Name: Produkcja genetycznie modyfikowanych złotych chomików syryjskich metodą wstrzyknięcia projądrowego kompleksu CRISPR/Cas9 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Naucz się produkcji genetycznie modyfikowanych złotych chomików syryjskich metodą wstrzyknięcia projądrowego kompleksu CRISPR/Cas9. Protokół umożliwia precyzyjną edycję genów w wrażliwych zarodkach chomika.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez National Institutes of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) of the National Institutes of Health pod numerem grantu 1R41OD021979 (dla ZW) oraz przez grant badawczy z Next-Generation BioGreen 21 Program, Republika Korei, grant nr. PJ01107704 (do ZW) i grant nr. PJ01107703 (do IK). Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy National Institutes of Health lub BioGreen 21. Dziękujemy dr Nikolasowi Roglowi za zredagowanie manuskryptu.

Procedury opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Uniwersytetu Stanowego Utah (protokół IACUC: 2484). Chomiki użyte w tym protokole to dorosłe (w wieku 6 - 10 tygodni) złote chomiki syryjskie szczepu LVG. Wszystkie chomiki są trzymane w wiwarium w centrum bioinnowacji na Uniwersytecie Stanowym Utah. Temperatura w pomieszczeniu jest ustawiona na 23 °C, wilgotność jest ustawiona na 40 - 50%, a cykl światła jest ustawiony na 14L:10D (jasny:ciemny). Jeśli to możliwe, manipulacja zarodkami i zabiegi chirurgiczne powinny być wykonywane technikami sterylnymi.
1. Przygotowanie rybonukleoprotein sgRNA i Cas9/sgRNA (RNP)
<ol>
	<li>Zsyntetyzować sgRNA zgodnie z procedurami transkrypcji in vitro opisanymi w podręczniku zestawu do syntezy (Tabela materiałów, Suplement 1).</li>
	<li>Aby złożyć rybonukleoproteiny, wymieszaj 2 μg Cas9 z 1 μg sgRNA i inkubuj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 10 - 15 min. Do wstrzykiwania PN należy przygotować roztwór roboczy o stężeniu 100 ng/μL Cas9 i 50 ng/μL sgRNA z 10 mM buforem TE (bez RNazy, tabela materiałów).</li>
</ol>
2. Przygotowanie do wazektomii
UWAGA: Wazektomia jest wykonywana u samców chomików w wieku 6 - 8 tygodni. Zabieg należy wykonać 10-14 dni przed pierwszym kryciem. Bezpłodność potwierdzają nieudane ciąże z krycia z płodnymi samicami. Samce po wazektomii mogą być zwykle używane przez rok, zanim staną się mniej aktywne seksualnie.
<ol>
	<li>Znieczulenie mężczyzn poprzez dootrzewnowe (i.p.) wstrzyknięcie ketaminy/ksylazyny w dawce 40 mg/kg (ketamina) i 10 mg/kg (ksylazyna). Potwierdź znieczulenie przez brak odruchu pedałowania (szczypanie palców</li>).
	<li>Połóż uspokojonego chomika w pozycji leżącej grzbietowej na suchej bibułce. Przepłucz brzuch trzema seriami zabiegów antyseptycznych, naprzemiennie stosując roztwory peelingu chirurgicznego między 70% alkoholem a jodowidonem.</li>
	<li>Wykonaj pionowe nacięcie nożyczkami chirurgicznymi, zaczynając od 1,5 cm czaszki do napletka, rozciągając się na 1 cm z każdej strony od linii środkowej (<silna klasa="xfig">Ryc. 1a). Naciąć skórę, tkankę podskórną i linię białą, aby uzyskać dostęp do przestrzeni otrzewnej (<silna klasa = "xfig" >Ryc. 1b).</li>
	<li>Wywieraj delikatny nacisk na ogonową stronę moszny, aby wypchnąć jądra i tkankę tłuszczową. Chwyć delikatnie nasieniowody kleszczami i ostrożnie oddziel naczynie krwionośne od naczynia krwionośnego za pomocą drugiego zestawu kleszczy (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1c).</li>
	<li>Przytrzymaj nasieniowody kleszczami, aby utworzyć pętlę. Podgrzej końcówkę innego kleszczyka w płomieniu, aż stanie się czerwona, a następnie użyj jej do usunięcia pętli nasieniowodów. Włóż tkankę tłuszczową i jądra z powrotem do brzucha. Usuń nasieniowody po przeciwnej stronie, wykonując te same procedury.</li>
	<li>Najpierw zszyj mięśnie, a następnie zszyj skórę. Umieść zwierzę na ciepłej podkładce w klatce na 30 minut, aż zwierzę wyzdrowieje. Obserwuj zwierzę, dopóki nie wznowi normalnej aktywności.</li>
</ol>
3. Harmonogram przygotowań chomika dawcy/biorcy
<ol>
	<li>Monitoruj i rejestruj cykle rujowe. 
	UWAGA: Samice chomików mają stabilny 4-dniowy cykl rujowy, który utrzymuje się natychmiast po porodzie. Samice w pierwszym dniu rui można rozpoznać po nieprzezroczystej, żółtawej i lepkiej wydzielinie z pochwy (<silna klasa="xfig">Ryc. 2a). Samice w 4 dniu rui można zidentyfikować po przezroczystym, lepkim śluzie (<silna klasa="xfig">Ryc. 2b).</li>
	<li>W przypadku superowulacji chomika-dawcy należy przeprowadzić superowulację dojrzałych płciowo samic (>6 tygodni) w pierwszym dniu cyklu rujowego poprzez wstrzyknięcie IP gonadotropiny surowicy ciężarnej klaczy (PMSG; rozpuszczonej w PBS jako 50 j.m./ml) (Tabela 1) między 9 a 12 AM. 
	UWAGA: PMSG służy do wywoływania superowulacji, ale nie do synchronizacji cyklu rujowego.</li>
	<li>80 - 84 h po wstrzyknięciu PMSG (dzień 4, 18 - 20) umieść samice w klatkach z samcami do krycia. Ponieważ krycia chomików nie skutkują zatyczkami kopulacyjnymi, zapewnij udane krycia, obserwując krycia.</li>
	<li>Przygotuj samice w ciąży rzekomej, kryjąc dojrzałe płciowo samice w 4 dniu rui z samcami po wazektomii. Harmonogram przygotowania samic dawczyni i biorczyni przedstawiono w tabeli 2. 
	UWAGA: Jako biorczycy mogą być również wykorzystywane prawdziwe ciężarne samice, tj. samice o kolorze sierści odróżnialnym od koloru złotego zmatowione tym samym kolorem płodnych samców. Szczenięta pochodzące z transferu zarodków można zidentyfikować na podstawie koloru sierści. Potencjalną zaletą wykorzystania prawdziwych ciężarnych samic jest to, że endogennie wyprodukowane zarodki zapewniłyby udaną ciążę i pomogłyby w zagnieżdżeniu się zarodków, którym wstrzyknięto PN; Potencjalną wadą wykorzystywania prawdziwych ciężarnych samic jako biorców jest to, że zarodki, którym wstrzyknięto PN, muszą konkurować o implantację z zarodkami wytwarzanymi endogennie.</li>
</ol>
4. Izolacja zygoty
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę hodowlaną (HECM-9; receptura jest opisana w Suplemencie 2), jak opisano wcześniej w McKiernan i Bavister12.</li>
	<li>Na dzień przed wstrzyknięciem PN należy przygotować naczynia do obchodzenia się z zygotą (25 μl/kroplę) i kroplę do wstrzykiwań PN (100 μl) w pokrywie naczynia o średnicy 35 mm z HECM-9. Następnie przykryj średnie krople olejem mineralnym. Zrównoważyć pożywkę w inkubatorze przez noc w następujących warunkach: 37,5 °C, 10% CO2, 5% O2, 85% N2 i 100% wilgotności.</li>
	<li>W dniu przewidzianym do wstrzyknięcia PN należy przygotować naczynia do płukania zarodków (1 miska/chomik dawcy) z HECM-9 i przechowywać wszystkie szalki w inkubatorze do czasu użycia.</li>
	<li>Eutanazja chomików z superowulacją za pomocą CO2.</li>
	<li>Izolacja jajowodu
	<ol>
		<li>Umieść uśpioną samicę chomika w pozycji leżącej grzbietowej na serwety chirurgicznej lub bibułce i przygotuj brzuch za pomocą sprayu 70% etanolu.</li>
		<li>Mocno przytrzymaj skórę i warstwę mięśni brzucha na linii środkowej i wykonaj nacięcie. Naciąć otrzewną, aby odsłonić narządy jamy brzusznej.</li>
		<li>Chwyć jeden z rogów macicy cienkimi kleszczami i wycofaj tkankę z brzucha. Oddziel macicę od mezometrium i tkanki tłuszczowej. Wykonaj nacięcie między jajowódem a jajnikiem i drugie cięcie przylegające do połączenia jajowodu i macicy (obejmują niewielką część macicy). Umieść oba jajowody w tym samym naczyniu do spłukiwania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Spłucz i zbierz zygoty
	<ol>
		<li>Pod mikroskopem preparacyjnym chwyć bok rogu macicy kleszczami Dumonta #5 i włóż igłę domowej roboty (<klasa silna = "xfig">Rysunek 3) do światła jajowodu od końca lejka i przepłucz jajowód 300 - 400 μl pożywki HECM-9.</li>
		<li>Natychmiast zebrać zygoty i umyć je dwukrotnie pożywką HECM-9 w naczyniu manipulacyjnym. Na tym etapie rozwoju wszystkie zygoty powinny zostać ogołocone z komórek wzgórka.</li>
		<li>Umieść zygoty w inkubatorze (37,5 °C, 10% CO2, 5% O2, 85% N2 i 100% wilgotności) natychmiast po pobraniu, aby zminimalizować ekspozycję na światło.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Wtrysk PN
<ol>
	<li>Rozmrozić Cas9/sgRNA RNP na lodzie i utrzymywać kompleks na lodzie podczas całego procesu wstrzykiwania PN.</li>
	<li>Załadować igły iniekcyjne roztworem Cas9/sgRNA RNP bezpośrednio przed eksperymentami iniekcyjnymi. Umieścić tylny koniec igieł do wstrzykiwań w probówce zawierającej roztwór Cas9/sgRNA RNP i pozwolić, aby roztwór Cas9/sgRNA RNP wypełnił igłę poprzez działanie kapilarne.</li>
	<li>Przygotować naczynie do wstrzykiwań i igły. Napełnij pipetę z uchwytem olejem mineralnym z dokładnością do ~3 mm od zgięcia igły uchwytu. Umieścić uchwyt w mikrowstrzykiwaczu tak, aby końcówka igły była ustawiona poziomo do dna naczynia i napełnić końcówkę igły pożywką przez odsysanie. Ustawić igłę do wstrzykiwań pod kątem 10 - 15° w kierunku przeciwnym do uchwytu.</li>
	<li>Wtrysk PN
	<ol>
		<li>Zidentyfikuj zygotę i zastosuj drobne ssanie za pomocą igły uchwytu. Idealnie, męskie i żeńskie przedjądrze znajdują się w tym samym zakresie ogniskowych i są ustawione równolegle do uchwytu.</li>
		<li>Przebić przez strefę i przedjądrze męskie (pozycja godziny 3) za pomocą igły do wstrzykiwań.</li>
		<li>Po pęcznieniu przedjądrza należy szybko wyjąć igłę, aby zapobiec przyleganiu jądra do igły i uniknąć uszkodzenia przedjądrza.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Przeniesienie zygot do chomików w ciąży rzekomej
<ol>
	<li>Znieczulij chomika w rzekomej ciąży (w taki sam sposób, jak opisano w sekcji wazektomii powyżej) i połóż go na serwety chirurgicznej lub suchej bibułce w pozycji brzusznej.</li>
	<li>Nałóż smary do oczu zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu oczu i przykryj głowę szmatką lub papierem, aby chronić oczy przed światłem. Przygotuj boczną część ciała, goląc obszar skóry o wymiarach około 4 cm x 4 cm z każdej strony ciała, a następnie nakładając 3 razy peelingi powidonowo-jodowe i 3 razy peelingi etanolowe 70%. Wykonaj 2 cm pionowe nacięcie 2 cm ogonowo do ostatniego żebra (jak pokazano na Rysunki 4a, 4b) po każdej stronie grzbietu zwierzęcia.</li>
	<li>Chwyć poduszeczkę tłuszczową kleszczami i delikatnie pociągnij, aż jajowód i macica będą widoczne. Zacisnąć poduszeczkę tłuszczową za pomocą hemostatyku i odbić poduszeczkę tłuszczową grzbietowo nad kręgosłupem (<silna klasa="xfig">Rysunek 4c). Ustaw układ rozrodczy w taki sposób, aby jajowód mógł być penetrowany igłą o rozmiarze 30 w celu transferu zarodków (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4d).</li>
	<li>Umyj wstrzyknięte zygoty za pomocą HECM-9 w nowym naczyniu. Użyj nowej szklanej pipety (średnica: ~150 - 200 μm), aby załadować 10 - 15 zygot. Ułóż zygoty jako łańcuch pereł, a następnie kilka pęcherzyków powietrza. Włóż pipetę do otwartej rurki z penetracją z kroku 6.3 i delikatnie dmuchnij w pipetę, aby przenieść zygoty do jajowodu. Kontynuuj, aż pierwszy pęcherzyk powietrza zostanie uwolniony do przewodu jajowodowego (<silna klasa="xfig">Rysunek 4e).</li>
	<li>Uwolnij poduszkę tłuszczową i zwróć tkankę do brzucha. Przenieś w przybliżeniu taką samą liczbę (10 - 15) wstrzykniętych zarodków do innego przewodu jajowodowego za pomocą tych samych procesów.</li>
	<li>Zszyj mięśnie i skórę w 2 warstwach. Buprenorfina-HCL (0,5 mg/kg) należy podawać podskórnie jako analgezję pooperacyjną. Umieść chomika z powrotem w klatce i umieść klatkę na ciepłej podkładce w celu odzyskania zdrowia. Umieść klatkę z powrotem w pomieszczeniu dla zwierząt, gdy zwierzę w pełni wyzdrowieje ze znieczulenia. Pooperacyjne leki przeciwbólowe podaje się ponownie sześć godzin później.</li>
</ol>

<ol><li>Takahashi, M., Hori, M., Mutoh, M., Wakabayashi, K., Nakagama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+animal+models+of+pancreatic+carcinogenesis+for+prevention+studies+and+their+relevance+to+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Experimental animal models of pancreatic carcinogenesis for prevention studies and their relevance to human disease.</a> Cancers (Basel). 3 (1), 582-602 (2011).</li>
<li>Wold, W. S., Toth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+three--Syrian+hamster+as+an+animal+model+to+study+oncolytic+adenoviruses+and+to+evaluate+the+efficacy+of+antiviral+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Chapter three--Syrian hamster as an animal model to study oncolytic adenoviruses and to evaluate the efficacy of antiviral compounds.</a> Adv Cancer Res. , 69-92 (2012).</li>
<li>Thomas, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syrian+hamster+as+a+permissive+immunocompetent+animal+model+for+the+study+of+oncolytic+adenovirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Syrian hamster as a permissive immunocompetent animal model for the study of oncolytic adenovirus vectors.</a> Cancer Res. 66 (3), 1270-1276 (2006).</li>
<li>Thomas, M. A., Spencer, J. F., Wold, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+Syrian+hamster+as+an+animal+model+for+oncolytic+adenovirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Use of the Syrian hamster as an animal model for oncolytic adenovirus vectors.</a> Methods Mol Med. , 169-183 (2007).</li>
<li>Hogarth, C. A., Roy, A., Ebert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+evidence+for+the+absence+of+a+functional+cholesteryl+ester+transfer+protein+gene+in+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol+B+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Genomic evidence for the absence of a functional cholesteryl ester transfer protein gene in mice and rats.</a> Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 135 (2), 219-229 (2003).</li>
<li>Ebihara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Syrian+golden+hamster+model+recapitulating+ebola+hemorrhagic+fever%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">A Syrian golden hamster model recapitulating ebola hemorrhagic fever.</a> J Infect Dis. 207 (2), 306-318 (2013).</li>
<li>Jove, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidomic+and+metabolomic+analyses+reveal+potential+plasma+biomarkers+of+early+atheromatous+plaque+formation+in+hamsters%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Lipidomic and metabolomic analyses reveal potential plasma biomarkers of early atheromatous plaque formation in hamsters.</a> Cardiovasc Res. 97 (4), 642-652 (2013).</li>
<li>Vairaktaris, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hamster+model+of+sequential+oral+oncogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Oncol%22%5BJournal%5D)">The hamster model of sequential oral oncogenesis.</a> Oral Oncol. 44 (4), 315-324 (2008).</li>
<li>Paciello, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syrian+hamster+infected+with+Leishmania+infantum%3A+a+new+experimental+model+for+inflammatory+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Syrian hamster infected with Leishmania infantum: a new experimental model for inflammatory myopathies.</a> Muscle Nerve. 41 (3), 355-361 (2010).</li>
<li>Safronetz, D., Ebihara, H., Feldmann, H., Hooper, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Syrian+hamster+model+of+hantavirus+pulmonary+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">The Syrian hamster model of hantavirus pulmonary syndrome.</a> Antiviral Res. 95 (3), 282-292 (2012).</li>
<li>Fan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+targeting+in+golden+Syrian+hamsters+by+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient gene targeting in golden Syrian hamsters by the CRISPR/Cas9 system.</a> PLoS One. 9 (10), e109755(2014).</li>
<li>McKiernan, S. H., Bavister, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+one-cell+hamster+embryos+with+water+soluble+vitamins%3A+pantothenate+stimulates+blastocyst+production%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Culture of one-cell hamster embryos with water soluble vitamins: pantothenate stimulates blastocyst production.</a> Hum Reprod. 15 (1), 157-164 (2000).</li>
<li>Takenaka, M., Horiuchi, T., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+light+on+development+of+mammalian+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Effects of light on development of mammalian zygotes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (36), 14289-14293 (2007).</li>
</ol>

ZW ma udziały finansowe w Auratus Bio, LLC., firmie biotechnologicznej specjalizującej się w tworzeniu genetycznie modyfikowanych zwierząt do badań biomedycznych i zastosowań rolniczych.

Aby lepiej wykorzystać potencjał złotych chomików syryjskich jako modeli chorób u ludzi, opracowaliśmy protokół wstrzykiwania PN do dostarczania kompleksu CRISPR/Cas9 w celu celowania w genom chomika. Protokół iniekcji PN optymalizuje kilka kluczowych zmiennych, w tym pożywkę do hodowli zarodków, temperaturę i długości fal światła13. Istnieje również kilka procedur obchodzenia się ze zwierzętami specyficznymi dla chomików, których należy przestrzegać, aby skutecznie przeprowadzić celowanie genowe ...

Złoty chomik syryjski (Mesocricetus auratus) jest jednym z najczęściej wykorzystywanych gryzoni do badań biomedycznych. Według Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych, w 2015 r. w Stanach Zjednoczonych wykorzystano około 100 000 chomików, co stanowi 13% całkowitego wykorzystania zwierząt laboratoryjnych wśród gatunków objętych ustawą o dobrostanie zwierząt (http://www.aphis.usda.gov; dostęp 10 marca 2017 r.).
Chomik oferuje kilka zalet w porównaniu z innymi gryzoniami w badaniu wielu chorób ludzkich. Na przykład histopatologia gruczolakoraków przewodowych trzustki wywołanych N-nitrozobis(2-oksopropylo)aminą (BOP) u chomików jest podobna do ludzkich guzów trzustki, podczas gdy leczenie BOP głównie indukuje guzy tarczycy u szczurów oraz nowotwory płuc i wątroby u myszy1. Ponieważ chomiki są jedynymi małymi gryzoniami, które wspierają replikację adenowirusów, są one również modelem z wyboru do testowania wektorów onkolitycznych opartych na adenowirusach i leków przeciwadenowirusowych2,3,4. Innym przykładem, w którym model chomika daje przewagę nad myszami i szczurami, jest badanie hiperlipidemii. Ludzie i chomiki wykazują duże podobieństwa w szlakach metabolicznych lipidów i oba gatunki są nosicielami genu kodującego białko przenoszące ester cholesterolu (CETP), który odgrywa kluczową rolę w metabolizmie lipidów, podczas gdy CETP jest nieobecny u myszy i szczurów5. Dodatkowo, u chomików rozwija się choroba krwotoczna, która jest bardziej reprezentatywna dla objawów u ludzi po ekspozycji na wirusa Ebola6. Chomiki są również modelami wybieranymi do badania miażdżycy7, raki jamy ustnej8 i miopatie zapalne9. Ostatnio wykazano również, że chomiki są bardzo podatne na zakażenie wirusem andyjskim i rozwijają chorobę podobną do zespołu płucnego hantawirusa, dostarczając jedyny model infekcji wirusem andyjskim u gryzoni10.
Aby zaspokoić niezaspokojone zapotrzebowanie na nowe genetyczne modele zwierzęce do badania chorób ludzkich, gdzie nie jest dostępny wiarygodny model małego gryzonia, ostatnio udało nam się zastosować system CRISPR/Cas9 u chomików i wyprodukowaliśmy kilka linii genetycznie modyfikowanych chomików11. Zygoty chomików są bardzo wrażliwe na środowisko środowiskowe, tak że protokoły wstrzykiwania PN opracowane u innych gatunków są nieodpowiednie. W związku z tym opracowaliśmy protokół wstrzykiwania PN dla chomika, który uwzględnia specjalne wymagania dotyczące obchodzenia się z zarodkami chomików in vitro. W tym miejscu opisujemy szczegółową procedurę iniekcji PN przy użyciu systemu CRISPR/Cas9 i towarzyszące jej etapy, od przygotowania pojedynczego prowadzącego RNA (sgRNA) do transferu wstrzykniętych zarodków do biorczyń.

<table><tbody><tr><td>Cas9</td><td>Invitrogen</td><td>B25640</td><td>1 &mu; g/&mu; L (~6,1 &mu; M)</td></tr> <tr><td>GeneArtTM Zestaw do syntezy precyzyjnej</td><td>Invitrogen</td><td>A29377</td><td>Do syntezy sgRNA</td></tr><tr><td>Albumina z ludzkiej surowicy</td><td>Sigma</td><td>A1653</td><td>Do podłoża uprawowego</td></tr><tr><td>Illuminator</td><td></td><td>Nikon NI-150</td><td>Do transferu zarodków</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>New Brunswick</td><td>Galaxy 14S</td><td>Do hodowli zarodków</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>PB-7</td><td>Do wytwarzania igieł iniekcyjnych</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>ECLIPSE Ti-S Do</td><td>mikroiniekcji</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>invitrogen</td><td>SMZ745T</td><td>Do transferu zarodków</td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Sigma</td><td>M1840</td><td>Przechowywać w ciemności</td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Sigma</td><td>G4877-2000IU</td><td>Do superowulacji</td></tr></tbody></table>

produkcja genetycznie modyfikowanych złotych chomików syryjskich metodą wstrzyknięcia projądrowego kompleksu crispr/cas9

Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex

Technika iniekcji projądrowej (PN) została po raz pierwszy opracowana u myszy w celu wprowadzenia obcych materiałów genetycznych do przedjądrzy zarodków w stadium jednokomórkowym. Wprowadzony materiał genetyczny może integrować się z genomem embrionalnym i generować zwierzęta transgeniczne z obcą informacją genetyczną po przeniesieniu wstrzykniętych zarodków do matek zastępczych. Po sukcesie u myszy, wstrzykiwanie PN zostało z powodzeniem zastosowane u wielu innych gatunków zwierząt. Ostatnio iniekcja PN została z powodzeniem zastosowana do wprowadzenia odczynników o działaniu modyfikującym geny, takich jak system CRISPR/Cas9, w celu uzyskania specyficznych dla miejsca modyfikacji genetycznych u kilku gatunków zwierząt laboratoryjnych i gospodarskich. Oprócz opanowania specjalnego zestawu umiejętności mikroiniekcji w celu produkcji genetycznie modyfikowanych zwierząt za pomocą iniekcji PN, naukowcy muszą zrozumieć fizjologię reprodukcji i zachowanie gatunków docelowych, ponieważ każdy gatunek stanowi unikalne wyzwania. Na przykład zarodki złotego chomika syryjskiego mają wyjątkowe wymagania dotyczące obchodzenia się z zarodkami in vitro, tak że techniki wstrzykiwania PN nie były możliwe u tego gatunku aż do niedawnych przełomów dokonanych przez naszą grupę. Dzięki naszemu zmodyfikowanemu gatunkowo protokołowi wstrzykiwania PN udało nam się wyprodukować kilka chomików z nokautem genów (KO) i knockin (KI), które z powodzeniem wykorzystano do modelowania chorób ludzkich. Tutaj opisujemy procedurę wstrzykiwania PN w celu dostarczenia kompleksu CRISPR/Cas9 do zygot chomika, warunki obchodzenia się z zarodkiem, procedury transferu zarodków i hodowlę wymaganą do wytworzenia chomików modyfikowanych genetycznie.

Wydajność opisanego protokołu w otrzymywaniu genetycznie zmodyfikowanych chomików zależy od wyników dwóch następujących krytycznych etapów: wskaźnika żywych urodzeń u samic biorców oraz liczby żywych młodych z zamierzonymi modyfikacjami genetycznymi. Wskaźnik żywych urodzeń jest bezpośrednim wynikiem jakości zarodków oraz umiejętności osoby wykonującej procedury iniekcji do pronukleusa (PN) i transferu zarodków. Aby mieć pewność, że potencjał rozwojowy manipulowanych zarodków nie zostanie...

Pronuclear (PN) wstrzykiwanie systemu CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) i systemu CRISPR-related protein-9 nucleazy (CRISPR/Cas9) jest wysoce efektywną metodą produkcji genetycznie modyfikowanych złotych chomików syryjskich. W niniejszym artykule opisujemy szczegółowy protokół wstrzykiwania PN do produkcji chomików z nokautem genów za pomocą systemu CRISPR/Cas9.

Produkcja genetycznie modyfikowanych złotych chomików syryjskich metodą wstrzyknięcia projądrowego kompleksu CRISPR/Cas9

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest przedstawienie widzom szczegółowych procedur wytwarzania genetycznie zmodyfikowanych złotych chomików syryjskich poprzez wstrzykiwanie kompleksu CRISPR/Cas9 do pronukleusa. Opracowany przez nas protokół wstrzykiwania do PN u złotego chomika syryjskiego umożliwia inżynierię genetyczną u tego gatunku. Technologia ta stanowi istotny wkład w rozwój modeli zwierzęcych.Ze względu na ekstremalną wrażliwość embrionów chomika na środowisko, opracowaliśmy unikalny protokół mikroiniekcji do pronukleusów, aby dostosować go do specyficznych wymagań embrionów chomika. Opracowanie tej techniki stanowi wielki krok naprzód w modelowaniu ludzkich chorób, ponieważ po raz pierwszy możliwe stało się wytwarzanie genetycznie zmodyfikowanych modeli chomika. W tym eksperymencie, na jeden dzień przed iniekcją do pronukleusów (PN), należy przygotować naczynia do manipulacji zygotami oraz kroplę do iniekcji PN w pokrywce naczynia o średnicy 35 mm z medium HECM-9.Przykryć krople pożywki olejem mineralnym. Aby zrównoważyć krople i pożywkę HECM-9, inkubować je w temperaturze 37.5 °C przez noc. W dniu iniekcji PN przygotować szalki do wypłukiwania embrionów, używając pożywki HECM-9.Przechowywać je w inkubatorze do momentu użycia. Aby wyizolować jajowody, uśpioną samicę chomika po superowulacji ułożyć w pozycji na plecach na podkładce chirurgicznej. Brzuch przemyć 70% etanolem.Następnie mocno chwyć skórę i warstwę mięśni brzucha w linii środkowej i wykonaj nacięcie wzdłuż końca brzucha. Aby odsłonić narządy brzuszne, rozetnij otrzewną. Następnie, używając precyzyjnej pęsety, uchwyć jeden z rogów macicy i odsuń tkankę z jamy brzusznej.Oddziel macicę od mezometrium i tkanki tłuszczowej. Wykonaj pierwsze cięcie pomiędzy jajowodem a jajnikiem, a drugie w pobliżu miejsca połączenia jajowodu z macicą, obejmując niewielką część macicy. Umieść jajowody w tej samej szalce Petriego.Aby zebrać zygoty pod mikroskopem stereoskopowym, należy użyć pęsety Dumont nr 5, aby chwycić bok rogu macicy. Następnie należy wprowadzić wykonaną samodzielnie igłę do światła jajowodu od strony końca lejkowatego. Po tym czasie jajowód należy przepłukać od 300 do 400 µL pożywki HECM-9.Bezpośrednio po wypłukaniu należy zebrać zygoty i dwukrotnie przemyć je roztworem HECM-9 w naczyniu manipulacyjnym. Na tym etapie rozwoju wszystkie zygoty powinny być pozbawione komórek cumulus. Następnie należy umieścić zygoty w inkubatorze aż do momentu iniekcji, aby uniknąć ekspozycji na światło.Aby przygotować kompleksy do iniekcji, rozmroź Cas9-sgRNA RNP na lodzie. Bezpośrednio przed iniekcją pobierz roztwór RNP do igły iniekcyjnej, umieszczając tylny koniec igły w probówce z roztworem, aby wypełniła się ona poprzez działanie kapilarne. Następnie napełnij pipetę uchwytu olejem mineralnym do poziomu około trzech milimetrów od zgięcia igły. Umieść uchwyt w mikroinjektorze tak, aby końcówka pipety uchwytu była poziomo skierowana do dna naczynia.Napełnij końcówkę igły pożywką poprzez zassanie. Następnie ustaw igłę do iniekcji pod kątem od 10 do 15 stopni w kierunku przeciwnym do uchwytu. Następnie zidentyfikuj zygotę i użyj igły uchwytu, aby zastosować delikatne zassanie.Męskie jąderko komórkowe, które jest nieco większe, oraz żeńskie powinny znajdować się najlepiej w tej samej płaszczyźnie ogniskowania i być ustawione równolegle do uchwytu. Używając igły w pozycji na godzinie trzeciej, należy przebić strefę błonistą (zona pellucida) i męskie jąderko komórkowe. Gdy jąderko napęcznieje, należy szybko wycofać igłę, aby zapobiec przyleganiu jądra do igły i uniknąć jego uszkodzenia.Wydajność celowania w geny STAT2 i RAG1 za pomocą systemu Cas9/sgRNA ocenia się na podstawie wskaźnika żywych urodzeń u samic biorców oraz liczby żywych szczeniąt z zamierzonymi modyfikacjami genetycznymi. Wyniki genotypowania szczeniąt, uzyskane za pomocą analizy polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych po PCR (PCR-RFLP), wykazują wydajność celowania w geny. Ścieżka pierwsza wskazuje allele zmodyfikowane biallelicznie, a ścieżki trzecia i siódma wskazują allele zmodyfikowane monoallelicznie lub mozaikowo.Technologia ta utorowała drogę badaczom do opracowania nowych genetycznie modyfikowanych modeli chorób ludzkich u chomików. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak wytworzyć genetycznie modyfikowane chomiki syryjskie poprzez pronuklearną iniekcję kompleksu CRISPR/Cas9.

production-genetically-engineered-golden-syrian-hamsters-pronuclear

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

CRISPR/Cas9 to solidny system do wywoływania zakłóceń w genach i elementach genetycznych. W tym miejscu opisujemy protokół skutecznego tworzenia delecji genomowych w liniach komórkowych ssaków przy użyciu CRISPR/Cas9.

Generowanie delecji genomowych w liniach komórkowych ssaków za pomocą CRISPR/Cas9

Mikroiniekcja mysich oocytów jest powszechnie stosowana zarówno do klasycznej transgenezy (tj. losowej integracji transgenów), jak i do celowania genów za pośrednictwem CRISPR. W protokole tym dokonano przeglądu najnowszych osiągnięć w dziedzinie mikroiniekcji, ze szczególnym naciskiem na kontrolę jakości i strategie genotypowania.

Generowanie genetycznie zmodyfikowanych myszy poprzez mikroiniekcję oocytów

Opisujemy tutaj technikę, która łączy mutagenezę transpozonów z sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości w celu identyfikacji i ilościowego określenia transpozonów mutantów leptospiralnych w tkankach po wyzwaniu chomików. Protokół ten może być stosowany do badań przesiewowych mutantów pod kątem przeżycia i rozprzestrzeniania się u zwierząt, a także może być stosowany w badaniach in vitro.

Wysokoprzepustowe sekwencjonowanie równoległe w celu pomiaru sprawności Leptospira interrogans Mutanty insercji transpozonów podczas infekcji złotego chomika syryjskiego

Zgrupowany, regularnie rozmieszczony, krótki powtórzeń palindromicznych/system białka związanego z CRISPR 9 (CRISPR/Cas9) stanowi obiecujące narzędzie dla inżynierii genetycznej i otwiera możliwość celowej integracji transgenów. Opisujemy strategię opartą na łączeniu końców za pośrednictwem homologii (HMEJ) dla efektywnej ukierunkowanej integracji DNA in vivo i celowanych terapii genowych przy użyciu CRISPR/Cas9.

Ukierunkowana integracja in vivo za pośrednictwem CRISPR/Cas9 przy użyciu strategii opartej na łączeniu końcowym za pośrednictwem homologii

Tutaj prezentujemy protokół promujący integrację transgenów i produkcję założycielskich myszy transgenicznych z wysoką skutecznością poprzez proste wstrzyknięcie wektora lentiwirusowego w przestrzeń okołobrewą zapłodnionego oocytu.

Produkcja transgenicznych myszy za pośrednictwem lentiwirusa: prosta i wysoce skuteczna metoda bezpośredniego badania założycieli

Herpeswirus indyków (HVT) jest szeroko stosowany jako platforma wektorowa do generowania rekombinowanych szczepionek przeciwko wielu chorobom ptaków. W artykule opisano proste i szybkie podejście do wytwarzania rekombinowanych szczepionek wektorowych HVT przy użyciu zintegrowanego systemu NHEJ-CRISPR/Cas9 i Cre-Lox.

Generowanie rekombinowanych wektorów herpeswirusa ptasiego z edycją genów CRISPR/Cas9

Tutaj prezentujemy zmodyfikowaną metodę kriokonserwacji jednokomórkowych zarodków, a także protokół, który łączy użycie zamrożonych i rozmrożonych embrionów z elektroporacją w celu efektywnego generowania genetycznie modyfikowanych myszy.

Wykorzystanie zamrożonych i rozmrożonych zarodków do wysokowydajnej produkcji genetycznie zmodyfikowanych myszy

Wiele cech eusocjalności owadów opiera się na komunikacji wewnątrz kolonii i podziale pracy. Manipulacja genetyczna kluczowych genów regulatorowych w zarodkach mrówek za pomocą mikroiniekcji i mutagenezy za pośrednictwem CRISPR dostarcza informacji na temat natury zachowań altruistycznych u owadów eusocjalnych.

Iniekcje zarodków w celu mutagenezy za pośrednictwem CRISPR u mrówki Harpegnathos saltator

Obecny protokół opisuje pojedynczą mutację M213L w Gja1, która zachowuje pełną generację Connexin43, ale uniemożliwia translację mniejszej wewnętrznie translowanej izoformy GJA1-20k.

Usunięcie wewnętrznego translacyjnego miejsca startowego z mRNA przy zachowaniu ekspresji białka o pełnej długości

Obecny protokół opisuje mikroiniekcję zygoty z CRISPR-Cas9 i DNA dawcy w celu efektywnej produkcji myszy z kasetą z genami i myszami z klapkami.

Mikroiniekcja zygoty do tworzenia alleli knock-in i flox kasety genów u myszy

Tutaj opisujemy prostą technikę przeznaczoną do efektywnego generowania genetycznie modyfikowanych myszy o nazwie CRISPR RNP Electroporation of Zygot (CRISPR-EZ). Metoda ta zapewnia edycję odczynników poprzez elektroporację do zarodków z wydajnością bliską 100%. Protokół ten jest skuteczny w przypadku mutacji punktowych, małych insercji genomowych i delecji w zarodkach ssaków.

Wydajna edycja genomu myszy za pomocą elektroporacji zygot CRISPR

Naucz się produkcji genetycznie modyfikowanych złotych chomików syryjskich metodą wstrzyknięcia projądrowego kompleksu CRISPR/Cas9. Protokół umożliwia precyzyjną edycję genów w wrażliwych zarodkach chomika.

Produkcja genetycznie modyfikowanych złotych chomików syryjskich metodą wstrzyknięcia projądrowego kompleksu CRISPR/Cas9

Przeglądaj więcej filmów