państwu o tym, jak przygotowujemy kultury korowe z myszy.Są to myszy w okresie postnatalnym, z których preparujemy te neurony. Zazwyczaj wykorzystujemy te hodowle do elektrofizjologii, a także do preparacji białek lub RNA. Tę samą metodę przygotowania hodowli stosujemy do obrazowania wapnia lub sodu.Zaletą tych kultur jest to, że stanowią one adaptację protokołu Bankera, jednak hodujemy je bez udziału komórek zasilających gleju, co czyni tę metodę znacznie wygodniejszą, a kultury są zazwyczaj bogatsze w neurony niż w komórki glejowe. Zatem zacznijmy, a ja pokażę Państwu, jak przygotowujemy te neurony. Dobrze, jesteśmy teraz w punkcie, w którym możemy usunąć mózg i rozpocząć właściwą dyssekcję.Należy jednak najpierw wspomnieć, że szkiełka podstawowe, na których będą wysiewane komórki, muszą zostać powleczone. Zazwyczaj robimy to przez noc w temperaturze pokojowej, stosując poli-L-lizynę w stężeniu 0,1 mg/ml. Następnego dnia usuwamy poli-L-lizynę i płuczemy szkiełka podstawkowe trzy razy z rzędu.W zależności od zastosowania używa się dużych lub małych szalek, bądź szkiełek podstawowych. To jest typowe wyposażenie komory z laminarnym przepływem powietrza; krótko wyjaśniłem, jakie roztwory należy przygotować oraz jakie instrumenty są przydatne do izolacji lub wycinania mózgu, a następnie do jego właściwego sekcjonowania. To, co tutaj mamy, to schłodzony roztwór do dysekcji.Zazwyczaj znajduje się to na lodzie. Dysponujemy wibratomem, którym wykonujemy skrawki mózgu. Używam korytka z roztworem do sekcji, w którym mózg jest montowany, a następnie krojony.Posiadam różne narzędzia niezbędne do wyjęcia mózgu. Mam płytkę do trepanacji. Jest to trepan 4%, którego używam do unieruchomienia mózgu.Potrzebujemy strzykawki, kilku filtrów sterylnych, szalek Rotmana oraz szalek Petriego o różnych rozmiarach. A to jest moje narzędzie do udrażniania rurek mysich. Mam tutaj również dociągane pipety szklane.Są to kapilary szklane, których używam jako narzędzi do mikrodysekcji, a także do pobierania fragmentów mózgu i ich powtarzalnego przenoszenia. Nasz roztwór enzymatyczny zawiera roztwór do dysekcji. Znajduje się w nim L-cysteina w celu aktywacji papainy, a także 0,1 N wodorotlenek sodu w celu zrównoważenia pH.Po dodaniu pepainy roztwór staje się lekko mętny i musi się wyklarować, zanim będziemy mogli go użyć do enzymatycznego trawienia tkanki. Teraz jesteśmy w zasadzie gotowi do rozpoczęcia procedury. Urządzenie fibroSlicer zostało przygotowane.Wstawiłem ostrze do sekcjonowania mózgu, a pod nim umieściłem naczynie z buforem, które podtrzymuje tkankę. Jestem teraz gotowy, aby zamocować blok AGA na płytce wspierającej, która będzie również stabilizować mózg. Ten AGA uległ już utwardzeniu; jest to roztwór 4% AGA, a ja po prostu przetnę obszar w ten sposób.Z boku należy po prostu wyciąć prostokątny otwór na świder. Następnie za pomocą szpachelki delikatnie wyjmuję ten element z bloku świdra. Teraz przykleję ten świder do płytki wsporczej, tak aby płaska strona świdra była skierowana do przodu.Oto podpora, do której przyklejany jest mózg, a następnie stabilizowany za pomocą tego świdra. Dzięki takiemu ułożeniu podczas sekcjonowania mózg nie przesuwa się do tyłu. Teraz możemy przystąpić do wyjęcia mózgu.Zazwyczaj używamy myszy w dniu P0 lub P1. Dobrze, tutaj mamy odciętą głowę myszy, a ja teraz szybko usunę skórę z czaszki. Najpierw przetnę pas mięśniowy znajdujący się tutaj oraz po drugiej stronie.Następnie używam nożyczek. Bardzo uważam, aby wewnętrzna strona nożyczek nie uszkodziła mózgu. Wycinam wokół czaszki po obu stronach.Teraz możemy po prostu pobrać chrząstkę; użyję do tego małego ULA i w ten sposób usuwam mózg. Mózg ten trafia następnie do szalki Petriego, którą wypełniłem roztworem do sekcji i na której dnie znajduje się papier filtracyjny Watman. Teraz chciałbym odciąć podstawę mózgu, aby uzyskać ładną, solidną i płaską powierzchnię do zamocowania mózgu na uchwycie.Na płytkę podpierającą naniosę bardzo małą kroplę kleju szybkoschnącego. Teraz za pomocą szpatułki podniosę mózg, pomagając sobie przy tym pęsetą zakrzywioną. Następnie zamierzam pozbyć się nadmiaru cieczy z roztworu do sekcji i zamocować mózg na wsporniku świdra.Jesteśmy teraz gotowi do przeniesienia mózgu do kąpieli buforowej. Dodaję więc roztwór do sekcji do tego małego naczynia, a następnie zamocuję wspornik utrzymujący mózg. Jest on montowany w taki sposób, aby mózg był skierowany w stronę ostrza.Dobrze, mózg jest teraz zamontowany. Użyję fibro-slicera i staram się zlokalizować początek mózgu, przesuwając go w stronę ostrza. Właśnie odciąłem niewielki fragment opuszki węchowej. Teraz przesuwam ostrze o około 600 micrometers w dół i wykonuję kolejne cięcie, które powinno przejść bezpośrednio przez korę.Kora przesuwa się i osiada na ostrzu. Przesuwam ostrze o kolejne 600 µm w dół i wycinam drugi przekrój. Ważne jest, aby czynność tę wykonywać w sposób ciągły, bez przerw i płynnie.Po wycofaniu ostrza należy zatrzymać przecinarkę do włókien. Teraz użyję pipety szklanej, którą wcześniej trzymałem nieprawidłowo. Użyję jej tylnego końca, aby przenieść ten przekrój kory tutaj, a następnie przełożyć go do czystej szalki Petriego.Przesuwam się przez mózg, zawsze o 600 micrometers, aż do momentu zebrania około pięciu do sześciu skrawków w przypadku myszy P zero lub P one. Kontynuuję to, aż dotrę do samego końca kory. Teraz jesteśmy gotowi do wyizolowania kory z pozostałej części mózgu.Zatem używam szklanych pipet, które zostały wyciągnięte tak, aby były ostre niczym narzędzia do sekcji. Zazwyczaj zaczynam od pierwszej otrzymanej sekcji, która jest najmniejsza, i musimy usunąć opuszkę węchową. Staram się również usunąć opony mózgowe z tego preparatu.Ponownie usuwamy opuszkę węchową z tego fragmentu, odklejając ją od opon mózgowych. Czasami zdarzają się fragmenty, których nie można tak łatwo oddzielić, więc w takim przypadku należy je pominąć i pozostawić, skupiając się na dobrych fragmentach. Zawsze przemieszczam się w stronę jednego z końców i opracowuję kolejne sekcje jedna po drugiej.Ważne jest, aby usunąć opony mózgowe; ponadto, analizując te przekroje, czasami warto je obrócić, aby lepiej dostrzec trakt włókien zawierający większość komórek nieneuronalnych, których nie chcemy w tym preparacie. Dobrze, na tym przekroju wyraźnie widać ten trakt włókien pod warstwą korową. Wykonuję nacięcie dokładnie w miejscu, gdzie kończy się warstwa korowa, wskazując na trakt włókien, w którym znajduje się większość komórek nieneuronalnych, których staramy się uniknąć w tym preparacie.Tnę wzdłuż tej linii, starając się pozostawić pasma włókien. Jest to etap, w którym sieka się tkankę na małe kostki. Dobrze, teraz sterylizuję roztwór enzymu za pomocą filtra 0,2 mikrona przymocowanego do strzykawki.Następnie dodaję to bezpośrednio na moje fragmenty kory w ten sposób. Należy upewnić się, że ilość cieczy jest wystarczająca, aby otoczyła wszystkie fragmenty kory, a następnie umieszcza się je w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 30 minut, co powinno znacznie rozluźnić tkankę. Minęło już 30 minut od momentu umieszczenia tych fragmentów kory w inkubatorze.W międzyczasie podgrzałem pożywkę neurobasal z dodatkiem suplementu B 27, w której komórki te ostatecznie zostaną umieszczone. Przygotowałem również tutaj kilka roztworów. Pierwszym z nich jest roztwór do sekcji.Zatem jest to zwykły roztwór do sekcji. Następnie są one przenoszone do roztworu z wysokim stężeniem inhibitora trypsyny, który zawiera BSA jako czynnik wiążący oraz APV w celu zablokowania komponentu receptora NMDA. Potem przechodzą przez trzy etapy płukania w roztworze z niskim stężeniem inhibitora trypsyny, BSA i APV. Teraz wyjmę te fragmenty z roztworu propanu i przeniosę je do probówki stożkowej zawierającej roztwór do sekcji DS.Kępki te będą opadać pod wpływem grawitacji i może minąć minuta lub dwie, zanim wszystkie osiądą w stożkowej części probówki. Następnie ponownie je pobiorę i przeniosę do roztworu zawierającego wysokie stężenie inhibitora trypsyny. Ponownie należy odczekać, aż kępki te osiądą na dnie probówki.Następuje jeszcze jedno przemycie roztworem o wysokim stężeniu inhibitora trypsyny, a następnie te agregaty są płukane w roztworze o niskim stężeniu inhibitora trypsyny. Po ostatnim przemyciu i zastosowaniu niskiego stężenia inhibitora enzymu, przeniosę komórki do uprzednio ogrzanego podłoża Neurobasal i rozpocznę mechaniczną dysocjację komórek poprzez pipetowanie ich w górę i w dół za pomocą kapilary szklanej o malejącej średnicy otworu. Przystępuję teraz do tryturyzacji komórek i agregatów tkankowych.Zanim jednak to zrobię, usunę wszystkie widoczne tutaj zanieczyszczenia. Są to na przykład białka i DNA, które wyciekają z komórek i tworzą substancję przypominającą kłębek waty, przylegającą do grudek tkanki. Należy usunąć ją w pierwszej kolejności, ponieważ zapycha ona końcówkę pipety, co zmusza do przepychania tkanki przez otwór o zbyt małej średnicy.Następnie połamię niektóre z tych szklanych kapilar, aby uzyskać otwór o odpowiedniej wielkości, umożliwiający wprowadzanie i wyprowadzanie komórek. Ta pipeta jest dobra. Widać, że jej końcówka jest ładnie zaokrąglona i nie posiada żadnych ostrych krawędzi.Włożę to do mojej pipety do palenia. Pomiędzy nimi znajduje się filtr 0,2 mikrona, a teraz będę przesuwać tkanki do wnętrza szklanej kapilary i z powrotem. Pierwszy proces powinien przebiec dość gładko, ponieważ grudki tkanki nie są znacznie większe od otworu pipety.Celem jest jedynie rozluźnienie tkanki. Następnie używam końcówki do pipety o nieco mniejszej średnicy. Zależy mi na tym, aby końcówka pipety była gładka i zaokrąglona.To wygląda dobrze. Ponownie, wszystkie grudki są przenoszone do rurki i z powrotem w jednym czasie. Tkanka jest teraz na tyle miękka i rozluźniona, że po ponownym zawieszeniu tych grudek w medium komórki w zasadzie same się uwolnią.Teraz przeniosę wszystkie zdysocjowane komórki do nowej probówki stożkowej o pojemności 15 ml i pipetuję je jeszcze dwa lub trzy razy, delikatnie zasysając i wydmuchując, aby rozbić komórki, które nadal tworzą większe skupiska. Następnie odczekamy jedną lub dwie minuty, aż większe fragmenty wciąż znajdujące się w zawiesinie opadną na dno. Mogą tam być również odłamki szklanych kapilar, które powinny one również osiąść na dnie.Następnie możemy wykorzystać alikwoty tej zawiesiny do wysiania na całkowicie pokryte szkiełka nakrywkowe lub szalki. Wysiewam 80 µL na to szkiełko nakrywkowe, które zostało wcześniej pokryte polilizyną, co tworzy ładną kroplę. Komórki z czasem opadną i przylgną do szkiełka nakrywkowego.Po około godzinie komórki opadły na dno i bardzo delikatnie dodam więcej pożywki do całej płytki. Można ją lekko zakręcić w ten sposób. Następnie komórki trafiają do inkubatora w temperaturze 37 °C, a jutro dostarczę im pożywkę warunkowaną.Niemniej jednak, są to komórki korowe. Mają nieco mniej niż jeden dzień. Zostały wysiane wczoraj i można zauważyć, że znajduje się tu wiele neuronów, bardzo dużo neuronów płucnych, a także nieco debris komórkowego.Są to komórki, które nie przeżyły. Zostaną one wypłukane podczas kilku kolejnych karmiń. Martwe komórki to te bardzo małe, okrągłe komórki o pofalowanych błonach.Właśnie zaprezentowałem sposób przygotowania tych dysocjowanych kultur korowych. Ważne jest, aby pamiętać, że podczas usuwania kory z plastrów mózgu należy oddzielić ją od włókien kory w obszarze thumb sala, ponieważ zawierają one wiele komórek nieneuronalnych. Ponadto, podczas trypsynizacji komórek należy unikać zbyt długiej inkubacji, gdyż prowadzi to w zasadzie do obumarcia większości wyizolowanych do tego momentu komórek.Therefore, należy obchodzić się z przekrojami tkanek z należytą ostrożnością, aby uzyskać wysokiej jakości kulturę. Powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

preparation-of-dissociated-mouse-cortical-neuron-cultures

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przygotowanie kultur dissociowanych neuronów kory mózgowej myszy

Opisano protokół systemu hodowli agregatów embrionalnego mózgu szczura. Wielopotencjalne komórki progenitorowe w agregatach mogą rozwijać się i różnicować w neurony, astrocyty oraz oligodendrocyty.

Przygotowanie hodowli agregatów mózgu szczura do badań nad rozwojem neuronów i gleju

Niniejszy protokół opisuje etapy niezbędne do wyizolowania, transfekcji metodą elektroporacji oraz hodowli neuronów hipokampa i kory mózgu myszy. Hodowle krótkoterminowe mogą być wykorzystywane do badań nad wzrostem i prowadzeniem aksonów, natomiast hodowle długoterminowe mogą służyć do badań nad synaptogenezą i analizy kolców dendrytycznych.

Nuklefekcja i hodowla pierwotna embrionalnych neuronów hipokampa i kory myszy

Ten artykuł opisuje metody uzyskiwania wzbogaconych populacji mysich komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPC) w hodowli podstawowej, które różnicują się w celu wytworzenia dojrzałych oligodendrocytów (OL). Ponadto w raporcie opisano techniki wytwarzania mysich kokultur mielinizacyjnych poprzez wysiewanie mysich OPC na łożu neurytowym neuronów zwojowych korzenia grzbietowego myszy (DRGN).

Wyprowadzanie wzbogaconych kultur oligodendrocytów i kokultur mielinizujących oligodendrocyty/neurony z postporodowych tkanek myszy

W tym filmie opisujemy metodę uzyskiwania czystej preparacji astrocytów od nowo narodzonych myszy.

Izolacja astrocytów: metoda uzyskiwania czystego przygotowania astrocytów korowych myszy

Ten film ilustruje metodę ustanawiania pośredniej kokultury neuronów i astrocytów przy użyciu podejścia opartego na podziałach. W tej konfiguracji neurony i astrocyty są przestrzennie oddzielone, ale mają wspólne uwarunkowane podłoże. Czynniki neurotroficzne uwalniane przez astrocyty sprzyjają różnicowaniu neuronów i tworzeniu połączeń synaptycznych, co sugeruje interakcje neuron-glej.

Technika pośredniej kohodowli neuronów i astrocytów do badania interakcji neuron-glej

Astrocyty zostały uznane za wszechstronne komórki uczestniczące w podstawowych procesach biologicznych, które są niezbędne do prawidłowego rozwoju i funkcjonowania mózgu oraz naprawy ośrodkowego układu nerwowego. Tutaj przedstawiamy szybką procedurę uzyskiwania czystych hodowli astrocytów myszy w celu zbadania biologii tej głównej klasy komórek ośrodkowego układu nerwowego.

Izolacja i hodowla astrocytów korowych myszy

Opisano protokół generowania systemu kokulturowego składającego się z neuronów pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), pierwotnych neuronów korowych i astrocytów. Ten system kohodowli umożliwia wykrycie powstawania kontaktów i obwodów synaptycznych między nowymi neuronami pochodzącymi z iPSC a istniejącymi wcześniej neuronami korowymi wykazującymi ekspresję rodopsyny kanałowej-2.

Optogenetyczne podejście do oceny tworzenia połączeń neuronalnych w systemie kokulturowym

Ten protokół opisuje pośrednią kokulturę neuron-astrocyt do analizy interakcji neuron-glej.

Test pośredniej kokultury neuron-astrocyty: zestaw in vitro do szczegółowego badania interakcji neuron-glej

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania Ca2+ w neuronach i komórkach glejowych, który umożliwia analizę sygnałów Ca2+ w rozdzielczości subkomórkowej. Proces ten ma zastosowanie do wszystkich typów komórek, które umożliwiają ekspresję genetycznie kodowanych wskaźników Ca2 +.

Analiza lokalnych sygnałów Ca2 + w hodowanych komórkach za pomocą ukierunkowanych na błonę wskaźników Ca2 +

Tutaj opisaliśmy protokół ilościowego badania montażu i struktury początkowych segmentów aksonów (AIS) neuronów hipokampa, które nie mają wstępnie zmontowanego AIS z powodu braku gigantycznej ankyryny-G.

Wykorzystanie pierwotnych hodowanych neuronów hipokampa do badania składania początkowych segmentów aksonów

Poznaj metodę przygotowania zdysocjowanych kultur neuronów korowych myszy do badań elektrofizjologicznych i obrazowania wapnia. Technika ta umożliwia studiowanie rozwoju neuronów in vitro.

Przygotowanie dysocjowanych kultur neuronów korowych myszy

Przeglądaj więcej filmów