Name: Przesuwająca się penetracja śmiertelnych mutantów szkieletowych danio pręgowanego za pomocą testów potomstwa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Poznaj metodę selektywnego hodowli do modyfikacji penetracji śmiertelnych mutantów szkieletowych u Danio rerio za pomocą testów potomstwa. Technika ta umożliwia generowanie linii o wysokiej i niskiej penetracji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Chuckowi Kimmelowi za wskazówki, Johnowi Dowdowi za pomoc w opracowaniu tej strategii hodowlanej, Macie Walker za jej pracę nad doskonaleniem plam szkieletowych, oraz Charline Walker i Bonnie Ullmann za pomocne rady. Prace te były wspierane przez K99/R00 DE024190 do JTN.

Wszystkie eksperymenty opisane w tym protokole zostały przeprowadzone zgodnie i zgodnie z Komitetami ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Oregonu (IACUC).
1. Przygotowanie niewybranego zapasu początkowego
<ol>
	<li>Zidentyfikuj heterozygotycznych nosicieli interesującego nas zmutowanego allelu za pomocą fin clip11 i genotypowania stada zwierząt o pełnym rodzeństwie za pomocą wybranej metody, takiej jak KASP12,13,14. Protokół ten został przeprowadzony na szczepie zebry mef2cab1086.</li>
	<li>Genotypowanie KASP 
	UWAGA: Startery specyficzne dla alleli dla KASP są projektowane przez firmę, która dostarcza odczynniki (patrz Tabela materiałów). Aby uzyskać odpowiednie stężenie barwnika 6-karboksylo-X-rodaminy (ROX) dla konkretnej maszyny do PCR w czasie rzeczywistym, odwiedź stronę internetową firmy.
	<ol>
		<li>Umieść tkankę ogona danio pręgowanego w 50 μl buforu do lizy (10 mM tris (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,3% niejonowy środek powierzchniowo czynny, 0,3% glikol oktylofenylopolietylenowy). Dodać 10 μl 10 mg/ml proteinazy-K do dołka 96-dołkowej płytki PCR i trawić w termocyklerze w temperaturze 55 °C przez 2 - 5 godzin, a następnie 20 minut etap inaktywacji w temperaturze 94 °C. Po strawieniu produkt lizy przechowywać w lodówce. 
		UWAGA: Produkty Lysis można z powodzeniem stosować przez kilka miesięcy po przygotowaniu. Gdy tkankę poddano lizie przy użyciu 50 mM NaOH, reakcje KASP zakończyły się niepowodzeniem. Wyniki te sugerują, że metoda przygotowania genomowego DNA NaOH nie jest kompatybilna z KASP.</li>
		<li>Określić ilościowo genomowe DNA za pomocą spektrofotometru. Rozcieńczyć matrycę genomowego DNA za pomocą wody klasy biologii molekularnej, tak aby każda reakcja zawierała około 20-30 ng. 
		UWAGA: Określ ilościowo 4 lub 5 próbek, połącz je, a następnie przygotuj rozcieńczenia dla wszystkich próbek na podstawie średniej. W przypadku stosowania tego protokołu dla tkanek dorosłego ogona często wystarczające jest rozcieńczenie 1:100. Dokładne określenie ilościowe stężenia DNA nie jest wymagane.</li>
		<li>Dodać 0,14 μl mieszanki startera KASP i 5 μl mieszanki głównej KASP na próbkę na lodzie do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i dobrze wymieszać przed krótkim odwirowaniem w celu zebrania zawartości na dnie probówki. 
		UWAGA: Mieszanka główna KASP jest wrażliwa na ciepło i światło, trzymaj bulion na lodzie i unikaj bezpośredniego światła.</li>
		<li>Odpipetować 5 μl roztworu startera/mastera do dołków 96-dołkowej płytki optycznej do PCR, odpowiedniej dla używanej maszyny do PCR w czasie rzeczywistym.</li>
		<li>Odmierzyć pipetą 5 μl rozcieńczonych (około 5 - 7 ng/μl) próbek matrycy DNA do każdego dołka i odessać pipetą do wymieszania.</li>
		<li>Dodaj 5 μl wody wolnej od nukleaz do 3 studzienek, aby służyły jako kontrole bez matrycy (NTC) i dodaj 5 μl rozcieńczonej potwierdzonej homozygotycznej matrycy DNA typu dzikiego, heterozygotycznego i homozygotycznego do kontroli pozytywnych.</li>
		<li>Umieść optycznie przezroczystą folię uszczelniającą na płycie, upewniając się, że folia jest całkowicie uszczelniona w każdym dołku.</li>
		<li>Krótko odwirować płytkę o masie 600 x g, aby zebrać zawartość na dnie i usunąć pęcherzyki z mieszanki. 
		UWAGA: Trzymaj talerz na lodzie i chroń przed światłem, aż będzie gotowy do kontynuowania.</li>
		<li>Użyj programu cyklicznego pokazanego w Tabeli 1, aby przeprowadzić główną reakcję KASP.</li>
		<li>Wyświetl wynikowy wykres punktowy utworzony przez komputer analizujący. Udana reakcja pokaże 4 odrębne grupy punktów na wykresie (<silna klasa="xfig">Rysunek 3): trzy grupy próbek odpowiadające genotypowi i jedno zgrupowanie NTC w pobliżu początku dostawy. Kontrole dodatnie powinny być segregowane z odpowiednim podziałem próbek.</li>
		<li>Jeżeli program komputerowy nie rozpoznaje grup działek jako odpowiadających określonym genotypom, mogą być wymagane dodatkowe zestawy cykliczne (tabela 2). Powtarzaj dodatkowy program, aż komputer rozpozna ścisłe grupowanie według genotypu.</li>
		<li>Eksportuj wyniki genotypowania do pliku arkusza kalkulacyjnego, aby ułatwić korzystanie i analizę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trzymaj zidentyfikowane heterozygotyczne zwierzęta razem w głównym systemie wodnym.</li>
</ol>
2. Pierwsza runda punktacji potomstwa
<ol>
	<li>Heterozygoty krzyżowe między rodzeństwem parami
	<ol>
		<li>Po tym, jak zwierzęta dojdą do siebie z klipsa płetwy, ustaw krzyżowanie parami. Użyj separatorów, aby upewnić się, że zarodki są synchroniczne16.</li>
		<li>Zbierz zarodki i trzymaj pary rodzicielskie w izolacji w klatkach hodowlanych.</li>
		<li>Monitoruj odizolowane dorosłe osobniki, aby agresywne ryby mogły zostać oddzielone lub zapewnione im schronienie (dobrze sprawdzają się rozdrobnione sieci na ryby). Ryby powinny być karmione, a ich woda zmieniana zgodnie z wytycznymi IACUC podczas przebywania w wodzie statycznej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hodowla zarodków
	<ol>
		<li>Etapowanie i hodowla zarodków danio pręgowanego do postaci larw w standardowych warunkach17.</li>
		<li>Zbierz fenotypowo dzikie zwierzęta za pomocą szklanej pipety w 5 lub 6 dniu, gdy pęcherz pławny jest napompowany w 75% sprzęgła. Umieść fenotypowe dzikie typy w odchowalni, w którym zapisano, które rodzice je przynieśli. 
		Uwaga: W przypadku zmutowanych alleli, które są recesywnie śmiertelne, co jest prawdą w przypadku wielu mutantów szkieletowych, homozygotyczne mutanty nie tworzą pęcherzy pławnych18,19. Dlatego fenotypowe dzikie typy można łatwo odróżnić od ich zmutowanego rodzeństwa na podstawie napompowanych pęcherzy pławnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie chrząstki i kości Alcian Blue/Alizarin Red
	<ol>
		<li>Larwy, które nie napełniają pęcherzy pławnych, należy znieczulić za pomocą 0,17 g/l Tricaine-S w pożywce zarodkowej. Zbierz zwierzęta do probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml za pomocą szklanej pipety Pasteura o szerokim otworze. Dodaj nie więcej niż 100 larw w tubie.</li>
		<li>Usuń wodę z zarodków z każdej probówki i umieść zwierzęta w 1 ml 2% paraformaldehydu w 1x PBS na probówkę. 
		ostrożność: Wodny roztwór PFA jest łatwopalny i powoduje poważne podrażnienie skóry i oczu. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej, takie jak rękawice i okulary ochronne, a po użyciu dokładnie umyć ręce.</li>
		<li>Kołysz się przez 1 godzinę; dłuższe mocowanie pogarsza barwienie kości. Regularnie sprawdzaj rurki podczas tego i wszystkich kolejnych etapów kołysania, aby upewnić się, że żadne larwy nie przykleiły się do boku lub nie zbiły się w dnie rurki.</li>
		<li>Usuń utrwalacz z probówek za pomocą szklanej pipety, dodaj 1 ml 50% etanolu i kołysz przez 10 minut.</li>
		<li>Przygotować świeży roztwór barwiący, dodając 20 μl 0,5% czerwieni alizarynowej na 1 ml premiksu Alcian (0,04% błękitu alckiego/10 mM MgCl2/80% etanolu). Usuń 50% etanolu, dodaj 1 ml roztworu barwiącego do każdej probówki i kołysz się przez noc. Larwy mogą pozostawać w plamie do 5 dni.</li>
		<li>Usuń roztwór plamy z probówek i dodaj 1 ml 80% roztworu etanolu/10 mM MgCl2 do każdej probówki. Kołysz rurkami przez co najmniej 1 godzinę; spłukiwanie przez noc może spowodować wyraźniejszą plamę Alcian Blue.</li>
		<li>Usunąć 80% roztwór etanolu/10 mM MgCl2 z probówek i dodać 1 ml 50% etanolu; miażdżyć przez 5 minut.</li>
		<li>Usuń 50% roztwór etanolu z probówek i dodaj 1 ml 25% etanolu i kołysz przez 5 minut.</li>
		<li>Usuń 50% roztwór etanolu z probówek i dodaj 1 ml świeżo przygotowanego roztworu wybielającego 3% H2O2/0,5% KOH. Pozostaw nakrętki otwarte i pozostaw probówki w stojaku na mikroprobówki na około 10 minut lub do momentu, gdy w górnej części roztworu będzie widoczne delikatne brązowe zabarwienie. 
		UWAGA: Na wierzchu roztworu tworzy się warstwa bąbelków. Na tym etapie wymagane jest ostrożne wyczucie czasu, ponieważ nadmierne wybielanie spowoduje słabą podwójną plamę.</li>
		<li>Usuń roztwór wybielający i dodaj 1 ml 25% glicerolu/0,1% KOH; kołysz przez 10 minut do 1 godziny.</li>
		<li>Usuń 25% roztworu glicerolu/0,1% KOH z probówek, dodaj 1 ml 50% roztworu glicerolu/0,1% KOH do każdej probówki, kołysz przez 10 minut do nocy.</li>
		<li>Usuń 50% roztworu glicerolu/0,1% KOH z probówek i ponownie dodaj 50% roztworu glicerolu/0,1% KOH do każdej probówki. Kołysanie przez noc pomoże usunąć pęcherzyki powietrza, które mogą gromadzić się wewnątrz larw. Barwione preparaty kostne przechowywać w temperaturze 4 °C, gdy nie są używane.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena fenotypu
	<ol>
		<li>Oceń barwione zmutowane potomstwo pod kątem penetracji wybranego fenotypu. W Nichols i wsp.1 mutantów zostało ocenionych za każde wystąpienie kości ektopowej. 
		Uwaga: Ponieważ rodzice danio pręgowanego znajdują się w statycznej wodzie, a czerwona plama Alizarin może z czasem blaknąć, ważne jest, aby naciąć szkielety w ciągu kilku dni od zakończenia przygotowania szkieletu.</li>
		<li>Penetracja to proporcja genotypu, która ma fenotyp. Oblicz procentową penetrację według następującego wzoru: 
		% penetracji = (mutanty z fenotypem)/(całkowita liczba mutantów) × 100</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Wybór rodziny
<ol>
	<li>Wybierz dwie rodziny o wysokiej penetracji i dwie rodziny o niskiej penetracji dla następnej generacji. Oprócz penetracji ważne jest, aby wziąć pod uwagę płodność i wigor przy wyborze rodzin do rozmnażania; zobacz Dyskusja, aby uzyskać więcej informacji na ten temat.</li>
	<li>Nadaj każdej parze rodzicielskiej identyfikator zapasów podrzędnych: rodzina .01, .02 itd.</li>
	<li>Trzymanie w domu par rodzicielskich w głównym systemie z kilkoma rybami "towarzyszącymi" płci mieszanej. Rybą towarzyszącą może być dowolna linia danio pręgowanego z trwałymi, oczywistymi cechami wyróżniającymi, takimi jak zmieniona pigmentacja lub struktura płetw. 
	UWAGA: Podczas gdy wielu badaczy z powodzeniem utrzymuje w zbiorniku tylko pary lęgowe, korzystne wyniki obserwuje się po trzymaniu par z kilkoma rybami towarzyszącymi. Ten opcjonalny krok pozwala na trzymanie par hodowlanych zwierząt w większych ławicach i łatwe odzyskiwanie, dzięki czemu można je wielokrotnie krzyżować w razie potrzeby. Pary rodzicielskie mogą być wielokrotnie krzyżowane, aby wygenerować duże rodziny z pełnym rodzeństwem; Odczekaj co najmniej tydzień przed ponownym krzyżowaniem tej samej pary rodzicielskiej.</li>
	<li>Należy usunąć rodziny larw z kroku 2.2.2, które nie zostały wybrane do następnego pokolenia.</li>
	<li>Oznacz zbiorniki zawierające larwy rodzeństwa typu dzikiego z wybranych rodzin penetracją ich zmutowanego rodzeństwa i wychowuj do dorosłości w normalny sposób.</li>
	<li>Następne pokolenie będzie miało co najmniej cztery rodziny z pełnym rodzeństwem, dwie dla linii wznoszącej i dwie dla linii spadkowej.</li>
	<li>Gdy larwy osiągną dojrzałość płciową, powtórz protokół, zaczynając od kroku pierwszego z nowym pokoleniem.</li>
</ol>

<ol><li>Nichols, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligament+versus+bone+cell+identity+in+the+zebrafish+hyoid+skeleton+is+regulated+by+mef2ca%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ligament versus bone cell identity in the zebrafish hyoid skeleton is regulated by mef2ca.</a> Development. 143 (23), 4430-4440 (2016).</li>
<li>Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Zhao, F., Liu, D., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ahsa1+and+Hsp90+activity+confers+more+severe+craniofacial+phenotypes+in+a+zebrafish+model+of+hypoparathyroidism%2C+sensorineural+deafness+and+renal+dysplasia+%28HDR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Ahsa1 and Hsp90 activity confers more severe craniofacial phenotypes in a zebrafish model of hypoparathyroidism, sensorineural deafness and renal dysplasia (HDR).</a> Dis Model Mech. 6 (5), 1285-1291 (2013).</li>
<li>Cox, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+of+variant+histone+H3.3+for+ectomesenchyme+potential+of+the+cranial+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">An essential role of variant histone H3.3 for ectomesenchyme potential of the cranial neural crest.</a> PLoS Genet. 8 (9), e1002938(2012).</li>
<li>DeLaurier, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+mef2ca+in+developmental+buffering+of+the+zebrafish+larval+hyoid+dermal+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of mef2ca in developmental buffering of the zebrafish larval hyoid dermal skeleton.</a> Dev Biol. 385 (2), 189-199 (2014).</li>
<li>McGurk, P. D., Ben Lovely, C., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+Craniofacial+Morphogenesis+in+Zebrafish+Using+4D+Confocal+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy.</a> J Vis Exp. (83), e51190(2014).</li>
<li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> J Vis Exp. (29), e1394 (2009).</li>
<li>Lush, J. L. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022030235931095">Progeny test and individual performance as indicators of an animal's breeding value.</a> J Dairy Science. 18 (1), 1-19 (1935).</li>
<li>Lerner, I. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLerner%2C+IM+%22Population+Genetics+and+Animal+Improvement%22">Population Genetics and Animal Improvement</a>. , Cambridge University Press. (1950).</li>
<li>Shinya, M., Sakai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Highly+Homogeneous+Strains+of+Zebrafish+Through+Full+Sib-Pair+Mating%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Generation of Highly Homogeneous Strains of Zebrafish Through Full Sib-Pair Mating.</a> G3. 1 (5), 377-386 (2011).</li>
<li>Neff, M. M., Neff, J. D., Chory, J., Pepper, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dCAPS%2C+a+simple+technique+for+the+genetic+analysis+of+single+nucleotide+polymorphisms%3A+experimental+applications+in+Arabidopsis+thaliana+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics.</a> Plant J. 14 (3), 387-392 (1998).</li>
<li>Xing, L. Y., Quist, T. S., Stevenson, T. J., Dahlem, T. J., Bonkowsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+Efficient+Zebrafish+Genotyping+Using+PCR+with+High-resolution+Melt+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Jove-Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis.</a> Jove-Journal of Visualized Experiments. (84), e51138(2014).</li>
<li>He, C., Holme, J., Anthony, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNP+genotyping%3A+the+KASP+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">SNP genotyping: the KASP assay.</a> Methods Mol Biol. 1145, 75-86 (2014).</li>
<li>Semagn, K., Babu, R., Hearne, S., Olsen, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s11032-013-9917-x">Single nucleotide polymorphism genotyping using Kompetitive Allele Specific PCR (KASP): overview of the technology and its application in crop improvement.</a> Molecular Breeding. 33 (1), 1-14 (2014).</li>
<li>Yuan, J., Wen, Z., Gu, C., Wang, D. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/273260117_Introduction_of_High_Throughput_and_Cost_Effective_SNP_Genotyping_Platforms_in_Soybean">Introduction of high throughput and cost effective SNP genotyping platforms in soybean.</a> Plant Genet Genomics Biotech. 2 (1), 90-94 (2014).</li>
<li>Walker, M. B., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-color+acid-free+cartilage+and+bone+stain+for+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech+Histochem%22%5BJournal%5D)">A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae.</a> Biotech Histochem. 82 (1), 23-28 (2007).</li>
<li>Nasiadka, A., Clark, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+breeding+in+the+laboratory+environment%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Zebrafish breeding in the laboratory environment.</a> ILAR J. 53 (2), 161-168 (2012).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8589427">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Schilling, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jaw+and+branchial+arch+mutants+in+zebrafish+I%3A+branchial+arches%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Jaw and branchial arch mutants in zebrafish I: branchial arches.</a> Development. 123, 329-344 (1996).</li>
<li>McCune, A. R., Carlson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twenty+ways+to+lose+your+bladder%3A+common+natural+mutants+in+zebrafish+and+widespread+convergence+of+swim+bladder+loss+among+teleost+fishes%5BTitle%5D)+AND+%22Evol+Dev%22%5BJournal%5D)">Twenty ways to lose your bladder: common natural mutants in zebrafish and widespread convergence of swim bladder loss among teleost fishes.</a> Evol Dev. 6 (4), 246-259 (2004).</li>
<li>Mrakovčič, M., Haley, L. E. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1095-8649.1979.tb03612.x/abstract">Inbreeding depression in the Zebra fish Brachydanio rerio (Hamilton Buchanan).</a> J Fish Biol. 15 (3), 323-327 (1979).</li>
<li>Charlesworth, D., Willis, J. H. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nrg/journal/v10/n11/full/nrg2664.html">The genetics of inbreeding depression.</a> Nat Rev Genet. 10 (11), 783-796 (2009).</li>
<li>McCune, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+low+genomic+number+of+recessive+lethals+in+natural+populations+of+bluefin+killifish+and+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A low genomic number of recessive lethals in natural populations of bluefin killifish and zebrafish.</a> Science. 296 (5577), 2398-2401 (2002).</li>
<li>Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+clones+of+homozygous+diploid+zebra+fish+%28Brachydanio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio).</a> Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).</li>
<li>Dreosti, E., Lopes, G., Kampff, A. R., Wilson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+social+behavior+in+young+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Development of social behavior in young zebrafish.</a> Front Neural Circuits. 9, 39(2015).</li>
<li>Eames, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FishFace%3A+interactive+atlas+of+zebrafish+craniofacial+development+at+cellular+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Bio%22%5BJournal%5D)">FishFace: interactive atlas of zebrafish craniofacial development at cellular resolution.</a> BMC Dev Bio. 13 (1), 23(2013).</li>
<li>Nichols, J. T., Pan, L., Moens, C. B., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((barx1+represses+joints+and+promotes+cartilage+in+the+craniofacial+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">barx1 represses joints and promotes cartilage in the craniofacial skeleton.</a> Development. 140 (13), 2765-2775 (2013).</li>
<li>Sasaki, M. M., Nichols, J. T., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((edn1+and+hand2+Interact+in+early+regulation+of+pharyngeal+arch+outgrowth+during+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">edn1 and hand2 Interact in early regulation of pharyngeal arch outgrowth during zebrafish development.</a> PLoS One. 8 (6), e67522(2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Hodowla selektywna odsłania subtelności funkcji genów
Zmiana zmutowanych fenotypów tak, aby były mniej lub bardziej dotkliwe poprzez selektywną hodowlę, jest prostym sposobem na uzyskanie nowego wglądu w funkcję genów. W porównaniu ze standardowymi metodami hodowli niewyselekcjonowanej, przedstawiony tutaj protokół może zapewnić znacznie pełniejsze zrozumienie zmutowanych fenotypów. W szczególności, generując szczepy, które są ciężkie, można ujawnić pełen zakres zmutowanych fe...

Danio pręgowany to potężny system modelowy do zrozumienia rozwoju szkieletu. W przypadku zmutowanych szczepów danio pręgowanego biolodzy mogą rozszyfrować funkcję genów podczas skeletogenezy. Jednak zmutowane fenotypy szkieletu danio pręgowanego mogą charakteryzować się zmienną penetracją1,2,3,4, co może utrudniać analizy rozwojowe i genetyczne. Cel tej metody jest trojaki. Po pierwsze, generowanie linii mutantów danio pręgowanego, które konsekwentnie wytwarzają ciężkie fenotypy, umożliwia dalsze badania rozwojowe, takie jak nagrywanie poklatkowe5 i transplantation6. Tego rodzaju badania mogą zostać sparaliżowane przez próby badania fenotypów, które manifestują się tylko niespójnie. Po drugie, chów wsobny odmian danio pręgowanego może zmniejszyć zmienność tła genetycznego, promując w ten sposób spójność i odtwarzalność eksperymentalną. Na przykład przeprowadzenie wszystkich analiz hybrydyzacji in situ na jednym selektywnie wsobnym szczepie może zmniejszyć mylącą zmienność i wzmocnić wnioski. Po trzecie, wygenerowanie ciężkich i łagodnych szczepów ujawni całą serię fenotypową, która może wynikać z określonej mutacji.
Na pierwszy rzut oka, selektywna hodowla śmiercionośnych mutantów wydaje się niemożliwa. Jak można rozmnażać się w celu penetracji, gdy zwierzęta, które są oceniane do selekcji, są martwe? Na szczęście metody selektywnej hodowli przez dobór rodzinny, w szczególności badanie potomstwa, od wielu lat wykazują skuteczność w programach hodowli zwierząt gospodarskich7,8. Programy te są stosowane głównie do selektywnej hodowli cech, które są obecne tylko u jednej płci, takich jak produkcja mleka u krów lub produkcja jaj u kur. Samce tych gatunków nie mogą być oceniane bezpośrednio, ale ich potomstwo jest oceniane, a następnie przypisuje się wartość rodzicom. Zapożyczając z tej strategii, przedstawiony tutaj protokół polega na ocenie utrwalonego i wybarwionego zmutowanego potomstwa z pary danio pręgowanego, które są heterozygotyczne pod względem zmutowanego genu będącego przedmiotem zainteresowania. Penetracja fenotypu u homozygotycznego letalnego zmutowanego potomstwa jest przypisywana rodzicom przy podejmowaniu decyzji, które osobniki wydadzą następne pokolenie w linii. Odkryliśmy, że ta metoda jest skutecznym sposobem na zmianę penetracji u letalnych mutantów szkieletowych danio pręgowanego1.
Podobnie jak w innych badaniach, ten protokół selektywnej hodowli bierze pod uwagę takie kryteria jak rozmiar lęgu, przeżywalność potomstwa, prawidłowy rozwój zarodków i stosunek płci9. Jednak wszystkie te czynniki są rozpatrywane w kontekście tła mutantów w celu przesunięcia penetracji mutantów. W związku z tym protokół ten rozszerza poprzednie paradygmaty hodowli selektywnej, oferując metodę wzmacniającą analizy rozwojowe mutantów, a także zwiększającą jednorodność tła.
Ten protokół wymaga obszernego genotypowania, dlatego ważne jest, aby zawczasu opracować niezawodny, szybki protokół genotypowania. Dostępnych jest wiele protokołów genotypowania10,11, jednak znajdziemy genotypowanie KASP 12,13,14 jest szybszy, bardziej opłacalny i bardziej niezawodny niż metody oparte na enzymatycznym rozszczepianiu amplifikowanych sekwencji za pomocą enzymu restrykcyjnego10. Dlatego w tej pracy uwzględniamy protokół KASP. Dodatkowo w tym protokole skupiamy się na zmutowanych fenotypach szkieletowych i uwzględniamy procedurę barwienia Alcian Blue/Alizarin Red zmodyfikowaną w stosunku do poprzednich protokołów15.
Opisana tutaj metoda to prosta strategia przesuwania penetracji śmiercionośnych mutantów w górę lub w dół. Chociaż protokół ten koncentruje się na zmutowanych fenotypach szkieletowych, uważamy, że będzie to przydatna strategia do hodowli wszystkich linii zmutowanych danio pręgowanego. W rzeczywistości użyteczność tej strategii hodowlanej prawdopodobnie wykracza poza danio pręgowanego. Przewidujemy, że protokół ten może zostać zmodyfikowany w celu zmiany penetracji w szerokim zakresie organizmów. Zmiana penetracji śmiertelności poprzez testowanie potomstwa może pomóc w przyspieszeniu postępu każdego genetyka rozwojowego.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyd, granulowany, stały</td><td>Ted Pella Co.</td><td>18501</td><td>Granulowany PFA jest bezpieczniejszą alternatywą dla sproszkowanego</td></tr><tr><td>chlorku magnezu PFA, stałego</td><td>Acros Organics</td><td>223210010</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS, Awaterous</td><td>Fisher</td><td>BP3994</td><td></td></tr><tr><td>190 proof Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue, solid</td><td>Anatech Ltd.</td><td>867</td><td>Musi pochodzić z Anatech</td></tr><tr><td>Alizarin Red, solid</td><td>Sigma</td><td>A5533-25G</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol, płynny</td><td>Fisher</td><td>BP229 1</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru, płynny</td><td>Fisher</td><td>BP263500</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu,&nbsp; solidny</td><td>Fisher</td><td>P250 500</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Maszyna do PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Fast Optical 96-dołkowa płytka reakcyjna z kodem kreskowym (0,1 ml)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346906</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelka Microseal 'B'</td><td>BioRad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>KASP Master Mix, High ROX</td><td>LGC</td><td>KBS-1016-022</td><td>https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk</td></tr><tr><td>KASP By Design Primer Mix</td><td>LGC</td><td>KBS-2100-100</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl, ciało stałe</td><td>Fisher</td><td>BP153 500</td><td></td></tr><tr><td>chlorek potasu, ciało stałe</td><td>Fisher</td><td>BP366 500</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20, płyn</td><td>Fisher</td><td>BP337 100</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40</td><td>ThermoFisher</td><td>28324</td><td></td></tr><tr><td>Trikaina-S</td><td>Western Chemicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Fisher</td><td>BP1700 100</td><td></td></tr><tr><td>Termocykler T100</td><td>Pipety Pasteura z</td><td></td> kontrolowanym spadkiem 1861096 <td></td></tr><tr><td></td><td>BioRad Fisher</td><td>13-678-30</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td>do oznaczania ilościowego DNA</td></tr></tbody></table>

przesuwająca się penetracja śmiertelnych mutantów szkieletowych danio pręgowanego za pomocą testów potomstwa

Shifting Zebrafish Lethal Skeletal Mutant Penetrance by Progeny Testing

Fenotypy mutantów danio pręgowanego są często nie w pełni penetrujące, przejawiają się tylko u niektórych mutantów. Interesujące fenotypy, które pojawiają się niespójnie, mogą być trudne do zbadania i mogą prowadzić do mylących wyników. Opisany tutaj protokół jest prostym paradygmatem hodowlanym mającym na celu zwiększenie i zmniejszenie penetracji śmiertelnych mutantów szkieletowych danio pręgowanego. Ponieważ śmiertelne mutanty nie mogą być selektywnie hodowane bezpośrednio, stosuje się klasyczną strategię hodowli selektywnej polegającą na testowaniu potomstwa. Metoda ta obejmuje również protokoły genotypowania genotypowania genengura i barwienia larw danio pręgowanego swoistego dla alleli (KASP) oraz barwienia larw chrząstki i kości danio pręgowanego. Zastosowanie opisanej tutaj strategii hodowlanej może zwiększyć penetrację interesującego fenotypu szkieletu, umożliwiając uzyskanie bardziej powtarzalnych wyników w dalszych zastosowaniach. Ponadto, zmniejszenie penetracji mutantów poprzez tę selektywną strategię hodowli może ujawnić procesy rozwojowe, które co najważniejsze wymagają funkcji zmutowanego genu. Chociaż szkielet jest tutaj szczegółowo rozważony, sugerujemy, że ta metodologia będzie przydatna dla wszystkich linii mutantów danio pręgowanego.

Niniejszy protokół opisuje długoterminową technikę hodowli, która jest przydatna w badaniu mutantów szkieletowych rybek danio pręgowanych (Rycina 1). Dobór selekcyjny oparty na testowaniu potomstwa powinien doprowadzić w ciągu kilku pokoleń do przesunięcia ogólnej penetracji zarówno w dół, jak i w górę (Rycina 2). W naszej poprzedniej pracy dwie rundy doboru selekcyjnego obniżyły średnią penetrację z 17% do 3%1<...

Celem tego protokołu jest zmiana penetracji śmiercionośnych zmutowanych fenotypów szkieletowych u danio pręgowanego poprzez selektywną hodowlę. Śmiertelne mutanty nie mogą być dorosłe do dorosłości i rozmnażane samodzielnie, dlatego ten protokół opisuje metodę śledzenia i selekcji penetracji przez wiele pokoleń za pomocą testów potomstwa.

Przesuwająca się penetracja śmiertelnych mutantów szkieletowych danio pręgowanego za pomocą testów potomstwa

Zebrafish mutant phenotypes are often incompletely penetrant, only manifesting in some mutants. Interesting phenotypes that inconsistently appear can be ...

Ogólnym celem tej strategii hodowlanej jest manipulowanie penetracją mutantów w górę lub w dół. Ta metoda selektywnej hodowli umożliwia pełniejsze zrozumienie fenotypów mutantów. Dzięki generowaniu szczepów mutantów o wysokiej i niskiej penetracji można zrozumieć całą serię fenotypową danej mutacji.Większość mutacji u danio-ostroskrzelnych, w których mutanty są recesywnie letalne, powoduje śmierć homozygotycznych mutantów przed możliwością bezpośredniego ich rozmnożenia. W związku z tym stosujemy klasyczną strategię selektywnej hodowli opartą na badaniu potomstwa, którą tutaj demonstrujemy. Po raz pierwszy opracowaliśmy tę metodę podczas prób rejestracji rozwoju ektopowych komórek kostnych w technice time-lapse.Niestety, często pojawiały się w nim dodatkowe komórki kostne, dlatego podjęliśmy próbę zmodyfikowania penetracji mutacji poprzez selektywną hodowlę. Chociaż metodę tę przeprowadzamy w skali populacji zebrafish z wykorzystaniem linii mutantów, można ją zastosować również do innych fenotypów mutantów zebrafish, a prawdopodobnie także u innych organizmów. Po przygotowaniu nieselekcjonowanego wyjściowego stada zebrafish zgodnie z protokołem tekstowym, należy przeprowadzić genot

shifting-zebrafish-lethal-skeletal-mutant-penetrance-progeny

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Tutaj prezentujemy systematyczne podejście do opracowywania fizjologicznie istotnych, czułych i specyficznych testów in vivo do interpretacji zmienności w ludzkiej patologii. Przejściowa manipulacja genetyczna poprzez mikrowstrzyknięcie WT i zmutowanych ludzkich oligonukleotydów antysensownych mRNA i morfoliny (MO) wykorzystuje podatność rozwijającego się zarodka danio pręgowanego do szybkiego oznaczania mutacji patogennych, zwłaszcza, ale nie wyłącznie, w kontekście zaburzeń rozwojowych...

In vivo (in vivo) Modelowanie chorobliwego genomu ludzkiego przy użyciu Danio rerio

Danio pręgowany jest teraz sprawdzonym i potężnym narzędziem do modelowania dystrofii mięśniowych, wrodzonych miopatii i pokrewnych chorób nerwowo-mięśniowych. Dwójłomność i zachowanie ucieczki wywołane dotykiem to dwa powszechne nieinwazyjne testy stosowane do określenia stopnia dezorganizacji mięśni i upośledzenia lokomocji zarodków danio pręgowanego we wczesnym okresie rozwoju.

Analiza wad mięśni szkieletowych u larw danio pręgowanego za pomocą testów dwójłomności i reakcji ucieczki wywołanej dotykiem

Danio pręgowany jest potężnym modelowym systemem do badań nad biologią rozwojową i chorobami ludzkimi ze względu na ich genetyczne podobieństwo do wyższych kręgowców. Protokół ten opisuje metodologię tworzenia haploidalnych zarodków danio pręgowanego, które można wykorzystać do strategii przesiewowych w celu identyfikacji recesywnych mutacji w genach niezbędnych do wczesnej embriogenezy.

Produkcja haploidalnych zarodków danio pręgowanego metodą zapłodnienia in vitro

Danio pręgowany był używany jako wiarygodne modele genetyczne w badaniach biomedycznych, zwłaszcza wraz z pojawieniem się technologii edycji genów. Gdy spodziewane są fenotypy larw, ekstrakcja DNA i identyfikacja genotypu może być trudna. W tym miejscu opisujemy skuteczną procedurę genotypowania larw danio pręgowanego, poprzez obcinanie ogonów, już po 72 godzinach od zapłodnienia.

Wysokoprzepustowa ekstrakcja DNA i genotypowanie larw danio pręgowanego 3dpf poprzez obcinanie płetw

Technologie CRISPR-Cas zrewolucjonizowały dziedzinę edycji genomu. Jednak znalezienie i wyizolowanie pożądanej edycji linii zarodkowej pozostaje głównym wąskim gardłem. Dlatego protokół ten opisuje solidną metodę szybkiego badania przesiewowego nasienia danio pręgowanego wstrzykniętego za pomocą F0 CRISPR pod kątem edycji linii zarodkowej przy użyciu standardowych technik PCR, trawienia restrykcyjnego i elektroforezy żelowej.

Badania przesiewowe plemników w celu szybkiej izolacji zmian linii zarodkowej u danio pręgowanego

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzić efektywną edycję zasady adeninowej bez ograniczeń PAM, aby zbudować precyzyjny model choroby danio pręgowanego za pomocą zSpRY-ABE8e.

Wydajna edycja bazy bez PAM do modelowania chorób genetycznych człowieka u danio pręgowanego za pomocą zSpRY-ABE8e

Ten protokół opisuje procedurę badania przesiewowego leków u larw danio pręgowanego 3-7 dni po zapłodnieniu, po której następuje ocena morfologiczna.

Badania przesiewowe małych cząsteczek i badania toksyczności u larw danio pręgowanego we wczesnym stadium rozwoju

RASopatie to wielosystemowe zespoły genetyczne wywołane hiperaktywacją szlaku RAS-MAPUK. Potencjalnie patogenne warianty oczekujące na walidację pojawiają się nieustannie, podczas gdy słabe dowody przedkliniczne ograniczają terapię. Tutaj opisujemy nasz protokół in vivo polegający na testowaniu i krzyżowej weryfikacji poziomów aktywacji ERK związanych z RASopatią oraz jego modulacji farmakologicznej podczas embrigenezy za pomocą obrazowania FRET na żywo u danio danio młodego typu Teen-reporter.

Efektywny protokół oceny modulacji aktywności ERK w wczesnych modelach zespołu Noonana u danio danio za pomocą mikroskopii na żywo FRET i immunofluorescencji

W tym miejscu opisujemy protokół generowania matczynego mutanta, który łączy stabilną linię knock-in zpc: cas9 z dostarczaniem kaset ekspresyjnych sgRNA za pośrednictwem Tol2.

Generowanie matczynych mutantów przy użyciu zpc:cas9 Knock-in Danio pręgowanego

Praca ta opisuje protokół do ilościowego określania kształtu chrząstki czaszkowo-twarzowej za pomocą wolnego oprogramowania (tpsDigs2, MorphoJ i PAST) do pomiaru zmian struktury twarzy u larw danio dano.

Morfometryczne analizy kształtu: narzędzie analityczne do kwantyfikacji kształtu czaszkowo-twarzowego u danio pręgowanego

Poznaj metodę selektywnego hodowli do modyfikacji penetracji śmiertelnych mutantów szkieletowych u Danio rerio za pomocą testów potomstwa. Technika ta umożliwia generowanie linii o wysokiej i niskiej penetracji.

Przesuwająca się penetracja śmiertelnych mutantów szkieletowych danio pręgowanego za pomocą testów potomstwa

Przeglądaj więcej filmów