Name: Obrazowanie w superrozdzielczości zubożenia stanu podstawowego w komórkach ssaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-05T08:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Poznaj mikroskopię GSD do wizualizacji białek błonowych w komórkach ssaków. Ta metoda superrozdzielczości obchodzi limit dyfrakcji, zapewniając dziesięciokrotnie lepszą rozdzielczość niż konwencjonalna mikroskopia fluorescencyjna.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta grantem od AHA dla R.E.D. (15SDG25560035). Autorzy pragną podziękować dr Fernando Santanie za użycie mikroskopu 3D Leica SR GSD oraz dr Johannesowi Hell za uprzejme dostarczenie przeciwciała FP1.

<ol><li>Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+microscopy+reveals+that+synaptotagmin+remains+clustered+after+synaptic+vesicle+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis.</a> Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).</li>
<li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+structured-illumination+microscopy%3A+wide-field+fluorescence+imaging+with+theoretically+unlimited+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13081-13086 (2005).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Hell, S. W., Kroug, M. <a target="_blank" href="http://www3.mpibpc.mpg.de/groups/hell/publications/pdf/Appl._Phys._B._60_495_497.pdf">Ground-state-depletion fluorscence microscopy: A concept for breaking the diffraction resolution limit.</a> JAppl Phys B. 60 (5), 495-497 (1995).</li>
<li>Bretschneider, S., Eggeling, C., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+diffraction+barrier+in+fluorescence+microscopy+by+optical+shelving%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Breaking the diffraction barrier in fluorescence microscopy by optical shelving.</a> Phys Rev Lett. 98 (21), 218103(2007).</li>
<li>Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+transcriptional+profiling+of+adult+mouse+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes.</a> J Vis Exp. (58), e3302(2011).</li>
<li>Davare, M. A., Horne, M. C., Hell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+phosphatase+2A+is+associated+with+class+C+L-type+calcium+channels+%28Cav1.2%29+and+antagonizes+channel+phosphorylation+by+cAMP-dependent+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein phosphatase 2A is associated with class C L-type calcium channels (Cav1.2) and antagonizes channel phosphorylation by cAMP-dependent protein kinase.</a> J Biol Chem. 275 (50), 39710-39717 (2000).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li>
<li>Chozinski, T. J., Gagnon, L. A., Vaughan, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twinkle%2C+twinkle+little+star%3A+photoswitchable+fluorophores+for+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Twinkle, twinkle little star: photoswitchable fluorophores for super-resolution imaging.</a> FEBS Lett. 588 (19), 3603-3612 (2014).</li>
<li>Dempsey, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja904588g">Photoswitching mechanism of cyanine dyes.</a> J Am Chem Soc. 131 (51), 18192-18193 (2009).</li>
<li>Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., van den Broek, B., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+Imaging+Conditions+for+Demanding+Multi-Color+Super+Resolution+Localization+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimizing Imaging Conditions for Demanding Multi-Color Super Resolution Localization Microscopy.</a> PLoS One. 11 (7), e0158884(2016).</li>
<li>Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ThunderSTORM%3A+a+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).</li>
<li>Veeraraghavan, R., Gourdie, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+optical+reconstruction+microscopy-based+relative+localization+analysis+%28STORM-RLA%29+for+quantitative+nanoscale+assessment+of+spatial+protein+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Stochastic optical reconstruction microscopy-based relative localization analysis (STORM-RLA) for quantitative nanoscale assessment of spatial protein organization.</a> Mol Biol Cell. 27 (22), 3583-3590 (2016).</li>
<li>Ries, J., Kaplan, C., Platonova, E., Eghlidi, H., Ewers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+versatile+method+for+GFP-based+super-resolution+microscopy+via+nanobodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple, versatile method for GFP-based super-resolution microscopy via nanobodies.</a> Nat Methods. 9 (6), 582-584 (2012).</li>
<li>Dixon, R. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4360655/">Graded Ca2+/calmodulin-dependent coupling of voltage-gated CaV1.2 channels.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat Methods. 8 (7), 527-528 (2011).</li>
<li>Nan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+superresolution+imaging+allows+quantitative+analysis+of+RAF+multimer+formation+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18519-18524 (2013).</li>
<li>Fricke, F., Beaudouin, J., Eils, R., Heilemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One%2C+two+or+three%3F+Probing+the+stoichiometry+of+membrane+proteins+by+single-molecule+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">One, two or three? Probing the stoichiometry of membrane proteins by single-molecule localization microscopy.</a> Sci Rep. 5, 14072(2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych sprzecznych interesów, które mogliby ujawnić.

Niedawna eksplozja technologii, które umożliwiają obrazowanie poza granicą dyfrakcji, stworzyła nowe możliwości wglądu w złożoność sygnalizacji komórkowej ssaków w przestrzeni i czasie. Technologie te obejmują STORM, STED, PALM, GSD, SIM i ich warianty (np. dSTORM, FPALM). Pomysłowość naukowców stojących za tymi technikami pozwoliła nam obejść ograniczenia narzucone przez prawa fizyki rządzące dyfrakcją światła. Pomimo tego ogromnego osiągnięcia, każda z tych technik idzie na pewien kompromis, aby osiągnąć super...

Reakcje sygnalizacji komórkowej przekształcają zmieniające się środowisko wewnętrzne i zewnętrzne, aby zainicjować odpowiedź komórkową. Regulują wszystkie aspekty fizjologii człowieka, służąc jako podstawa uwalniania hormonów i neuroprzekaźników, bicia serca, widzenia, zapłodnienia i funkcji poznawczych. Zakłócenie tych kaskad sygnałowych może mieć poważne konsekwencje w postaci stanów patofizjologicznych, w tym raka, choroby Parkinsona i Alzheimera. Przez dziesięciolecia badacze biologiczni i medyczni z powodzeniem wykorzystywali białka fluorescencyjne, sondy i bioczujniki w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną jako podstawowe narzędzia do zrozumienia precyzyjnej organizacji przestrzennej i czasowej tych sygnałów komórkowych.
Mocnymi stronami technik optycznych, takich jak mikroskopia epifluorescencyjna, konfokalna czy mikroskopia z pełnym wewnętrznym odbiciem (TIRF), są ich czułość, szybkość i kompatybilność z obrazowaniem żywych komórek, podczas gdy głównym ograniczeniem jest ich rozdzielczość ograniczona dyfrakcją, co oznacza, że struktury lub kompleksy białkowe mniejsze niż 200-250 nm nie mogą być rozwiązane. Wraz z teoretycznym i praktycznym rozwojem deterministycznej superrozdzielczości (np. mikroskopia wymuszonej emisji zubożenia (STED1), strukturalnej mikroskopii oświetleniowej (SIM2) lub stochastycznej superrozdzielczości (np. fotoaktywowana mikroskopia lokalizacyjna (PALM3) lub zubożenia stanu podstawowego (GSD4,5)), rozdzielczość boczna i osiowa w mikroskopii fluorescencyjnej została rozszerzona poza barierę dyfrakcyjną, do rzędu kilkudziesięciu nanometrów. W ten sposób badacze mają teraz niezrównaną zdolność do wizualizacji i zrozumienia, w jaki sposób dynamika i organizacja białek przekłada się na funkcjonowanie na poziomie zbliżonym do molekularnego.
Mikroskopia zubożenia stanu podstawowego, po której następuje powrót pojedynczej cząsteczki (GSDIM), lub po prostu GSD, jak jest znana, omija limit dyfrakcji, zmniejszając liczbę jednocześnie emitujących fluorofory4,5. Wysokoenergetyczne światło laserowe jest używane do wzbudzania próbki znakowanej fluoroforem, bombardując elektrony fotonami i zwiększając prawdopodobieństwo, że przejdą one "odwrócenie spinu" i wejdą w stan potrójny lub "ciemny" ze stanu wzbudzonego4. To skutecznie wyczerpuje stan podstawowy, stąd nazwa "zubożenie stanu podstawowego". W stanie trypletowym fluorofory nie emitują fotonów, a próbka wydaje się ciemniejsza. Jednak te fluorofory stochastycznie wracają do stanu podstawowego i mogą przejść przez kilka fotonów emitujących przejścia ze stanu wzbudzonego do podstawowego przed powrotem do stanu trypletowego. Przy mniejszej ilości fluoroforów emitowanych w danym momencie, wybuchy fotonów emitowane z poszczególnych fluoroforów stają się przestrzennie i czasowo odrębne od sąsiednich fluoroforów. Rozbłysk fotonów można dopasować do funkcji Gaussa, której obliczony środek ciężkości odpowiada położeniu fluoroforu z precyzją lokalizacji, która zależy od apertury numerycznej (NA) soczewki, długości fali światła używanej do wzbudzenia i, co najważniejsze, liczby fotonów emitowanych na fluorofor. Jednym z ograniczeń GSD jest to, że ponieważ tylko podzbiór fluoroforów aktywnie emituje w danym momencie, tysiące obrazów muszą zostać zebrane w ciągu kilku minut, aby zbudować kompletną mapę lokalizacji. Długi czas akwizycji w połączeniu z wysokim zapotrzebowaniem na moc lasera oznacza, że GSD lepiej nadaje się do próbek stacjonarnych niż na żywo.
Ten artykuł opisuje przygotowanie stałych próbek do obrazowania mikroskopowego w superrozdzielczości białek rezydujących w błonie i retikulum endoplazmatycznym (ER) (lista niezbędnych materiałów eksploatacyjnych i odczynników znajduje się w Tabeli Materiałów). Przedstawiono przykłady, w jaki sposób protokół ten można łatwo dostosować do ilościowego określenia wielkości i stopnia grupowania kanałów Ca2+ bramkowanych napięciem typu L (Cav1,2) w sarkolemmie miocytów serca lub wykorzystać do wizualizacji dystrybucji komórkowej ER. Zrozumienie rozmieszczenia i organizacji tych składników komórkowych jest niezwykle ważne dla zrozumienia inicjacji, translacji i ostatecznie funkcji wielu kaskad sygnalizacyjnych zależnych od Ca2 +. Na przykład kanały Cav1.2 są fundamentalnie ważne dla sprzężenia wzbudzenia-skurczu, podczas gdy uwalnianie Ca2 + za pośrednictwem receptora z ER jest prawdopodobnie najbardziej wszechobecną kaskadą sygnalizacyjną w komórkach ssaków.

<table><tbody><tr><td>KOH</td><td>Thermo Scientific</td><td>P250-500</td><td>Do czyszczenia szkła nakrywkowego</td></tr><tr><td>#1.5 szkło nakrywkowe 18 x 18 mm</td><td>Marienfeld Superior</td><td>0107032)</td><td>Do wzrostu/przetwarzania/obrazowania komórek</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>BP3994</td><td>Rozcieńczony do 1x wodą dejonizowaną</td></tr><tr><td>Poly-L-Lizyna</td><td>Sigma</td><td>P4832</td><td>Wspomaga adhezję komórek do pokrywania szklanej</td></tr><tr><td>lamininy</td><td>Sigma</td><td>114956-81-9</td><td>Wspomaga adhezję komórek do szkła pokryciowego</td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Thermo Scientific</td><td>11150-059</td><td>Pożywki do hodowli miocytów komorowych</td></tr><tr><td>DMEM 11995</td><td>Gibco</td><td>11995</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>10437028</td><td>Media suplement</td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>Media suplement</td></tr><tr><td>0,05% trypsyna-EDTA</td><td>Corning</td><td>25-052-CL</td><td>Roztwór do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Przejściowy odczynnik do transfekcji</td></tr><tr><td>bez Ca2+ PBS</td><td>Gibco</td><td>1419-144</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>100% metanolu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A414-4</td><td>Utrwalanie komórek</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Elektron Mikroskopia Sciences</td><td>15710</td><td>Utrwalanie komórek</td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SLBR6504V</td><td>Utrwalanie komórek</td></tr><tr><td>SEAblock</td><td>Thermo Scientific</td><td>37527</td><td>BSA lub inne alternatywne rozwiązanie blokujące</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Detergent do przepuszczalności komórek</td></tr><tr><td>Królik anty-CaV1.2 (FP1)</td><td>Prezent</td><td>N/A</td><td>Istnieją komercyjne przeciwciała anty-CaV1.2, takie jak Alomone Labs Rb anty-CaV1.2 (ACC-003)</td></tr> <tr><td>Mysz monoklonalna anty-RFP</td><td>Rockland Inc.</td><td>200-301-379</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 donket anty-królicze IgG (H+L)</td><td>Invitrogen (Thermo Scientific)</td><td>A31573</td><td>Przeciwciało drugorzędowe</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H+L)</td><td>Invitrogen (Thermo Scientific)</td><td>A11031</td><td>Przeciwciało drugorzędowe</td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td>Zapobiega rozwojowi drobnoustrojów w celu długotrwałego przechowywania próbek</td></tr><tr><td>Katalaza</td><td>Sigma</td><td>C40</td><td>Składnik bufora fotoprzełączającego</td></tr><tr><td>Oksydaza glukozowa</td><td>Sigma</td><td>G2133</td><td>Składnik buforowy fotoprzełączający</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td>Składnik buforowy fotoprzełączający</td></tr><tr><td>chlorowodorek beta-merkaptoetyloaminy</td><td>Fisher</td><td>BP2664100</td><td>Składnik buforowy fotoprzełączający</td></tr> <tr><td>i beta;-merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>63689</td><td>Składnik buforu fotoprzełączającego</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-3</td><td>Składnik buforowy fotoprzełączający</td></tr><tr><td>Dekstroza</td><td>Fisher</td><td>D14-212</td><td>Składnik buforowy fotoprzełączania</td></tr><tr><td>Szkiełka wgłębieniowe</td><td>Neolab</td><td>1 &ndash; 6293</td><td>Do montażu próbek</td></tr><tr><td>Twinsil</td><td>Picodent</td><td>13001000</td><td>Do uszczelniania szkła nakrywkowego</td></tr><tr><td>sec61&beta;- Plazmid mCherry</td><td>Addgene</td><td>49155</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop 3D Leica SR GSD</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór</td><td></td><td></td> bloku myjącego <td>20 % SEAblock w PBS</td></tr><tr><td>Pierwszorzędowy roztwór</td><td></td><td></td> do inkubacji przeciwciał <td>0,5 % Triton-X100, 20 % SEAblock, w PBS</td></tr><tr><td>Wtórny roztwór</td><td></td><td></td> <td>do inkubacji przeciwciał1:1000 w PBS</td></tr></tbody></table>

obrazowanie w superrozdzielczości zubożenia stanu podstawowego w komórkach ssaków

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Postępy w mikroskopii fluorescencyjnej i biologii komórki są ściśle ze sobą powiązane, a zwiększona zdolność do wizualizacji zdarzeń komórkowych często prowadzi do dramatycznych skoków w naszym zrozumieniu funkcjonowania komórek. Rozwój i dostępność mikroskopii superrozdzielczej znacznie rozszerzyły granice rozdzielczości optycznej z ~250-20 nm. Biolodzy nie są już ograniczeni do opisywania oddziaływań molekularnych w kategoriach kolokalizacji w ograniczonym obszarze dyfrakcji, ale teraz możliwe jest wizualizacja dynamicznych oddziaływań poszczególnych cząsteczek. W tym miejscu przedstawiamy protokół wizualizacji i kwantyfikacji białek komórkowych za pomocą mikroskopii zubożenia w stanie podstawowym do obrazowania komórek stałych. Podajemy przykłady z dwóch różnych białek błonowych, elementu translokonu retikulum endoplazmatycznego, sec61β i zlokalizowanego w błonie plazmatycznej, bramkowanego napięciem kanału Ca2 + typu L (CaV1.2). Omówiono konkretne parametry mikroskopu, metody fiksacji, formułę bufora foto-przełączającego oraz pułapki i wyzwania związane z przetwarzaniem obrazu.

Jak opisano we wstępie, istnieje wiele różnych modalności obrazowania mikroskopowego o nadrozdzielczości. Niniejszy protokół koncentruje się na obrazowaniu o nadrozdzielczości metodą GSD. Reprezentatywne obrazy oraz mapy lokalizacji przedstawiono na Rysunku 2 i Rysunku 3.
Rysunek 2 przedstawia komórkę COS-7 przetransfekowaną białkiem ER, mC...

Ten artykuł przedstawia protokół wykrywania jednego lub więcej białek plazmy i/lub błony wewnątrzkomórkowej za pomocą mikroskopii superrozdzielczej GSD (Ground State Depletion) w komórkach ssaków. W tym miejscu omawiamy korzyści i rozważania dotyczące stosowania takich podejść do wizualizacji i kwantyfikacji białek komórkowych.

Obrazowanie w superrozdzielczości zubożenia stanu podstawowego w komórkach ssaków

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Ogólnym celem tej techniki obrazowania fluorescencyjnego jest wizualizacja i kwantyfikacja białek komórkowych w utrwalonych komórkach z rozdzielczością poniżej limitu dyfrakcyjnego, przy użyciu formy mikroskopii super-rozdzielczej nazywanej mikroskopią z wygaszaniem stanu podstawowego i powrotem pojedynczych cząsteczek. Metoda ta pomaga odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii komórki i biofizyki błon, ponieważ pozwala ominąć limit rozdzielczości dyfrakcyjnej, co umożliwia badaczom dokładniejsze określenie, wizualizację i kwantyfikację rozkładu białek komórkowych. Główną zaletą tego protokołu jest możliwość uzyskania obrazów z około dziesięciokrotnie lepszą rozdzielczością w porównaniu do konwencjonalnych metod obrazowania fluorescencyjnego, takich jak mikroskopia konfokalna.Procedury zaprezentują Oscar Vivas, postdoc w moim laboratorium, oraz Karen Hannigan, postdoc w laboratorium Rose Dixon. Na początek należy przygotować szkiełka nakrywki i komórki zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole tekstowym. Następnie należy utrwalić próbki i przeprowadzić immunocytochemię w celu znakowania białek błony plazmatycznej i/lub białek błon wewnątrzkomórkowych, które są przedmiotem analizy.Następnie przygotuj roztwór Glocka do usuwania tlenu, dodając najpierw 12,5 µL roztworu zapasu katalazy, 3,5 mg oksydazy glukozowej oraz 0,5 µL 1 M Tris do 49,5 µL PBS w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Zamknij probówkę i krótko wymieszaj na wirówce typu vortex, aby rozpuścić składniki. Następnie odwiruj roztwór przez trzy minuty.Następnie przygotuj roztwór thial indukujący przełączanie fotochemiczne, rozpuszczając beta-merkaptoetylaminę w PBS do stężenia 100 mM i dostosowując pH do wartości 8.0. Rozlej roztwór thial na alikwoty i przechowuj w zamrażarce do jednego tygodnia. Bezpośrednio przed obrazowaniem wymieszaj thial oraz komponenty usuwające tlen z buforem solnym i przechowuj roztwór w lodzie.Używając 100 µl przygotowanego buforu do przełączania fotochemicznego, zamocuj szkiełka nakrywki zawierające barwione komórki na szkiełkach z wgłębieniem. Następnie uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywki klejem silikonowym, aby zapobiec szybkiej utleniając się buforu obrazowego. Przed rozpoczęciem obrazowania odczekaj kilka minut, aż klej silikonowy całkowicie utwardzieje.W przeciwnym razie szkiełko nakrywkowe będzie przesuwać się. Aby rozpocząć, należy wybrać odpowiedni laser do oświetlenia próbki, w zależności od wybranego fluoroforu. W przypadku fluoroforu Alexa 647 należy użyć lasera o długości fali 642 nanometrów.Następnie należy wybrać odpowiednią kostkę dichroiczną oraz obiektyw. Otwórz oprogramowanie do obrazowania. Wybierz tryb akwizycji 2D, a następnie ustaw czas ekspozycji na 11 milliseconds.Następnie ustaw wzmocnienie EM (EM Gain) na 300 i wybierz odpowiedni próg detekcji. Dalej, włącz Auto Event Control i ustaw liczbę zdarzeń na obraz (Events Per Images) na osiem. Wprowadź rozmiar piksela (Pixel Size) wynoszący 20 nanometers.W zakładce GSD Tools przejdź do opcji High Resolution Image Calculation i upewnij się, że wybrany jest tryb Histogram Mode. Aby obrazować białka w błonie plazmatycznej, wybierz tryb TIRF i zmień kąt padania, aby określić głębokość penetracji. Następnie ustaw intensywność lasera na 100%, aby wprowadzić elektrony w stan ciemny.Następnie wybierz Single Molecule Detection podczas pompowania i ustaw automatyczną akwizycję dla wartości korelacji klatek wynoszącej 0,20. W ustawieniach akwizycji ustaw intensywność lasera na 50% oraz liczbę klatek akwizycyjnych na 60 000. Następnie rozpocznij obrazowanie.Aby określić wielkość klastrów białkowych, otwórz w programie ImageJ plik obrazu mapy lokalizacji pojedynczych cząsteczek z histogramem o rozdzielczości 10 nanometrów. W menu Image przejdź do Adjust i wybierz opcję Auto, aby zoptymalizować jasność i kontrast obrazu. Następnie w menu Type wybierz 8-bit.Następnie otwórz menu Analyze, kliknij Set Scale i wprowadź pokazane tutaj wartości. Następnie w menu Analyze wybierz Set Measurements i zaznacz pole obok opcji Area. W menu Image wybierz Adjust, Threshold, a następnie wybierz Over/Under.Ustaw wartość maksymalną na 255, minimalną na 1 i kliknij Apply. Na koniec otwórz menu Analyze i wybierz Analyze Particles. Zaznacz opcje Pixel units, Display results oraz Summarize.Następnie ustaw rozmiar od czterech do nieskończoności, wybierz opcję Bare Outlines i kliknij OK. Komórka przedstawiona tutaj została przetransfekowana białkiem siateczki śródplazmatycznej, mCherry-Sec61 beta, a obrazowanie wykonano zarówno przy użyciu mikroskopii TIRF z ograniczeniem dyfrakcyjnym, jak i mikroskopii super-rozdzielczej GSD w trybie TIRF. Krzywe te reprezentują średnicę cewek ER. Obraz po prawej stronie wykazuje poprawę rozdzielczości bocznej i stanowi dokładniejszą reprezentację struktury cewek ER.Poprawa rozdzielczości oferowana przez obrazowanie super-rozdzielcze GSD jest dodatkowo zaprezentowana na tych obrazach, przedstawiających znakowany miocyt sercowy z przeciwciałem anty-CAV 1.2. Przy zastosowaniu trybu GSD poprawa rozdzielczości bocznej jest wyraźna, a oddzielne klastry kanałów są łatwiejsze do zidentyfikowania. Po opanowaniu techniki, protokół ten można zrealizować w czasie krótszym niż trzy dni.Obrazowanie nadrozdzielcze pojedynczej komórki trwa od 10 do 30 minut, w zależności od wymaganej liczby klatek. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak elektromikroskopia, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. o to, jak interesujące białko fluorescencyjne oddziałuje ze złożonym środowiskiem komórkowym. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak przygotować, pozyskać i analizować próbki w celu wizualizacji jednego lub większej liczby białek komórkowych w mikroskopii nadrozdzielczej z wykorzystaniem deplekcji stanu podstawowego z następującym po niej powrotem pojedynczych cząsteczek.

ground-state-depletion-super-resolution-imaging-in-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy metodę obrazowania w super-rozdzielczości, aby zbadać strukturalną organizację bakteryjnego pierścienia FtsZ, niezbędnego aparatu do podziału komórek.  Metoda ta opiera się na analizach ilościowych obrazów z mikroskopii lokalizacji aktywowanej fotoaktywowaną (PALM) i może być stosowana do innych bakteryjnych białek cytoszkieletu.

Obrazowanie w superrozdzielczości maszynerii podziału bakteryjnego

Czasoprzestrzenne informacje o dynamicznych białkach wewnątrz żywych komórek są kluczowe dla zrozumienia biologii. Rodzaj mikroskopii superrozdzielczej, zwany szybką mikroskopią oświetlenia strukturalnego 3D (f3D-SIM), ujawnia unikalne informacje na temat cytokinetycznego pierścienia Z u bakterii: zarówno jego wygląd podobny do koralików, jak i szybką dynamikę FtsZ w pierścieniu.

Obrazowanie cytokinetycznego pierścienia Z w superrozdzielczości u żywych bakterii przy użyciu szybkiej mikroskopii oświetlenia strukturalnego 3D (f3D-SIM)

Opisujemy tutaj połączenie techniki tworzenia synaps immunologicznych z wykorzystaniem dwuwarstwowego lipidu na wspartym szkłem z techniką obrazowania w superrozdzielczości mikroskopii STED (Stimulated emission depletion). Celem tego protokołu jest dostarczenie użytkownikom instrukcji niezbędnych do pomyślnego przeprowadzenia tych dwóch technik.

Obrazowanie w superrozdzielczości synapsy immunologicznej komórek NK na płaskiej dwuwarstwie lipidowej na podłożu szklanym

PI(4,5)P2 reguluje różne funkcje komórkowe, ale jego nanoskalowa organizacja w błonie komórkowej jest słabo poznana. Znakując PI(4,5)P2 dwukolorową sondą fluorescencyjną połączoną z domeną homologii Pleckstrin, opisujemy nowatorskie podejście do badania rozkładu przestrzennego PI(4,5)P2 w błonie plazmatycznej w skali nanometrowej.

Obrazowanie pojedynczej cząsteczki w superrozdzielczości 4,5-bisfosforanu fosfatydyloinozytolu w błonie plazmatycznej za pomocą nowatorskich sond fluorescencyjnych

Konwencjonalne koniugaty BODIPY mogą być używane do mikroskopii lokalizacji pojedynczych cząsteczek żywych komórek (SMLM) poprzez wykorzystanie ich przejściowo tworzących, przesuniętych ku czerwieni dimerów stanu podstawowego. Przedstawiamy zoptymalizowany protokół SMLM do śledzenia i rozpoznawania subkomórkowych obojętnych lipidów i kwasów tłuszczowych w żywych komórkach ssaków i drożdży w nanoskopowej skali długości.

Konwencjonalne koniugaty BODIPY do mikroskopii superrozdzielczej żywych komórek i śledzenia pojedynczych cząsteczek

Prezentowany tutaj jest protokół do obrazowania żywych komórek w nienaruszonej tkance w superrozdzielczości. Ustandaryzowaliśmy warunki obrazowania bardzo wrażliwej populacji dorosłych komórek macierzystych w ich natywnym środowisku tkankowym. Technika ta polega na zrównoważeniu rozdzielczości czasowej i przestrzennej, aby umożliwić bezpośrednią obserwację zjawisk biologicznych w żywej tkance.

Obrazowanie żywych komórek w superrozdzielczości struktur subkomórkowych

Błona podstawna jest niezbędna do morfogenezy tkanek i narządów podczas rozwoju. Aby lepiej zrozumieć mechanizmy prowadzące do prawidłowego umiejscowienia tej struktury, w przedstawionym protokole opisano metody wizualizacji i charakterystyki wewnątrzkomórkowego transportu i wydzielania białek błony podstawnej w komórkach nabłonka za pomocą mikroskopii konfokalnej i superrozdzielczej.

Obrazowanie konfokalne i superrozdzielcze spolaryzowanego transportu wewnątrzkomórkowego i wydzielania białek błony podstawnej podczas oogenezy Drosophila

Mikroskopia superrozdzielcza może dostarczyć szczegółowych informacji na temat organizacji komponentów w kompleksie synaptonemalnym w mejozie. Tutaj demonstrujemy protokół rozwiązywania poszczególnych białek kompleksu synaptonemalnego Caenorhabditis elegans.

Mikroskopia superrozdzielcza kompleksu synaptonemalnego w obrębie linii zarodkowej Caenorhabditis elegans

Ten artykuł zawiera prosty i przejrzysty protokół oznaczania efektorów wydzielanych przez Salmonellę za pomocą rozszerzenia kodu genetycznego (GCE) specyficznie dla miejsca i obrazowania subkomórkowej lokalizacji wydzielanych białek w komórkach HeLa za pomocą bezpośredniej stochastycznej mikroskopii rekonstrukcji optycznej (dSTORM)...

Obrazowanie w superrozdzielczości białek wydzielanych przez bakterie za pomocą ekspansji kodu genetycznego

Protokół ten określa procedurę wykonywania głębokiej, całkomórkowej mikroskopii lokalizacyjnej pojedyncząsteczkowej (SMLM) za pomocą obrotowego mikroskopu konfokalnego z optycznym przesunięciem fotonów, co umożliwia obrazowanie DNA-PAINT bez potrzeby stosowania niestandardowej optyki czy złożonego oświetlenia.

Obrazowanie całokomórkowe superrozdzielczości za pomocą DNA-PAINT na obracającym się dysku konfokalnym z optycznym przekształceniem fotonów

Protokół ten opisuje zaawansowane zastosowania obrazowania oraz zarządzanie współzasobami systemu mikroskopu konfokalnego z laserowym skanowaniem zintegrowanym z multipleksowanym detektorem matrycowym do obrazowania komórkowego i subkomórkowego o wysokiej rozdzielczości. Workflow umożliwia obrazowanie multimodalne od konfokalnej do superrozdzielczości (~120 nm) na jednej platformie, czyniąc wizualizację w skali nanoskalowej bardziej dostępną.

Obrazowanie superrozdzielcze i zarządzanie współdzielone: Protokół do mikroskopii konfokalnej z detekcją multipleksową

Poznaj mikroskopię GSD do wizualizacji białek błonowych w komórkach ssaków. Ta metoda superrozdzielczości obchodzi limit dyfrakcji, zapewniając dziesięciokrotnie lepszą rozdzielczość niż konwencjonalna mikroskopia fluorescencyjna.

Obrazowanie w superrozdzielczości zubożenia stanu podstawowego w komórkach ssaków

Przeglądaj więcej filmów