Przygotowanie próbki do analizy endopeptydomicznej w ludzkim płynie mózgowo-rdzeniowym
4 grudnia 2017
Przedstawiono metodę analizy spektrometrycznej endogennych peptydów w ludzkim płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF). Dzięki zastosowaniu filtracji odcięcia masy cząsteczkowej, wstępnego frakcjonowania chromatograficznego, analizy spektrometrii mas i późniejszej kombinacji strategii identyfikacji peptydów, możliwe było prawie dziesięciokrotne rozszerzenie znanego peptydomu płynu mózgowo-rdzeniowego w porównaniu z poprzednimi badaniami.
Celem tego protokołu jest przygotowanie i analiza próbek ludzkiego płynu mózgowo-rdzeniowego do analizy LC-MS endogennych peptydów. Etap wstępnego frakcjonowania peptydów przed LC-MS zwiększa liczbę zidentyfikowanych peptydów i umożliwia wykrycie peptydów CSF o stosunkowo niskiej liczebności. Peptydy endogenne w płynie mózgowo-rdzeniowym to cząsteczki wapnia, które nie zostały dokładnie zbadane i mogą potencjalnie zawierać ważne nowe biomarkery zaburzeń neurodegeneracyjnych. Metoda ta umożliwia obszerną charakterystykę peptydomu płynu mózgowo-rdzeniowego za pomocą spektrometrii mas. Głównymi zaletami tej metody jest to, że umożliwia wstrzykiwanie peptydów CSF o niskiej obfitości i jest kompatybilna z technikami znakowania izobarycznego multipleksowego, dzięki czemu ma zastosowanie w badaniach klinicznych. Do tej pory stosowaliśmy tę metodę głównie do analizy płynu mózgowo-rdzeniowego. Mamy jednak wstępne dane wskazujące, że przy niewielkich modyfikacjach może być również stosowany do analizy próbek osocza i tkanek. Rozpocznij od rozmrożenia 1,5 mililitra porcji płynu mózgowo-rdzeniowego w temperaturze pokojowej na mieszalniku rolkowym. Po rozmrożeniu przenieś zawartość do 10-mililitrowych tubek polipropylenowych. I dodaj 80 mikrolitrów jednego molowego TAB jako środek buforujący. Następnie dodaj 0,65 mililitra ośmiomolowego chlorowodorku guanidyny, aby rozpuścić agregaty białkowe i delikatnie wirować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie w 60 mikrolitrach 200 milimolowego wodnego roztworu TCEP i inkubować w temperaturze 55
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia metodę analizy spektrometrią mas endogennych peptydów w ludzkim płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF). Dzięki zastosowaniu filtracji z odcięciem masy cząsteczkowej, prefrakcjonowania chromatograficznego oraz analizy spektrometrycznej, badanie znacząco rozszerza znany peptidom CSF, usprawniając identyfikację niskostężnych peptydów, które mogłyby służyć jako biomarkery schorzeń neurodegeneracyjnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- neuronauka
- spektrometria mas
- poszukiwanie biomarkerów
Wstęp
- Endogenne peptydy w płynie mózgowo-rdzeniowym mogą mieć istotne znaczenie w identyfikacji zaburzeń neurodegeneracyjnych.
- Peptydy o niskiej zawartości w płynie mózgowo-rdzeniowym nie zostały dotąd szeroko zbadane.
- Istniejące metody dostarczyły ograniczonych danych na temat peptydomu płynu mózgowo-rdzeniowego.
Cel badania
- W celu usprawnienia identyfikacji i charakterystyki endogennych peptydów w ludzkim płynie mózgowo-rdzeniowym.
- W celu uzyskania bardziej kompleksowego obrazu peptydomu płynu mózgowo-rdzeniowego.
- W celu zbadania potencjału nowych biomarkerów w schorzeniach neurodegeneracyjnych.
Zastosowane metody
- Spektrometria mas z wstępnym frakcjonowaniem próbek CSF.
- Obejmuje rozmrażanie i przetwarzanie alikwotów CSF o objętości 1,5 milliliter przy użyciu specyficznych odczynników.
- Kompatybilna z technikami multipleksowego znakowania izobarycznego.
- Może zostać dostosowana do analizy próbek plazmy i tkanek przy zastosowaniu niewielkich modyfikacji.
Główne wyniki
- Metoda ta pozwala na wykrycie znacznie większej liczby peptydów w porównaniu do poprzednich badań.
- Kluczowe wyniki wskazują na obecność wcześniej niebadanych peptydów o niskiej zawartości.
- Dostarcza informacji, które mogą prowadzić do odkrycia nowych biomarkerów.
Wnioski
- Niniejsze badanie prezentuje wydajne podejście do charakteryzacji peptidomu płynu mózgowo-rdzeniowego.
- Wszechstronność tej metody otwiera nowe możliwości dla badań klinicznych nad zaburzeniami neurodegeneracyjnymi.
- Potencjalne implikacje dla zrozumienia mechanizmów neuronalnych i identyfikacji markerów chorób.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta zwiększa wykrywalność niskonapięciowych peptydów endogennych w ludzkim płynie mózgowo-rdzeniowym, który jest kluczowym biofluidem w odkrywaniu biomarkerów chorób neurodegeneracyjnych. Poprzez redukcję złożoności białek za pomocą frakcjonowania MWCO oraz poprawę pokrycia peptydów dzięki wstępnemu frakcjonowaniu RP-HPLC przy wysokim pH, zwiększa ona czułość analityczną w badaniach nad walidacją celów terapeutycznych. Podejście to wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez umożliwienie głębszego profilowania peptydomu, co może wpłynąć na pewność wyboru celów we wczesnej fazie oraz selekcję biomarkerów predykcyjnych w programach odkrywania leków dla OUN.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia analizę endogennych populacji peptydów odzwierciedlających procesy patofizjologiczne OUN, co wspiera testowanie hipotez dotyczących celów terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Redukuje zakłócenia zakresu dynamicznego powodowane przez białka CSF o wysokiej zawartości, co poprawia wykrywalność niskopoziomowych peptydów sygnałowych istotnych dla modulacji szlaków.
Przesiewy i rozwój testów
- Wartość naukowa: Generuje powtarzalne wzorce frakcjonowania peptydów, które umożliwiają spójne odczyty LC-MS/MS w celu standaryzacji analizy.
- Wartość operacyjna: Kompatybilne z multipleksowym znakowaniem izobarycznym, co pozwala na porównawczą analizę peptydomu w kohortach chorych i kontrolnych w ramach przepływów pracy służących do przesiewania biomarkerów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Ułatwia odkrywanie biomarkerów poprzez identyfikację peptydów pochodzących z płynu mózgowo-rdzeniowego, które mogą korelować z mechanizmami chorób neurodegeneracyjnych.
- Wartość operacyjna: Możliwość adaptacji do próbek osocza i tkanek przy niewielkich modyfikacjach, co wspiera walidację międzypróbkową w procesach translacyjnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w wczesny etap procesu odkrywania, wspierając opartą na hipotezach eksplorację peptydomu przed etapami identyfikacji związku wiodącego i walidacji przedklinicznej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera nieuprzedzone profilowanie endogennych peptydów w celu wyjaśnienia ścieżek związanych z chorobami i zmniejszenia ryzyka przy wyborze celu terapeutycznego.
- Przesiewanie: Umożliwia wysoką pewność detekcji peptydów dzięki zmniejszeniu złożoności próbki i poprawie rozdziału chromatograficznego.
- Analityka: Generuje ilościowe dane peptydowe z rozdzielczością frakcjonowania, kompatybilne z multipleksowaniem opartym na znakowaniu do badań porównawczych.
- Badania translacyjne: Stanowi podstawę do dopasowania biomarkerów poprzez powiązanie zmian w peptidomie CSF z procesami neurodegeneracyjnymi.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwach: Podstawowy schemat pracy — filtracja MWCO, frakcjonowanie przy wysokim pH i LC-MS — może zostać zestandaryzowany w różnych laboratoriach w celu zapewnienia powtarzalnej analizy peptidomu.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa wydajność identyfikacji peptydów i umożliwia wykrywanie gatunków o niskiej liczności, które mogą służyć jako wskaźniki mechanistyczne lub wskaźniki stanu chorobowego.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki standaryzowanej prefrakcjonacji i zmniejsza zmienność techniczną w analizie złożonych płynów biologicznych.
- Wartość strategiczna: Zwiększa pewność podejmowania decyzji w walidacji celów poprzez rozszerzenie obserwowalnej przestrzeni biologicznej w CSF.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację biomarkerów z uwzględnieniem ryzyka dzięki szerszemu pokryciu peptydomu i lepszej detekcji sygnału.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza ekspercka w zakresie przygotowania płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF), inhibicji proteaz oraz peptydomiki opartej na spektrometrii mas.
- Instrumentacja musi obejmować systemy LC-MS/MS kompatybilne z frakcjonowaniem przy wysokim pH i zdolne do czułej detekcji peptydów.
- Standaryzacja między ośrodkami wymaga spójnego doboru filtrów MWCO, konkatenacji frakcji oraz jednolitych parametrów identyfikacji w oprogramowaniu.
- Adaptacja do osocza lub tkanek wymaga optymalizacji warunków lizy, usuwania białek wysokobelkowych (deplecji) oraz frakcjonowania, aby uwzględnić różną złożoność matrycy.
- Ograniczenia praktyczne obejmują potencjalną utratę peptydów podczas filtracji oraz konieczność rygorystycznej kontroli zanieczyszczeń ze względu na analizę analitów o niskim stężeniu.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
1:12
Pre-treatment of Bulk Volume CSF without Quantification
2:24
Pre-treatment of Small Volume CSF Samples with Isobaric Labeling
4:00
MWCO Filtration, Desalting, and Sample Clean-up by Solid Phase Extraction
6:00
Offline High-pH Reverse Phase HPLC Sample Fractionation
7:09
LC-MS Analysis
7:47
Results: Peptide Identification After LC-MS Analysis
9:13
Conclusion
