Regeneracja złotych mikroelektrod w układzie w układzie dla analizatora komórek w czasie rzeczywistym

Ogólnym celem tej procedury jest regeneracja komercyjnych płytek elektronicznych przystosowanych do analizatora komórek w czasie rzeczywistym (Real-Time Cell Analyzer, RTCA). Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie regeneracji jednorazowych chipów opartych na złocie, w tym regeneracji płytek elektronicznych stosowanych w RTCA. Główną zaletą tej techniki jest to, że procedura regeneracji może być przeprowadzona przy użyciu łagodnych i łatwo dostępnych odczynników laboratoryjnych o niskiej toksyczności.

Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy zaczęliśmy korzystać z analizatora Real-Time Cell Analyzer, który wykorzystuje chipy pokryte złotem. Procedurę należy rozpocząć od inkubacji i proliferacji komórek A549 w naczyniu do hodowli komórkowej, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Do każdego dołka inkubacyjnego płyty elektronicznej L8 należy dodać 150 µL pożywki komórkowej. Płytę należy pozostawić na 30 minut w komorze z laminarnym przepływem powietrza w celu wyrównania temperatury.

Po 30 minutach ręcznie włóż elektroniczną płytkę L8 do analizatora Real-Time Cell Analyzer w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie uruchom program operacyjny analizatora Real-Time Cell Analyzer na komputerze. Na domyślnej stronie konfiguracji wzorca eksperymentu wybierz Model Eksperymentu (Experiment Model) i nazwij przeprowadzany pomiar.

Na stronie układu (layout page) zaznacz odpowiednie studzienki uwzględnione w eksperymencie i wprowadź informacje, takie jak typ komórek, ich liczba oraz nazwy leków, w polach edycji. Na stronie harmonogramu (schedule page) dodaj kroki eksperymentalne, a następnie wybierz czas trwania każdego kroku oraz interwał akwizycji danych w czasie rzeczywistym. Kliknij start, aby zmierzyć impedancję tła medium.

Plik eksperymentu zostanie zapisany. Wynikowe dane zostaną automatycznie odjęte. Na stronie wykresu należy dodać studzienki, po czym zostanie wyświetlony wykres indeksu komórkowego w funkcji czasu.

W celu przeprowadzenia eksperymentu z proliferacji komórek, najpierw kliknij przycisk pauzy, aby wstrzymać program. Następnie wyjmij płytkę elektroniczną i dodaj do każdego dołka 100 µL buforu z zawiesiną komórek A549 w temperaturze pokojowej. Pozostaw płytkę na 30 minut w komorze z laminarnym przepływem powietrza, aby komórki osiadły na dnie dołków inkubacyjnych.

Ręcznie wsuń płytkę elektroniczną do stacji analizatora komórek w czasie rzeczywistym. Następnie kliknij przycisk start, aby kontynuować eksperyment. Na stronie z wykresem analizator stale rejestruje wartości indeksu komórkowego, czyli krzywe, przez cały czas trwania eksperymentu.

Po zakończeniu eksperymentu przejdź do strony wykresów i otwórz plik eksperymentu. Następnie zaznacz wszystkie testowane studzienki inkubacyjne oraz wynikowe krzywe indeksu komórkowego, które można uśrednić lub znormalizować po raz ostatni przed dodaniem leków farmaceutycznych lub zmianą medium, aby zmniejszyć różnice między analizami. Na stronie analizy danych można obliczyć EC50 lub IC50.

Po przeprowadzeniu oceny cytotoksyczności leku przeciwnowotworowego zgodnie z opisem w protokole tekstowym, wyjmij z analizatora Real-Time Cell Analyzer płytkę elektroniczną zawierającą komórki. Umieść zużytą płytkę elektroniczną w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza w temperaturze pokojowej i dokładnie wymieszaj pożywkę hodowlaną za pomocą pipety. Następnie za pomocą pipety odessij całą pożywkę.

Płucz płytki elektroniczne 200 µL wody dejonizowanej trzykrotnie w temperaturze pokojowej. Pozostałe komórki na płytkach elektronicznych traw w 0,25% świeżo przygotowanej trypsynie przez jedną do dwóch godzin w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Po zakończeniu trawienia, pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza w temperaturze pokojowej, wymieszaj roztwór inkubacyjny od pięciu do 10 razy za pomocą pipety, a następnie usuń roztwór.

Płucz płytki elektroniczne 200 µl wody zdejonizowanej dwukrotnie. Następnie przemyj 200 µl 100% etanolu dwukrotnie, a potem taką samą objętością 75% etanolu dwukrotnie. Na koniec ponownie wypłucz 200 µl wody zdejonizowanej dwukrotnie.

Odwróć płytkę elektroniczną na sterylną gazę lub ręcznik papierowy, aby odlać pozostałą wodę w temperaturze pokojowej. Następnie przeprowadź sterylizację ultrafioletową zregenerowanej płytki elektronicznej przez jedną do dwóch godzin w komorze z laminarnym przepływem powietrza w temperaturze pokojowej. Po wykorzystaniu płytek do dostarczania leków przy użyciu materiału mezoporowatego zgodnie z opisem w protokole tekstowym, straw przez trypsynę pozostałe komórki w sposób opisany wcześniej.

Ponieważ pipeta jest często używana podczas eksperymentów, należy zwrócić uwagę, aby nie porysować końcówki oraz powierzchni mikroczipów. Przepłucz mikroczipy 200 µL wody dejonizowanej jednorazowo w komorze z laminarnym przepływem powietrza w temperaturze pokojowej. Następnie przemyj mikroczipy 200 µL absolutnego etanolu dwukrotnie w temperaturze pokojowej.

Następnie przepłucz mikroczipy raz 200 µL 75% etanolu w temperaturze pokojowej. Do każdej studni dodaj 250 µL 75% etanolu, a następnie zabezpiecz płytkę elektroniczną folią uszczelniającą w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu płytki elektronicznej z prędkością 114 ×g przez dwie minuty opróżnij płytkę.

Odwróć płytkę elektroniczną na sterylnej gazie lub papierze ręcznikowym, aby odlać pozostały płyn w temperaturze pokojowej. Powtórz płukanie 75% ethanol, a następnie wirówkę. Następnie przeprowadź sterylizację ultrafioletową zregenerowanej płytki elektronicznej przez jedną do dwóch godzin w komorze z laminarnym przepływem powietrza w temperaturze pokojowej.

Oceń właściwości optyczne zregenerowanej powierzchni płyty elektronicznej, najpierw demontując dolną część dołka inkubacyjnego zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby ocenić żywotność przytwierdzonych komórek po pobraniu leku przeciwnowotworowego na świeżych i zregenerowanych płytach elektronicznych, wykorzystaj konfokalny mikroskop skaningowy do monitorowania spontanicznej fluorescencji cząsteczek DOX pochłoniętych przez komórki A549. W celu zarejestrowania spontanicznej fluorescencji DOX pochłoniętego przez komórki, użyj obiektywu olejowego 63× oraz długości fali wzbudzenia 485 nanometrów.

Następnie oceniono właściwości elektrochemiczne zregenerowanych elektrod, zaczynając od wypolerowania elektrody złotej oraz elektrody z węgla szklistego do uzyskania powierzchni lustrzanej przy użyciu zawiesiny polerskiej Illumina na tkaninie polerskiej. Następnie elektrody poddano sonikacji w wodzie w celu usunięcia wszelkich cząsteczek. W kolejnym kroku aktywowano elektrodę złotą w 0,5-moliarskim kwasie siarkowym.

Przeprowadź pomiary spektroskopii impedancyjnej elektrochemicznej (EIS) dla gołej elektrody złotej oraz elektrody z węgla szklistego w 10-mM roztworze elektrolitu chlorku potasu, zawierającym 1 mM ferocyjanku potasu. Następnie nanieś 10 µL zawiesiny komórek na powierzchnię elektrody złotej w GCE. Po dodaniu komórek inkubuj elektrodę złotą w GCE w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez trzy godziny, a następnie uzyskaj dane EIS dla elektrod zmodyfikowanych komórkami, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Aby zregenerować elektrody, zanurz elektrodę złotą oraz GCE zmodyfikowaną komórkami w 0,25% trypsyną na okres od 0,5 do 2 godzin. Delikatnie przemyj obie elektrody wodą czterokrotnie. Następnie delikatnie przemyj elektrody czterokrotnie absolutnym etanolem.

Następnie zanurz elektrodę złota w GCE w 75% etanolu przez około pięć minut. Po pięciu minutach delikatnie opłucz chip 75% etanolem cztery razy przed uzyskaniem danych EIS z regenerowanych elektrod, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby ocenić wydajność regeneracji macierzy złotej płyty elektronicznej, przeprowadzono obserwacje mikroskopowe zarówno dla świeżych, jak i traktowanych płyt elektronicznych.

Nie stwierdzono istotnych różnic w właściwościach optycznych powierzchni mikrochipów. Fluorescencję cząsteczek doxorubicyny wykorzystano do oceny stanu komórek na złotych mikrochipach przed i po regeneracji. Podobna homogeniczność oraz dobrze zdefiniowana morfologia komórkowa wykazały możliwość ponownego wykorzystania chipów.

Protokół regeneracji jest stosowany do rzeczywistego testu proliferacji komórek. Krzywe wzrostu uzyskane z wielu studni inkubacyjnych testowanej płytki elektronicznej wykazują dobrą spójność, co wskazuje na pomyślną regenerację komercyjnego chipa. Przedstawiona tutaj zregenerowana płytka elektroniczna L8 została przetestowana w celu oceny cytotoksyczności z wykorzystaniem materiałów z mezoporowatej krzemionki.

Indeks komórkowy próbki traktowanej materiałami mezoporowatymi spadł w porównaniu z kontrolą, co wskazuje na lekką cytotoksyczność tych materiałów. Dalsza enkapsulacja i uwalnianie leku przeciwnowotworowego doksorubicyny przez materiały mezoporowate spowodowały gwałtowny spadek krzywej wzrostu komórek A549. Po opanowaniu techniki, jej wykonanie zajmuje cztery godziny, pod warunkiem przeprowadzenia procedury w sposób prawidłowy.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że czas trawienia typu zlewni może różnić się w zależności od konkretnego układu. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak konfokalna mikroskopia skaningowa, a nawet spektroskopia czy spektroskopia impedancyjna elektrochemiczna, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. w celu oceny efektu regeneracji.