RGB i spektralne obrazowanie korzeni do fenotypowania roślin i badań fizjologicznych: konfiguracja eksperymentalna i protokoły obrazowania

Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie wyczerpujących informacji na temat korzeni roślin rosnących w kłączach wypełnionych glebą poprzez połączenie różnych metod obrazowania. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie fenotypowania i hodowli roślin, takie jak wpływ różnych architektur korzeniowych na lepszą odporność na stres abiotyczny. Główną zaletą tego podejścia jest to, że łączy obrazowanie RGB dla architektury root i obrazowanie hiperspektralne dla funkcjonalności root.

Potencjał wykorzystania obrazowania hiperspektralnego korzeni rozciąga się w szerokim zakresie parametrów ryzosfery, ponieważ informacje spektralne mogą ujawnić zmiany fizykochemiczne na małą skalę wprowadzone przez korzenie roślin. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy napełniania rhizobox muszą być wykonane ostrożnie. W przeciwnym razie wpłynie to negatywnie na wzrost korzeni i widoczność korzeni.

Procedurę tę należy rozpocząć od przygotowania kłączoboxów do wypełnienia podłoża zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Wstępnie zwilż suchą glebę do grawimetrycznej zawartości wody 0,108 grama na gram, dodając 400 gramów wody na 3 705 gramów suchej gleby. Delikatnie wymieszaj glebę i wodę, aby uzyskać jednorodny rozkład wody.

Ręcznie rozbijaj większe agregaty, aby rozmiar cząstek był mniejszy lub równy dwóm milimetrom. Bardzo ważne jest, aby uzyskać jednorodną warstwę gleby w pobliżu okna obserwacji gazu, unikając szczelin powietrznych. Wierzchołki korzeni roślin szybko się odwadniają, wrastając w szczeliny powietrzne.

Ma to również negatywny wpływ na jakość obrazu spektralnego do mapowania wody. Wstępnie zwilżoną glebę należy wsypać do otwartych pojemników na ryzoboxy i delikatnie zagęścić ją za pomocą arkusza styropianu, aby pokryć wewnętrzną objętość skrzynki, uzyskując w ten sposób jednorodną gęstość nasypową wynoszącą 1,3 grama na centymetr sześcienny. Dodaj pozostałą ilość wody, aby osiągnąć docelową zawartość wody 0,31 centymetra sześciennego na centymetr sześcienny, spryskując powierzchnię za pomocą butelki z rozpylaczem.

Zapewnij mały rozmiar kropli, aby uniknąć degradacji struktury powierzchni, a także jednorodnego zwilżania. Utrzymuj pudełko na wadze podczas opryskiwania, aby monitorować ilość wody faktycznie dodanej do podłoża. Pozwól wodzie ponownie się rozprowadzić przez 10 minut, a następnie dociśnij szklankę do powierzchni i przymocuj ją bocznymi metalowymi szynami.

Średnia końcowa waga kłączoboxów z zwilżonym podłożem wynosiła 17 818 plus minus 68 gramów. Wyposaż pomieszczenie klimatyczne w osiem lamp LED zapewniających jednorodne oświetlenie 450 mikromoli na metr kwadratowy na sekundę z pikami widmowymi przy 440 i 660 nanometrach dla optymalnego wzrostu roślin. Po ustawieniu parametrów otoczenia zgodnie z rośliną i potrzebami eksperymentalnymi, przykryj szklane okno drewnianą płytą, aby utrzymać strefę korzeniową w ciemności i uniknąć wzrostu glonów z powodu światła przenikającego przez powierzchnię szkła.

Następnie umieść kłączoboxy pod kątem 45 stopni za pomocą odpowiedniej metalowej ramy. Maksymalizuje to wzrost korzeni w kierunku powierzchni szkła z powodu grawitropizmu. W przypadku obrazowania korzeni RGB oświetl ryzobox za pomocą czterech 24-watowych świetlówek fluorescencyjnych przymocowanych w odległości 80 centymetrów od ryzoboxa.

Zamontuj również cztery 15-watowe lampy UV w odległości 20 centymetrów od alternatywnego oświetlenia rhizoboxa, wykorzystując autofluorescencję korzeni w przypadku niskiego kontrastu między korzeniem a jasnym tłem podłoża. Włącz lampy UV, a następnie zamontuj rhizobox, który ma być obrazowany, w uchwycie skrzynki obrazowej. Następnie zrób dwa zdjęcia, aby pokryć górną i dolną połowę kłącza z zakładką około trzech centymetrów.

Pobieraj i przetwarzaj obrazy RBG zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Na koniec uruchom analizę uzyskanych obrazów korzeni RBG, a następnie sprawdź, czy istnieją regiony, które są niezgodne. W takim przypadku należy zdefiniować obszar wykluczenia i ponownie uruchomić analizę.

W przypadku pierwiastków, które nie są sklasyfikowane, dodaj dodatkowe klasy kolorów i ponownie uruchom analizę. W przypadku elementów błędnie sklasyfikowanych jako korzenie, aktywuj lub zwiększ opcje filtrowania zanieczyszczeń i ostrych krawędzi. Wykonaj akwizycję obrazu, określając najpierw czasy integracji kamery dla skanowania rhizobox i biały standard w oprogramowaniu kamery.

Aby to zrobić, otwórz graficzny interfejs użytkownika do obrazowania i przesuń kamerę w miejsce kłącza, w którym znajdują się korzenie. Dostosuj czas integracji kamery celującej w jasny obiekt w taki sposób, aby około 85% pełnego zakresu dynamicznego kamery było wykorzystywane na histogramie wyświetlanym przez oprogramowanie. Prawidłowe ustawienie czasu integracji dla różnych podłoży i tkanek korzeniowych ma kluczowe znaczenie dla pełnego wykorzystania zakresu dynamicznego kamery termowizyjnej poprzez uniknięcie utraty informacji w wyniku przekroczenia jej zakresu.

Powtórz ten proces dla białego standardu, przesuwając system pozycjonowania kamery w celu wycelowania w biały standard przed zamknięciem oprogramowania kamery. Następnie otwórz GUI obrazowania Matlab i wprowadź wszystkie ustawienia z bieżącego skanowania rhizobox. Ciemne i białe wzorce należy otrzymywać przed każdym badaniem obrazowania raz dziennie.

Ciemny standard reprezentuje szum aparatu, podczas gdy biały standard zapewnia maksymalny współczynnik odbicia. Dane te są wymagane do normalizacji obrazu podczas przetwarzania wstępnego. Określ, czy skanowany ma być cały rhizobox, czy tylko jego część.

W tym przypadku obrazowane są całe ryzoboxy. Następnie rozpocznij skanowanie. Do spektralnego pomiaru zawartości wody potrzebny jest ryzobox kalibracyjny.

Podziel kłączobox na pięciocentymetrowe przegrody za pomocą arkuszy styropianu, aby wypełnić je ziemią o różnej zawartości wody. Zeskanuj ryzobox kalibracyjny z tymi samymi ustawieniami, które są używane w przypadku posadzonych ryzoboxów. Na przykład, aby połączyć cechy korzeni i nadziemia, uzyskaj porometr liściowy do pomiaru przewodności aparatów szparkowych.

Przygotować urządzenie do warunków otoczenia przez co najmniej jedną godzinę w komorze klimatycznej. Wykonaj pomiary z co najmniej trzech liści na roślinę. Reprezentatywny obraz wzrostu korzeni odmiany buraka cukrowego Ferrara, oparty na obrazowaniu RGB, jest pokazany tutaj.

Po 35 dniach od wysiewu korzenie roślin wydłużyły się, aby dotrzeć do dna kłącza. Nie można było oddzielić niektórych osi korzeniowych w górnej części ryzoboxa od obrazów RGB. Starzenie się starszych korzeni podstawowych zmienia ich kolor na brązowy.

W związku z tym oddzielenie tych korzeni od tła gleby na podstawie progu koloru nie powiedzie się. Korzystając z obrazowania hiperspektralnego, segmentacja opiera się na różnych cechach spektralnych pierwszego planu korzeni i tła gleby. Poprawia to wynik segmentacji.

Różnice w zmierzonej długości korzenia w porównaniu z ręcznie śledzonym obrazem referencyjnym wynoszą tylko 1,5%Ponadto obrazowanie spektralne umożliwia dokładne mapowanie zawartości wody wokół korzenia, aby wywnioskować pobór wody. Oto szkielet korzenia pokazany w kolorze czarnym. Jaśniejsze obszary pokazują obszary o większym zubożeniu wody w pobliżu osi korzeniowych.

Podczas gdy ciemniejsze niebieskie obszary reprezentują regiony o wyższej zawartości wody w glebie poza zasięgiem korzeni. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak prawidłowo napełniać kłącza, aby zapewnić zadowalający wzrost korzeni i widoczność. Stanowi to podstawę do późniejszego obrazowania i reprezentatywnych wyników fenotypowania korzeni.

Zgodnie z tą procedurą, można zastosować inne metody klasyfikacji spektralnej, takie jak grupowanie K-średnich lub maszyny wektorów nośnych, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat właściwości korzeni i ryzosfer, takich jak starzenie się i rozkład korzeni. Po ustaleniu, technika ta pozwala na kompleksowe fenotypowanie systemów korzeniowych i abiotycznej odpowiedzi na stres. Można scharakteryzować zestaw 10 odmian o łącznym czasie trwania eksperymentu krótszym niż trzy miesiące.