Name: AFM i mikroreologia w komórkach żółtka zarodka danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Odkryj metody pomiaru właściwości mechanicznych komórek żółtka zarodka Danio rerio za pomocą mikroskopii sił atomowych i mikroreologii. Techniki te pozwalają badać mechanobiologię rozwoju z minimalną manipulacją.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Amayrze Hernández-Vega i Philippe'owi-Alexandre'owi Pouille'owi za udział w tworzeniu podstaw dla tych protokołów. Dziękujemy również Platformie Obrazowania Molekularnego z IBMB-PCB, Xavierowi Estebanowi i członkom laboratorium za nieustanne wsparcie. Prace te zostały wsparte w ramach Programu Grup Skonsolidowanych Generalitat de Catalunya oraz DGI oraz dotacji Consolider z Ministerstwa Gospodarki i Konkurencyjności Hiszpanii dla EMB i DN.

Wszystkie opisane poniżej kroki protokołu są zgodne z wytycznymi naszych instytucji dotyczącymi opieki nad zwierzętami.
1. Hodowla danio pręgowanego
<ol>
	<li>Hoduj i utrzymuj dorosłego danio pręgowanego w standardowych warunkach. 
	UWAGA: W tym badaniu wykorzystano zarodki typu dzikiego AB i TL.</li>
	<li>Zebrać zarodki i wyhodować je w temperaturze 28,5 °C w pożywce dla zarodków E324. Ułóż je zgodnie z morfologią, jak opisano wcześniej19.</li>
</ol>
2. Mikroskopia sił atomowych
<ol>
	<li>Ręcznie dechorionowane zarodki danio pręgowanego (w różnym wieku w zależności od indywidualnych zainteresowań). Usuń kosmówkę dwoma cienkimi i ostrymi kleszczami (patrz tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Chwyć kosmówkę za pomocą jednego kleszcza i rozerwij go drugimi kleszczami. Następnie, trzymając kosmówkę w obszarze przeciwległym do rozdarcia, delikatnie wepchnij zarodek przez otwór.</li>
		<li>Wykonaj dekorionację pod stereoskopowym mikroskopem preparacyjnym z regulowanym zakresem powiększenia od 8X do 50X.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamontuj zarodki do AFM
	<ol>
		<li>Przygotuj roztwór 2% agarozy w pożywce dla zarodków i wypełnij nim szalkę Petriego o średnicy 35 mm. Niech stwardnieje. Wykonaj małe otwory o średnicy 1,5 mm (dwa razy większej niż wielkość zarodka) i głębokości około 350 μm (połowa wielkości zarodka) cienkimi kleszkami w łożu agarozy.</li>
		<li>Umieść zarodki w workach wykonanych w warstwie agarozy i upewnij się, że są na miejscu, rozprowadzając wokół roztworu 0,5% niskotopliwej agarozy w pożywce zarodkowej. Wlej ten roztwór tylko wokół zarodków, aby zabezpieczyć je w otworach.</li>
		<li>Zanim agaroza o niskiej temperaturze topnienia zestale się w temperaturze pokojowej, obróć zarodki w taki sposób, aby obszar zainteresowania badany przez AFM był skierowany do góry (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Badanie zarodków za pomocą AFM
	<ol>
		<li>Zlokalizuj i zobrazuj zarodki na szalce Petriego za pomocą obiektywu 20X w odwróconym mikroskopie sił atomowych (patrz Tabela Materiałów25) w temperaturze pokojowej (23 - 24 °C). 
		UWAGA: Zarodki są utrzymywane przy życiu, zanurzane w pożywce zarodkowej i przyczepiane do łoża agarozy.</li>
		<li>Zbadać powierzchnię komórek żółtkowych odlanych zarodków za pomocą sferycznych kulek polistyrenowych o średnicy 4,5 μm przymocowanych do wspornika o nominalnej stałej sprężystości 0,01 N/m. Ustawić amplitudę między szczytami oscylacji wspornika na 5 μm, a jej częstotliwość na 1 Hz.</li>
		<li>Rutynowo należy zebrać dane dla każdego regionu, który ma być badany w różnych pozycjach i na kilku zarodkach, w celu uśrednienia danych. 
		UWAGA: Dobrym punktem wyjścia jest zbadanie pięciu pozycji znajdujących się pośrodku i w rogach kwadratu o wymiarach 10 μm x 10 μm poprzez kontrolowanie położenia wspornika za pomocą siłowników piezo-wykonawczych XY mikroskopu AFM. Obrazowanie i zbieranie danych trwało około 20 minut na zarodek. Rejestrowanie danych w różnych regionach powierzchni komórek żółtka zarodka, np. na biegunie roślinnym lub w różnych regionach w pobliżu marginesu komórek EVL (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B i 1C), można wykonać tylko przy użyciu różnych próbek zorientowanych w różny sposób.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obliczanie sił
	<ol>
		<li>Zmierzyć pionowe przemieszczenie wspornika AFM (z) za pomocą czujników tensometrycznych sprzężonych z siłownikami piezoelektrycznymi oraz jego ugięcie (d) za pomocą fotodiody kwadrantowej metodą dźwigni optycznej z oprogramowaniem sterującym mikroskopem (patrz Tabela materiałów25).</li>
		<li>Użyj nachylenia krzywej d-z uzyskanego z danych zebranych z odsłoniętego obszaru szklanego szkiełka nakrywkowego, aby skalibrować korelację między sygnałem fotodiody a ugięciem wspornika (d). 
		UWAGA: Zmierzone przemieszczenie pionowe jest równe ugięciu wspornika, a nachylenie reprezentuje czułość na ugięcie dźwigni optycznej26.</li>
		<li>Wywnioskuj stałą sprężystości wspornika (k) z fluktuacji termicznych, jak opisano wcześniej27.</li>
		<li>Obliczyć wgłębienie próbki (h) jako: 
		h = (z- z c) - (d - dwył.) (1) 
		UWAGA: Tutaj zc jest położeniem punktu styku, a doff jest przesunięciem fotodiody.</li>
		<li>Oblicz siłę (F) działającą na wspornik jako: 
		F = k · d (2)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oblicz napięcie kory mózgowej w odniesieniu do modelu ciecz-balon składającego się z elastycznej warstwy napięcia korowego Tc otaczającej lepką ciecz. W tym modelu, dla małych wgłębień (w porównaniu z wielkością zarodka), siła wzrasta proporcjonalnie4,28 as: 
	F = 4π Tc [(Rb / Re) +1)] h (3) 
	UWAGA: Tutaj Rb jest promieniem koralika, a Re jest promieniem zarodka. W przypadku zarodka danio pręgowanego, ponieważ promień zarodka (400 μm) jest o dwa rzędy wielkości większy niż promień koralika (2,25 μm), równanie to można w przybliżeniu wyznaczyć jako: 
	F = 4π Tc h (4)
	<ol>
		<li>Obliczyć krzywe siły rozciągającej i wgniecenia (F-h) w każdym regionie komórek żółtka zarodka dla pięciu różnych pomiarów punktowych.</li>
		<li>Oblicz Tc dla każdej krzywej F-h za pomocą nieliniowego dopasowania metodą najmniejszych kwadratów. Do celów analizy statystycznej obliczone napięcie korowe Tc należy uśrednić z różnych krzywych F-h.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierz właściwości lepkosprężyste (reologię) kory mózgowej, stosując oscylacje wieloczęstotliwościowe o niskiej amplitudzie (100 nm) podczas AFM złożone z fal sinusoidalnych o różnych częstotliwościach25.
	<ol>
		<li>Oblicz efektywny moduł zespolony g*(ƒ) w dziedzinie częstotliwości z krzywych wgłębienia siły jako: 
		g*(f) = [F(f) / h(f)] - ifb (5) 
		tutaj i jest jednostką urojoną, a F(f) i h(f) są częstotliwościami (f) widm siły i wcięcia. b jest poprawkami na opór lepkości na wsporniku uzyskany z oscylacji przyłożonych do powierzchni.</li>
		<li>Podziel g*(ƒ) na części rzeczywiste i urojone jako: 
		g*(ƒ) = g'(f) + ig''(f) (6) 
		em>g'(f) jest modułem sprężystości i jest miarą energii sprężystości zmagazynowanej i odzyskanej w każdym cyklu oscylacji. g''(f) jest modułem lepkości, który odpowiada za rozproszoną energię.</li>
		<li>Oblicz tangens straty, który zapewnia indeks zachowania materiału w stanie stałym (<1) lub cieczy (>1), jako: 
		g''(f) / g'(f) (7) 
		UWAGA: Przy tego typu pomiarze możliwe jest wyodrębnienie parametrów wskazujących na lepkość i elastyczność badanego materiału. Chociaż b nieznacznie zależy od odległości końca wspornika od powierzchni, biorąc pod uwagę bardzo niskie wartości g'' wykazywane przez komórkę żółtka (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 2D poniżej), niewielkie różnice w b mają znikomy wpływ na pomiary29.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Mikroreologia śledzenia cząstek
<ol>
	<li>Wykonać mikroiniekcję cząstek do komórki żółtka
	<ol>
		<li>Wykonaj dostosowane mikroigły za pomocą poziomego ściągacza do mikropipet i borokrzemianowego szkła kapilarnego (patrz Tabela materiałów).
		<ol>
			<li>Przygotuj mikroigły o średnicy zewnętrznej 1,00 mm, średnicy wewnętrznej 0,58 mm i długości 10 cm, korzystając z ustawień ściągacza: Ciśnienie: 500; Ciepło: 510; Uciąg: 65; Prędkość: 25; Czas: 50.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotuj płytkę Petriego do wstrzykiwań, tworząc proste pasy wgłębień w 1% agarozie w podłożu zarodkowym, używając niestandardowych form (patrz Tabela materiałów).
		<ol>
			<li>Odwróć foremki do góry nogami i umieść je na płynnym żelu agarozowym i usuń foremki, gdy żel zastygnie. Pipetować zarodki do rowków wykonanych przez pleśń w agarozie pod stereoskopowym mikroskopem preparacyjnym przy powiększeniu 1,2x. 
			UWAGA: Szerokość i konstrukcja form umożliwiają zarodkom samodzielne wyrównanie.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przed wstrzyknięciem należy prawie całkowicie usunąć podłoże, aby ułatwić wstrzyknięcie (napięcie powierzchniowe zapobiega przywieraniu zarodka/kosmówki do igły podczas wyjmowania jej po wstrzyknięciu).</li>
		<li>Mikroiniekcję nanocząstek fluorescencyjnych (promień a = 100 nm, patrz tabela materiałów) rozcieńczonych w wodzie (1:1000) w roślinną część komórki żółtka zarodka (<klasa silna = "xfig">Rysunek 3A).</li>
		<li>Wyreguluj mikropipetę za pomocą precyzyjnych mikromanipulatorów i wstrzyknij kulki za pomocą automatycznego mikrowtryskiwacza z regulatorem czasu i ciśnienia (patrz Tabela materiałów). Ustaw ciśnienie w zakresie od 10 do 20 psi.</li>
		<li>Przed wstrzyknięciem roztworu kulek należy skalibrować objętość do wstrzyknięcia (0,5 nL), mierząc wielkość kropli dostarczanej przez mikrowstrzykiwacz za pomocą mikrometru o wymiarach 1x 0,01 mm stage (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Zastosuj powiększenie 1,6x w stereoskopowym mikroskopie preparacyjnym, aby uwidocznić zarodki podczas wstrzyknięć, które są wykonywane w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oceń lepkosprężyste zachowanie żółtka, rejestrując wahania termiczne
	<ol>
		<li>Dekorionować zarodki, którym wstrzyknięto mikroimplanty, jak w kroku 2.1 i zanurzyć je w 0,5% agarozie o niskiej temperaturze topnienia w roztworze pożywki dla zarodków w temperaturze 30 °C. Następnie przenieść je na szklane płytki dolne (patrz Tabela Materiałów) i ustawić je w kierunku szkiełka nakrywkowego, gdy agaroza jest jeszcze płynna. 
		UWAGA: Gdy agaroza zestala się w temperaturze pokojowej, zarodki są gotowe do obrazowania.</li>
		<li>Zarodki osadzone w szklanych płytkach dolnych umieścić na stoliku konfokalnego mikroskopu odwróconego 2 godziny po mikroiniekcji. Rejestruj obrazy nanocząstek przez 26 s z częstotliwością próbkowania 25 Hz za pomocą obiektywu 63X w temperaturze pokojowej w odwróconym mikroskopie konfokalnym przy użyciu standardowego komercyjnego oprogramowania mikroskopowego (rozmiar piksela = 166 nm, obrazy rejestrowane co 40 ms).</li>
		<li>Oblicz położenie środków ciężkości cząstek i zdefiniuj ich trajektorie w czasie za pomocą wtyczki TrackMate oprogramowania ImageJ o otwartym kodzie źródłowym (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B).</li>
		<li>Oblicz dwuwymiarowe średnie przemieszczenie kwadratowe (MSD) każdej cząstki za pomocą specjalnego oprogramowania6,30 jako: 
		<Δr2 (τ)> = <[x(t + τ) - x(t)]2 + [y(t + τ) - y(t)]2> (8) 
		UWAGA: Tutaj t jest czasem, który upłynął, i upływem czasu. W czystej lepkiej cieczy MSD wzrasta odwrotnie proporcjonalnie do lepkości (ν) zgodnie z zależnością Stokesa-Einsteina: 
		<Δr2 (τ)> = 4kB Tτ/ 6πνa, (9) 
		gdzie T jest temperaturą bezwzględną.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hernandez-Vega, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+cortical+tension+drives+zebrafish+epiboly+movements%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Polarized cortical tension drives zebrafish epiboly movements.</a> EMBO J. 36, 25-41 (2017).</li>
<li>Brodland, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video+force+microscopy+reveals+the+mechanics+of+ventral+furrow+invagination+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Video force microscopy reveals the mechanics of ventral furrow invagination in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 22111-22116 (2010).</li>
<li>Grill, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+up+is+stressful%3A+biophysical+laws+of+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Growing up is stressful: biophysical laws of morphogenesis.</a> Curr Opin Genet Dev. 21, 647-652 (2011).</li>
<li>Krieg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensile+forces+govern+germ-layer+organization+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish.</a> Nat Cell Biol. 10, 429-436 (2008).</li>
<li>Koser, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensing+is+critical+for+axon+growth+in+the+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanosensing is critical for axon growth in the developing brain.</a> Nat Neurosci. 19, 1592-1598 (2016).</li>
<li>Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle-tracking+microrheology+of+living+cells%3A+principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Particle-tracking microrheology of living cells: principles and applications.</a> Annu Rev Biophys. 38, 301-326 (2009).</li>
<li>de Pablo, P. J., Carrión-Vázquez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Biological+Samples+with+Atomic+Force+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Imaging Biological Samples with Atomic Force Microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2014, 167-177 (2014).</li>
<li>Roca-Cusachs, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheology+of+passive+and+adhesion-activated+neutrophils+probed+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Rheology of passive and adhesion-activated neutrophils probed by atomic force microscopy.</a> Biophys J. 91, 3508-3518 (2006).</li>
<li>Evans, E., Yeung, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apparent+viscosity+and+cortical+tension+of+blood+granulocytes+determined+by+micropipet+aspiration%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Apparent viscosity and cortical tension of blood granulocytes determined by micropipet aspiration.</a> Biophys J. 56, 151-160 (1989).</li>
<li>Fabry, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+scale+and+other+invariants+of+integrative+mechanical+behavior+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+E+Stat+Nonlin+Soft+Matter+Phys%22%5BJournal%5D)">Time scale and other invariants of integrative mechanical behavior in living cells.</a> Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 68, 041914(2003).</li>
<li>Kashef, J., Franz, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+methods+for+analyzing+cell-cell+adhesion+in+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative methods for analyzing cell-cell adhesion in development.</a> Dev Biol. 401, 165-174 (2015).</li>
<li>Chevalier, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+micromechanical+properties+of+embryonic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Measuring the micromechanical properties of embryonic tissues.</a> Methods. 94, 120-128 (2016).</li>
<li>Reichlin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+native+coronary+artery+endothelium+in+situ+and+in+cell+culture+by+scanning+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Investigating native coronary artery endothelium in situ and in cell culture by scanning force microscopy.</a> J Struct Biol. 152, 52-63 (2005).</li>
<li>Rho, J. Y., Tsui, T. Y., Pharr, G. M. <a target="_blank" href="http://www.jbiomech.com/article/S0021-9290(98)80045-6/abstract">Elastic properties of osteon and trabecular bone measured by nanoindentation.</a> J Biomech. 31, 21(1998).</li>
<li>Grant, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+characterisation+and+biomechanical+analysis+of+the+sclera+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mech+Behav+Biomed+Mat%22%5BJournal%5D)">Surface characterisation and biomechanical analysis of the sclera by atomic force microscopy.</a> J Mech Behav Biomed Mat. 4, 535-540 (2011).</li>
<li>Efremov, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy+of+living+and+fixed+Xenopus+laevis+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy of living and fixed Xenopus laevis embryos.</a> Micron. 42, 840-852 (2011).</li>
<li>Henkels, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+Mechanical+Variation+Reveals+Critical+Role+for+Rho+Kinase+During+Primitive+Streak+Morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal Mechanical Variation Reveals Critical Role for Rho Kinase During Primitive Streak Morphogenesis.</a> Ann Biomed Eng. 41, 421-432 (2013).</li>
<li>Solnica-Krezel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrulation+in+zebrafish+--+all+just+about+adhesion%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Gastrulation in zebrafish -- all just about adhesion?</a> Curr Opin Genet Dev. 16, 433-441 (2006).</li>
<li>Kimmel, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Rohde, L. A., Heisenberg, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+gastrulation%3A+cell+movements%2C+signals%2C+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish gastrulation: cell movements, signals, and mechanisms.</a> Int Rev Cytol. 261, 159-192 (2007).</li>
<li>Campinho, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tension-oriented+cell+divisions+limit+anisotropic+tissue+tension+in+epithelial+spreading+during+zebrafish+epiboly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tension-oriented cell divisions limit anisotropic tissue tension in epithelial spreading during zebrafish epiboly.</a> Nat Cell Biol. 15, 1405-1414 (2013).</li>
<li>Fischer-Friedrich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+surface+tension+and+internal+pressure+generated+by+single+mitotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Quantification of surface tension and internal pressure generated by single mitotic cells.</a> Sci Rep. 4, 6213(2014).</li>
<li>Moeendarbary, E., Harris, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+mechanics%3A+principles%2C+practices%2C+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Syst+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Cell mechanics: principles, practices, and prospects.</a> Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 6, 371-388 (2014).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio)</a>. , University of Oregon Press. Eugene, OR. (2000).</li>
<li>Alcaraz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microrheology+of+human+lung+epithelial+cells+measured+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Microrheology of human lung epithelial cells measured by atomic force microscopy.</a> Biophys J. 84, 2071-2079 (2003).</li>
<li>Jorba, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+Micromechanical+Properties+of+the+Extracellular+Matrix+of+Soft+Tissues+by+Atomic+Force+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Probing Micromechanical Properties of the Extracellular Matrix of Soft Tissues by Atomic Force Microscopy.</a> J Cell Physiol. 232, 19-26 (2017).</li>
<li>Hutter, J. L., Bechhoefer, J. <a target="_blank" href="http://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.1143970">Calibration of atomic-force microscope tips.</a> Review of Scientific Instruments. 64, 1868-1873 (1993).</li>
<li>Lomakina, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheological+analysis+and+measurement+of+neutrophil+indentation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Rheological analysis and measurement of neutrophil indentation.</a> Biophys J. 87, 4246-4258 (2004).</li>
<li>Alcaraz, J., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/la0110850">Correction of Microrheological Measurements of Soft Samples with Atomic Force Microscopy for the Hydrodynamic Drag on the Cantilever.</a> Langmuir. 18, 716-721 (2002).</li>
<li>Daniels, B. R., Masi, B. C., Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+single-cell+micromechanics+in+vivo%3A+the+microrheology+of+C.+elegans+developing+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Probing single-cell micromechanics in vivo: the microrheology of C. elegans developing embryos.</a> Biophys J. 90, 4712-4719 (2006).</li>
<li>Kalwarczyk, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+viscosity+of+complex+liquids+and+cytoplasm+of+mammalian+cells+at+the+nanoscale%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of viscosity of complex liquids and cytoplasm of mammalian cells at the nanoscale.</a> Nano Lett. 11, 2157-2163 (2011).</li>
<li>Soroldoni, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+oscillations.+A+Doppler+effect+in+embryonic+pattern+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic oscillations. A Doppler effect in embryonic pattern formation.</a> Science. 345, 222-225 (2014).</li>
<li>He, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+constriction+drives+tissue-scale+hydrodynamic+flow+to+mediate+cell+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation.</a> Nature. 508, 392-396 (2014).</li>
<li>Johansen, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+micromanipulation+of+nanoparticles+and+cells+inside+living+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Optical micromanipulation of nanoparticles and cells inside living zebrafish.</a> Nat Commun. 7, 10974(2016).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych lub innych konfliktów interesów.

Tutaj pokazujemy, że właściwości materiałowe i niektóre parametry biomechaniczne komórki żółtka danio pręgowanego podczas epibolii można łatwo oszacować za pomocą AFM i mikroreologii nanocząstek.
Podczas gdy AFM został wykorzystany do odzyskania cech reologicznych komórek i tkanek w warunkach fizjologicznych 4,5,25,28, tutaj opracowaliśmy protokół stosowania AFM do nienaruszonych rozwijających się zarodków, który wykorzystaliśmy do zbadania powierzchni komóre...

Fizyczne zasady leżące u podstaw biomechanicznej kontroli procesów morfogenetycznych są w dużej mierze niezdefiniowane. Podczas gdy badania biomechaniczne na poziomie molekularnym i komórkowym nabierają znacznego rozpędu, badanie parametrów biomechanicznych na poziomie tkanki/organizmu jest w powijakach. Regresja hydrodynamiczna1 lub Video Force Microscopy2 pozwalają badaczom rozróżniać siły czynne i pasywne, podczas gdy mikrochirurgia laserowa3, czyli mniej inwazyjna mikroskopia sił atomowych (AFM) zdysocjowanych komórek4 lub in vivo5 lub mikroreologia nanocząstek6 pozwalają na przewidywanie właściwości mechanicznych i reakcji tkanki.
AFM to trójwymiarowa technika topograficzna o wysokiej rozdzielczości atomowej, rozwiązująca chropowatość powierzchni i podatność na ugięcie końcówek wsporników przy kontakcie z sondowaną powierzchnią7. Opracowano różne metodologie wykorzystujące AFM do badania właściwości powierzchni, w tym pomiaru tarcia, sił adhezji i właściwości lepkosprężystych różnych materiałów. Ostatnio AFM stał się potężnym narzędziem do pozyskiwania informacji o właściwościach mechanicznych próbek biologicznych. W szczególności AFM może nieinwazyjnie wyodrębnić złożony moduł ścinania z pojedynczych komórek, stosując wgłębienia oscylacyjne z mikrokońcówką przymocowaną do wspornika o znanej stałej zginania8. To pozwala nam wnioskować o wynikających z tego siłach. Jednak AFM nie jest wyjątkowy, a różne metodologie pozwalają na ekstrakcję danych reologicznych i właściwości mechanicznych z poszczególnych komórek (np. aspiracja mikropipet9, magnetyczna cytometria skręcająca (MTC)10 lub jednoosiowa próba rozciągania11).
Jednak zastosowanie tych nowatorskich metodologii do złożonych procesów morfogenetycznych nie jest proste. Głównymi wyzwaniami stojącymi przy określaniu właściwości mechanicznych tkanek embrionalnych są mały (μm do mm), miękki (w zakresie 102 - 104 Pa) i lepkosprężysty (powodujący zjawiska zależne od czasu) charakter materiału12. Dlatego ważne jest, aby dostosować metody stosowane do określania właściwości mechanicznych (sztywność, lepkość, adhezja) do konkretnego przypadku zarodków i rozwijających się organizmów. Analizując podejścia reologiczne do opracowywania badań, należy wziąć pod uwagę dwie ważne kwestie: unikanie natrętnych zakłóceń i zapewnienie łatwej dostępności. W tym scenariuszu aspiracja mikropipet, MTC i próba rozciągania wykazują ograniczenia. W pierwszym przypadku duża deformacja, której doznaje komórka, może zmienić jej właściwości fizjologiczne i mechaniczne9. W drugim przypadku potrzeba mocnego przylegania tkanki doświadczalnej do podłoża w celu zapewnienia, że przyłożone naprężenia deformują miejscowo cytoszkielet, może również mieć wpływ na stan aktywacji komórek, a tym samym na ich cechy mechaniczne10. Wreszcie, jednoosiowe podejścia do rozciągania są ograniczone przez geometrię rozwijających się organizmów i dostępność11.
AFM wydaje się być lepiej przystosowany do badania procesów rozwojowych, ponieważ pozwala na badanie próbek biologicznych bezpośrednio w ich naturalnym środowisku, bez konieczności kłopotliwego przygotowywania próbek. Ponadto, ponieważ dysocjacja tkanek embrionalnych jest na ogół trudna, zmniejszony rozmiar sond AFM zapewnia wysoki stopień wszechstronności bez ograniczeń w wyborze rodzaju podłoża (wodnego lub niewodnego), temperatury próbki lub składu chemicznego próbki. AFM jest na tyle wszechstronny, że można go stosować w dużych domenach i skalach czasowych i został wykorzystany do odzyskiwania właściwości materialnych tkanek w różnych stadiach rozwojowych lub warunkach fizjologicznych. Całe rodzime tkanki, takie jak tętnice13 lub bones14 zostały zbadane z topograficznego punktu widzenia, a w niektórych przypadkach, takich jak twardówka, uzyskano również właściwości mechaniczne15. Topografia została również zbadana w żywych zarodkach, co pozwoliło na wizualizację np. rearanżacji komórek podczas morfogenezy w Xenopus16. Wreszcie, opracowano kompleksowe protokoły przygotowania próbek w celu określenia parametrów mechanicznych podczas różnych procesów rozwojowych. Mapy nanowgłębień zostały wygenerowane na natywnych nieutrwalonych skrawkach tkanek dla embrionalnego przewodu pokarmowego pisklącia11; Właściwości adhezyjne i mechaniczne uzyskane dla poszczególnych komórek progenitorowych ektodermy, mezodermy i endodermy wyizolowanych z zarodków zebry danio pręgowanego<klasa SUP="xref">4; Pomiary sztywności wykonane dla epiblastu i prymitywnej smugi na eksplantatach z ptasich zarodków17; oraz wyraźny wzór gradientów sztywności bezpośrednio zdefiniowany w embrionalnym mózgu Xenopus5.
Znaczący skok jakościowy dla zastosowania AFM do badania rozwoju embrionalnego może wynikać z podejścia do prostych, dostępnych procesów morfogenetycznych. Epibolia danio pręgowanego jest istotnym i konserwatywnym wydarzeniem, w którym różne tkanki koordynują się w ograniczonej sferycznej przestrzeni, aby skierować ekspansję blastodermy w ciągu kilku godzin. Na początku epibolii danio pręgowanego (stadium kuliste) powierzchowna warstwa komórek, warstwa otaczająca (EVL), pokrywa półkulistą czapeczkę blastomerów wyśrodkowaną na zwierzęcym biegunie zarodka osadzonego na masywnej komórce syncytialnej żółtka. Epibolia składa się z korowej ekspansji roślinnej EVL, głębokich komórek (DC) blastodermy i zewnętrznej warstwy syncytialnej komórki żółtkowej (E-YSL) wokół żółtka. Epibolia kończy się zamknięciem EVL i DC na biegunie roślinnym18,19,20. Nie jest jeszcze jasne, w jaki sposób i gdzie siły są generowane podczas epibolii oraz jak są one globalnie sprzężone1,21.
Tutaj szczegółowo opisujemy, jak zastosować AFM do wnioskowania o pasywnych właściwościach mechanicznych tkanek podczas progresji epibolii w komórce żółtka danio pręgowanego in vivo. W tym celu wykorzystaliśmy małe mikrosfery przymocowane do wsporników AFM jako sondy. Pozwala to na uzyskanie precyzyjnych informacji lokalnych na niejednorodnej powierzchni komórki żółtka oraz badanie gradientów napięcia i ich dynamiki w czasie. Alternatywne podejścia AFM, takie jak te wykorzystujące wsporniki klinowe22, nie renderują wystarczająco precyzyjnych danych lokalnych. Technika klinowa, która wymaga bardzo ostrożnych umiejętności manipulacyjnych w celu sklejenia klina większego niż rozmiar próbki na końcu wspornika, nie nadaje się dobrze do sondowania mechaniki zarodka (~ 2 razy większego niż długość wspornika).
Modelowanie i charakteryzowanie właściwości lepkosprężystych komórek w sposób jakościowy i ilościowy pozwala na lepsze zrozumienie ich biomechaniki. Z biomechanicznego punktu widzenia niezbędne jest zrozumienie epibolii, a nie tylko wymaganie wiedzy na temat pomiarów i dynamiki napięcia korowego, które można uzyskać za pomocą AFM; W związku z tym potrzebne są informacje na temat właściwości biofizycznych tkanki. Aby wydobyć te informacje, na przestrzeni lat opracowano różne techniki reologii komórkowej w celu scharakteryzowania różnych typów komórek w różnych warunkach fizjologicznych23. Należą do nich AFM, MTC i pęseta optyczna (OT). Metody te okazały się jednak nieodpowiednie do analiz mezoskopowych w skali zarodków lub narządów. Jako alternatywę, z powodzeniem dostosowaliśmy mikroreologię śledzenia nanocząstek6 do pomiarów reologicznych in vivo. Technika ta analizuje przemieszczenia Browna poszczególnych cząstek i wnioskuje o lokalnych właściwościach mikromechanicznych.
Razem AFM i mikroreologia nanocząstek pozwalają na określenie dynamiki napięcia korowego i wewnętrznych właściwości mechanicznych żółtka podczas epibolii. Informacje te w pełni potwierdzają model, w którym stres anizotropowy rozwija się w wyniku różnic w odpowiedzi na deformację EVL i warstwy cytoplazmatycznej żółtka (YCL) na izotropowy skurcz aktomiozyny kory E-YSL jest niezbędny dla kierunkowego ruchu netto EVL i progresji epibolii1.

<table><tbody><tr><td>Odwrócony mikroskop optyczny</td><td>Nikon</td><td>TE2000</td><td>Wizualizacja próbki i wspornika AFM</td></tr><tr><td>Mikroskop sił atomowych (AFM)</td> <td>Wykonany na zamówienie</td> <td>-</td> <td>można zastosować dowolny skomercjalizowany AFM</td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop konfokalny</td><td>Zeiss</td><td>LSM780</td><td>Zbieranie danych nanorheologicznych</td></tr><tr><td>Agaroza D1 Low EEO</td><td>Conda</td><td>8016.00</td><td>Odlewanie zarodków</td></tr><tr><td>Ultraczysta agaroza LMP (niskotopliwa)</td><td>Invitrogen</td><td>16520-100</td><td>Zabezpieczanie zarodków</td></tr><tr><td>Formy do mikroiniekcji i transplantacji danio pręgowanego</td><td>Świat Instrumenty precyzyjne</td><td>Z-MOLDS</td><td>Odlewanie zarodków. Wykonane na zamówienie z oryginalnymi wymiarami można również zastosować</td></tr><tr><td>kleszcze Dumont 5 FST</td><td></td><td>11251-20</td><td>o średnicy 1,5 mm</td></tr><tr><td>Si3N4 wspornik</td><td>Novascan</td><td>PT. GS</td><td>Pomiar zarodka za pomocą AFM. Końcówka kulista: 4,5 i mikro; m średnicy i k=0,01 N / m</td></tr><tr><td>Nanocząstki fluorescencyjne</td><td>Life</td><td>Technologies FluoSpheres F8811,</td> <td>Do śledzenia nanorheologii</td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-2000</td><td>Wytwarzanie szytych na miarę mikroigieł</td></tr><tr><td>Borokrzemianowe szkło kapilarne</td><td>Warner</td><td>Instruments G100TF-4</td><td>Wytwarzanie mikroigieł na zamówienie</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MN-153</td><td>Manipulowanie mikropipetą</td></tr><tr><td>Mikrowtryskiwacz</td><td>Eppendorf</td><td>FemtoJet Express</td><td>Kontrolowanie czasu i ciśnienia iniekcji</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>DFC365FX</td><td>Wizualizacja zarodków podczas iniekcji</td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td><td>analityczne MathWorks</td><td>Matlab</td><td>Analiza AFM i danych śledzenia cząstek</td></tr><tr><td>Zebra</td><td>AB i TL dziki typ</td><td>- </td><td>Szczepy stosowane do pobierania zarodków</td></tr><tr><td>Szklane płytki dolne</td><td>Mat Tek</td><td>P35G-0.170-14-C</td><td>Montaż zarodków do zbierania danych nanorheologicznych</td></tr><tr><td>Mikrometr stopniowy</td><td>FST</td><td>29025-02</td><td>Pomiar objętości iniekcji</td></tr></tbody></table>

afm i mikroreologia w komórkach żółtka zarodka danio pręgowanego

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

Wyjaśnienie czynników, które kierują czasoprzestrzenną organizacją ewoluujących tkanek, jest jednym z głównych celów badań nad rozwojem. Różne twierdzenia twierdzą, że wniosły ważny wkład w zrozumienie właściwości mechanicznych komórek i tkanek w ich organizacji czasoprzestrzennej w różnych procesach rozwojowych i morfogenetycznych. Jednak ze względu na brak wiarygodnych i dostępnych narzędzi do pomiaru właściwości materiałów i parametrów rozciągania in vivo, walidacja tych hipotez była trudna. W tym artykule przedstawiono metody wykorzystujące mikroskopię sił atomowych (AFM) i śledzenie cząstek w celu ilościowego określenia właściwości mechanicznych nienaruszonej komórki żółtka zarodka danio pręgowanego podczas epibolii. Epibolia jest wczesnym, konserwatywnym procesem rozwojowym, którego badanie jest ułatwione dzięki przezroczystości zarodka. Metody te są proste do wdrożenia, niezawodne i szeroko stosowane, ponieważ przezwyciężają natrętne interwencje, które mogą wpływać na mechanikę tkanek. Zastosowano prostą strategię montażu próbek, rejestracji AFM oraz wstrzykiwania i śledzenia nanocząstek. Takie podejście sprawia, że metody te można łatwo dostosować do innych okresów rozwoju lub organizmów.

Pomiary napięcia kory 
Dla każdego punktu pomiarowego za pomocą AFM zarejestrowano pięć krzywych siła-przemieszczenie (F-z), przykładając do dźwigni wymuszenie o częstotliwości 1 Hz i amplitudzie szczyt-szczyt 5 µm (prędkość = 10 µm/s) aż do maksymalnego wciśnięcia wynoszącego ~2 µm. Procedura ta trwała mniej niż 20 min i nie była wpływana przez postęp epiboli. Każdy warunek eksperymentalny przetestowano na co najmniej 5 embrionach.
<p class="jove_content" fo:keep-...

Brak narzędzi do pomiaru właściwości materiału i parametrów rozciągania in vivo uniemożliwia walidację ich ról podczas rozwoju. Zastosowaliśmy mikroskopię sił atomowych (AFM) i śledzenie nanocząstek, aby określić ilościowo cechy mechaniczne nienaruszonej komórki żółtka zarodka danio pręgowanego podczas epibolii. Metody te są niezawodne i mają szerokie zastosowanie, unikając inwazyjnych interwencji.

AFM i mikroreologia w komórkach żółtka zarodka danio pręgowanego

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Ogólnym celem tych procedur jest dostosowanie konkretnych metod wyznaczania właściwości mechanicznych, takich jak sztywność, lepkość i adhezja, do specyfiki zarodków i rozwijających się organizmów. Metody wprowadzone w niniejszej pracy pozwalają odpowiedzieć na pytania z zakresu mechanobiologii, na przykład w kwestii tego, jak właściwości te mogą reagować na bodźce genetyczne lub fizyczne podczas rozwoju lub na zaburzenia w regulacji aktywności komórkowej. Wieloma zaletami tej techniki jest to, że umożliwia ona uzyskanie kluczowych informacji przy minimalnej manipulacji, co pozwala na rozstrzygnięcie kwestii niemożliwych do zbadania za pomocą innych procedur.Metody te pozwalają zrozumieć rolę komórki żółtka, a następnie mogą one zostać zastosowane w różnych obszarach zarodka, w różnych stadiach rozwoju, a nawet u innych organizmów modelowych. Wizualna demonstracja tych metod jest kluczowa, ponieważ montaż i manipulacja zarodkami są trudne do opanowania. Na początek należy zebrać zarodki Danio przebrany i hodować je w temperaturze 28 °C w podłożu E3 dla zarodków.Określ stadium rozwoju embrionów na podstawie ich morfologii. Ręcznie usuń otoczki (dekurionacja) z embrionów ryby danio w

afm-and-microrheology-in-the-zebrafish-embryo-yolk-cell

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Mikroiniekcja jest uznaną i skuteczną metodą wprowadzania obcych substancji do zapłodnionych embrionów danio pręgowanego. W niniejszej pracy prezentujemy niezawodną technikę mikroiniekcji służącą do przeprowadzania badań nad nadekspresją mRNA oraz wyciszaniem genów za pomocą morfolino oligonukleotydów u danio pręgowanego.

Mikroiniekcja mRNA i morfolinoowych oligonukleotydów antysensownych w embriony ryb danio pręgowanych.

W tym filmie demonstrujemy metodę analizy rozwijającego się mózgu kręgowca w żywych embrionach danio pręgowanego z rozdzielczością pojedynczej komórki przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Obejmuje ona sposób, w jaki wstrzykujemy substancje do embrionu danio pręgowanego w stadium jednej komórki, a następnie montujemy i obrazujemy rozwijający się mózg.

Obrazowanie na żywo embrionalnego mózgu rybki zebrafish przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Ten film opisuje technikę mikroiniekcji zarodka w celu dostarczenia związków do woreczka z żółtkiem danio pręgowanego.

Mikroiniekcja zarodka: technika dostarczania związku do żółtka danio pręgowanego

Procesy rozwojowe, takie jak proliferacja, wzorzec, różnicowanie i prowadzenie aksonów, mogą być łatwo modelowane w rdzeniu kręgowym drobnicy danio pręgowanego.  W tym artykule opisujemy procedurę montowania zarodków danio pręgowanego, która optymalizuje wizualizację tych zdarzeń.

Rozwarstwienie i boczne dopasowanie zarodków danio pręgowanego: analiza rozwoju rdzenia kręgowego

Obrazowanie dynamicznego zachowania organelli i innych struktur subkomórkowych in vivo może rzucić światło na ich funkcję w warunkach fizjologicznych i chorobowych. W tym artykule przedstawiono metody genetycznego znakowania dwóch organelli, centrosomów i mitochondriów oraz obrazowania ich dynamiki w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii szerokokątnej i konfokalnej.

Obrazowanie struktur subkomórkowych w żywym zarodku danio pręgowanego

Mitoza jest niezbędna dla każdego żywego organizmu, a defekty często prowadzą do raka i zaburzeń rozwojowych. Korzystając z tego protokołu obrazowania i danio pręgowanego jako systemu modelowego, naukowcy mogą wizualizować mitozę w żywym organizmie kręgowców i mnogość defektów, które powstają, gdy procesy mitotyczne są wadliwe.

Obserwacja podziału i dynamiki mitotycznej w żywym zarodku danio pręgowanego

Rozwój rzęsek jest niezbędny do prawidłowego organogenezy. Protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodę oznaczania i wizualizacji komórek rzęskowych danio pręgowanego.

Wizualizacja wielorzęskowych komórek u danio pręgowanego za pomocą połączonego protokołu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ i immunofluorescencji całej góry

Ten protokół opisuje podejście do etykietowania in toto i wielowymiarowego obrazowania wczesnego rozwoju oczu danio pręgowanego. Opisujemy znakowanie, osadzanie i obrazowanie czterowymiarowe (4D) za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej oraz rozważania dotyczące optymalizacji pozyskiwania zestawów danych do analizy mechanizmów morfogenezy panewki wzrokowej.

4-wymiarowe obrazowanie morfogenezy kubka wzrokowego danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół do badania wewnątrzkomórkowych właściwości mechanicznych izolowanych embrionalnych komórek zebrytanicznego danio pręgowanego w trójwymiarowym zamknięciu z bezpośrednim pomiarem siły przez pułapkę optyczną.

Bezpośrednie pomiary siły mechaniki subkomórkowej w zamknięciu za pomocą pęsety optycznej

Pokazujemy metodę, która wykorzystuje szybką skaningową mikroskopię konfokalną do wykonywania na żywo obrazowania komórek mikrogleju w rozwijającym się tektum wzrokowym danio pręgowanego, umożliwiając analizę dynamiki tych komórek in vivo.

Obrazowanie na żywo i charakterystyka dynamiki mikrogleju w zarodku danio pręgowanego

Opisano strategię przygotowania próbki do obrazowania wczesnych zarodków danio pręgowanego w nienaruszonym kosmówce za pomocą mikroskopu z arkuszami świetlnymi. Analizuje różne orientacje, jakie zarodki nabywają w kosmówce na 70% etapie epibolii i pąków, a także szczegółowo opisuje strategie obrazowania w celu uzyskania rozdzielczości w skali komórkowej w całym zarodku przy użyciu systemu arkuszy świetlnych.

Obrazowanie w mikroskopii świetlnej i strategie montażu wczesnych zarodków danio pręgowanego

Odkryj metody pomiaru właściwości mechanicznych komórek żółtka zarodka Danio rerio za pomocą mikroskopii sił atomowych i mikroreologii. Techniki te pozwalają badać mechanobiologię rozwoju z minimalną manipulacją.

AFM i mikroreologia w komórkach żółtka zarodka danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów