Name: Wydajne generowanie i edycja IPSC bez zasilania z ludzkich komórek trzustki przy użyciu systemu CRISPR-Cas9 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Poznaj metodę generowania wolnych od śladów iPSC z ludzkich komórek trzustki i ich edycji za pomocą CRISPR-Cas9. Technika ta umożliwia niezawodne uzyskiwanie klonalnych linii komórkowych bez mozaicyzmu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca w laboratorium była wspierana przez grant na staż podoktorski dla dr Anjali Nandal oraz grant eksploracyjny z Maryland Stem Cell Research Fund dla BT (TEDCO).

<ol><li>Malik, N., Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+methods+for+human+iPSC+derivation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A review of the methods for human iPSC derivation.</a> Methods Mol. Biol. 997, 23-33 (2013).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Sommer, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+generation+using+a+single+lentiviral+stem+cell+cassette%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette.</a> Stem cells. 27, 543-549 (2009).</li>
<li>Macarthur, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells+by+a+nonintegrating+RNA+Sendai+virus+vector+in+feeder-free+or+xeno-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+Int%22%5BJournal%5D)">Generation of human-induced pluripotent stem cells by a nonintegrating RNA Sendai virus vector in feeder-free or xeno-free conditions.</a> Stem cells Int. , 564612(2012).</li>
<li>Li, H. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytoplasmic+RNA+vector+derived+from+nontransmissible+Sendai+virus+with+efficient+gene+transfer+and+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression.</a> J Virol. 74, 6564-6569 (2000).</li>
<li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus%2C+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Jpn.+Acad.+Ser.+B%2C+PhysBiol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proc. Jpn. Acad. Ser. B, PhysBiol. Sci. 85, 348-362 (2009).</li>
<li>Nakagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+efficient+feeder-free+culture+system+for+the+derivation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells.</a> Sci. Rep. 4, 3594(2014).</li>
<li>Hockemeyer, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Meet+Genome+Editing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing.</a> Cell stem cell. 18, 573-586 (2016).</li>
<li>Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Based+Technologies+for+the+Manipulation+of+Eukaryotic+Genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes.</a> Cell. 169, 559(2017).</li>
<li>Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Based+Technologies+for+the+Manipulation+of+Eukaryotic+Genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes.</a> Cell. 168, 20-36 (2017).</li>
<li>Sander, J. D., Joung, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas+systems+for+editing%2C+regulating+and+targeting+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.</a> Nat. Biotech. 32, 347-355 (2014).</li>
<li>McElroy, S. L., Reijo Pera, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+mouse+embryonic+fibroblast+feeder+cells+for+human+embryonic+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of mouse embryonic fibroblast feeder cells for human embryonic stem cell culture.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cardiomyocyte+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+temporal+modulation+of+canonical+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, E1848-E1857 (2012).</li>
<li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+diabetes+with+insulin-producing+cells+derived+in+vitro+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells.</a> Nat. Biotech. 32, 1121-1133 (2014).</li>
<li>Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+technology%3A+a+decade+of+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 16, 115-130 (2017).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+CRISPR%2FHDR-mediated+knock-in+for+mouse+embryonic+stem+cells+and+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes.</a> BioTechniques. 59, (2015).</li>
<li>Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+CRISPR%2FCas9-mediated+precise+genome+editing+by+improved+design+and+delivery+of+gRNA%2C+Cas9+nuclease%2C+and+donor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotech%22%5BJournal%5D)">Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA.</a> J Biotech. 241, 136-146 (2017).</li>
</ol>

BT jest członkiem-założycielem RenOVAte Biosciences Inc.

Przeprogramowanie ludzkich komórek somatycznych na komórki iPS stanowi istotny bodziec dla rozwoju dziedzin biologii podstawowej, medycyny spersonalizowanej, modelowania chorób, opracowywania leków i medycyny regeneracyjnej16. Wiele obecnych i szeroko stosowanych metod generowania iPSC u ludzi wymaga użycia wirusa z ryzykiem integracji z genomem gospodarza lub wektorów episomalnych o niskiej wydajności przeprogramowania. W tym miejscu przedstawiamy skuteczną metodę generowania iPSC bez karmienia z...

Przeprogramowanie ludzkich komórek somatycznych do stanu pluripotencjalnego poprzez nadekspresję czynników przeprogramowujących zrewolucjonizowało badania nad komórkami macierzystymi, znajdując zastosowanie w modelowaniu chorób, medycynie regeneracyjnej i opracowywaniu leków. Dostępnych jest kilka metod przeprogramowania niewirusowych do dostarczania czynników przeprogramowujących i generowania iPSC, ale proces ten jest pracochłonny i niezbyt wydajny1. Metody wirusowe, choć skuteczne, wiążą się z problemami integracji wirusów i rakotwórczości2,3,4. W tym manuskrypcie opisujemy wykorzystanie cytoplazmatycznego wirusa Sendai do dostarczania czynników przeprogramowujących i ustanawiania linii iPSC wolnych od śladów, które nie mają integracji żadnych sekwencji wektorów wirusowych ze swoimi genomami5. Wirus Sendai to wirus RNA, który jest rozcieńczany z cytoplazmy komórki ~10 pasaży po infekcji i wytwarza obfite czynniki przeprogramowujące, co prowadzi do szybkiego i skutecznego przeprogramowania6,7. Ustalone iPSC można następnie łatwo przenieść na pożywkę wolną od karmienia, aby uniknąć użycia mysich fibroblastów embrionalnych (MEF) jako komórek zasilających8.
W tej publikacji, oprócz opisu przeprogramowania za pośrednictwem wirusa Sendai, opisujemy również ulepszony protokół edycji iPSC, który ma potencjał do dostarczania nieograniczonej liczbie komórek ludzkich pożądanych modyfikacji genetycznych do badań. Wykorzystaliśmy technologię CRISPR/Cas9 do modyfikacji iPSC, która jest obecnie wykorzystywana w szerokim zakresie zastosowań, w tym do knock-inów i knock-outów, delecji genomowych na dużą skalę, badań przesiewowych w bibliotekach zbiorczych w celu odkrycia genów, inżynierii genetycznej wielu organizmów modelowych oraz terapii genowej9,10,11. Technika ta polega na tworzeniu kompleksów nukleazy Cas9 pochodzącej ze Streptococcus pyogenes i 20-merowych przewodników RNA, które osiągają rozpoznanie celu poprzez parowanie zasad z genomową sekwencją docelową przylegającą do sekwencji 3' nukleotydu protospacerowego sąsiadującego z sekwencją (PAM). Nukleaza Cas9 indukuje dwuniciowe pęknięcie ~ 3 nukleotydów z miejsca PAM, które jest następnie naprawiane głównie przez niehomologiczny szlak łączenia końców (NHEJ) prowadzący do insercji lub delecji w otwartej ramce odczytu, a tym samym funkcjonalny nokaut genów12.
Nasz ulepszony protokół zawiera szczegóły dotyczące hodowli ludzkich komórek trzustki, ich przeprogramowania na mitotycznie inaktywowanych mysich fibroblastach embrionalnych (MEF) w celu osiągnięcia wyższej efektywności przeprogramowania, późniejszej adaptacji do hodowli bez karmowania na Matrigel, charakterystyki ustalonych iPSC, projektowania i przygotowania RNA pod kontrolą CRISPR, dostarczania do iPSC jako kompleksów RNP, sortowania pojedynczych komórek w celu wygenerowania linii klonalnych edytowanych iPSC, Łatwe przesiewanie i identyfikacja zmian oraz charakteryzacja klonów pojedynczych komórek. Delecje genomowe zostały skutecznie wygenerowane w tym badaniu poprzez wprowadzenie białka Cas9 i dwóch kompleksów CRISPR sgRNA RNP w celu wywołania dwuniciowych pęknięć (DSB) i delecji segmentu pośredniego. Metoda ta wykorzystuje zastosowanie dwóch prowadnic do generowania delecji w otwartej ramce odczytu, wysoką wydajność NHEJ prowadzącą do małej liczby klonów, które należy scharakteryzować, oraz łatwe wstępne badanie przesiewowe klonów za pomocą zautomatyzowanego urządzenia do elektroforezy kapilarnej, analizatora fragmentów. Te skuteczne metody edycji genomu w celu generowania modeli chorób opartych na ludzkich komórkach macierzystych wkrótce staną się standardowym i rutynowym podejściem w każdym laboratorium komórek macierzystych. Wreszcie, precyzyjna edycja genomu umożliwi wyjście poza modelowanie chorób komórek macierzystych i potencjalnie może pomóc w katalizowaniu terapii opartych na komórkach.

<table><tbody><tr><td>Wektory wirusowe Sendai - CytoTune-iPS 2.0 Kit</td><td>Invitrogen</td><td>A16517</td><td>Rozmrażanie na lodzie; S No: 1</td></tr><tr><td>Trypsyna EDTA</td><td>Gibco Life Tech</td><td>25300-054</td><td>0,05%, 100 ml; S No: 2</td></tr><tr><td>Inhibitor skał (Y-27632)</td> <td>Milipore</td><td>SCM075</td><td>Użyj 10 &mu; M; S No: 3</td></tr><tr><td>DMEM/F-12 medium</td><td>Invitrogen</td><td>11330-032</td><td>S No: 4</td></tr><tr><td>Wymiana surowicy (KSR)</td> <td>Gibco</td><td>10828028</td><td>S No: 5</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11960069</td><td>1X; S No: 6</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30071.03</td><td>Podwielokrotność; S No: 7</td></tr><tr><td>L-glutamina (Glutamax, 100X), płyn</td><td>Thermo Scientific</td><td>35050061</td><td>1/100; S nr: 8</td></tr><tr><td>aminokwasów endogennych</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td>1/100; S Nr: 9</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>55 mM, 1/1,000; S No: 10</td></tr><tr><td>Hemacytometry</td><td>Hausser Hausser Scientific</td><td>02-671-54</td><td>S No: 11</td></tr><tr><td>0,1% roztwór żelatyny</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7903</td><td>Inkubuj w 37&ordm; C przez 1 godzinę; Nr S: 12</td></tr><tr><td>Przeciwciało SSEA-4</td><td>Santacruz</td><td>sc-21704</td><td>1/100; S Nr: 13</td></tr><tr><td>TRA-1-81</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>przeciwciała 4745S</td><td>1/200; S Nr: 14</td></tr><tr><td>OCT4 przeciwciało</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5279</td><td>1/1,000; S No: 15</td></tr><tr><td>Kolagen I, Rat Tail</td><td>Life Technologies</td><td>A10483-01</td><td>Przechowywać w chłodzie; S Nr: 16</td></tr><tr><td>Alexa Fluor fluorescencyjna 488/568 (przeciwciała drugorzędowe)</td> <td>Invitrogen</td><td>A21202 / A10042</td><td>1/2,000; S Nr: 17</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30028LS</td><td>1X; S Nr: 18</td></tr><tr><td>100-milimetrowe naczynie do hodowli tkankowej</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td>S No: 20</td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka do hodowli tkankowej</td><td>Falcon</td><td>353078</td><td>S No: 21</td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka do hodowli tkankowej</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td>S No: 22</td></tr><tr><td>Zakres preparacyjny&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>SMZ745</td><td>S No: 23</td></tr><tr><td>Osłona do kompletacji</td><td>NuAire</td><td>NU-301</td><td>S No: 24</td></tr><tr><td>15&nbsp; ml Probówka wirówkowa</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td>S Nr: 25</td></tr><tr><td>50&nbsp; ml Probówka wirówkowa</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td>S No: 26</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Invitrogen</td><td>11360</td><td>S Nr: 28</td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td>S No: 29</td></tr><tr><td>Prigrow III medium</td><td>ABM</td><td>TM003</td><td>S No: 31</td></tr><tr><td>Hrabina i handel; Licznik komórek</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td>S Nr: 32</td></tr><tr><td>System rentgenowski Faxitron</td><td>Faxitron</td><td></td><td>CellRad S No: 33</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT-104</td><td>S No: 34</td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Life Technologies</td><td>17104019</td><td>zapas 1 mg / ml; S No: 35</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7923</td><td>S No: 36</td></tr><tr><td>Matrigel z kwalifikacją hESC</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td>Do rozcieńczenia użyj zimnego DMEM/F-12; Nr S: 37</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R & D</td><td>233-FB</td><td>Zapas 10 ug/ml; S No: 38</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>EMS</td><td>15710</td><td>4% zapasów w PBS; Nr S: 39</td></tr><tr><td>TRA-1-60</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-21705</td><td>1/100; Nr kat.: 40</td></tr><tr><td>NANOG</td><td>ReproCELL</td><td>RCAB0004P-F</td><td>1/100; S No: 41</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416-100ML</td><td>S No: 42</td></tr><tr><td>Zestaw fosfatazy alkalicznej</td><td>Stemgent</td><td>00-0055</td><td>S No: 43</td></tr><tr><td>Białko Cas9</td><td>PNA Bio</td><td>CP01-50</td><td>Rozmrażanie i podwielokrotność; S No: 44</td></tr><tr><td>Serum kozie lub osła</td><td>Sigma</td><td>D9663/G9023</td><td>S No: 45</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-100ML</td><td>S No: 46</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Scientific</td><td>D1306</td><td>S No: 47</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>9285-100ML</td><td>S No: 48</td></tr><tr><td>NaCL</td><td>Sigma</td><td>S7653-250G</td><td>S No: 49</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>BP2482-500</td><td>S Nie: 50</td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4</td><td>NEB</td><td>M0202T</td><td>S Nr: 51</td></tr><tr><td>Zestaw Mega Shortscript T7</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM1354</td><td>S No: 52</td></tr><tr><td>Zestaw Mega Clear</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM1908</td><td>Nr S: 53</td></tr><tr><td>SMC4</td><td>BD Biosciences</td><td>354357</td><td>S No: 54</td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7159</td><td>S No: 55</td></tr><tr><td>Zestaw do klonowania CloneJET</td><td>Thermo Scientific</td><td>K1232</td><td>S No: 56</td></tr><tr><td>Analizator fragmentówTM</td><td>Advanced Analytical</td><td></td><td>Nr S: 57</td></tr><tr><td>mTeSR1 medium kit</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5850</td><td>Ciepła do temperatury pokojowej; S No: 58</td></tr><tr><td>Medium mFreSR&trade;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5855</td><td>S No: 59</td></tr><tr><td>Medium zamrażające CryoStor&reg;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7930</td><td>S Nr: 60</td></tr><tr><td>MEFs</td><td>Globalstem</td><td>GSC-6301G</td><td>S No: 61</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td>S No: 62</td></tr><tr><td>Ludzkie komórki trzustki</td><td>ABM</td><td>T0159</td><td>Nr S: 63</td></tr><tr><td>STEMdiff&trade; Indukcja neuronalna Medium</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>5835</td><td>Nr S: 64</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Thermofisher</td><td>11875-093</td><td>Nr S: 65</td></tr><tr><td>2% B27-insulina</td><td>Thermofisher</td><td>A1895601</td><td>Nr S: 66</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Technologie Stemcell</td><td>72052</td><td>Nr S: 67</td></tr><tr><td>Technologie macierzyste</td><td>IWP4</td><td>72552</td><td>Nr S: 68</td></tr><tr><td>2% B27</td><td>Thermofisher</td><td>17504044</td><td>S No: 69</td></tr><tr><td>MCDB 131</td><td>Life Technologies</td><td>10372019</td><td>S No: 70</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8761-100ML</td><td>Nr S: 71</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-100G</td><td>Nr S: 72</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Proliant</td><td>68700</td><td>Nr S: 73</td></tr><tr><td>GDF8</td><td>Pepro-Tech</td><td>120-00</td><td>Nr S: 74</td></tr><tr><td>TUJ1 przeciwciało</td><td>EMD Milipore</td><td>AB9354</td><td>S Nr: 75</td></tr><tr><td>NKX2-5 przeciwciało</td><td>Santa Cruz</td><td>Sc-14033</td><td>S No: 76</td></tr><tr><td>Przeciwciało SOX17</td><td>R & Systemy D</td><td>AF1924</td><td>S No: 77</td></tr><tr><td>Jodek propidyny</td><td>Thermo Scientific</td><td>P3566</td><td>S No: 78</td></tr><tr><td>Amaxa 4D-nucleofector&handel;</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002</td><td>S No: 79</td></tr><tr><td>FACSAria II (sorter komórek)</td><td>BD biosciences</td><td>SORP UV</td><td>S No: 80</td></tr></tbody></table>

wydajne generowanie i edycja ipsc bez zasilania z ludzkich komórek trzustki przy użyciu systemu crispr-cas9

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Embrionalne i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste mogą samoistnie odnawiać się i różnicować w wiele typów komórek ciała. Komórki pluripotencjalne są zatem pożądane do badań w medycynie regeneracyjnej i są obecnie w badaniach klinicznych nad chorobami oczu, cukrzycą, chorobami serca i innymi zaburzeniami. Potencjał różnicowania się w wyspecjalizowane typy komórek w połączeniu z ostatnimi postępami w technologiach edycji genomu, w tym systemem CRISPR/Cas, zapewnił dodatkowe możliwości dostosowania genomu iPSC do różnych zastosowań, w tym modelowania chorób, terapii genowej i stronniczych ścieżek różnicowania, by wymienić tylko kilka. Wśród dostępnych technologii edycji, CRISPR/Cas9 ze Streptococcus pyogenes okazał się narzędziem z wyboru do edycji genomu eukariotycznego w miejscu specyficznym. CRISPR są łatwo dostępne, niedrogie i bardzo wydajne w inżynierii ukierunkowanych edycji. System wymaga nukleazy Cas9 i sekwencji prowadzącej (20-merowej) specyficznej dla celu genomowego przylegającego do 3-nukleotydowego motywu protospacerowego "NGG" (PAM) w celu ukierunkowania Cas9 na pożądane locus genomowe, wraz z uniwersalnym znacznikiem wiążącym Cas9 RNA (razem nazywane pojedynczym przewodnikiem RNA lub sgRNA). W tym miejscu przedstawiamy krok po kroku protokół wydajnego generowania iPSC niezależnego od źródła i wolnego od śladu oraz opisujemy metodologie edycji genomu iPSC przy użyciu kompleksów rybonukleoproteiny Cas9 (RNP). Protokół edycji genomu jest skuteczny i może być łatwo multipleksowany przez wstępne kompleksowanie sgRNA dla więcej niż jednego celu z białkiem Cas9 i jednoczesne dostarczanie do komórek. Na koniec opisujemy uproszczone podejście do identyfikacji i charakterystyki iPSC z pożądanymi zmianami. Podsumowując, oczekuje się, że przedstawione strategie usprawnią generowanie i edycję iPSC dla różnorodnych aplikacji.

W niniejszej publikacji zastosowaliśmy prosty, lecz wydajny protokół generowania iPSC z ludzkich komórek trzustki przy użyciu wektorów wirusa Sendai, które nie integrują się z genomem ani nie pozostawiają śladów (footprint-free). Rysunek 1A przedstawia schematyczny przebieg tego protokołu przeprogramowania. Ludzkie komórki trzustki zakupiono komercyjnie, hodowano w medium Prigrow III i transdukowano wirusem Sendai zgodnie z powyższym opisem. Transdukowane, wr...

Ten protokół szczegółowo opisuje generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) bez śladu z ludzkich komórek trzustki w warunkach wolnych od karmienia, a następnie edycję za pomocą rybonukleoprotein CRISPR/Cas9 i charakterystykę zmodyfikowanych klonów pojedynczych komórek.

Wydajne generowanie i edycja IPSC bez zasilania z ludzkich komórek trzustki przy użyciu systemu CRISPR-Cas9

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wygenerowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSCs) pozbawionych śladów manipulacji (footprint-free) z ludzkich komórek trzustki w warunkach bez użycia komórek karmidła, a następnie edycja tych komórek przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR-Cas9 i wreszcie charakterystyka zmodyfikowanych klonów pojedynczych komórek. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie edycji genomu ludzkich komórek macierzystych, takie jak generowanie iPSCs pozbawionych śladów manipulacji oraz edycja za pomocą rybonukleoprotein CRISPR-Cas9. Główną zaletą tej techniki jest możliwość generowania linii klonalnych edytowanych iPSCs z wysoką niezawodnością oraz brak dowodów na występowanie mozaicyzmu.Po pokryciu płytki sześcio-dołkowej zimnym kolagenem, w 2. dniu wysiać pierwotne ludzkie komórki trzustkowe z wczesnych pasażów w medium Prigrow III, aby w dniu transdukcji (dzień zero) osiągnąć gęstość około 2,5 x 10⁵ komórek lub co najmniej 60% konfluencji na dołek. W dniu transdukcji, po zebraniu i policzeniu komórek zgodnie z protokołem tekstowym, rozmrozić w lodzie jeden zestaw probówek z wektorem Sendai i ostrożnie dodać obliczone objętości z każdej probówki do 1 mL uprzednio ogrzanego medium Prigrow III. Delikatnie wymieszać roztwór za pomocą pipety.Odssać medium Prigrow III z komórek i powoli dodać do studni mieszaninę wirusa reprogramującego. Następnie inkubować komórki w inkubatorze w temperaturze 37°C przez noc. Dwadzieścia cztery godziny po transdukcji ostrożnie usunąć mieszaninę wirusa z komórek i zastąpić ją świeżym medium Prigrow III.Szóstego dnia dodać 1 mL roztworu do odrywania komórek i inkubować je przez 10 minut. Następnie, używając Prigrow III z inhibitorem ROCK, wysiać wszystkie komórki na płytki z MEF przygotowane dzień wcześniej. Inkubować komórki w temperaturze 37°C przez noc.Regularnie obserwuj płytki pod kątem pojawienia się skupisk lub kolonii komórek wskazujących na komórki przeprogramowane, które tworzą agregaty klonalne o morfologii brukowanej, z dużym jądrem i jąderkami. Zaznacz prawdopodobne kolonie iPSC i regularnie monitoruj ich wzrost. Prawie cztery tygodnie po transdukcji, po przygotowaniu płytek MEF z 24 dołkami, przygotuj membranę macierzy, odmierzając jej ilość na podstawie czynnika rozcieńczenia podanego w certyfikacie analizy.Wybierz 24–48 kolonii i przenieś je na 24-dołkowe płytki pokryte błoną macierzy z mTeSR1. Inkubuj płytki przez 24 godziny i codziennie wymieniaj medium. Szczegółowe informacje znajdują się w protokole tekstowym.Dodaj 500 mcL dispazy, aby odczepić trwałe kolonie wysiane na membranie macierzowej. Po inkubacji komórek przez 20 minut wysiej je ponownie na płytki 12-dołkowe powlekane membraną macierzową. Powiększ i scharakteryzuj klony, stosując barwienie na fosfatazę alkaliczną, barwienie immunocytochemiczne oraz analizę FACS zgodnie z protokołem tekstowym.Aby przeprowadzić transfekcję HIPSC po syntezie SGRNA zgodnie z protokołem tekstowym, należy przygotować mieszaninę główną do nukleofekcji dla każdej próbki, łącząc 0,5 mcg białka Cas9 i 0,5 mcg każdego SGRNA w objętości reakcji 22 mcL. Po odessaniu pożywki zawierającej inhibitor ROCK, należy użyć 2 mL RTPBS do przemycia każdej studni z iPSC. Następnie odessano PBS i dodano 1 mL roztworu do odrywania komórek.Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Resuspendować komórki w 3 mL medium mTeSR1 i delikatnie pipetować w górę i w dół, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek. Przenieść zdysocjowane komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 mL zawierającej 5 mL medium mTeSR1.Do mieszaniny głównej do nukleofekcji dodać 16,4 mcL suplementu do pierwotnych komórek P3 oraz 3,6 mcL suplementu one z zestawu Nucleofector. Po policzeniu i odwirowaniu komórek, każdą jednostkę 0,5 x 10 do 6. komórek resuspendować w 22 mcL wcześniej przygotowanej mieszaniny głównej do transfekcji. Szybko przenieść komórki do komory centralnej jednego dołka paskowej kuwety Nucleocuvette.Następnie umieść pasek w urządzeniu Nucleofector i przeprowadź nukleofekcję komórek, korzystając z programu CB150. Po nukleofekcji szybko dodaj 80 mcL uprzednio ogrzanej pożywki mTeSR1 zawierającej 10 micromolar inhibitora ROCK do każdej studni z nukleofektowanymi komórkami. Delikatnie wymieszaj, pipetując ciecz w górę i w dół.Ostrożnie przenieś komórki z paska do studzienek płytki 12-dołkowej z membraną macierzystą, uprzednio pokrytej pożywką mTeSR1 z inhibitorem ROCK. Drugiego dnia inkubacji po przygotowaniu płytek MEF, wymień pożywkę dla HIPSC z mTeSR1 na mTeSR1 uzupełniony o 1XSMC4 na co najmniej dwie godziny przed sortowaniem pojedynczych komórek. Odessij pożywkę z HIPSC i użyj PBS, aby delikatnie przemyć komórki.Następnie do każdego dołka dodaj 500 mcL roztworu do odrywania komórek i inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Przygotuj zawiesinę pojedynczych komórek, dodając 1 mL mTeSR1 do każdego dołka i delikatnie pipetując ciecz w górę i w dół kilka razy. Przenieś pojedyncze komórki do poszczególnych dołków wcześniej przygotowanej płytki 96-dołkowej.Cztery dni po sortowaniu powinno dojść do widocznego tworzenia się kolonii. W tym momencie należy wymienić pożywkę na pożywkę HESC uzupełnioną o 1X SMC4. Po wyekstrahowaniu i namnożeniu docelowego DNA zgodnie z protokołem tekstowym, należy użyć zestawu do analizy fragmentów, aby przeprowadzić analizę PCR wzbogaconego docelowego regionu genomowego wszystkich klonów przy użyciu mieszaniny barwnika do żelu zgodnie z instrukcjami producenta.Potwierdź klony pluripotencjalnych iPSC zgodnie z protokołem tekstowym. Przed transdukcją wirusem Sendai komórki trzustkowe wykazują typową morfologię wrzecionowatą. Do 12. dnia na MEF pojawiają się małe, zwarte kolonie przypominające kolonie ludzkich komórek pluripotencjalnych.Zazwyczaj w pełni przeprogramowane kolonie ludzkich iPSC mają bardzo wyraźne granice i mogą być pobierane między 23. a 30. dniem. Przedstawiono tutaj dysocjowaną kolonię w 23. dniu. Poniżej znajduje się typowy obraz w kontraście fazowym kolonii iPSC po pobraniu i hodowli w warunkach bez komórek dokarmiających po przeprogramowaniu komórek trzustki za pomocą wirusa Sendai.Po prawej stronie znajdują się kolonie iPSC wybarwione na czerwono za pomocą fosfatazy alkalicznej. Potwierdzono obecność iPSC poprzez barwienie immunologiczne markerów pluripotencji OCT4 i NANOG, co przedstawiono na tych panelach. W tym doświadczeniu iPSC wybarwiono markerami powierzchniowymi komórek, a następnie przeprowadzono analizę FACS na zawiesinie pojedynczych komórek.Zielony szczyt reprezentuje pancreaticzne iPSCs, a fioletowy szczyt zawiera komórki ujemne pod kątem iPSC. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o zachowaniu warunków aseptycznych lub sterylnych podczas sortowania komórek i hodowli komórkowej. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak celowane modyfikacje genów w iPSCs i ESCs, a na dodatkowe pytania można odpowiedzieć poprzez przeprowadzenie precyzyjnych modyfikacji genetycznych.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać rzetelną wiedzę na temat tego, jak niezawodnie generować iPSCs wolne od śladów (footprint-free) i wolne od komórek wspierających (feeder-free) oraz jak przeprowadzać bialleliczną edycję genomu.

efficient-generation-editing-feeder-free-ipscs-from-human-pancreatic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Narzędzia do edycji genomu, takie jak system CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (związany z CRISPR), znacznie poprawiły skuteczność celowania w geny w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych (hiPSC). Niniejszy manuskrypt opisuje protokół generowania specyficznego dla linii reportera hiPSC przy użyciu rekombinacji homologicznej wspomaganej systemem CRISPR/Cas.

Wydajne generowanie reporterów knockin specyficznych dla linii neuronowej hiPSC przy użyciu systemu podwójnej nickazy CRISPR/Cas9 i Cas9

Edycja genomu ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) może być przeprowadzona szybko i efektywnie. Przedstawiono tutaj solidną procedurę eksperymentalną inżynierii genetycznej hPSC, której przykładem jest edycja locus AAVS1 w celu ekspresji EGFP i wprowadzenia oporności na antybiotyki.

Opracowanie ludzkich pluripotencjalnych linii komórek macierzystych z edytowanym genomem: od ukierunkowania do izolacji

Opisano protokoły do generowania linii mutantów hPSC za pomocą platformy iCRISPR i różnicowania hPSC na komórki podobne do β reagujące na glukozę. Połączenie technologii edycji genomu z różnicowaniem ukierunkowanym na hPSC stanowi potężną platformę do systematycznej analizy roli determinantów linii w rozwoju człowieka i postępie choroby.

Edycja genomu i ukierunkowane różnicowanie hPSC w celu badania determinantów linii w rozwoju trzustki człowieka

Protokół szybkiego rozerwania genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w pierwotnych komórkach krwiotwórczych myszy i człowieka jest opisany w tym artykule. Rybonukleoproteiny Cas9-sgRNA są wprowadzane przez elektroporację z sgRNA generowanymi przez transkrypcję in vitro i komercyjny Cas9. Wysoka wydajność edycji jest osiągana przy ograniczonych kosztach czasowych i finansowych.

Wysoce skuteczne rozrywanie genów mysich i ludzkich hematopoetycznych komórek progenitorowych za pomocą CRISPR/Cas9

Wykorzystanie wstępnie złożonego kompleksu rybonukleoproteinowego Cas9 (RNP) to potężna metoda precyzyjnej, efektywnej edycji genomu. W tym miejscu podkreślamy jego użyteczność w szerokim zakresie komórek i organizmów, w tym pierwotnych komórek ludzkich oraz zarówno klasycznych, jak i powstających organizmów modelowych.

Ulepszona edycja genomu za pomocą rybonukleoproteiny Cas9 w różnych komórkach i organizmach

Tutaj opisano protokół oznaczania białek o endogennej ekspresji znacznikami fluorescencyjnymi w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych za pomocą CRISPR/Cas9. Przypuszczalnie edytowane komórki są wzbogacane przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją i generowane są klonalne linie komórkowe.

Endogenne znakowanie białek w ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórkach macierzystych przy użyciu CRISPR/Cas9

Prezentowany jest tutaj protokół do efektywnej edycji genów za pośrednictwem rybonukleoproteiny CRISPR/Cas9 w komórkach ssaków za pomocą elektroporacji rurkowej.

CRISPR/Cas9 Precyzyjna edycja genów za pośrednictwem rybonukleoprotein za pomocą elektroporacji rurkowej

Ten protokół zapewnia metodę ułatwiającą generowanie zdefiniowanych heterozygotycznych lub homozygotycznych zmian nukleotydowych za pomocą CRISPR-CAS9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych.

Generowanie zdefiniowanych modyfikacji genomowych z wykorzystaniem CRISPR-CAS9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych

Tutaj opisujemy szczegółową metodę bezproblemowej edycji genów w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych przy użyciu plazmidu dawcy opartego na piggyBac i mutanta nickazy Cas9. Do eksonu 8 locus czynnika jądrowego hepatocytów 4 alfa (HNF4α) w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych (hESC) wprowadzono dwie mutacje punktowe.

Wprowadzenie mutacji punktowych do ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu płynnej edycji genomu

Przedstawiona metoda opisuje generowanie nokautu genu za pośrednictwem CRISPR w linii H9 ludzkiej embrionalnej komórki macierzystej (hESC), która stabilnie wyraża sgRNA ukierunkowane na gen L2HGDH za pomocą wysoce wydajnego systemu dostarczania genów za pośrednictwem lentiwirusa.

Delecja genu za pośrednictwem CRISPR-Cas9 w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych hodowanych w warunkach wolnych od karmowego

Poznaj metodę generowania wolnych od śladów iPSC z ludzkich komórek trzustki i ich edycji za pomocą CRISPR-Cas9. Technika ta umożliwia niezawodne uzyskiwanie klonalnych linii komórkowych bez mozaicyzmu.

Wydajne generowanie i edycja IPSC bez zasilania z ludzkich komórek trzustki przy użyciu systemu CRISPR-Cas9

Przeglądaj więcej filmów