Wydajne generowanie i edycja IPSC bez zasilania z ludzkich komórek trzustki przy użyciu systemu CRISPR-Cas9

Ten protokół szczegółowo opisuje generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) bez śladu z ludzkich komórek trzustki w warunkach wolnych od karmienia, a następnie edycję za pomocą rybonukleoprotein CRISPR/Cas9 i charakterystykę zmodyfikowanych klonów pojedynczych komórek.

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych lub IPSC z ludzkich komórek trzustki w warunkach wolnych od pokarmu, a następnie edycja komórek za pomocą rybonukleoprotein CRISPR-Cas9 i wreszcie scharakteryzowanie zmodyfikowanych klonów pojedynczych komórek. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie edycji genomu ludzkich komórek macierzystych, takie jak generowanie IPSC bez śladów węglowych i edycja rybonukleoprotein CRISPR-Cas9. Główną zaletą tej techniki jest to, że linie klonalne edytowanych IPSC mogą być generowane z dużą niezawodnością i nie ma dowodów na mozaikowość.

Po pokryciu sześciodołkowej płytki zimnym kolagenem, umieść ludzkie pierwotne komórki trzustki we wczesnym pasażu w pożywce Prigrow III w dniu 2, aby osiągnąć około 2,5 x 10 do 5 komórek lub co najmniej 60% konfluencji na studzienkę w dniu transdukcji lub dniu zero. W dniu transdukcji po zebraniu i policzeniu komórek zgodnie z protokołem tekstowym, rozmrozić na lodzie jeden zestaw probówek wektorowych Sendai i ostrożnie dodać obliczone objętości każdej probówki do 1 ml podgrzanego podłoża Prigrow III. Delikatnie odpipetować, aby wymieszać roztwór.

Odessać Prigrow III z komórek i powoli dodawać mieszaninę wirusów przeprogramowujących do studzienek. Następnie inkubuj komórki w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Dwadzieścia cztery godziny po transdukcji ostrożnie wyrzuć mieszaninę wirusa na komórki i zastąp ją świeżą pożywką Prigrow III.

Szóstego dnia dodaj 1 ml roztworu do odrywania komórek do komórek i inkubuj je przez 10 minut. Następnie, za pomocą Prigrow III z inhibitorem skał, ułóż wszystkie komórki na szalkach z MEF-ów przygotowanych dzień wcześniej. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc.

Regularnie obserwuj płytki pod kątem pojawienia się grudek lub kolonii komórkowych wskazujących na przeprogramowane komórki, które utworzą agregaty klonalne o morfologii brukowej i dużym jądrze i jąderkach. Zaznacz prawdopodobne kolonie IPSC i regularnie sprawdzaj je pod kątem wzrostu. Prawie cztery tygodnie po transdukcji, po przygotowaniu 24-dołkowych płytek MEF, należy przygotować membranę matrycy, dzieląc ją na porcje w oparciu o współczynnik rozcieńczenia na certyfikacie analizy.

Wybierz 24-48 kolonii i przenieś je na 24-dołkowe płytki pokryte membraną matrycową z mTeSR1. Inkubuj płytki przez 24 godziny i codziennie zmieniaj podłoże. Zapoznaj się z protokołem tekstowym, aby uzyskać dodatkowe informacje.

Dodać 500 mcl dypazy, aby odłączyć wytrzymałe kolonie pokryte membraną matrycy. Po inkubacji komórek przez 20 minut, umieść je ponownie na 12-dołkowych płytkach pokrytych membraną matrycową. Rozwiń i scharakteryzuj klony za pomocą barwienia fosfatazą alkaliczną, barwienia immunologicznego i analizy FACS zgodnie z protokołem tekstowym.

Aby transfekować HIPSC po zsyntetyzowaniu SGRNA zgodnie z protokołem tekstowym, należy przygotować główną mieszankę nukleofakcji dla każdej próbki, łącząc 0,5 mcg białka Cas9 i 0,5 mcg każdego SGRNA w objętości reakcyjnej 22 mcL. Po zasysaniu pożywki zawierającej inhibitor skał, należy użyć 2 ml RTPBS do przepłukania każdej studzienki ISPC. Następnie odessać PBS i dodać 1 ml roztworu do odrywania komórek.

Inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Ponownie zawiesić komórki w 3 ml pożywki mTeSR1 i delikatnie pipetować w górę i w dół, aby wytworzyć zawiesinę pojedynczej komórki. Przenieś zdysocjowane komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml pożywki mTeSR1.

Do głównej mieszanki nukleofekcji dodaj 16,4 mcl suplementu komórek pierwotnych P3 i 3,6 mcl suplementu pierwszego z zestawu Nucleofector. Po zliczeniu i odwirowaniu komórek, ponownie zawiesić każdą jednostkę 0,5 x 10 do 6 komórek w 22 mcL wcześniej przygotowanej mieszanki wzorcowej do transfekcji. Szybko przenieś komórki do centralnej komory jednego dołka paska nukleokulty.

Następnie umieść pasek w urządzeniu Nucleofector i nukleofectuj komórki za pomocą programu CB150. Po nukleofekcji szybko dodaj 80 mcl podgrzanego podłoża mTeSR1 zawierającego 10 inhibitorów skał mikromolowych do każdej studzienki komórek nukleofektowanych. Delikatnie mieszać, pipetując w górę i w dół.

Delikatnie przenieść komórki z paska do studzienek wstępnie pokrytej membraną matrycy, 12-dołkowej płytki zawierającej pożywkę mTeSR1 z inhibitorem skał. W drugim dniu inkubacji po przygotowaniu płytek MEF zastąpić pożywkę na HIPSC z mTeSR1 na mTeSR1 uzupełnioną 1XSMC4 na co najmniej dwie godziny przed sortowaniem pojedynczych komórek. Odessać pożywkę z HIPSC i użyć PBS do delikatnego przemycia komórek.

Następnie dodaj 500 mcl roztworu do oddzielania komórek do każdej studzienki i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Wygeneruj zawiesinę pojedynczej komórki, dodając 1 ml mTeSR1 do każdej studzienki i delikatnie pipetuj w górę i w dół kilka razy. Posortuj pojedyncze komórki do pojedynczych dołków wcześniej przygotowanej płytki 96-dołkowej.

Cztery dni po sortowaniu powinno być widoczne utworzenie kolonii. W tym momencie zastąp pożywkę hodowlaną pożywką HESC uzupełnioną 1X SMC4. Po ekstrakcji i namnażaniu docelowego DNA zgodnie z protokołem tekstowym, użyj zestawu analizatora fragmentów, aby uruchomić amplifikowany PCR docelowy region genomowy wszystkich klonów przez mieszankę barwników żelowych zgodnie z instrukcjami producenta.

Potwierdź pluripotencjalne klony IPSC zgodnie z protokołem tekstowym. Przed transdukcją wirusa Sendai komórki trzustki wykazują typową wrzecionowatą morfologię. Małe, ciasne kolonie pojawiają się na MEF w 12 dniu, przypominając ludzkie kolonie komórek pluripotencjalnych.

Zwykle w pełni przeprogramowane ludzkie kolonie IPSC mają bardzo wyraźne granice i można je wykryć w ciągu 23 do 30 dni. Zdysocjowana kolonia w 23 dniu jest pokazana tutaj. Przedstawiono typowy obraz z kontrastem fazowym kolonii IPSC po pobraniu i hodowli w warunkach wolnych od żywiciela po przeprogramowaniu komórek trzustki przez wirusa Sendai.

Kolonie IPSC barwione fosfatazą alkaliczną na czerwono znajdują się po prawej stronie. IPSC potwierdzono przez barwienie immunologiczne dla markerów pluripotencji OCT4 i NANOG, jak widać w tych panelach. W tym eksperymencie IPSC wybarwiono markerami powierzchniowymi komórek, a analizę FACS przeprowadzono na zawiesinie pojedynczej komórki.

Zielony pik reprezentuje IPSC trzustki, a fioletowy pik zawiera komórki IPSC ujemne. Podejmując się tej procedury, należy pamiętać o zachowaniu aseptycznych lub sterylnych warunków sortowania komórek i hodowli komórek. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak celowanie w geny w IPSC i ESC, a także uzyskać odpowiedzi na dodatkowe pytania, wykonując precyzyjne modyfikacje genetyczne.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak niezawodnie generować IPSC bez śladu węglowego i bez zasilania oraz przeprowadzać bialleliczną edycję genomu.