Wydajne generowanie i edycja IPSC bez zasilania z ludzkich komórek trzustki przy użyciu systemu CRISPR-Cas9

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wygenerowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSCs) pozbawionych śladów manipulacji (footprint-free) z ludzkich komórek trzustki w warunkach bez użycia komórek karmidła, a następnie edycja tych komórek przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR-Cas9 i wreszcie charakterystyka zmodyfikowanych klonów pojedynczych komórek. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie edycji genomu ludzkich komórek macierzystych, takie jak generowanie iPSCs pozbawionych śladów manipulacji oraz edycja za pomocą rybonukleoprotein CRISPR-Cas9. Główną zaletą tej techniki jest możliwość generowania linii klonalnych edytowanych iPSCs z wysoką niezawodnością oraz brak dowodów na występowanie mozaicyzmu.

Po pokryciu płytki sześcio-dołkowej zimnym kolagenem, w 2. dniu wysiać pierwotne ludzkie komórki trzustkowe z wczesnych pasażów w medium Prigrow III, aby w dniu transdukcji (dzień zero) osiągnąć gęstość około 2,5 x 10⁵ komórek lub co najmniej 60% konfluencji na dołek. W dniu transdukcji, po zebraniu i policzeniu komórek zgodnie z protokołem tekstowym, rozmrozić w lodzie jeden zestaw probówek z wektorem Sendai i ostrożnie dodać obliczone objętości z każdej probówki do 1 mL uprzednio ogrzanego medium Prigrow III. Delikatnie wymieszać roztwór za pomocą pipety.

Odssać medium Prigrow III z komórek i powoli dodać do studni mieszaninę wirusa reprogramującego. Następnie inkubować komórki w inkubatorze w temperaturze 37°C przez noc. Dwadzieścia cztery godziny po transdukcji ostrożnie usunąć mieszaninę wirusa z komórek i zastąpić ją świeżym medium Prigrow III.

Szóstego dnia dodać 1 mL roztworu do odrywania komórek i inkubować je przez 10 minut. Następnie, używając Prigrow III z inhibitorem ROCK, wysiać wszystkie komórki na płytki z MEF przygotowane dzień wcześniej. Inkubować komórki w temperaturze 37°C przez noc.

Regularnie obserwuj płytki pod kątem pojawienia się skupisk lub kolonii komórek wskazujących na komórki przeprogramowane, które tworzą agregaty klonalne o morfologii brukowanej, z dużym jądrem i jąderkami. Zaznacz prawdopodobne kolonie iPSC i regularnie monitoruj ich wzrost. Prawie cztery tygodnie po transdukcji, po przygotowaniu płytek MEF z 24 dołkami, przygotuj membranę macierzy, odmierzając jej ilość na podstawie czynnika rozcieńczenia podanego w certyfikacie analizy.

Wybierz 24–48 kolonii i przenieś je na 24-dołkowe płytki pokryte błoną macierzy z mTeSR1. Inkubuj płytki przez 24 godziny i codziennie wymieniaj medium. Szczegółowe informacje znajdują się w protokole tekstowym.

Dodaj 500 mcL dispazy, aby odczepić trwałe kolonie wysiane na membranie macierzowej. Po inkubacji komórek przez 20 minut wysiej je ponownie na płytki 12-dołkowe powlekane membraną macierzową. Powiększ i scharakteryzuj klony, stosując barwienie na fosfatazę alkaliczną, barwienie immunocytochemiczne oraz analizę FACS zgodnie z protokołem tekstowym.

Aby przeprowadzić transfekcję HIPSC po syntezie SGRNA zgodnie z protokołem tekstowym, należy przygotować mieszaninę główną do nukleofekcji dla każdej próbki, łącząc 0,5 mcg białka Cas9 i 0,5 mcg każdego SGRNA w objętości reakcji 22 mcL. Po odessaniu pożywki zawierającej inhibitor ROCK, należy użyć 2 mL RTPBS do przemycia każdej studni z iPSC. Następnie odessano PBS i dodano 1 mL roztworu do odrywania komórek.

Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Resuspendować komórki w 3 mL medium mTeSR1 i delikatnie pipetować w górę i w dół, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek. Przenieść zdysocjowane komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 mL zawierającej 5 mL medium mTeSR1.

Do mieszaniny głównej do nukleofekcji dodać 16,4 mcL suplementu do pierwotnych komórek P3 oraz 3,6 mcL suplementu one z zestawu Nucleofector. Po policzeniu i odwirowaniu komórek, każdą jednostkę 0,5 x 10 do 6. komórek resuspendować w 22 mcL wcześniej przygotowanej mieszaniny głównej do transfekcji. Szybko przenieść komórki do komory centralnej jednego dołka paskowej kuwety Nucleocuvette.

Następnie umieść pasek w urządzeniu Nucleofector i przeprowadź nukleofekcję komórek, korzystając z programu CB150. Po nukleofekcji szybko dodaj 80 mcL uprzednio ogrzanej pożywki mTeSR1 zawierającej 10 micromolar inhibitora ROCK do każdej studni z nukleofektowanymi komórkami. Delikatnie wymieszaj, pipetując ciecz w górę i w dół.

Ostrożnie przenieś komórki z paska do studzienek płytki 12-dołkowej z membraną macierzystą, uprzednio pokrytej pożywką mTeSR1 z inhibitorem ROCK. Drugiego dnia inkubacji po przygotowaniu płytek MEF, wymień pożywkę dla HIPSC z mTeSR1 na mTeSR1 uzupełniony o 1XSMC4 na co najmniej dwie godziny przed sortowaniem pojedynczych komórek. Odessij pożywkę z HIPSC i użyj PBS, aby delikatnie przemyć komórki.

Następnie do każdego dołka dodaj 500 mcL roztworu do odrywania komórek i inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Przygotuj zawiesinę pojedynczych komórek, dodając 1 mL mTeSR1 do każdego dołka i delikatnie pipetując ciecz w górę i w dół kilka razy. Przenieś pojedyncze komórki do poszczególnych dołków wcześniej przygotowanej płytki 96-dołkowej.

Cztery dni po sortowaniu powinno dojść do widocznego tworzenia się kolonii. W tym momencie należy wymienić pożywkę na pożywkę HESC uzupełnioną o 1X SMC4. Po wyekstrahowaniu i namnożeniu docelowego DNA zgodnie z protokołem tekstowym, należy użyć zestawu do analizy fragmentów, aby przeprowadzić analizę PCR wzbogaconego docelowego regionu genomowego wszystkich klonów przy użyciu mieszaniny barwnika do żelu zgodnie z instrukcjami producenta.

Potwierdź klony pluripotencjalnych iPSC zgodnie z protokołem tekstowym. Przed transdukcją wirusem Sendai komórki trzustkowe wykazują typową morfologię wrzecionowatą. Do 12. dnia na MEF pojawiają się małe, zwarte kolonie przypominające kolonie ludzkich komórek pluripotencjalnych.

Zazwyczaj w pełni przeprogramowane kolonie ludzkich iPSC mają bardzo wyraźne granice i mogą być pobierane między 23. a 30. dniem. Przedstawiono tutaj dysocjowaną kolonię w 23. dniu. Poniżej znajduje się typowy obraz w kontraście fazowym kolonii iPSC po pobraniu i hodowli w warunkach bez komórek dokarmiających po przeprogramowaniu komórek trzustki za pomocą wirusa Sendai.

Po prawej stronie znajdują się kolonie iPSC wybarwione na czerwono za pomocą fosfatazy alkalicznej. Potwierdzono obecność iPSC poprzez barwienie immunologiczne markerów pluripotencji OCT4 i NANOG, co przedstawiono na tych panelach. W tym doświadczeniu iPSC wybarwiono markerami powierzchniowymi komórek, a następnie przeprowadzono analizę FACS na zawiesinie pojedynczych komórek.

Zielony szczyt reprezentuje pancreaticzne iPSCs, a fioletowy szczyt zawiera komórki ujemne pod kątem iPSC. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o zachowaniu warunków aseptycznych lub sterylnych podczas sortowania komórek i hodowli komórkowej. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak celowane modyfikacje genów w iPSCs i ESCs, a na dodatkowe pytania można odpowiedzieć poprzez przeprowadzenie precyzyjnych modyfikacji genetycznych.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać rzetelną wiedzę na temat tego, jak niezawodnie generować iPSCs wolne od śladów (footprint-free) i wolne od komórek wspierających (feeder-free) oraz jak przeprowadzać bialleliczną edycję genomu.