RGB i spektralne obrazowanie korzeni do fenotypowania roślin i badań fizjologicznych: konfiguracja eksperymentalna i protokoły obrazowania

Ogólnym celem niniejszej procedury jest uzyskanie kompleksowych informacji na temat korzeni roślin rosnących w wypełnionych glebą ryzoboksach poprzez połączenie różnych metod obrazowania. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu fenotypowania i hodowli roślin, takie jak wpływ różnych architektur korzeni na lepszą odporność na stresy abiotyczne. Główną zaletą tego podejścia jest połączenie obrazowania RGB w celu analizy architektury korzeni oraz obrazowania hiperspektralnego w celu oceny funkcjonalności korzeni.

Potencjał wykorzystania obrazowania hiperspektralnego w badaniach korzeni rozciąga się na szeroki zakres parametrów ryzosfery, ponieważ informacje spektralne mogą ujawnić małoskalowe zmiany fizykochemiczne wprowadzone przez korzenie roślin. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy napełniania ryzoboksu muszą zostać przeprowadzone starannie. W przeciwnym razie wzrost korzeni oraz ich widoczność zostaną negatywnie utrudnione.

Procedurę należy rozpocząć od przygotowania rizoboksów do wypełnienia podłożem, zgodnie ze szczegółowym opisem w protokole tekstowym. Należy wstępnie nawilżyć suchą glebę do grawimetrycznej zawartości wody wynoszącej 0,108 gram na gram, dodając 400 gramów wody na 3 705 gramów suchej gleby. Glebę i wodę należy delikatnie wymieszać, aby uzyskać jednorodny rozkład wody.

Ręcznie rozbić większe agregaty, aby utrzymać wielkość cząstek mniejszą niż lub równą 2 mm. Kluczowe jest uzyskanie homogenicznej warstwy gleby przy oknie obserwacyjnym gazu, unikając przerw powietrznych. Wierzchołki korzeni roślin szybko wysychają, wrastając w przestrzenie powietrzne.

Jakość obrazowania spektralnego dla mapowania wody ulega również pogorszeniu. Wypełnij otwarte ryzoboksy wcześniej namoczoną glebą i delikatnie ją ugnieć, używając arkusza polistyrenowego pokrywającego wewnętrzną objętość pojemnika, aby uzyskać jednorodną gęstość objętościową wynoszącą 1.3 g/cm³. Pozostałą ilość wody, niezbędną do osiągnięcia docelowej zawartości wody na poziomie 0.31 cm³/cm³, dodaj, rozpylając ją na powierzchnię za pomocą butelki ze spryskiwaczem.

Należy zapewnić małą wielkość kropli, aby uniknąć degradacji struktury powierzchni, a także uzyskać jednorodne zwilżenie. Podczas rozpylania należy trzymać pudełko na wadze, aby monitorować ilość wody faktycznie dodanej do podłoża. Pozostawić wodę na 10 minut w celu jej redystrybucji, a następnie docisnąć szkło do powierzchni i przymocować je za pomocą bocznych szyn metalowych.

Średnia końcowa masa rizoboksów z namoczonym podłożem wynosiła 17 818 ± 68 g. Wyposaż pomieszczenie klimatyczne w osiem lamp LED zapewniających jednorodne oświetlenie o natężeniu 450 µmol m⁻² s⁻¹ z pikami widmowymi przy 440 i 660 nm w celu optymalnego wzrostu roślin. Po ustawieniu parametrów otoczenia zgodnie z potrzebami roślin i wymogami eksperymentu, zasłoń szklane okno drewnianą płytą, aby utrzymać strefę korzeniową w ciemności i zapobiec rozwojowi glonów spowodowanemu przenikaniem światła przez szklaną powierzchnię.

Następnie umieść rhizoboxy pod kątem 45 stopni, korzystając z odpowiedniej metalowej konstrukcji. Maksymalizuje to wzrost korzeni w kierunku szklanej powierzchni dzięki gravitropizmowi. W celu obrazowania korzeni w systemie RGB oświetl rhizobox za pomocą czterech 24-watowych świetlówek zamontowanych w odległości 80 centymetrów od rhizoboxu.

Należy również zamontować cztery lampy UV o mocy 15 W w odległości 20 centymetrów od rhizoboxu jako alternatywne oświetlenie, wykorzystujące autofluorescencję korzeni w przypadku niskiego kontrastu między korzeniami a jasnym tłem substratu. Należy włączyć lampy UV, a następnie umieścić rhizobox przeznaczony do obrazowania w uchwycie komory obrazującej. Następnie należy wykonać dwa zdjęcia, aby objąć górną i dolną połowę rhizoboxu, zachowując zakładkę o szerokości około trzech centymetrów.

Należy pozyskać i przetworzyć obrazy RBG zgodnie ze szczegółami opisanymi w protokole tekstowym. Na koniec należy przeprowadzić analizę pozyskanych obrazów korzeni RBG, a następnie sprawdzić, czy występują obszary niedopasowane. W takim przypadku należy zdefiniować region wykluczenia i zrestartować analizę.

W przypadku korzeni niezaklasyfikowanych należy dodać dodatkowe klasy kolorów i ponownie uruchomić analizę. Dla elementów błędnie zaklasyfikowanych jako korzenie należy aktywować lub zwiększyć opcje filtrowania zanieczyszczeń i nierównych krawędzi. Akwizycję obrazów należy przeprowadzić, najpierw określając czasy integracji kamery dla skanowania rhizoboxu oraz wzorca bieli w oprogramowaniu kamery.

Aby to zrobić, otwórz interfejs graficzny obrazowania i przesuń kamerę w miejsce w ryzoboksie, w którym znajdują się korzenie. Dostosuj czas integracji kamery, celując w jasny obiekt w taki sposób, aby na histogramie wyświetlanym przez oprogramowanie wykorzystane zostało około 85% pełnego zakresu dynamicznego kamery. Prawidłowe ustawienie czasu integracji dla różnych podłoży i tkanek korzenia jest kluczowe, aby w pełni wykorzystać zakres dynamiczny kamery na podczerwień, unikając utraty informacji wynikającej z przekroczenia tego zakresu.

Powtórz ten proces dla wzorca białego, przesuwając system pozycjonowania kamery na wzorzec biały przed zamknięciem oprogramowania kamery. Następnie otwórz interfejs graficzny GUI obrazowania w programie Matlab i wprowadź wszystkie ustawienia z bieżącego skanowania rhizoboxu. Przed każdą serią obrazowania, raz dziennie, wykonaj pomiary wzorców ciemnego i białego.

Standard ciemny reprezentuje szum kamery, natomiast standard jasny określa maksymalną odblaskowość. Dane te są niezbędne do normalizacji obrazu podczas wstępnego przetwarzania. Należy określić, czy skanowany jest cały rhizobox, czy tylko jego część.

W niniejszym przypadku obrazowane są całe ryzoboksy. Następnie należy rozpocząć skanowanie. Do pomiaru zawartości wody w oparciu o analizę spektralną niezbędny jest ryzoboks kalibracyjny.

Podziel ryzoboks na pięciocentymetrowe przedziały za pomocą arkuszy polistyrenu, aby wypełnić je glebą o różnej zawartości wody. Zeskanuj kalibracyjny ryzoboks, korzystając z tych samych ustawień, które zostały zastosowane dla ryzoboksów z roślinami. Jako przykład, w celu połączenia cech korzeni i części nadziemnych, użyj porometru liściowego do pomiaru przewodnictwa szparkowego.

Równoważyć urządzenie z warunkami otoczenia przez co najmniej jedną godzinę w komorze klimatycznej. Wykonać pomiary z co najmniej trzech liści z każdej rośliny. Przedstawiono tutaj reprezentacyjny obraz wzrostu korzenia buraka cukrowego odmiany Ferrara, uzyskany za pomocą obrazowania RGB.

W 35. dniu po wysiewie korzenie roślin wydłużyły się, osiągając dno rizoboksu. Niektórych osi korzeniowych w górnej części rizoboksu nie udało się wysegmentować z obrazów RGB. Starzenie się starszych korzeni bazalnych powoduje zmianę ich barwy na brązową.

W związku z tym oddzielenie tych korzeni od tła glebowego na podstawie progu kolorystycznego okazuje się nieskuteczne. Dzięki zastosowaniu obrazowania hiperspektralnego segmentacja opiera się na różnych cechach spektralnych pierwszego planu (korzeni) i tła (gleby). Pozwala to na uzyskanie lepszych wyników segmentacji.

Różnice w zmierzonej długości korzenia w stosunku do obrazu referencyjnego śledzonego ręcznie wynoszą zaledwie 1,5%. Ponadto obrazowanie spektralne pozwala na precyzyjne mapowanie zawartości wody wokół korzenia w celu wyciągnięcia wniosków na temat poboru wody. Tutaj szkielet korzenia pokazano na czarno. Jaśniejsze obszary wskazują regiony większego wyczerpania wody w pobliżu osi korzenia.

Podczas gdy ciemnoniebieskie obszary reprezentują regiony o wyższej zawartości wody w glebie poza zasięgiem korzeni. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat prawidłowego wypełniania rizoboksów w celu zapewnienia satysfakcjonującego wzrostu i widoczności korzeni. Stanowi to podstawę dla późniejszego obrazowania i reprezentatywnych wyników fenotypowania korzeni.

Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody klasyfikacji spektralnej, takie jak grupowanie K-średnich lub maszyny wektorów nośnych, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat właściwości korzeni i ryzosfery, takich jak starzenie się i rozkład korzeni. Po opracowaniu, technika ta pozwala na kompleksowe fenotypowanie systemów korzeniowych oraz odpowiedzi na stres abiotyczny. Zbiór 10 odmian można scharakteryzować w całkowitym czasie trwania eksperymentu wynoszącym mniej niż trzy miesiące.