Name: RGB i spektralne obrazowanie korzeni do fenotypowania roślin i badań fizjologicznych: konfiguracja eksperymentalna i protokoły obrazowania (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Poznaj metodę obrazowania RGB i spektralnego korzeni roślin w glebowych ryzoboxach. Technika ta umożliwia szczegółową analizę architektury i funkcjonalności korzeni, wspierając badania fenotypowania i hodowli roślin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy potwierdzają finansowanie z Austriackiego Funduszu Naukowego FWF za pośrednictwem Projektu o numerze P 25190-B16 (Korzenie odporności na suszę). Stworzenie infrastruktury obrazowania hiperspektralnego zostało wsparte finansowo przez Rząd Federalny Dolnej Austrii (Land Niederösterreich) w ramach projektu K3-F-282/001-2012. Dodatkowe fundusze na eksperyment z burakami cukrowymi otrzymano od Centrum Badań i Innowacji AGRANA GmbH (ARIC). Autorzy dziękują Craigowi Jacksonowi za wsparcie techniczne podczas eksperymentu i angielską korektę rękopisu. Podziękowania należą się również Markusowi Freudhofmaierowi, który przyczynił się do stworzenia systemu obrazowania RGB oraz Josefowi Schodlowi za konstrukcję mocowania rhizobox.

<ol><li>Kutschera, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKutschera%2C+L+%22Wurzelatlas+mitteleurop%C3%A4ischer+Ackerunkr%C3%A4uter+und+Kulturpflanzen%22">Wurzelatlas mitteleuropäischer Ackerunkräuter und Kulturpflanzen</a>. , DLG-Verlags-GmbH, Frankfurt am Main. (1960).</li>
<li>Kenrick, P., Strullu-Derrien, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+early+evolution+of+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">The origin and early evolution of roots.</a> Plant Physiol. 166, 570-580 (2014).</li>
<li>Franklin, J., Serra-Diaz, J. M., Syphard, A. D., Regan, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+change+and+terrestrial+plant+community+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Global change and terrestrial plant community dynamics.</a> PNAS. 113, 3725-3734 (2016).</li>
<li>MacDonald, G. K., Bennett, E. M., Potter, P. A., Ramankutty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agronomic+phosphorus+imbalances+across+the+world%27s+croplands%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Agronomic phosphorus imbalances across the world's croplands.</a> PNAS. 108, 3086-3091 (2011).</li>
<li>Vörösmarty, C. J., Green, P., Salisbury, J., Lammers, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+water+resources%3A+vulnerability+from+climate+change+and+population+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global water resources: vulnerability from climate change and population growth.</a> Science. 289, 284(2000).</li>
<li>Lobell, D. B., Cassman, K. G., Field, C. B. <a target="_blank" href="http://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.environ.041008.093740">Crop yield gaps: their importance, magnitudes, and causes.</a> Annu. Rev. Environ. Resour. 34, 179-204 (2009).</li>
<li>Angus, J. F., Van Herwaarden, A. F. <a target="_blank" href="https://dl.sciencesocieties.org/publications/aj/abstracts/93/2/290">Increasing water use and water use efficiency in dryland wheat.</a> Agron. J. 93, 290-298 (2001).</li>
<li>Lassaletta, L., Billen, G., Grizzetti, B., Anglade, J., Garnier, J. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/1748-9326/9/10/105011/meta">50 year trends in nitrogen use efficiency of world cropping systems: the relationship between yield and nitrogen input to cropland.</a> Environ. Res. Lett. 9 (10), 105011(2014).</li>
<li>Lynch, J. P. <a target="_blank" href="https://media.eurekalert.org/aaasnewsroom/2010/FIL_000000000282/RSGR.pdf">Roots of the second green revolution.</a> Aust. J Bot. 55, 493-512 (2007).</li>
<li>Comas, L. H., Becker, S. R., Von Mark, V. C., Byrne, P. F., Dierig, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root+traits+contributing+to+plant+productivity+under+drought%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Root traits contributing to plant productivity under drought.</a> Front. Plant Sci. 4, 442(2013).</li>
<li>Metcalfe, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+extracting+plant+roots+from+soil+which+facilitates+rapid+sample+processing+without+compromising+measurement+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">A method for extracting plant roots from soil which facilitates rapid sample processing without compromising measurement accuracy.</a> New Phytol. 174, 697-703 (2007).</li>
<li>Kutschera, L., Lichtenegger, E., Sobotik, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKutschera%2C+L+%22Wurzelatlas+der+Kulturpflanzen+gem%C3%A4%C3%9Figter+Gebiete+mit+Arten+des+Feldgem%C3%BCsebaues%22">Wurzelatlas der Kulturpflanzen gemäßigter Gebiete mit Arten des Feldgemüsebaues</a>. , DLG-Verlag, Frankfurt am Main. (2009).</li>
<li>Gioia, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.publish.csiro.au/FP/FP16128">GrowScreen-PaGe, a non-invasive, high-throughput phenotyping system based on germination paper to quantify crop phenotypic diversity and plasticity of root traits under varying nutrient supply.</a> Funct. Plant Biol. 44, 76-93 (2017).</li>
<li>Watt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+controlled-environment+seedling+root+screen+for+wheat+correlates+well+with+rooting+depths+at+vegetative%2C+but+not+reproductive%2C+stages+at+two+field+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Bot%22%5BJournal%5D)">A rapid, controlled-environment seedling root screen for wheat correlates well with rooting depths at vegetative, but not reproductive, stages at two field sites.</a> Ann. Bot. 112, 447-455 (2013).</li>
<li>Fiorani, F., Schurr, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Future+scenarios+for+plant+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Future scenarios for plant phenotyping.</a> Annu. Rev Plant Biol. 64, 267-291 (2013).</li>
<li>Metzner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+comparison+of+MRI+and+X-ray+CT+technologies+for+3D+imaging+of+root+systems+in+soil%3A+potential+and+challenges+for+root+trait+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct comparison of MRI and X-ray CT technologies for 3D imaging of root systems in soil: potential and challenges for root trait quantification.</a> Plant Methods. 11, 1(2015).</li>
<li>Choat, B., Badel, E., Burlett, R., Delzon, S., Cochard, H., Jansen, S. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/profile/Herve_Cochard/publication/294244494_Choat-et-al-2015/links/56bf0bf408ae2f498ef7e2f9.pdf">Non-invasive measurement of vulnerability to drought induced embolism by X-ray microtomography.</a> Plant Physiol. 170, 273-282 (2015).</li>
<li>Metzner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+comparison+of+MRI+and+X-ray+CT+technologies+for+3D+imaging+of+root+systems+in+soil%3A+potential+and+challenges+for+root+trait+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct comparison of MRI and X-ray CT technologies for 3D imaging of root systems in soil: potential and challenges for root trait quantification.</a> Plant Methods. 11, 1(2015).</li>
<li>Le Marié, C., Kirchgessner, N., Marschall, D., Walter, A., Hund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhizoslides%3A+paper-based+growth+system+for+non-destructive%2C+high+throughput+phenotyping+of+root+development+by+means+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Rhizoslides: paper-based growth system for non-destructive, high throughput phenotyping of root development by means of image analysis.</a> Plant Methods. 10, 1(2014).</li>
<li>Bengough, A. G., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1023/B:PLSO.0000037029.82618.27">Gel observation chamber for rapid screening of root traits in cereal seedlings.</a> Plant Soil. 262, 63-70 (2004).</li>
<li>Nagel, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.publish.csiro.au/FP/FP12023">GROWSCREEN-Rhizo is a novel phenotyping robot enabling simultaneous measurements of root and shoot growth for plants grown in soil-filled rhizotrons.</a> Funct. Plant Biol. 39, 891-904 (2012).</li>
<li>Price, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378429002000126">Upland rice grown in soil-filled chambers and exposed to contrasting water-deficit regimes: I. Root distribution, water use and plant water status.</a> Field Crops Res. 76, 11-24 (2002).</li>
<li>Vadez, V. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0378429014000872">Root hydraulics: the forgotten side of roots in drought adaptation.</a> Field Crops Res. 165, 15-24 (2014).</li>
<li>Dane, J. H., Hopmans, J. W. Pressure plate extractor. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDane%2C+JH+%22Methods+of+soil+analysis.+Part+4.+Physical+methods%22">Methods of soil analysis. Part 4. Physical methods</a>. Dane, J. H., Topp, G. C. , SSSA Inc. Madison, Wisconsin, USA. 688-690 (2002).</li>
<li>Wösten, J. H. M., Pachepsky, Y. A., Rawls, W. J. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022169401004644">Pedotransfer functions: bridging the gap between available basic soil data and missing soil hydraulic characteristics.</a> J. Hydrol. 251, 123-150 (2001).</li>
<li>Passioura, J. B. <a target="_blank" href="http://www.publish.csiro.au/FP/FP06223">The perils of pot experiments.</a> Funct. Plant Biol. 33, 1075-1079 (2006).</li>
<li>Dorrepaal, R., Malegori, C., Gowen, A. <a target="_blank" href="http://www.impublications.com/content/abstract?code=J24_0089">Tutorial: Time series hyperspectral image analysis.</a> J. Near Infrared Spec. 24, 89-107 (2016).</li>
<li>Kim, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+image-derived+indices+of+water-stressed+plants+using+hyperspectral+imaging+in+SWIR+and+histogram+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Scie+rep%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive image-derived indices of water-stressed plants using hyperspectral imaging in SWIR and histogram analysis.</a> Scie rep. 5, (2015).</li>
<li>Humplík, J. F., Lazár, D., Husičková, A., Spíchal, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+phenotyping+of+plant+shoots+using+imaging+methods+for+analysis+of+plant+stress+responses-a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated phenotyping of plant shoots using imaging methods for analysis of plant stress responses-a review.</a> Plant Methods. 11, 29(2015).</li>
<li>Lobell, D. B., Asner, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moisture+effects+on+soil+reflectance%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Sci.+Soc.+Am.+J%22%5BJournal%5D)">Moisture effects on soil reflectance.</a> Soil Sci. Soc. Am. J. 66, 722-727 (2002).</li>
<li>Esquerre, C., Gowen, A. A., Burger, J., Downey, G., O'Donnell, C. P. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0169743912000408">Suppressing sample morphology effects in near infrared spectral imaging using chemometric data pre-treatments.</a> Chemometr. Intell. Lab. 117, 129-137 (2012).</li>
<li>Williams, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+flux+maxima+of+arsenic%2C+lead%2C+and+iron+around+root+apices+in+flooded+lowland+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Localized flux maxima of arsenic, lead, and iron around root apices in flooded lowland rice.</a> Environ Sci. Technol. 48, 8498-8506 (2014).</li>
<li>Cseresnyés, I., Takács, T., Végh, K. R., Anton, A., Rajkai, K. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1164556312001021">Electrical impedance and capacitance method: a new approach for detection of functional aspects of arbuscular mycorrhizal colonization in maize.</a> Eur. J Soil Biol. 54, 25-31 (2013).</li>
<li>Brown, M., Lowe, D. G. <a target="_blank" href="http://matthewalunbrown.com/papers/ijcv2007.pdf">Automatic panoramic image stitching using invariant features.</a> Int. J. Comput. Vision. 74, 59-73 (2007).</li>
<li>Jiang, Y., Li, C., Takeda, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nondestructive+detection+and+quantification+of+blueberry+bruising+using+near-infrared+%28NIR%29+hyperspectral+reflectance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Nondestructive detection and quantification of blueberry bruising using near-infrared (NIR) hyperspectral reflectance imaging.</a> Scientific Reports. 6, 35679(2016).</li>
<li>Chang, C. -W., Laird, D. A., Mausbach, M. J., Hurburgh, C. R. <a target="_blank" href="http://lib.dr.iastate.edu/cgi/viewcontent.cgi?article=1718&context=abe_eng_pubs">Near-infrared reflectance spectroscopy-principal components regression analyses of soil properties.</a> Soil Sci. Soc. Am. J. 65, 480-490 (2001).</li>
<li>Leitner, D., Felderer, B., Vontobel, P., Schnepf, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovering+root+system+traits+using+image+analysis+exemplified+by+two-dimensional+neutron+radiography+images+of+lupine%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Recovering root system traits using image analysis exemplified by two-dimensional neutron radiography images of lupine.</a> Plant Physiol. 164 (1), 24-35 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokoły przewidują dwa uzupełniające się podejścia do obrazowania systemu korzeniowego uprawianego w glebie. Kluczowym krokiem dla uzyskania wiarygodnych wyników eksperymentalnych jest wypełnienie kizoboxów, które musi zapewnić równą i jednorodną warstwę substratu na przedniej szybie, aby zapewnić ścisły kontakt korzenia z glebą w oknie obserwacyjnym i uniknąć szczelin powietrznych. Jest to główny powód, dla którego zaleca się stosowanie stosunkowo drobnoziarnistej gleby przesianej o grubości < 2 mm: Większe kruszywa skutkują większą morfologią powierzchni w oknie obserwacyjnym z pustkami między kruszywami. Oprócz większego ryzyka odwodnienia wierzchołków korzeni, wymaga to również bardziej złożonych technik przetwarzania obrazu do mapowania wody31.
Modyfikacje protokołu skupiają się więc na usprawnieniu i szybkim napełnianiu kizoboxów. Obecnie czas napełniania wynosi około 30 minut na pudełko. Ponadto testowane jest zastosowanie ryzoboxów z dwoma szklanymi oknami do obrazowania z obu stron oraz modyfikacje optymalizujące jednorodność oświetlenia w celu uzyskania lepszych obrazów RGB. Dalsza rozbudowa sprzętowa może również rozważyć integrację optod planarnych32 , jak również obrazowania pojemnościowego33 z systemem rhizobox. Wykracza to jednak poza obecne działania modernizacyjne.
Modyfikacje oprogramowania koncentrują się na automatycznej rejestracji obrazu w celu połączenia górnych i dolnych obrazów RBG34. W przypadku obrazowania hiperspektralnego testowane są zaawansowane metody ekstrakcji cechbez nadzoru 28 , a także bardziej czułe metody wykrywania nadzorowanych celów, takie jak SVM35 . W ten sposób dane hiperspektralne potencjalnie pozwalają na ocenę wielu właściwości gleby, ryzosfery i korzeni36. Ponadto planowane jest opracowanie (pół)zautomatyzowanego oprogramowania do tworzenia obrazów korzeni ryzoboksów w oparciu o zmodyfikowaną wersję Root System Analyzer37 w celu ilościowego określenia cech morfologicznych (długość, średnica, powierzchnia) oraz architektonicznych (częstotliwość rozgałęzień, kąty rozgałęzień).
Głównym ograniczeniem protokołu w porównaniu z podejściami do obrazowania 3D jest ograniczenie właściwości widocznych na powierzchni, korzeni i ryzosfery. Wykazano jednak, że widoczne cechy korzeni są wiarygodnym wskaźnikiem zastępczym dla całego systemu korzeniowego21. Technikę rhizobox można łatwo połączyć z tradycyjnym destrukcyjnym pobieraniem próbek (płukaniem) pod koniec obrazowania dynamicznego wzrostu w celu walidacji stosunku widocznych do całkowitych cech systemu korzeniowego. Ponieważ zależność ta może się różnić w zależności od gatunku21, zaleca się destrukcyjne pobieranie próbek, aby zapewnić wiarygodne wnioskowanie z widocznych cech dla każdej nowej serii fenotypowania z różnymi gatunkami roślin uprawnych.
Kluczową zaletą przedstawionego tutaj protokołu jest połączenie realistycznych warunków uprawy (gleba), stosunkowo wysokiej potencjalnej przepustowości dla czasowo rozdzielczego obrazowania RGB oraz wnioskowania o funkcjonalności korzeni (np. poborze wody) za pomocą chemometrycznych danych dotyczących korzeni i ryzosfery z obrazowania hiperspektralnego. W ten sposób metody te przezwyciężają ograniczenia wnioskowania w wysokoprzepustowych metodach obrazowania sadzonek i korzeni nieglebowych14, a jednocześnie częściowo umożliwiają głęboki wgląd w fenotypowanie procesów funkcjonalnych przy mniejszej złożoności eksperymentalnej i wyższej przepustowości w porównaniu z zaawansowanymi metodami 3D15.
W nadchodzących eksperymentach protokół zostanie wykorzystany do zbadania wpływu mikoryzy na rozwój systemu korzeniowego i funkcjonalność roślin strączkowych, a także do fenotypowania cech korzeni gatunków roślin okrywowych w odniesieniu do struktury gleby, obiegu azotu i węgla.

Korzenie pełnią kilka istotnych funkcji dla roślin, takich jak magazynowanie asymilatów, kotwiczenie roślin lądowych w glebie oraz pobieranie i transport wody i składników odżywczych1. Z punktu widzenia ewolucyjnego uważa się, że formowanie osi korzeniowych było fundamentalnym warunkiem powstania roślin lądowych2. Pomimo tej ważnej roli, historycznie korzenie zajmowały jedynie marginalną pozycję w badaniach biologicznych. W czasach nowszych obserwuje się jednak rosnące zainteresowanie naukowe systemami korzeniowymi roślin, co przedstawiono na Rysunku 1.
<img alt="Wykres trendów badań nad korzeniami, wykładniczy wzrost zainteresowania badaniami nad roślinami, dekady 1960-obecnie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56251/56251fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Znaczenie badań nad korzeniami w naukach o roślinach. 
Liczba badań związanych z korzeniami jako procent wszystkich opublikowanych badań nad roślinami w czasopismach SCI w ciągu ostatnich dekad. Wynik wyszukiwania w bazie Scopus przy użyciu słów kluczowych „plant” oraz „plant AND root”. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56251/56251fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Można wysnuć hipotezę, że za ostatnie postępy w badaniach nad korzeniami odpowiadają dwa główne powody. Po pierwsze, roślinność lądowa jest narażona na częstsze stresy środowiskowe w wyniku globalnych zmian3. W kontekście produkcji roślin uprawnych szacuje się, że na świecie około 30% obszarów rolniczych jest ograniczonych dostępnością wody i fosforu4,5. Spadek plonów spowodowany stresem jest główną przyczyną znacznych luk w plonowaniu, które w skali globalnej szacuje się na poziomie poniżej 50% potencjalnej produktywności dla agroekosystemów deszczowych6. Oprócz niskiej dostępności zasobów, wiąże się to również ze słabą efektywnością ich wykorzystania, tzn. niewystarczającą zdolnością rośliny do eksploatacji dostępnych zasobów7. Skutkuje to stratami zasobów mobilnych, takich jak azotany, co może negatywnie wpływać na inne ekosystemy. Przykładowo, obecna globalna efektywność wykorzystania azotu jest szacowana na 47%8. Lepsza efektywność wykorzystania zasobów poprzez ulepszone metody zarządzania i odmiany jest zatem niezwykle istotna zarówno dla zrównoważonego wzrostu produkcji rolniczej, jak i dla zrównoważenia środowiskowego. W tym kontekście korzenie roślin są uważane za kluczowy cel w celu ulepszenia upraw i systemów uprawy9,10.
Drugim istotnym tłem dla niedawnego zainteresowania korzeniami roślin są postępy technologiczne w metodach pomiarowych. Metody badania korzeni były przez długi czas ograniczone przez dwa kluczowe wyzwania: w przypadku pomiaru korzeni roślin rosnących w glebie musiały one zostać wyizolowane w celu kwantyfikacji, najczęściej poprzez wypłukiwanie11, co naruszało architektoniczny układ osi korzeniowych. Obserwacje korzeni in-situ z wykorzystaniem metod wykopaliskowych, pozwalające na zachowanie naturalnego położenia korzeni w glebie, były stosowane do opisów botanicznych12. Niemniej jednak są one bardzo czasochłonne i w związku z tym nie spełniają wymagań dotyczących przepustowości w porównawczej analizie strukturalno-funkcjonalnej systemu korzeniowego. Z drugiej strony, wysokoprzepustowe metody pomiaru architektury korzeni były wykonywane głównie na podłożach sztucznych i dla siewek13, w przypadku których ekstrapolacja do naturalnego środowiska wzrostu roślin jest dyskusyjna14.
Ostatni rozkwit badań nad korzeniami jest ściśle powiązany z postępem w metodach obrazowania15. Podejścia obrazowe w badaniach korzeni można podzielić umownie na trzy typy. Po pierwsze, istnieją metody 3D o wysokiej rozdzielczości, takie jak CT i MRI16. Metody te są najodpowiedniejsze do badania procesów interakcji korzeni roślin z glebą, takich jak zatorowość ksylemu indukowana suszą17. Zazwyczaj stosuje się je do stosunkowo niewielkich próbek, co pozwala na szczegółowe obserwacje. Porównanie CT i MRI dla doniczek o różnych rozmiarach oraz obrazowanie korzeni cienkich przedstawiono w18. Po drugie, istnieją wysokoprzepustowe metody obrazowania19,20. Metody te opierają się głównie na powszechnym obrazowaniu 2D RGB korzeni rosnących na podłożach sztucznych (żel, papier do kiełkowania), gdzie wysoki kontrast umożliwia stosunkowo prostą separację korzeni od tła. Są one odpowiednie do wysokoprzepustowego porównywania cech korzeni siewek różnych genotypów roślin uprawnych w standaryzowanych, sztucznych warunkach wzrostu13. Pomiędzy tymi dwoma podejściami znajdują się metody z wykorzystaniem rhizoboxów: wykorzystują one obrazowanie 2D korzeni rosnących w glebie przez dłuższy czas i charakteryzują się średnią przepustowością21,22. Aktualnym wyzwaniem w obrazowaniu (2D) korzeni jest rejestrowanie nie tylko opisów struktury, ale również wskaźników funkcjonalności korzeni23.
W niniejszej pracy przedstawiamy protokoły eksperymentalne do obrazowania systemów korzeniowych hodowanych w ryzoboksach z wykorzystaniem (i) taniego i prostego, wykonanego na zamówienie zestawu do obrazowania RGB oraz (ii) bardziej złożonego zestawu do obrazowania NIR. Przedstawiono i omówiono przykładowe wyniki uzyskane z obu tych zestawów w kontekście fenotypowania roślin oraz badań nad fizjologią roślin.

<table><tbody><tr><td>Rhizobox</td><td>Technisches B&uuml; RO F&UUML; r Bodenkultur</td><td>Eksperymentalny budowniczy</td><td></td></tr><tr><td>Lampy LED ATUM HORTI 600</td><td>Klutronic</td><td>AHI10600F</td><td></td></tr><tr><td>Świetlówka HiLite T5 Day</td><td>Juwel Aquarium</td><td>86324</td><td></td></tr><tr><td>Świetlówka UV Eurolite 45cm slim 15 W</td><td>Conrad</td><td>593384 - 62</td><td></td></tr><tr><td>Canon EOS 6D</td><td>Canon Austria GmbH</td><td>8035B024</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop CS5 Wersja rozszerzona 12.0 x 32</td><td>Adobe Systems Software Ireland Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>WinRhizo Pro v. 2013</td><td>Regent Instruments Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kamera SWIR Xeva-1.7-320</td><td>Xenics</td><td>XEN-000105</td><td></td></tr><tr><td>Spektrograf Imspector N25E</td><td>Specim</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skaner do obrazowania hiperspektralnego</td><td>Carinthian Tech Research AG</td><td>Konstruktor eksperymentalny</td><td>Projekt i montaż skanera do obrazowania hiperspektralnego oraz oprogramowania</td></tr><tr><td>Matlab R2106a</td><td>Mathworks</td><td></td><td>W tym zestawy narzędzi do przetwarzania obrazu, przetwarzania sygnałów i statystyki oraz uczenia maszynowego</td></tr><tr><td>AP4 Poromoeter</td><td>Delta-T-Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LI-3100C Miernik powierzchni LI-COR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BASF Styradur Arkusze styropianu</td><td>Obi Baumarkt</td><td>9706318</td><td>Można stosować różne rodzaje arkuszy styropianu lub innego materiału oddzielającego różnie wilgotną glebę</td></tr></tbody></table>

rgb i spektralne obrazowanie korzeni do fenotypowania roślin i badań fizjologicznych: konfiguracja eksperymentalna i protokoły obrazowania

RGB and Spectral Root Imaging for Plant Phenotyping and Physiological Research: Experimental Setup and Imaging Protocols

Lepsze zrozumienie dynamiki korzeni roślin jest niezbędne do poprawy efektywności wykorzystania zasobów w systemach rolniczych i zwiększenia odporności odmian roślin uprawnych na stresy środowiskowe. Przedstawiono protokół eksperymentalny dla obrazowania RGB i hiperspektralnego systemów korzeniowych. Podejście to wykorzystuje ryzoboxy, w których rośliny rosną w naturalnej glebie przez dłuższy czas, aby obserwować w pełni rozwinięte systemy korzeniowe. Przedstawiono przykłady warunków eksperymentalnych do oceny roślin kłączowych w warunkach stresu wodnego i badania roli korzeni. Konfiguracja obrazowania RGB jest opisana w celu taniego i szybkiego ilościowego określenia rozwoju korzeni w czasie. Obrazowanie hiperspektralne poprawia segmentację korzeni od tła gleby w porównaniu z progowaniem opartym na kolorach RGB. Szczególną zaletą obrazowania hiperspektralnego jest pozyskiwanie informacji chemometrycznych na temat systemu korzenia-gleby w celu zrozumienia funkcjonalnego. Wykazano to za pomocą mapowania zawartości wody w wysokiej rozdzielczości. Obrazowanie spektralne jest jednak bardziej złożone pod względem pozyskiwania, przetwarzania i analizy obrazu w porównaniu z podejściem RGB. Połączenie obu metod może zoptymalizować kompleksową ocenę systemu korzeniowego. Podano przykłady zastosowań integrujące cechy korzeni i nadziemia w kontekście fenotypowania roślin i badań fizjologicznych roślin. Dalszą poprawę obrazowania korzeniowego można uzyskać poprzez optymalizację jakości obrazu RGB z lepszym oświetleniem przy użyciu różnych źródeł światła oraz poprzez rozszerzenie metod analizy obrazu w celu wnioskowania o właściwościach strefy korzeniowej na podstawie danych spektralnych.

Przedstawiono eksperymentalny protokół oceny systemów korzeniowych roślin uprawianych w glebie za pomocą RGB i obrazowania hiperspektralnego. Połączenie szeregów czasowych obrazu RGB z informacjami chemometrycznymi ze skanów hiperspektralnych optymalizuje wgląd w dynamikę korzeni roślin.

RGB i spektralne obrazowanie korzeni do fenotypowania roślin i badań fizjologicznych: konfiguracja eksperymentalna i protokoły obrazowania

Better understanding of plant root dynamics is essential to improve resource use efficiency of agricultural systems and increase the resistance of crop ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest uzyskanie kompleksowych informacji na temat korzeni roślin rosnących w wypełnionych glebą ryzoboksach poprzez połączenie różnych metod obrazowania. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu fenotypowania i hodowli roślin, takie jak wpływ różnych architektur korzeni na lepszą odporność na stresy abiotyczne. Główną zaletą tego podejścia jest połączenie obrazowania RGB w celu analizy architektury korzeni oraz obrazowania hiperspektralnego w celu oceny funkcjonalności korzeni.Potencjał wykorzystania obrazowania hiperspektralnego w badaniach korzeni rozciąga się na szeroki zakres parametrów ryzosfery, ponieważ informacje spektralne mogą ujawnić małoskalowe zmiany fizykochemiczne wprowadzone przez korzenie roślin. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy napełniania ryzoboksu muszą zostać przeprowadzone starannie. W przeciwnym razie wzrost korzeni oraz ich widoczność zostaną negatywnie utrudnione.Procedurę należy rozpocząć od przygotowania rizoboksów do wypełnienia podłożem, zgodnie ze szczegółowym opisem w protokole tekstowym. Należy wstępnie nawilżyć suchą glebę do grawimetrycznej zawartości wody wynoszącej 0,108 gram na gram, dodając 400 gramów wody na 3 705 gramów suchej gleby. Glebę i wodę należy delikatnie wymieszać, aby uzyskać jednorodny rozkład wody.Ręcznie rozbić większe agregaty, aby utrzymać wielkość cząstek mniejszą niż lub równą 2 mm. Kluczowe jest uzyskanie homogenicznej warstwy gleby przy oknie obserwacyjnym gazu, unikając przerw powietrznych. Wierzchołki korzeni roślin szybko wysychają, wrastając w przestrzenie powietrzne.Jakość obrazowania spektralnego dla mapowania wody ulega również pogorszeniu. Wypełnij otwarte ryzoboksy wcześniej namoczoną glebą i delikatnie ją ugnieć, używając arkusza polistyrenowego pokrywającego wewnętrzną objętość pojemnika, aby uzyskać jednorodną gęstość objętościową wynoszącą 1.3 g/cm³. Pozostałą ilość wody, niezbędną do osiągnięcia docelowej zawartości wody na poziomie 0.31 cm³/cm³, dodaj, rozpylając ją na powierzchnię za pomocą butelki ze spryskiwaczem.Należy zapewnić małą wielkość kropli, aby uniknąć degradacji struktury powierzchni, a także uzyskać jednorodne zwilżenie. Podczas rozpylania należy trzymać pudełko na wadze, aby monitorować ilość wody faktycznie dodanej do podłoża. Pozostawić wodę na 10 minut w celu jej redystrybucji, a następnie docisnąć szkło do powierzchni i przymocować je za pomocą bocznych szyn metalowych.Średnia końcowa masa rizoboksów z namoczonym podłożem wynosiła 17 818 ± 68 g. Wyposaż pomieszczenie klimatyczne w osiem lamp LED zapewniających jednorodne oświetlenie o natężeniu 450 µmol m⁻² s⁻¹ z pikami widmowymi przy 440 i 660 nm w celu optymalnego wzrostu roślin. Po ustawieniu parametrów otoczenia zgodnie z potrzebami roślin i wymogami eksperymentu, zasłoń szklane okno drewnianą płytą, aby utrzymać strefę korzeniową w ciemności i zapobiec rozwojowi glonów spowodowanemu przenikaniem światła przez szklaną powierzchnię.Następnie umieść rhizoboxy pod kątem 45 stopni, korzystając z odpowiedniej metalowej konstrukcji. Maksymalizuje to wzrost korzeni w kierunku szklanej powierzchni dzięki gravitropizmowi. W celu obrazowania korzeni w systemie RGB oświetl rhizobox za pomocą czterech 24-watowych świetlówek zamontowanych w odległości 80 centymetrów od rhizoboxu.Należy również zamontować cztery lampy UV o mocy 15 W w odległości 20 centymetrów od rhizoboxu jako alternatywne oświetlenie, wykorzystujące autofluorescencję korzeni w przypadku niskiego kontrastu między korzeniami a jasnym tłem substratu. Należy włączyć lampy UV, a następnie umieścić rhizobox przeznaczony do obrazowania w uchwycie komory obrazującej. Następnie należy wykonać dwa zdjęcia, aby objąć górną i dolną połowę rhizoboxu, zachowując zakładkę o szerokości około trzech centymetrów.Należy pozyskać i przetworzyć obrazy RBG zgodnie ze szczegółami opisanymi w protokole tekstowym. Na koniec należy przeprowadzić analizę pozyskanych obrazów korzeni RBG, a następnie sprawdzić, czy występują obszary niedopasowane. W takim przypadku należy zdefiniować region wykluczenia i zrestartować analizę.W przypadku korzeni niezaklasyfikowanych należy dodać dodatkowe klasy kolorów i ponownie uruchomić analizę. Dla elementów błędnie zaklasyfikowanych jako korzenie należy aktywować lub zwiększyć opcje filtrowania zanieczyszczeń i nierównych krawędzi. Akwizycję obrazów należy przeprowadzić, najpierw określając czasy integracji kamery dla skanowania rhizoboxu oraz wzorca bieli w oprogramowaniu kamery.Aby to zrobić, otwórz interfejs graficzny obrazowania i przesuń kamerę w miejsce w ryzoboksie, w którym znajdują się korzenie. Dostosuj czas integracji kamery, celując w jasny obiekt w taki sposób, aby na histogramie wyświetlanym przez oprogramowanie wykorzystane zostało około 85% pełnego zakresu dynamicznego kamery. Prawidłowe ustawienie czasu integracji dla różnych podłoży i tkanek korzenia jest kluczowe, aby w pełni wykorzystać zakres dynamiczny kamery na podczerwień, unikając utraty informacji wynikającej z przekroczenia tego zakresu.Powtórz ten proces dla wzorca białego, przesuwając system pozycjonowania kamery na wzorzec biały przed zamknięciem oprogramowania kamery. Następnie otwórz interfejs graficzny GUI obrazowania w programie Matlab i wprowadź wszystkie ustawienia z bieżącego skanowania rhizoboxu. Przed każdą serią obrazowania, raz dziennie, wykonaj pomiary wzorców ciemnego i białego.Standard ciemny reprezentuje szum kamery, natomiast standard jasny określa maksymalną odblaskowość. Dane te są niezbędne do normalizacji obrazu podczas wstępnego przetwarzania. Należy określić, czy skanowany jest cały rhizobox, czy tylko jego część.W niniejszym przypadku obrazowane są całe ryzoboksy. Następnie należy rozpocząć skanowanie. Do pomiaru zawartości wody w oparciu o analizę spektralną niezbędny jest ryzoboks kalibracyjny.Podziel ryzoboks na pięciocentymetrowe przedziały za pomocą arkuszy polistyrenu, aby wypełnić je glebą o różnej zawartości wody. Zeskanuj kalibracyjny ryzoboks, korzystając z tych samych ustawień, które zostały zastosowane dla ryzoboksów z roślinami. Jako przykład, w celu połączenia cech korzeni i części nadziemnych, użyj porometru liściowego do pomiaru przewodnictwa szparkowego.Równoważyć urządzenie z warunkami otoczenia przez co najmniej jedną godzinę w komorze klimatycznej. Wykonać pomiary z co najmniej trzech liści z każdej rośliny. Przedstawiono tutaj reprezentacyjny obraz wzrostu korzenia buraka cukrowego odmiany Ferrara, uzyskany za pomocą obrazowania RGB.W 35. dniu po wysiewie korzenie roślin wydłużyły się, osiągając dno rizoboksu. Niektórych osi korzeniowych w górnej części rizoboksu nie udało się wysegmentować z obrazów RGB. Starzenie się starszych korzeni bazalnych powoduje zmianę ich barwy na brązową.W związku z tym oddzielenie tych korzeni od tła glebowego na podstawie progu kolorystycznego okazuje się nieskuteczne. Dzięki zastosowaniu obrazowania hiperspektralnego segmentacja opiera się na różnych cechach spektralnych pierwszego planu (korzeni) i tła (gleby). Pozwala to na uzyskanie lepszych wyników segmentacji.Różnice w zmierzonej długości korzenia w stosunku do obrazu referencyjnego śledzonego ręcznie wynoszą zaledwie 1,5%. Ponadto obrazowanie spektralne pozwala na precyzyjne mapowanie zawartości wody wokół korzenia w celu wyciągnięcia wniosków na temat poboru wody. Tutaj szkielet korzenia pokazano na czarno. Jaśniejsze obszary wskazują regiony większego wyczerpania wody w pobliżu osi korzenia.Podczas gdy ciemnoniebieskie obszary reprezentują regiony o wyższej zawartości wody w glebie poza zasięgiem korzeni. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat prawidłowego wypełniania rizoboksów w celu zapewnienia satysfakcjonującego wzrostu i widoczności korzeni. Stanowi to podstawę dla późniejszego obrazowania i reprezentatywnych wyników fenotypowania korzeni.Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody klasyfikacji spektralnej, takie jak grupowanie K-średnich lub maszyny wektorów nośnych, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat właściwości korzeni i ryzosfery, takich jak starzenie się i rozkład korzeni. Po opracowaniu, technika ta pozwala na kompleksowe fenotypowanie systemów korzeniowych oraz odpowiedzi na stres abiotyczny. Zbiór 10 odmian można scharakteryzować w całkowitym czasie trwania eksperymentu wynoszącym mniej niż trzy miesiące.

rgb-spectral-root-imaging-for-plant-phenotyping-physiological

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Ten protokół opisuje proces szybkiego zbierania obrazów sadzonek rzodkiewnika reagujących na bodziec grawitacyjny za pomocą dostępnych na rynku skanerów płaskich.  Metoda ta pozwala na niedrogie, wysokonakładowe przechwytywanie obrazów o wysokiej rozdzielczości, które można poddać dalszym algorytmom analizy.

Używanie skanerów płaskich do zbierania poklatkowych obrazów o wysokiej rozdzielczości odpowiedzi grawitropowej korzenia rzodkiewnika

Tutaj prezentujemy protokół do badania zachowań związanych ze wzrostem roślin, a zwłaszcza fenotypów w powtarzalny sposób. Pokazujemy, jak zapewnić zmienne, a jednocześnie stabilne warunki oświetleniowe. Prawidłowe analizy zależą od wystarczającej liczby prób i prawidłowych ocen statystycznych.

Analiza zachowania wzrostu Arabidopsis thaliana w różnych jakościach światła

Wizualizacja i pomiar wzrostu korzeni in situ jest niezwykle trudne. Przedstawiamy konfigurowalną metodę rhizobox do śledzenia rozwoju i proliferacji korzeni w czasie w odpowiedzi na wzbogacenie w składniki odżywcze. Metoda ta służy do analizy różnic genotypowych w plastyczności korzeni kukurydzy w odpowiedzi na organiczne źródło azotu.

Zoptymalizowany protokół Rhizobox do wizualizacji wzrostu korzeni i reakcji na zlokalizowane składniki odżywcze

Opisujemy nowe techniczne podejście do badania reakcji fotosyntezy u wyższych roślin, obejmujące jednoczesne pomiary fluorescencji chlorofilu a i reflektancji liści za pomocą PAM i radiometru spektralnego do wykrywania sygnałów z tego samego obszaru liści u Arabidopsis.

Ocena zachowań fotosyntetycznych poprzez jednoczesne pomiary współczynnika odbicia liści i analizy fluorescencji chlorofilu

Używamy prostych narzędzi laboratoryjnych do badania architektury systemu korzeniowego (RSA) Arabidopsis i Medicago. Sadzonki są uprawiane hydroponicznie na siatce i rozprowadzane za pomocą pędzla artystycznego, aby odsłonić RSA. Obrazy są wykonywane za pomocą skanowania lub kamery o wysokiej rozdzielczości, a następnie analizowane za pomocą ImageJ w celu zmapowania cech.

Prosty protokół mapowania cech architektury systemu korzeniowego roślin

Zaprojektowaliśmy protokół fenotypowania oparty na obrazach, aby określić morfologiczne i fizjologiczne reakcje na pojedyncze i skojarzone zabiegi upałów, suszy i podlewania. Podejście to umożliwiło identyfikację wczesnych, późnych i regeneracyjnych reakcji na poziomie całego zakładu, w szczególności części nadziemnych, a także podkreśliło konieczność stosowania wielu czujników obrazowania.

Wysokoprzepustowe fenotypowanie oparte na obrazie w celu określenia morfologicznych i fizjologicznych odpowiedzi na pojedyncze i połączone stresy u ziemniaka

Przedstawiono metodę taniego obrazowania roślin do pomiaru fenotypów, wraz z najlepszymi praktykami przechwytywania obrazów i potokiem analizy obrazu do ilościowego określania cech roślin. Metody te zastosowano do pomiaru fenotypów kukurydzy (Zea mays) w warunkach upałów, suszy i połączonego stresu abiotycznego.

Obrazowanie i analiza w celu ilościowego określenia fenotypów stresu abiotycznego kukurydzy (Zea mays)

Biomasa roślinna stanowi źródło odnawialne dla wielu produktów, w tym paliwa, paszy, żywności i różnych materiałów. W artykule badamy właściwości drzewa tytoniowego (Nicotiana glauca) i topoli jako odpowiednich źródeł dla rurociągu biorafineryjnego.

Profilowanie transkryptu i metabolitów w celu oceny drzewa tytoniowego i topoli jako surowca dla przemysłu biotechnologicznego

Zrozumienie roli heterogeniczności środowiska we współistnieniu gatunków zazwyczaj skupiało się na typach heterogeniczności, które są zewnętrzne w stosunku do składu gatunkowego społeczności. Przedstawiamy nowatorskie szczegółowe metody tworzenia zabiegów na rzecz niejednorodności gleby przy użyciu gleb poddanych warunkowaniu zwrotnemu roślina-gleba lub heterogeniczności nieodłącznie związanej ze składem zbiorowiska.

Eksperymentalny protokół manipulowania heterogenicznością gleby wywołaną przez rośliny

To badanie przedstawia metodę wykopaliskową do badania podpowierzchniowej hydrologicznej, geochemicznej i mikrobiologicznej heterogeniczności lizymetru glebowego. Lizymetr symuluje sztuczne zbocze wzgórza, które początkowo było w jednorodnym stanie i zostało poddane działaniu około 5000 mm wody w ciągu ośmiu cykli nawadniania w okresie 18 miesięcy.

Wykopy lizymetryczne gleby do sprzężonych badań hydrologicznych, geochemicznych i mikrobiologicznych

Poznaj metodę obrazowania RGB i spektralnego korzeni roślin w glebowych ryzoboxach. Technika ta umożliwia szczegółową analizę architektury i funkcjonalności korzeni, wspierając badania fenotypowania i hodowli roślin.

RGB i spektralne obrazowanie korzeni do fenotypowania roślin i badań fizjologicznych: konfiguracja eksperymentalna i protokoły obrazowania (Wideo) | JoVE Journal

RGB i spektralne obrazowanie korzeni do fenotypowania roślin i badań fizjologicznych: konfiguracja eksperymentalna i protokoły obrazowania

Przeglądaj więcej filmów