Name: Regeneracja złotych mikroelektrod w układzie w układzie dla analizatora komórek w czasie rzeczywistym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: Poznaj metodę regeneracji złotych mikroelektrod w analizatorze komórek w czasie rzeczywistym RTCA. Technika umożliwia wielokrotne użycie płytek przy użyciu łagodnych odczynników, redukując koszty i odpady laboratoryjne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (U1703118), projekt finansowany przez Priorytetowy Program Akademicki Rozwoju Instytucji Szkolnictwa Wyższego w Jiangsu (PAPD), Program Jiangsu Shuangchuang, Otwarte Fundusze Państwowego Kluczowego Laboratorium Chemo/Biosensoringu i Chemometrii (2016015) oraz Narodowe Laboratorium Biomakromolekuł (2017kf05) oraz projekt Jiangsu Specially-Designated Professor, Chiny.

UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, proces regeneracji obejmuje etap trawienia trypsyny i płukania etanolem i wodą. Czas trawienia zmienia się w zależności od liczby użytych komórek, a rodzaj i liczba użytych komórek może się różnić w zależności od celów eksperymentalnych. Zaleca się sprawdzenie zregenerowanych mikroczipów metodami optycznymi i elektrochemicznymi w celu optymalizacji warunków regeneracji. Podczas eksperymentu mogą być zaangażowane rozpuszczalne i nierozpuszczalne substancje chemiczne, a tutaj szczegółowo opisano te dwa typowe przypadki procedur regeneracji.
1. Przygotowanie roztworów regeneracyjnych
UWAGA: Przygotuj i przetwarzaj wszystkie roztwory w sterylnych warunkach.
<ol>
	<li>Przygotuj świeży 0,25% (g/v) roztwór trypsyny. Trypsynę można kupić lub świeżo przygotować w następujący sposób.
	<ol>
		<li>Rozpuść 0,25 g trypsyny w 100 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem o pH 7,4 (PBS).</li>
		<li>Mieszać roztwór, aż trypsyna całkowicie się rozpuści w temperaturze 4 oC. Mieszaj roztwór na niskich obrotach, uważając, aby nie tworzyć się pęcherzyków.</li>
		<li>Przefiltrować roztwór za pomocą filtra 0,22 μm w kapturze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj 75% etanolu przy użyciu etanolu absolutnego. Wlać 75 ml absolutnego etanolu do kolby miarowej i dodawać wodę dejonizowaną, aż objętość osiągnie 100 ml. W razie potrzeby przeprowadzić dalszą sterylizację.</li>
</ol>
2. Inkubacja i proliferacja komórek A549 w płytkach elektronicznych
UWAGA: Płytki elektroniczne typu 16 i L8 są wykonane z ułożonych w układ złotych mikroelektrod litograficznie wydrukowanych na dnie dołków inkubacyjnych. Tablica elektroniczna 16 ma 16 dołków, podczas gdy tablica elektroniczna L8 ma 8 dołków. Studzienki płytki elektronicznej 16 są okrągłe, podczas gdy studzienki płytki elektronicznej L8 są zaokrąglonymi prostokątami. Objętość każdej płytki elektronicznej 8 dołka wynosi około 830 μl, a każdej płytki elektronicznej 16 dołka około 270 μl.
<ol>
	<li>Hodowla komórkowa A549
	<ol>
		<li>Hodowla komórek A549 w pożywce Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną-streptomycyną w naczyniu do hodowli komórkowej.</li>
		<li>Przejść przez komórki, gdy gęstość komórek osiągnie ~75%, a następnie przemyć przylegającą warstwę komórek 1 × PBS i trypsynizować 0,25% roztworem trypsyny przez 1 minutę w temperaturze 37 oC. Odwirować komórki przy 179 × g przez 5 minut, aby usunąć trypsynę. Ponownie zawiesić komórki w pożywce o pojemności 10 ml w celu dalszej hodowli lub innych eksperymentów. 
		UWAGA: Roztwór komórek zawieszonych w pożywce jest tutaj oznaczony jako bufor zawiesiny komórek.</li>
		<li>Wyjmij 10 μl i policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru. Użyj pożywki RPMI-1640, aby dodatkowo rozcieńczyć bufor zawiesiny komórek, aby przygotować 30 000-80 000 komórek/ml buforu zawiesiny komórek do eksperymentów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Eksperyment proliferacji/cytotoksyczności i gromadzenie danych
	<ol>
		<li>Dodać 50 μl (150 μl dla płytki elektronicznej L8) pożywki komórkowej do każdej studzienki inkubacyjnej płytki elektronicznej 16 i pozostawić na 30 minut w kapturze bezpieczeństwa biologicznego w celu zrównoważenia. Ręcznie włożyć płytkę elektroniczną 16 do analizatora komórek w czasie rzeczywistym w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 oC.</li>
		<li>Uruchom program operacyjny analizatora komórek w czasie rzeczywistym na komputerze. Na domyślnej stronie konfiguracji wzorca eksperymentu wybierz pozycję "Model eksperymentu" i nazwij uruchomiony test.</li>
		<li>Na stronie Układ wybierz odpowiednie studnie, które są uwzględnione w eksperymencie i wprowadź informacje, takie jak typ komórki, liczba i nazwy leków w polach edycji. Na stronie Harmonogram dodaj kroki eksperymentalne, a następnie wybierz czas trwania (np. 12, 24 lub 48 godzin) każdego kroku i interwału pozyskiwania danych w czasie rzeczywistym. 
		Uwaga: W tym przypadku interwał kroku 1 i 2 wynosi 1 minutę i 15 minut później.</li>
		<li>Zapisz plik i kliknij przycisk "Start", aby zmierzyć impedancję tła nośnika na jego stronie indeksu komórek; wynikowe dane zostaną automatycznie odjęte. Na stronie Wykres studni można odwiedzić wszystkie krzywe studni. Na stronie Wykres dodaj studnie, a zostanie wyświetlony wykres indeksu komórek czasowych.</li>
		<li>W eksperymencie proliferacji komórek najpierw kliknij przycisk "Pauza", aby wstrzymać program . Następnie wyjąć płytkę elektroniczną i dodać 100 μl buforu zawiesiny komórek A549 do dołka w temperaturze pokojowej. Pozostawić płytkę na 30 minut w kapturze bezpieczeństwa biologicznego, aby komórki mogły osiąść na dnie dołków inkubacyjnych.</li>
		<li> Ręcznie włóż płytkę elektroniczną do stacji analizatora komórek w czasie rzeczywistym. Kliknij przycisk "Start", aby kontynuować eksperyment. 
		Uwaga: Na stronie Wykres analizator w sposób ciągły rejestruje wartości indeksu komórek lub krzywe przez cały czas trwania eksperymentu.</li>
		<li>Po zakończeniu eksperymentu wejdź na stronę Wykres i otwórz plik eksperymentu. Następnie wybierz wszystkie testowane studzienki inkubacyjne i wynikowe krzywe indeksu komórkowego, które można uśrednić lub znormalizować po raz ostatni przed dodaniem leków farmaceutycznych lub zmianą pożywki, aby zmniejszyć różnice między testami. Na stronie Data Analysis (Analiza danych) można obliczyć EC50 lub IC50</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Regeneracja płyt elektronicznych
UWAGA: Dla każdego etapu płukania, roztwór w płytce elektronicznej był dokładnie mieszany (5-10 razy) za pomocą pipety.
<ol>
	<li>Przypadek 1: Ocena cytotoksyczności leku przeciwnowotworowego
	<ol>
		<li>Nasiona komórek A549 na płytce elektronicznej, jak opisano w sekcji 2.</li>
		<li>Najpierw rozpuść lek przeciwnowotworowy chlorowodorek doksorubicyny (DOX) w pożywce komórkowej. Powoli dodawaj DOX do komórek (końcowe stężenie DOX wynosi 30 μg/ml) za pomocą pipety. Zapisać CI zgodnie z opisem w punkcie 2. 
		UWAGA: Zastosowana płytka elektroniczna została zregenerowana natychmiast po zakończeniu eksperymentu. W tym przypadku, ponieważ DOX jest rozpuszczalną substancją chemiczną, regeneracja płytki elektronicznej zgodnie z protokołem jest stosunkowo łatwa do przeprowadzenia i nie są wymagane żadne dodatkowe kroki.</li>
		<li>regeneracja
		<ol>
			<li>Wyjmij elektroniczną płytkę zawierającą komórki ze stacji analizatora komórek w czasie rzeczywistym. Umieść zużytą płytkę elektroniczną w sterylnym kapturze bezpieczeństwa biologicznego w temperaturze pokojowej i dokładnie wymieszaj pożywkę hodowlaną za pomocą pipety. Odpipetować całe podłoże.</li>
			<li>Opłucz płytki elektroniczne 200 μl wodą dejonizowaną 3 razy w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Pozostałe komórki na płytkach elektronicznych trawić 0,25% świeżo przygotowanej trypsyny przez 1-2 godziny (200 μl/dołek) w inkubatorze w temperaturze 37 oC. Po zakończeniu trawienia wymieszać roztwór inkubacyjny 5-10 razy za pomocą pipety i odpipetować cały roztwór z okapu bezpieczeństwa biologicznego w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Wypłucz płytki elektroniczne odpowiednio 200 μl etanolu i 200 μl wody w następujący sposób: woda dejonizowana 2 razy, 100% etanol 2 razy; 75% etanol 2 razy; woda dejonizowana 2 razy. Odwróć płytkę elektroniczną na sterylnej gazie lub bibułce, aby zdekantować pozostałą wodę o temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Ultrafioletem sterylizuj zregenerowaną płytkę elektroniczną przez 1-2 godziny w okapie bezpieczeństwa biologicznego w temperaturze pokojowej. 
			UWAGA: Podwój objętość wszystkich roztworów do regeneracji płytki elektronicznej L8.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przypadek 2: podawanie leku za pomocą materiału mezoporowatego.
	<ol>
		<li>Użyj mezoporowatych materiałów krzemionkowych przypominających pręciki o średniej wielkości porów 5,6 nm jako matryc dostarczania leków, jak wcześniej informowano20. 
		UWAGA: W tym przypadku płytka elektroniczna została wykorzystana do monitorowania wpływu uwalniania leku na komórki.
		<ol>
			<li>Dodaj materiały mezoporowate do roztworu inkubacyjnego każdej studzienki płytek elektronicznych. Ponieważ materiały krzemionkowe nie są rozpuszczalne i wytrącają się w płytce elektronicznej, przepłucz płytkę w następujący sposób:</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wykonaj kroki 3.1.3.1-3.1.3.3 zgodnie z opisem dla przypadku 1.</li>
		<li>Opłucz mikroczipy 200 μl dejonizowanej wody w okapie bezpieczeństwa biologicznego w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Wypłucz mikroczipy 200 μl absolutnego etanolu 2 razy w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Opłucz mikroczipy 200 μl 75% etanolu raz w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodaj 250 μl 75% etanolu do każdego dołka i uszczelnij płytkę elektroniczną folią uszczelniającą w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Wirować z prędkością 114 x g przez 2 minuty i opróżnić płytkę elektroniczną. Odwróć płytkę elektroniczną na sterylnej gazie lub bibułce, aby zdekantować pozostałą wodę o temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Powtórz kroki 3.2.5-3.2.7 raz.</li>
		<li>Ultrafioletem sterylizuj zregenerowaną płytkę elektroniczną przez 1-2 godziny w okapie bezpieczeństwa biologicznego w temperaturze pokojowej. 
		UWAGA: Podwój objętość całego roztworu podczas płukania płytek elektronicznych L8.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Ocena efektu regeneracji
<ol>
	<li>Charakterystyka optyczna regenerowanej powierzchni płytki elektronicznej
	<ol>
		<li>Za pomocą stalowej łyżki ostrożnie zdemontuj dolną część studzienki inkubacyjnej ze świeżej i zregenerowanej płytki elektronicznej, która zawiera ułożone w układ złote mikroelektrody. Zakładając plastikową rękawicę, ostrożnie wytrzyj część zawierającą mikroczip z płytki elektronicznej za pomocą stalowej łyżki.</li>
		<li>Umieść obie części na środku szklanych szkiełek mikroskopowych i zbierz wynikowe widma Ramana za pomocą mikroskopu Ramana wyposażonego w detektor CCD21. 
		UWAGA: Spektrometr został wyposażony w laser o długości fali 633 nm, a widma rejestrowane były w odstępie 30 s naświetlania laserem na długości fali w zakresie 500-3500 cm-1. Obrazy optyczne uzyskano za pomocą mikroskopu Ramana przy użyciu soczewki oka 10x i obiektywu 50x. <silna klasa="xfig">Rysunek 1A i <silna klasa="xfig">Rysunek 1C również uzyskano przy użyciu zainstalowanego aparatu do mikroskopu Ramana.</li>
		<li>Aby ocenić żywotność przyłączonych komórek po wchłonięciu leku przeciwnowotworowego na świeżych i zregenerowanych płytkach elektronicznych, należy użyć konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego do monitorowania spontanicznej fluorescencji cząsteczek DOX wchłoniętych przez A549.
		<ol>
			<li>Aby zarejestrować spontaniczną fluorescencję pochłoniętego DOX przez komórki (świeże i zregenerowane płytki elektroniczne z ogniwami A549), użyj obiektywu olejowego 63X i 485 nm jako długości fali wzbudzenia.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zachowania elektrochemiczne regenerowanych elektrod 
	UWAGA: Ponieważ ręczny demontaż komercyjnej płytki elektronicznej jest trudny i nie jest idealny do oceny sprawdzonego stanu elektrycznego powierzchni, wydajność regeneracji protokołu oceniono przy użyciu zwykłej elektrody węglowej ze złota/szklistego (GCE) jako platformy testowej, na której przeprowadzono elektrochemiczną spektroskopię impedancji (EIS). Średnice elektrody Au i GCE wynoszą po 3 mm. Dane elektrochemiczne uzyskano za pomocą analizatora elektrochemicznego z układem trójelektrodowym, a pomiary impedancji przeprowadzono przy użyciu sygnału prądu przemiennego (AC) o amplitudzie 10 mV w szerokim zakresie częstotliwości od 100 kHz do 0,01 Hz.
	<ol>
		<li>Przed pomiarem wypoleruj elektrodę Au i GCE do lustrzanej powierzchni za pomocą zawiesiny tlenku glinu na ściereczce do polerowania, a następnie wykonaj sonikację w wodzie, aby usunąć wszelkie cząstki.</li>
		<li>Aktywuj elektrodę Au w 0,5 M H2SO4. Uzyskaj dane EIS samej elektrody Au i GCE w 10 mM roztworze elektrolitu KCl zawierającym 1mM K3[Fe(CN)6] zgodnie z opisem22.</li>
		<li>Przygotować podstawowy roztwór ogniwa A549 zgodnie z ppkt 2.1.2 i 2.1.3. Upuść zawiesinę ogniw o objętości 10 μl na powierzchnię elektrody Au i GCE. Inkubować elektrodę Au i GCE zmodyfikowane komórkami w inkubatorze o temperaturze 37 oC przez 3 godziny. Uzyskaj dane EIS elektrody Au i GCE zmodyfikowanej ogniwami w 10 mM roztworze elektrolitu KCl zawierającym 1mM K3[Fe(CN)6].</li>
		<li>Zregeneruj elektrody za pomocą protokołu i zmierz EIS.
		<ol>
			<li>Zanurz elektrodę Au i GCE modyfikowane komórkami w 0,25% trypsyny na 0,5-2 godziny. Przepłucz elektrodę Au i GCE delikatnie wodą 4 razy. Delikatnie przepłucz elektrody absolutnym etanolem 4 razy. Zanurz elektrodę Au i GCE w 75% etanolu na ~5 min. Delikatnie opłucz frytki 75% etanolem 4 razy.</li>
			<li>Uzyskać dane EIS regenerowanej elektrody Au i GCE w 10 mM roztworze elektrolitu KCl zawierającym 1mM K3[Fe(CN)6].</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Michaelis, S., Wegener, J., Robelek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+monitoring+of+cell-based+assays%3A+Combining+impedance+analysis+with+SPR+for+multiparametric+cell+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Label-free monitoring of cell-based assays: Combining impedance analysis with SPR for multiparametric cell profiling.</a> Biosens. Bioelectron. 49, 63-70 (2013).</li>
<li>Hillger, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+biosensor+for+label-free+detection+of+GPCR-mediated+drug+responses+in+personal+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Whole-cell biosensor for label-free detection of GPCR-mediated drug responses in personal cell lines.</a> Biosens. Bioelectron. 74, 233-242 (2015).</li>
<li>Atienzar, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+real-time+cell+analyzer+technology+in+drug+discovery%3A+defining+optimal+cell+culture+conditions+and+assay+reproducibility+with+different+adherent+cellular+models%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">The use of real-time cell analyzer technology in drug discovery: defining optimal cell culture conditions and assay reproducibility with different adherent cellular models.</a> J. Biomol. Screen. 16 (6), 575-587 (2011).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+luminescent+mesoporous+silica+nanoparticles+for+imaging+and+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Label-free luminescent mesoporous silica nanoparticles for imaging and drug delivery.</a> Theranostics. 3 (9), 650-657 (2013).</li>
<li>Gao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silicon+Nanowire+Arrays+for+Label-Free+Detection+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Silicon Nanowire Arrays for Label-Free Detection of DNA.</a> Anal. Chem. 79 (9), 3291-3297 (2007).</li>
<li>Giaever, I., Keese, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+morphological+biosensor+for+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A morphological biosensor for mammalian cells.</a> Nature. 366 (6455), 591-592 (1993).</li>
<li>Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+cytotoxicity+using+electric+cell-substrate+impedance+sensing%3A+concentration+and+time+response+function+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Assessment of cytotoxicity using electric cell-substrate impedance sensing: concentration and time response function approach.</a> Anal. Chem. 74 (22), 5748-5753 (2002).</li>
<li>Xiao, C., Lachance, B., Sunahara, G., Luong, J. H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in-depth+analysis+of+electric+cell-substrate+impedance+sensing+to+study+the+attachment+and+spreading+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">An in-depth analysis of electric cell-substrate impedance sensing to study the attachment and spreading of mammalian cells.</a> Anal. Chem. 74 (6), 1333-1339 (2002).</li>
<li>Xing, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+monitoring+of+cytotoxicity+on+microelectronic+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Dynamic monitoring of cytotoxicity on microelectronic sensors.</a> Chem. Res. Toxicol. 18 (2), 154-161 (2005).</li>
<li>Abassi, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+cell-based+morphological+screening%3A+prediction+of+mechanism+of+compound+action+and+off-target+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinetic cell-based morphological screening: prediction of mechanism of compound action and off-target effects.</a> Chem. Biol. 16 (7), 712-723 (2009).</li>
<li>Urcan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+xCELLigence+impedance+analysis+of+the+cytotoxicity+of+dental+composite+components+on+human+gingival+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Dent.+Mater%22%5BJournal%5D)">Real-time xCELLigence impedance analysis of the cytotoxicity of dental composite components on human gingival fibroblasts.</a> Dent. Mater. 26 (1), 51-58 (2010).</li>
<li>Atienza, J. M., Zhu, J., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+monitoring+of+cell+adhesion+and+spreading+on+microelectronic+sensor+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Dynamic monitoring of cell adhesion and spreading on microelectronic sensor arrays.</a> J. Biomol. Screen. 10 (8), 795-805 (2005).</li>
<li>Rahim, S., Uren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Real-time+Electrical+Impedance+Based+Technique+to+Measure+Invasion+of+Endothelial+Cell+Monolayer+by+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells.</a> J. Vis. Exp. (50), e2792(2011).</li>
<li>Moodley, K., Angel, C. E., Glass, M., Graham, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+profiling+of+NK+cell+killing+of+human+astrocytes+using+xCELLigence+technology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Real-time profiling of NK cell killing of human astrocytes using xCELLigence technology.</a> J. Neurosci. Meth. 200 (2), 173-180 (2011).</li>
<li>Marinova, Z., Walitza, S., Grunblatt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+impedance-based+cell+analyzer+as+a+tool+to+delineate+molecular+pathways+involved+in+neurotoxicity+and+neuroprotection+in+a+neuronal+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Real-time impedance-based cell analyzer as a tool to delineate molecular pathways involved in neurotoxicity and neuroprotection in a neuronal cell line.</a> J. Vis. Exp. (90), e51748(2014).</li>
<li>Chatelier, R. C., Gengenbach, T. R., Griesser, H. J., Brighamburke, M., Oshannessy, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+to+recondition+and+reuse+Biacore+sensor+chips+fouled+with+covalently+immobilized+protein%2Fpeptide%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A general method to recondition and reuse Biacore sensor chips fouled with covalently immobilized protein/peptide.</a> Anal. Biochem. 229 (1), 112-118 (1995).</li>
<li>Vashist, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+regenerating+gold+surface+for+prolonged+reuse+of+gold-coated+surface+plasmon+resonance+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A method for regenerating gold surface for prolonged reuse of gold-coated surface plasmon resonance chip.</a> Anal. Biochem. 423 (1), 23-25 (2012).</li>
<li>Nguyen, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regenerative+label-free+fiber+optic+sensor+using+surface+plasmon+resonance+for+clinical+diagnosis+of+fibrinogen%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Nanomed%22%5BJournal%5D)">A regenerative label-free fiber optic sensor using surface plasmon resonance for clinical diagnosis of fibrinogen.</a> Int. J. Nanomed. 10, 155-163 (2015).</li>
<li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+to+regenerate+arrayed+gold+microelectrodes+for+label-free+cell+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A general method to regenerate arrayed gold microelectrodes for label-free cell assay.</a> Anal. Biochem. 516, 57-60 (2017).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/cplu.201500231/abstract">Three-dimensionally controllable synthesis of multichannel silica nanotubes and their application as dual drug carriers.</a> ChemPlusChem. 80 (11), 1615-1623 (2015).</li>
<li>Verrier, S., Notingher, I., Polak, J. M., Hench, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+monitoring+of+cell+death+using+Raman+microspectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">In situ monitoring of cell death using Raman microspectroscopy.</a> Biopolymers. 74 (1-2), 157-162 (2004).</li>
<li>Keighley, S. D., Li, P., Estrela, P., Migliorato, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+DNA+immobilization+on+gold+electrodes+for+label-free+detection+by+electrochemical+impedance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Optimization of DNA immobilization on gold electrodes for label-free detection by electrochemical impedance spectroscopy.</a> Biosens. Bioelectron. 23 (8), 1291-1297 (2008).</li>
<li>Kandimalla, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+ethyl+parathion+antibodies+for+repeated+use+in+immunosensor%3A+a+study+on+dissociation+of+antigens+from+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Regeneration of ethyl parathion antibodies for repeated use in immunosensor: a study on dissociation of antigens from antibodies.</a> Biosens. Bioelectron. 20 (4), 903-906 (2004).</li>
<li>McGovern, J. P., Shih, W. Y., Shih, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+Bacillus+anthracis+spores+using+fully+submersible%2C+self-exciting%2C+self-sensing+PMN-PT%2FSn+piezoelectric+microcantilevers%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">In situ detection of Bacillus anthracis spores using fully submersible, self-exciting, self-sensing PMN-PT/Sn piezoelectric microcantilevers.</a> Analyst. 132 (8), 777-783 (2007).</li>
<li>Loo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+to+regenerate+piezoelectric+microcantilever+sensors+%28PEMS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">A rapid method to regenerate piezoelectric microcantilever sensors (PEMS).</a> Sensors. 11 (5), 5520-5528 (2011).</li>
<li>Fischer, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0167931708005972">Gold cleaning methods for electrochemical detection applications.</a> Microelectron. Eng. 86 (4-6), 1282-1285 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tabeli 1 podsumowaliśmy kilka dostępnych metod 17,23,24,25,26 do regeneracji mikroczipów. Zasadniczo, metody te wymagały stosunkowo trudnych warunków eksperymentalnych, aby osiągnąć pełną regenerację chipów ze względu na obecność silnych oddziaływań cząsteczka-cząsteczka, takich jak kompleks immunologiczny stosowany w chipach SPR. Jednak te ...

Dzięki wydajnemu i mniej pracochłonnemu procesowi eksperymentalnemu, technologia komórkowa bez znaczników odnotowała szybki wzrost w ciągu ostatniej dekady do celów analitycznych i przesiewowych, takich jak w aspekcie proteomiki1,2, drug delivery3, etc.4,5 W porównaniu z tradycyjnymi metodami biochemicznymi mającymi na celu analizę komórek, bezznacznikowy test komórkowy w czasie rzeczywistym z prototypem opracowanym przez Giaevera i współpracowników before6 opiera się na zasadzie rejestrowania zmian sygnału elektrycznego na powierzchni mikrochipów podłączonych do komórek, które pozwalają na ciągły pomiar wzrostu lub migracji komórek w sposób ilościowy. Podążając za tą strategią, wprowadzono system elektronicznej detekcji komórek w czasie rzeczywistym (RT-CES) wykorzystujący zasadę wykrywania opartą na impedancji elektrycznej7,8, a ostatnio uruchomiono komercyjny analizator komórek w czasie rzeczywistym (RTCA) do badań laboratoryjnych9.
Komercyjna analizator komórek w czasie rzeczywistym głównie odczytuje wywołane przez komórki sygnały impedancji elektrycznej, które wynikają z fizjologicznych zmian inkubowanych komórek, w tym proliferacji komórek, migracji, żywotności, morfologii i przylegania do powierzchni mikroprocesorów10,11. Takie sygnały elektryczne są następnie przekształcane przez analizator w bezwymiarowy parametr zwany indeksem komórki (CI) w celu oceny stanu ogniwa. Zmiana impedancji mikroczipów odzwierciedla głównie lokalne środowisko jonowe pokrytych ogniw na granicy faz elektroda/roztwór. W związku z tym wydajność analityczna analizatora komórkowego zależy w dużej mierze od rdzenia czujnika, jednorazowych mikroczipów (tj. tak zwanych płytek elektronicznych, np. 96/16/8-dołk), które są wykonane z ułożonych w układ złotych mikroelektrod litograficznie wydrukowanych na dnie dołków inkubacyjnych. Złote mikroelektrody łączą się w okrąg on-line (<silna klasa="xfig">Rysunek 1) i pokrywają większość powierzchni dołków inkubacyjnych, co pozwala na dynamiczne i czułe wykrywanie przyłączonych komórek3,12,13,14. CI zwiększy się w przypadku większego pokrycia powierzchni komórek na chipie i zmniejszy się, gdy komórki zostaną wystawione na działanie substancji toksycznej powodującej apoptozę. Chociaż analizator komórek w czasie rzeczywistym jest często używany do określania cytotoksyczności11 i neurotoxicity15 i dostarcza więcej informacji kinetycznych niż klasyczna metoda punktów końcowych, jednorazowe płytki elektroniczne są najdroższymi materiałami eksploatacyjnymi.
Do tej pory nie było dostępnych metod regeneracji płytki elektronicznej, co prawdopodobnie wynika z faktu, że w grę wchodzą trudne warunki regeneracji, takie jak roztwór piranii lub kwas octowy16,17,18, które mogą zmienić stan elektryczny mikroczipów złota. Dlatego w procesie regeneracji płytki elektronicznej pożądana będzie łagodna i skuteczna metoda usuwania przylegających komórek i innych substancji z powierzchni wiórów złota. Niedawno opracowaliśmy protokół mający na celu regenerację jednorazowych płytek elektronicznych przy użyciu odczynników niekorozyjnych, a zregenerowane chipy zostały scharakteryzowane metodami elektrochemicznymi, a także optycznymi19. Stosując łatwo dostępne i umiarkowane odczynniki laboratoryjne, w tym trypsynę i etanol, ustaliliśmy ogólną metodę regeneracji komercyjnej płytki elektronicznej bez skutków ubocznych, która jest z powodzeniem stosowana do regeneracji dwóch głównych typów płytek elektronicznych (zarówno 16, jak i L8) stosowanych do RTCA.

<table><tbody><tr><td>Szczur: Sprague-Dawley</td><td>Charles River</td><td>Cat# 400</td><td></td></tr><tr><td>mysz anty-szczur CD11b monoklonalny (klon OX42)</td><td>Bio-Rad</td><td>Cat# MCA275R</td><td>Panoramowanie: 1:1,000; Barwienie: 1:500</td></tr><tr><td>Koza wielokolążkowa anty-Iba1&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>Cat# AB5076</td><td>Barwienie: 1:500</td></tr><tr><td>Królik poliklonalny anty-Ki67&nbsp;</td><td>Biblioteka&nbsp;</td><td>Kot# AB15580</td><td>Barwienie: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey anty-mysz 594</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# 11055</td><td>Barwienie: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey anty-koza 488</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# A-21203</td><td>Barwienie: 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor Donkey anty-Rabbit 647</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# A-31573</td><td>Barwienie: 1:500</td></tr><tr><td>Triton-X (detergent w barwieniu ICC)</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# 28313</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan heparanu</td><td>Galen Materiały laboratoryjne</td><td>Kat# GAG-HS01</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>Kat# M3149</td><td></td></tr><tr><td>Pepton z suchej masy mlecznej</td><td>Sigma</td><td>Cat# P6838</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&beta; 2</td><td>Peprotech</td><td>Cat# 100-35B</td><td></td></tr><tr><td>Mysz IL-34</td><td>R& D Systems</td><td>Cat# 5195-ML/CF</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol z wełny owczej</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>Cat# 700000P</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen IV</td><td>Corning&nbsp;</td><td>Kat# 354233</td><td></td></tr><tr><td>Kwas oleinowy</td><td>Cayman Chemicals&nbsp;</td><td>Kat# 90260</td><td></td></tr><tr><td>11(Z)Kwas eikosadienowy (gondoiczny)</td><td>Kajmany Chemikalia&nbsp;</td><td>Kot# 20606</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM barwnik</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium homodimer-1</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# E1169</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Worthington</td><td>Cat# DPRFS</td><td></td></tr><tr><td>Percoll PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>Cat# 17-5445-02</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Cat# T9935</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>Cat# 21041-02</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina / Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>Cat# 15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Gibco</td><td>Cat# 25030-081</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylocysteina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Cat# A9165</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>Cat# 16634</td><td></td></tr><tr><td>Apo-transferyna&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Cat# T1147</td><td></td></tr><tr><td>Selenin sodu</td><td>Sigma</td><td>Cat# S-5261</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (wysoki poziom glukozy)</td><td>Gibco</td><td>Cat# 11960-044</td><td></td></tr><tr><td>Dapi Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>Cat# 0100-20&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lizyna&nbsp;</td><td>Tabliczki Sigma</td><td>Cat# A-003-E</td><td></td></tr><tr><td>Primaria&nbsp;</td><td>VWR</td><td>Cat# 62406-456</td><td></td></tr><tr><td>Odczynniki podstawowe&nbsp; </td><td>reconstitution&nbsp; </td><td>Stężenie zastosowane</td><td>Przechowywanie</td></tr><tr><td>Apo-transferyna</td><td>10 mg/ml w PBS&nbsp;</td><td>1:100-20</td><td>&stopni; C</td></tr><tr><td>N-acetylocysteina</td><td>5 mg/ml w H2O&nbsp;</td><td>1:1,000-20</td><td>&stopni; C</td></tr><tr><td>Selenin sodu</td><td>2,5 mg/ml w H2O&nbsp;</td><td>1:25,000-20</td><td>&stopni; C</td></tr><tr><td>Kolagen IV</td><td>200 &mu; g/ml w PBS&nbsp;</td><td>1:100-80</td><td>&stopni; C</td></tr><tr><td>TGF-b2</td><td>20 &mu; g/ml w PBS&nbsp;</td><td>1:10,000-20</td><td>&stopni; C</td></tr><tr><td>IL-34</td><td>100 &mu; g/ml w PBS&nbsp;</td><td>1:1,000-80</td><td>&stopni; C</td></tr><tr><td>Cholesterol z wełny owczej</td><td>1,5 mg/ml w 100% etanolu&nbsp;</td><td>1:1,000-20</td><td>&stopni; C</td></tr><tr><td>Siarczan heparanu</td><td>1 mg/ml w H2O</td><td>1:1,000-20</td><td>&deg; C</td></tr><tr><td>Kwas oleinowy/Kwas gondoinowy</td><td>Gondoinowy: 0,001 mg/ml; Oleinowy: 0,1 mg/ml w 100% etanolu&nbsp;</td><td>1:1,000-20</td><td>&stopni; C</td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>50 mg/ml w PBS&nbsp;</td><td>1:100-20</td><td>&stopni; C</td></tr><tr><td>Solutions&nbsp; </td><td>Przepis&nbsp; </td><td></td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Bufor perfuzyjny</td><td>50 &mu; g/mL heparyny w DPBS++ (PBS z Ca++ i Mg+ +)Stosować</td><td></td> <td>w stanie lodowatym</td></tr>, gdy jest zimny <tr><td>Bufor dounkujący</td><td>200 &mu; L 0,4% DNaseI w 50 ml DPBS++</td><td></td><td>Stosować w stanie lodowatym</td></tr><tr><td>Bufor do płukania</td><td>2 mg/ml peptonu z suchej masy mlecznej w DPBS++</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microglea Growth Medium (MGM)</td><td>DMEM/F12 zawierające 100 jednostek/ml penicyliny, 100 &mu; g/ml streptomycyny, 2 mM glutaminy, 5 &mu; g/ml N-acetylocysteiny, 5 &mu; g/ml insuliny, 100 &mu; g / ml apo-transferyny i 100 ng / ml seleninu</td><td></td> sodu <td>Użyj lodowatego MGM, aby usunąć mikroglej z naczynia do immnopaningu.</td></tr><tr><td>Kolagen IV Powłoka</td><td>MGM zawierająca 2 &mu; g/mL kolagen IV</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor seperacyjny mielinowy</td><td>9 mL Percoll PLUS, 1 ml 10x PBS bez Ca++ i Mg++, 9 &mu; L 1 M CaCl2, 5 &mu; L 1 M MgCl2</td><td></td><td>Dobrze wymieszać po dodaniu&nbsp; CaCl2 i MgCl2</td></tr><tr><td>TGF-b2/IL-34/Pożywki wzrostowe zawierające cholesterol (TIC)&nbsp;</td><td>MGM zawierające ludzkie 2 ng/ml TGF-b2, 100 ng/ml mysiej IL-34, 1,5 &mu; g/ml cholesterolu z wełny owczej, 10 &mu; g/ml siarczanu heparanu, 0,1 &m; g/ml kwasu oleinowego i 0,001 &mu; g/ml kwasu</td><td></td> gondonowego <td>Upewnij się, że dodałeś cholesterol do podłoża podgrzanego do 37 stopni C i nie dodawać więcej niż 1,5 &mu; g / ml lub wytrąci się. Nie filtruj mediów zawierających cholesterol. Zrównoważ pożywkę TIC z 10% CO2 przez 30 minut - 1 godzinę przed dodaniem do komórek, aby zapewnić optymalne pH.</td></tr></tbody></table>

regeneracja złotych mikroelektrod w układzie w układzie dla analizatora komórek w czasie rzeczywistym

Regeneration of Arrayed Gold Microelectrodes Equipped for a Real-Time Cell Analyzer

Test komórkowy bez znaczników jest korzystny dla badań biochemicznych, ponieważ nie wymaga użycia zwierząt doświadczalnych. Ze względu na swoją zdolność do dostarczania bardziej dynamicznych informacji o komórkach w warunkach fizjologicznych niż klasyczne testy biochemiczne, ten bezznacznikowy test komórkowy w czasie rzeczywistym oparty na zasadzie impedancji elektrycznej przyciąga coraz większą uwagę w ciągu ostatniej dekady. Jednak jego praktyczne zastosowanie może być ograniczone ze względu na stosunkowo wysoki koszt pomiaru, w którym do analizatora komórek stosuje się kosztowne jednorazowe mikroczipy ze złota. W tym protokole opracowaliśmy ogólną strategię regeneracji złotych mikroelektrod z matrycą wyposażonych w komercyjny analizator komórek bez etykiety. Proces regeneracji obejmuje trawienie trypsyny, płukanie etanolem i wodą oraz etap wirowania. Proponowana metoda została przetestowana i wykazano, że jest skuteczna w przypadku regeneracji i wielokrotnego użycia komercyjnych płytek elektronicznych co najmniej trzy razy, co pomoże naukowcom zaoszczędzić na wysokich kosztach bieżących testów komórkowych w czasie rzeczywistym.

Właściwości powierzchni złotych mikroczipów: Procedury regeneracji zastosowane w niniejszym protokole przedstawiono na Rysunku 1. Rysunek 2 przedstawia mikroskopowe obrazy powierzchni nowych i regenerowanych płytek elektronicznych wykonane za pomocą mikroskopu optycznego. Jak pokazano na Rysunku 2A i Rysunku 2C, obserwacje mikroskopowe w...

Ten protokół opisuje ogólną strategię regeneracji komercyjnych mikroelektrod złotych wyposażonych w bezznacznikowy analizator komórek, mający na celu zaoszczędzenie na wysokich kosztach eksploatacji testów opartych na mikroprocesorach. Proces regeneracji obejmuje trawienie trypsyną, płukanie etanolem i wodą oraz etap wirowania, który umożliwia wielokrotne użycie mikroczipów.

Regeneracja złotych mikroelektrod w układzie w układzie dla analizatora komórek w czasie rzeczywistym

The label-free cell-based assay is advantageous for biochemical study because of it does not require the use of experimental animals. Due to its ability ...

Ogólnym celem tej procedury jest regeneracja komercyjnych płytek elektronicznych przystosowanych do analizatora komórek w czasie rzeczywistym (Real-Time Cell Analyzer, RTCA). Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie regeneracji jednorazowych chipów opartych na złocie, w tym regeneracji płytek elektronicznych stosowanych w RTCA. Główną zaletą tej techniki jest to, że procedura regeneracji może być przeprowadzona przy użyciu łagodnych i łatwo dostępnych odczynników laboratoryjnych o niskiej toksyczności.Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy zaczęliśmy korzystać z analizatora Real-Time Cell Analyzer, który wykorzystuje chipy pokryte złotem. Procedurę należy rozpocząć od inkubacji i proliferacji komórek A549 w naczyniu do hodowli komórkowej, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Do każdego dołka inkubacyjnego płyty elektronicznej L8 należy dodać 150 µL pożywki komórkowej. Płytę należy pozostawić na 30 minut w komorze z laminarnym przepływem powietrza w celu wyrównania temperatury.Po 30 minutach ręcznie włóż elektroniczną płytkę L8 do analizatora Real-Time Cell Analyzer w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie uruchom program operacyjny analizatora Real-Time Cell Analyzer na komputerze. Na domyślnej stronie konfiguracji wzorca eksperymentu wybierz Model Eksperymentu (Experiment Model) i nazwij przeprowadzany pomiar.Na stronie układu (layout page) zaznacz odpowiednie studzienki uwzględnione w eksperymencie i wprowadź informacje, takie jak typ komórek, ich liczba oraz nazwy leków, w polach edycji. Na stronie harmonogramu (schedule page) dodaj kroki eksperymentalne, a następnie wybierz czas trwania każdego kroku oraz interwał akwizycji danych w czasie rzeczywistym. Kliknij start, aby zmierzyć impedancję tła medium.Plik eksperymentu zostanie zapisany. Wynikowe dane zostaną automatycznie odjęte. Na stronie wykresu należy dodać studzienki, po czym zostanie wyświetlony wykres indeksu komórkowego w funkcji czasu.W celu przeprowadzenia eksperymentu z proliferacji komórek, najpierw kliknij przycisk pauzy, aby wstrzymać program. Następnie wyjmij płytkę elektroniczną i dodaj do każdego dołka 100 µL buforu z zawiesiną komórek A549 w temperaturze pokojowej. Pozostaw płytkę na 30 minut w komorze z laminarnym przepływem powietrza, aby komórki osiadły na dnie dołków inkubacyjnych.Ręcznie wsuń płytkę elektroniczną do stacji analizatora komórek w czasie rzeczywistym. Następnie kliknij przycisk start, aby kontynuować eksperyment. Na stronie z wykresem analizator stale rejestruje wartości indeksu komórkowego, czyli krzywe, przez cały czas trwania eksperymentu.Po zakończeniu eksperymentu przejdź do strony wykresów i otwórz plik eksperymentu. Następnie zaznacz wszystkie testowane studzienki inkubacyjne oraz wynikowe krzywe indeksu komórkowego, które można uśrednić lub znormalizować po raz ostatni przed dodaniem leków farmaceutycznych lub zmianą medium, aby zmniejszyć różnice między analizami. Na stronie analizy danych można obliczyć EC50 lub IC50.Po przeprowadzeniu oceny cytotoksyczności leku przeciwnowotworowego zgodnie z opisem w protokole tekstowym, wyjmij z analizatora Real-Time Cell Analyzer płytkę elektroniczną zawierającą komórki. Umieść zużytą płytkę elektroniczną w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza w temperaturze pokojowej i dokładnie wymieszaj pożywkę hodowlaną za pomocą pipety. Następnie za pomocą pipety odessij całą pożywkę.Płucz płytki elektroniczne 200 µL wody dejonizowanej trzykrotnie w temperaturze pokojowej. Pozostałe komórki na płytkach elektronicznych traw w 0,25% świeżo przygotowanej trypsynie przez jedną do dwóch godzin w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Po zakończeniu trawienia, pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza w temperaturze pokojowej, wymieszaj roztwór inkubacyjny od pięciu do 10 razy za pomocą pipety, a następnie usuń roztwór.Płucz płytki elektroniczne 200 µl wody zdejonizowanej dwukrotnie. Następnie przemyj 200 µl 100% etanolu dwukrotnie, a potem taką samą objętością 75% etanolu dwukrotnie. Na koniec ponownie wypłucz 200 µl wody zdejonizowanej dwukrotnie.Odwróć płytkę elektroniczną na sterylną gazę lub ręcznik papierowy, aby odlać pozostałą wodę w temperaturze pokojowej. Następnie przeprowadź sterylizację ultrafioletową zregenerowanej płytki elektronicznej przez jedną do dwóch godzin w komorze z laminarnym przepływem powietrza w temperaturze pokojowej. Po wykorzystaniu płytek do dostarczania leków przy użyciu materiału mezoporowatego zgodnie z opisem w protokole tekstowym, straw przez trypsynę pozostałe komórki w sposób opisany wcześniej.Ponieważ pipeta jest często używana podczas eksperymentów, należy zwrócić uwagę, aby nie porysować końcówki oraz powierzchni mikroczipów. Przepłucz mikroczipy 200 µL wody dejonizowanej jednorazowo w komorze z laminarnym przepływem powietrza w temperaturze pokojowej. Następnie przemyj mikroczipy 200 µL absolutnego etanolu dwukrotnie w temperaturze pokojowej.Następnie przepłucz mikroczipy raz 200 µL 75% etanolu w temperaturze pokojowej. Do każdej studni dodaj 250 µL 75% etanolu, a następnie zabezpiecz płytkę elektroniczną folią uszczelniającą w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu płytki elektronicznej z prędkością 114 ×g przez dwie minuty opróżnij płytkę.Odwróć płytkę elektroniczną na sterylnej gazie lub papierze ręcznikowym, aby odlać pozostały płyn w temperaturze pokojowej. Powtórz płukanie 75% ethanol, a następnie wirówkę. Następnie przeprowadź sterylizację ultrafioletową zregenerowanej płytki elektronicznej przez jedną do dwóch godzin w komorze z laminarnym przepływem powietrza w temperaturze pokojowej.Oceń właściwości optyczne zregenerowanej powierzchni płyty elektronicznej, najpierw demontując dolną część dołka inkubacyjnego zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby ocenić żywotność przytwierdzonych komórek po pobraniu leku przeciwnowotworowego na świeżych i zregenerowanych płytach elektronicznych, wykorzystaj konfokalny mikroskop skaningowy do monitorowania spontanicznej fluorescencji cząsteczek DOX pochłoniętych przez komórki A549. W celu zarejestrowania spontanicznej fluorescencji DOX pochłoniętego przez komórki, użyj obiektywu olejowego 63× oraz długości fali wzbudzenia 485 nanometrów.Następnie oceniono właściwości elektrochemiczne zregenerowanych elektrod, zaczynając od wypolerowania elektrody złotej oraz elektrody z węgla szklistego do uzyskania powierzchni lustrzanej przy użyciu zawiesiny polerskiej Illumina na tkaninie polerskiej. Następnie elektrody poddano sonikacji w wodzie w celu usunięcia wszelkich cząsteczek. W kolejnym kroku aktywowano elektrodę złotą w 0,5-moliarskim kwasie siarkowym.Przeprowadź pomiary spektroskopii impedancyjnej elektrochemicznej (EIS) dla gołej elektrody złotej oraz elektrody z węgla szklistego w 10-mM roztworze elektrolitu chlorku potasu, zawierającym 1 mM ferocyjanku potasu. Następnie nanieś 10 µL zawiesiny komórek na powierzchnię elektrody złotej w GCE. Po dodaniu komórek inkubuj elektrodę złotą w GCE w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez trzy godziny, a następnie uzyskaj dane EIS dla elektrod zmodyfikowanych komórkami, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Aby zregenerować elektrody, zanurz elektrodę złotą oraz GCE zmodyfikowaną komórkami w 0,25% trypsyną na okres od 0,5 do 2 godzin. Delikatnie przemyj obie elektrody wodą czterokrotnie. Następnie delikatnie przemyj elektrody czterokrotnie absolutnym etanolem.Następnie zanurz elektrodę złota w GCE w 75% etanolu przez około pięć minut. Po pięciu minutach delikatnie opłucz chip 75% etanolem cztery razy przed uzyskaniem danych EIS z regenerowanych elektrod, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby ocenić wydajność regeneracji macierzy złotej płyty elektronicznej, przeprowadzono obserwacje mikroskopowe zarówno dla świeżych, jak i traktowanych płyt elektronicznych.Nie stwierdzono istotnych różnic w właściwościach optycznych powierzchni mikrochipów. Fluorescencję cząsteczek doxorubicyny wykorzystano do oceny stanu komórek na złotych mikrochipach przed i po regeneracji. Podobna homogeniczność oraz dobrze zdefiniowana morfologia komórkowa wykazały możliwość ponownego wykorzystania chipów.Protokół regeneracji jest stosowany do rzeczywistego testu proliferacji komórek. Krzywe wzrostu uzyskane z wielu studni inkubacyjnych testowanej płytki elektronicznej wykazują dobrą spójność, co wskazuje na pomyślną regenerację komercyjnego chipa. Przedstawiona tutaj zregenerowana płytka elektroniczna L8 została przetestowana w celu oceny cytotoksyczności z wykorzystaniem materiałów z mezoporowatej krzemionki.Indeks komórkowy próbki traktowanej materiałami mezoporowatymi spadł w porównaniu z kontrolą, co wskazuje na lekką cytotoksyczność tych materiałów. Dalsza enkapsulacja i uwalnianie leku przeciwnowotworowego doksorubicyny przez materiały mezoporowate spowodowały gwałtowny spadek krzywej wzrostu komórek A549. Po opanowaniu techniki, jej wykonanie zajmuje cztery godziny, pod warunkiem przeprowadzenia procedury w sposób prawidłowy.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że czas trawienia typu zlewni może różnić się w zależności od konkretnego układu. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak konfokalna mikroskopia skaningowa, a nawet spektroskopia czy spektroskopia impedancyjna elektrochemiczna, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. w celu oceny efektu regeneracji.

regeneration-arrayed-gold-microelectrodes-equipped-for-real-time-cell

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Film demonstruje funkcjonalną regenerację połączeń propriordzeniowych za pomocą testu opartego na matrycy wieloelektrodowej (MEA). Wycinki rdzenia kręgowego umieszcza się na MEA i pozostawia się do połączenia. Połączone plastry są mechanicznie oddzielane poprzez tworzenie zmiany, indukując neurony propriordzeniowe do wzrostu nad zmianą i łączenia plasterków. Aktywność elektryczna warstw jest oceniana w celu identyfikacji regeneracji połączeń funkcjonalnych.

Badanie regeneracji funkcjonalnych połączeń między wycinkami rdzenia kręgowego przy użyciu układu wieloelektrodowego

Różne powłoki elektrod wpływają na wydajność rejestracji neuronowej poprzez zmiany właściwości elektrochemicznych, chemicznych i mechanicznych. Porównanie elektrod in vitro jest stosunkowo proste, jednak porównanie odpowiedzi in vivo jest zwykle skomplikowane ze względu na różnice w odległości między elektrodami a neuronami oraz między zwierzętami. Ten artykuł zawiera solidną metodę porównywania elektrod do rejestracji neuronowej.

Metoda systematycznej oceny elektrochemicznej i elektrofizjologicznej elektrod rejestrujących działanie neuronów

Ten protokół omawia Wykrywanie Impedancji Elektrycznej Komórki, metodę rejestrowania i analizy widma impedancji przylegających komórek do ilościowego określenia przyczepienia, proliferacji, ruchliwości i reakcji komórkowych na bodźce farmakologiczne i toksyczne. Położono nacisk na wykrywanie przepuszczalności śródbłonka oraz ocenę kontaktów komórka-komórka i komórka-substrat.

Wykrywanie impedancji substratu elektrycznego podłoża komórkowego w celu ilościowego określenia proliferacji śródbłonka, funkcji bariery i ruchliwości

Tutaj prezentujemy protokół, który opiera się na wycinkach rdzenia kręgowego hodowanych na układach wieloelektrodowych w celu zbadania funkcjonalnej regeneracji połączeń propriordzeniowych in vitro.

Badanie regeneracji funkcjonalnej w organotypowych kokulturach rdzenia kręgowego hodowanych na matrycach wieloelektrodowych

Komórki neuronalne myszy hodowane na układach wieloelektrodowych wykazują zwiększoną reakcję po stymulacji elektrycznej. Protokół ten pokazuje, jak hodować neurony, jak rejestrować aktywność i jak ustanowić protokół trenowania sieci w celu reagowania na wzorce stymulacji.

Zależny od czasu wzrost odpowiedzi sieci na stymulację kultur komórek neuronalnych na układach mikroelektrod

W tym badaniu modyfikujemy mikroelektrody z włókna węglowego za pomocą nanocząsteczek złota, aby zwiększyć czułość wykrywania neuroprzekaźników.

Mikroelektrody z włókna węglowego modyfikowane nanocząstkami złota dla lepszej detekcji neurochemicznej

Opisana poniżej jest metoda implantacji wielu układów elektrod polimerowych w anatomicznie odległych obszarach mózgu w celu przewlekłego zapisu elektrofizjologicznego u swobodnie poruszających się szczurów. Przygotowanie i implantacja chirurgiczna są szczegółowo opisane, z naciskiem na zasady projektowania, które mają pomóc w adaptacji tych metod do stosowania u innych gatunków.

Przewlekła implantacja wielu elastycznych matryc elektrod polimerowych

Ten protokół opisuje procedurę konstruowania układów mikroelektrod z włókna węglowego do przewlekłych i ostrych zapisów elektrofizjologicznych in vivo u myszy (Mus musculus) i fretki (Mustela putorius furo) z wielu obszarów mózgu. Każdy krok, po zakupie surowych włókien węglowych do implantacji matrycy mikroelektrodowej, jest szczegółowo opisany, z naciskiem na budowę matrycy mikroelektrodowej.

Budowa i implementacja układów mikroelektrod z włókna węglowego do przewlekłych i ostrych nagrań in vivo

Tutaj opisujemy metodologię produkcji konfigurowalnych układów elektrod z włókna węglowego do nagrywania in vivo w nerwach i mózgu.

Zestaw narzędzi typu open source: laboratoryjny zestaw mikroelektrod z włókna węglowego do nagrywania nerwów

Opisujemy podejście do wykrywania i przechwytywania inwazyjnych subpopulacji komórek w czasie rzeczywistym. Projekt eksperymentalny wykorzystuje analizę komórkową w czasie rzeczywistym poprzez monitorowanie zmian impedancji elektrycznej komórek. Można wychwycić inwazyjne komórki nowotworowe, immunologiczne, śródbłonkowe lub zrębowe w złożonych tkankach i ocenić wpływ kokultur.

Wykrywanie i wychwytywanie w czasie rzeczywistym inwazyjnych subpopulacji komórek z kokultur

Przedstawiona tutaj jest metoda mechanicznego fenotypowania pojedynczych komórek za pomocą opartej na elektronice platformy mikroprzepływowej zwanej mechano-node-pore sensing (mechano-NPS). Platforma ta utrzymuje umiarkowaną przepustowość 1-10 komórek/s, mierząc zarówno elastyczne, jak i lepkie właściwości biofizyczne komórek.

Mechano-Node-Pore Sensing: szybka, niewymagająca oznaczeń platforma do wieloparametrowych pomiarów lepkosprężystych pojedynczych komórek

Poznaj metodę regeneracji złotych mikroelektrod w analizatorze komórek w czasie rzeczywistym RTCA. Technika umożliwia wielokrotne użycie płytek przy użyciu łagodnych odczynników, redukując koszty i odpady laboratoryjne.

Regeneracja złotych mikroelektrod w układzie w układzie dla analizatora komórek w czasie rzeczywistym

Przeglądaj więcej filmów