Regeneracja złotych mikroelektrod w układzie w układzie dla analizatora komórek w czasie rzeczywistym
12 marca 2018
Ten protokół opisuje ogólną strategię regeneracji komercyjnych mikroelektrod złotych wyposażonych w bezznacznikowy analizator komórek, mający na celu zaoszczędzenie na wysokich kosztach eksploatacji testów opartych na mikroprocesorach. Proces regeneracji obejmuje trawienie trypsyną, płukanie etanolem i wodą oraz etap wirowania, który umożliwia wielokrotne użycie mikroczipów.
Ogólnym celem tej procedury jest regeneracja komercyjnych płytek elektronicznych wyposażonych w analizator komórek w czasie rzeczywistym (RTCA). Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie regeneracji jednorazowych chipów na bazie złota, w tym regeneracji planów elektronicznych stosowanych w RTCA. Główną zaletą tej techniki jest to, że procedura regeneracji może być przeprowadzona przy użyciu łagodnych i łatwo dostępnych odczynników laboratoryjnych o niskiej toksyczności.
Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zaczęliśmy używać analizatora komórek w czasie rzeczywistym, który kosztował chipy na bazie złota. Rozpocznij tę procedurę od inkubacji i proliferacji komórek A549 w naczyniu do hodowli komórkowych, jak opisano w protokole tekstowym. Dodać 150 mikrolitrów pożywki komórkowej do każdej studzienki inkubacyjnej płytki elektronicznej L8. Pozostaw płytkę na 30 minut w kapturze bezpieczeństwa biologicznego w celu zrównoważenia.
Po 30 minutach ręcznie włóż płytkę elektroniczną L8 do analizatora komórek w czasie rzeczywistym w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie uruchom program operacyjny Real-Time Cell Analyzer na komputerze. Na stronie ustawień domyślnego wzorca eksperymentu wybierz pozycję Model eksperymentu i nazwij uruchomiony test.
Na stronie układu wybierz odpowiednie studzienki, które są uwzględnione w eksperymencie, i wprowadź informacje, takie jak typ komórki, liczba i nazwy leków w polach edycji. Na stronie harmonogramu dodaj kroki eksperymentalne, a następnie wybierz czas wykonywania każdego kroku i interwał pobierania danych w czasie rzeczywistym. Kliknij start, aby zmierzyć impedancję tła nośnika.
Plik eksperymentu zostanie zapisany. Wynikowe dane zostaną automatycznie odjęte. Na stronie wykresu dodaj studnie, a zostanie wyświetlony wykres indeksu komórek czasowych.
W eksperymencie proliferacji komórek najpierw kliknij przycisk pauzy, aby wstrzymać program. Następnie wyjmij płytkę elektroniczną i dodaj 100 mikrolitrów buforu zawiesiny komórek A549 na studzienkę w temperaturze pokojowej. Pozostawić płytkę na 30 minut w okapie bezpieczeństwa biologicznego, aby komórki osiadły na dnie studzienek inkubacyjnych.
Ręcznie włóż płytkę elektroniczną do stacji analizatora komórek w czasie rzeczywistym. Następnie kliknij przycisk Start, aby kontynuować eksperyment. Na stronie wykresu analizator w sposób ciągły rejestruje wartości indeksu komórek lub krzywe przez cały czas trwania eksperymentu.
Po zakończeniu eksperymentu przejdź na stronę wykresu i otwórz plik eksperymentu. Następnie wybierz wszystkie testowane studzienki inkubacyjne i wynikowe krzywe indeksu komórkowego, które można uśrednić lub znormalizować po raz ostatni przed dodaniem leków farmaceutycznych lub zmianą pożywki, aby zmniejszyć różnice między testami. Na stronie analizy danych można obliczyć EC50 lub IC50.
Po wykonaniu oceny cytotoksyczności leku przeciwnowotworowego zgodnie z opisem w protokole tekstowym, należy wyjąć elektroniczną płytkę zawierającą komórki ze stacji Real-Time Cell Analyzer. Umieść zużytą płytkę elektroniczną w sterylnym kapturze bezpieczeństwa biologicznego w temperaturze pokojowej i dokładnie wymieszaj pożywkę hodowlaną za pomocą pipety. Następnie za pomocą pipety odessać całe podłoże.
Opłucz płytki elektroniczne 200 mikrolitrami dejonizowanej wody trzy razy w temperaturze pokojowej. Pozostałe komórki na płytkach elektronicznych trawić 0,25% świeżo przygotowanej trypsyny przez jedną do dwóch godzin w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po zakończeniu trawienia należy pracować w okapie bezpieczeństwa biologicznego w temperaturze pokojowej, aby wymieszać roztwór inkubacyjny od pięciu do 10 razy za pomocą pipety, a następnie usunąć roztwór.
Opłucz płytki elektroniczne dwukrotnie 200 mikrolitrami wody dejonizowanej. Następnie dwukrotnie umyj 200 mikrolitrami 100% etanolu, a następnie dwukrotnie tą samą objętością 75% etanolu. Na koniec spłucz dwukrotnie kolejnymi 200 mikrolitrami wody dejonizowanej.
Odwróć płytkę elektroniczną na sterylnej gazie lub bibułce, aby zdekantować pozostałą wodę o temperaturze pokojowej. Następnie wykonuj sterylizację ultrafioletową na zregenerowanej płytce elektronicznej przez jedną do dwóch godzin w okapie bezpieczeństwa biologicznego w temperaturze pokojowej. Po użyciu płytek do podawania leku za pomocą materiału mezoporowatego, jak opisano w protokole tekstowym, należy strawić pozostałe komórki trypsyną jak poprzednio.
Ponieważ pipeta jest często używana w eksperymentach, osoba powinna zwrócić uwagę, aby uniknąć zarysowania końcówki i powierzchni mikroczipów. Opłucz mikroczipy 200 mikrolitrami dejonizowanej wody raz w okapie bezpieczeństwa biologicznego w temperaturze pokojowej. Następnie podnieś mikroczipy z 200 mikrolitrami absolutnego etanolu dwa razy w temperaturze pokojowej.
Następnie spłucz mikroczipy 200 mikrolitrami 75% etanolu raz w temperaturze pokojowej. Dodaj 250 mikrolitrów 75% etanolu do każdej studzienki i uszczelnij płytkę elektroniczną folią uszczelniającą w temperaturze pokojowej. Po obracaniu płytki elektronicznej pod kątem 114 razy G przez dwie minuty, opróżnij płytkę.
Odwróć płytkę elektroniczną na sterylnej gazie lub bibułce, aby zdekantować pozostały płyn w temperaturze pokojowej. Powtórz płukanie 75% etanolem, a następnie wirowanie. Następnie wykonuj sterylizację ultrafioletową na zregenerowanej płytce elektronicznej przez jedną do dwóch godzin w okapie bezpieczeństwa biologicznego w temperaturze pokojowej.
Ocenić charakterystyki optyczne zregenerowanej powierzchni płytki elektronicznej, demontując najpierw dolną część inkubacji, jak opisano w protokole tekstowym. Aby ocenić żywotność przyłączonych komórek po wchłonięciu leku przeciwnowotworowego na świeżych i zregenerowanych płytkach elektronicznych, należy użyć konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego do monitorowania spontanicznej fluorescencji cząsteczek DOX wchłoniętych przez komórki A549. Aby zarejestrować spontaniczną fluorescencję wchłoniętego DOX przez komórki, użyj 63-krotnego obiektywu olejowego i 485 nanometrów jako długości fali wzbudzenia.
Następnie oceń zachowania elektrochemiczne zregenerowanych elektrod, najpierw polerując złotą elektrodę i szklistą elektrodę węglową do powierzchni przypominającej lustro za pomocą zawiesiny iluminacyjnej na ściereczce do polerowania. Następnie poddaj elektrody sonikacji w wodzie, aby usunąć wszelkie cząstki. Następnie aktywuj złotą elektrodę w 0,5-molowym kwasie siarkowym.
Uzyskaj dane elektrochemicznej spektroskopii impedancyjnej lub EIS elektrody z gołego złota i szklistej elektrody węglowej w 10-milimolowym roztworze elektrolitu chlorku potasu, zawierającym jeden milimolowy feracyjanek potasu. Teraz upuść 10 mikrolitrów zawiesiny ogniwa na powierzchnię złotej elektrody w GCE. Po dodaniu komórek należy inkubować złotą elektrodę w GCE w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny przed uzyskaniem danych EIS elektrod zmodyfikowanych za pomocą komórek, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
Aby zregenerować elektrody, zanurz złotą elektrodę w GCE zmodyfikowanym ogniwami w 0,25% trypsyny na 0,5 do dwóch godzin. Delikatnie opłucz obie elektrody wodą cztery razy. Następnie delikatnie przepłucz elektrody czterokrotnie absolutnym etanolem.
Następnie zanurz złotą elektrodę w GCE w 75% etanolu na około pięć minut. Po pięciu minutach delikatnie przepłucz chip 75% etanolem cztery razy przed uzyskaniem danych EIS regenerowanych elektrod, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby ocenić skuteczność regeneracji złotej płytki elektronicznej, przeprowadzono obserwacje mikroskopowe zarówno dla świeżych, jak i poddanych obróbce płytek elektronicznych.
Nie stwierdzono żadnej wirtualnej różnicy we właściwościach optycznych powierzchni mikroprocesora. Throescence cząsteczek doksorubicyny służy do oceny stanu komórek na mikroczipach złota przed i po regeneracji. Podobna jednorodność i dobrze zdefiniowana morfologia komórkowa wykazały możliwość wielokrotnego użytku chipów.
Protokół regeneracji jest stosowany do prawdziwego testu proliferacji komórek. Krzywe wzrostu uzyskane z wielu dołków inkubacyjnych testowanej płytki elektronicznej wykazują dobrą spójność, co wskazuje na udaną regenerację komercyjnego chipa. Pokazana tutaj zregenerowana płytka elektroniczna L8 została przetestowana pod kątem oceny cytotoksyczności przy użyciu mezoporowatych materiałów krzemionkowych.
Indeks komórkowy próbki poddanej działaniu materiałów mezoporowatych zmniejszył się w porównaniu z kontrolą, co wskazuje na niewielką cytotoksyczność materiałów. Dalsza enkapsulacja i uwalnianie leku przeciwnowotworowego doksorubicyny przez materiały mezoporowate spowodowało dramatyczny spadek krzywej wzrostu komórek A549. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu czterech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że czas trawienia w zlewie może się różnić w zależności od chipsa. Zgodnie z tą procedurą można wykonać inne metody, takie jak konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa, a nawet spektroskopia, elektrochemiczna spektroskopia impedancyjna w celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak ocena efektu regeneracji.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół opisuje metodę regeneracji komercyjnych mikroelektrod złota stosowanych w analizatorze komórek w czasie rzeczywistym (RTCA). Proces regeneracji ma na celu zmniejszenie kosztów związanych z jednorazowymi mikrochipami poprzez umożliwienie wielokrotnego użycia poprzez serię łagodnych obróbek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Elektrofizjologia
Tło
- Mikrochipy na bazie złota są powszechnie używane w RTCA do analizy komórek.
- Jednorazowe mikrochipy powodują wysokie koszty w ustawieniach badawczych.
- Regeneracja tych chipów może zwiększyć zrównoważoność w praktykach laboratoryjnych.
- Metoda wykorzystuje środki o niskiej toksyczności, co czyni ją bezpieczniejszą dla środowiska laboratoryjnego.
Cel badania
- Rozwój opłacalnej metody regeneracji mikroelektrod złota.
- Zbadanie wykonalności ponownego użycia płytek elektronicznych w RTCA.
- Minimalizacja odpadów i zmniejszenie wpływu na środowisko jednorazowych materiałów laboratoryjnych.
Stosowane metody
- Inkubacja i proliferacja komórek A549 w naczyniu do hodowli komórek.
- Zastosowanie trawienia trypsyną do odłączenia komórek od mikroelektrod.
- Płukanie elektrod etanolem i wodą.
- Zastosowanie kroku wirowania w celu ułatwienia procesu regeneracji.
Główne wyniki
- Procedura regeneracji umożliwia wielokrotne użycie mikroelektrod złota.
- Zastosowanie łagodnych środków zapewnia niską toksyczność podczas procesu.
- Metoda wykazuje skuteczność w utrzymaniu funkcjonalności elektrod.
- Oszczędności kosztów są znaczne w porównaniu z zakupem nowych mikrochipów.
Wnioski
- Ten protokół regeneracji przedstawia opłacalną alternatywę dla jednorazowych mikroelektrod.
- Wspiera zrównoważone praktyki w badaniach nad analizą komórek.
- Podejście może być dostosowane do różnych rodzajów płytek elektronicznych stosowanych w RTCA.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Disposable gold microchips in real-time cell analysis impose significant recurring costs that limit assay scalability in drug discovery workflows. This regeneration protocol enables cost-effective reuse of commercial electronic plates, supporting sustainable and scalable label-free impedance-based cell assays. By reducing consumable expenses, the method improves capital efficiency and supports higher-throughput screening in early discovery stages.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables repeated label-free monitoring of cellular responses to compounds, supporting consistent target engagement assessment.
- Operational Value: Reduces variability between assays by allowing reuse of standardized electrode surfaces under controlled conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a reusable platform for real-time impedance readouts, facilitating kinetic profiling of compound effects on cell adhesion and proliferation.
- Operational Value: Supports assay standardization across multiple runs, improving data comparability in dose-response and cytotoxicity screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains electrode functionality for longitudinal studies, enabling assessment of drug-induced cellular changes over time.
- Operational Value: Allows for repeated testing of the same plate format, supporting follow-up mechanistic studies after initial screening hits.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum by enabling reusable impedance-based readouts from early compound screening through follow-up mechanistic validation, reducing the need for repeated chip procurement.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via real-time, label-free measurement of cellular impedance as a proxy for adhesion, viability, and morphology.
- Screening: Enhances assay readiness and reproducibility by allowing consistent electrode performance across multiple experimental cycles.
- Analytics: Generates quantitative impedance outputs (e.g., cell index) that can be normalized and compared across conditions to assess compound effects.
- Translational Research: Enables continuity from initial screening to secondary validation by preserving electrode functionality for repeated use.
- Enterprise Reuse: Positions the regeneration process as a reusable laboratory capability rather than a single-use consumable workflow.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence by enabling consistent, low-variability measurements across replicate assays.
- Operational Value: Increases throughput and reduces downtime associated with chip replacement and revalidation.
- Strategic Value: Lowers cost per assay, improving budget efficiency in high-volume screening campaigns.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted decision-making by generating reliable, reproducible data across multiple test cycles.
Implementation Considerations
- Requires aseptic technique and familiarity with cell culture handling to avoid electrode surface damage.
- Depends on access to standard lab equipment including incubators, pipettes, centrifuges, and UV sterilization units.
- Necessitates optimization of trypsin exposure time based on cell type and adhesion strength to prevent electrode degradation.
- Requires training to ensure consistent execution of rinsing, spinning, and sterilization steps across users.
- Performance should be validated via impedance baseline stability and optical/electrochemical characterization before reuse in critical assays.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:52
Proliferation/Cytotoxicity Experiment and Data Acquisition
3:54
Case 1: Regeneration of Electronic Plates after Cytotoxicity Evaluation of Anti-cancer Drug
5:53
Case 2: Regeneration of Electronic Plates after Drug Delivery using Mesoporous Material
7:34
Assessment of Regeneration Effect
10:22
Results: Evaluationof Regenerated Electronic Plates
12:01
Conclusion
