Częściowa transsekcja nerwu wzrokowego u szczurów: model ustalony z nowym podejściem operacyjnym do oceny wtórnego zwyrodnienia komórek zwojowych siatkówki
15 października 2017
Wtórne zwyrodnienie komórek zwojowych siatkówki (RGC) występuje często w jaskrze. W pracy opisano innowacyjne podejście operacyjne do częściowej transsekcji nerwu wzrokowego. Zastosowanie tego oszczędzającego miejsce podejścia operacyjnego rozszerza zakres zastosowań modelu i umożliwia eksplorację mechanizmów wtórnych uszkodzeń w RGC w nowy sposób.
Wtórne zwyrodnienie komórek zwojowych siatkówki występuje głównie w jaskrze. W artykule przedstawiono innowacyjny model podejścia operacyjnego częściowej transsekcji nerwu wzrokowego. To oszczędzające miejsce podejście operacyjne poprawia zdolność badacza do podawania leków, nośników lub selektywnych znaczników RGC na kikut częściowo przeciętego nerwu wzrokowego i pozwala naukowcom badać wtórne mechanizmy uszkodzeń RGC w nowy sposób.
Jaskra jest przewlekłą chorobą neurodegeneracyjną, a postępująca neuropatologia utrzymuje się przez długi czas. Nadciśnienie oczne jest jedną z wyraźnych przyczyn jaskry, a zmniejszenie nadciśnienia ocznego okazało się jedyną potwierdzoną skuteczną terapią leczenia jaskry. Ale sytuacja niektórych pacjentów ulegnie dalszemu pogorszeniu, nawet po opanowaniu nadciśnienia ocznego.
W związku z tym wtórne zwyrodnienie RGC, które uważa się za występujące w jaskrze. Jednak mechanizm konkretnie związany z pierwotnym lub wtórnym zwyrodnieniem nadal nie jest jasny. Wtórne zwyrodnienie mechanizmu RGC będzie kierować leczeniem urazów neurologicznych i chorób neurodegeneracyjnych CES.
Aby pomóc w częściowym ilościowym przecięciu nerwu wzrokowego, prezentujemy nowo zaprojektowane, niedrogie narzędzie chirurgiczne. Instrument składa się z dwóch części, ręcznej tyczki i rowkowanej główki. Rowkowana głowa jest półokrągła o pionowej głębokości 200 mikrometrów, a rowkowana powierzchnia umożliwia ułożenie w niej brzusznego nerwu wzrokowego i ustabilizowanie go do przecięcia.
Umieść nerw wzrokowy w rowku instrumentu. Rowkowana powierzchnia instrumentu umożliwia stabilizację nerwu wzrokowego do transsekcji. Następnie przeciąć pionowo nerw wzrokowy odpowiednią końcówką igły lub ostrzem noża.
Należy pamiętać, że odcięta jest tylko grzbietowa część nerwu wzrokowego, ponieważ część brzuszna jest chroniona przez instrument. Oddziel i oddziel oponę twardą wokół nerwu wzrokowego, upewniając się, że nie odcina tętnicy ocznej związanej z osłonką opony mózgowej. Pierwotne uszkodzenie zostało osiągnięte w RGC odpowiadających ilościowo przeciętym aksonom nerwu wzrokowego po stronie grzbietowej, podczas gdy wtórne uszkodzenie zostałoby wykonane w RGC odpowiadających nieprzeciętym aksonom nerwu wzrokowego, stronie środkowej i brzusznej, bez bezpośredniego uszkodzenia.
Szczury znieczulono przy użyciu weterynaryjnego systemu parowania izofluranu. Podczas operacji monitorowano znieczulenie, a dawkę izofluranu odpowiednio dostosowano. Stale oceniaj głębokość i tempo oddychania oraz wykonuj ocenę szczypania palców u nóg co pięć minut, aby upewnić się, że nie ma głębokiego bólu.
Umieść prawą stronę szczura do góry na stole operacyjnym z głową skierowaną w stronę operacji. Wyreguluj prawy orbit w środku chirurgicznego pola widzenia. Następnie kilkakrotnie oczyść obszar nacięcia wzdłuż bocznej kanty do zewnętrznego otworu akustycznego prawej skóry oczodołu, stosując 0,5% chlorheksydyny i 75% etanolu.
Usuń futro między bocznym kantem a zewnętrznym otworem akustycznym za pomocą nożyczek do tęczówki. Wykonaj nacięcie skóry za pomocą nożyczek do tęczówki wzdłuż bocznego kantu do zewnętrznego otworu akustycznego o długości od 0,5 do jednego centymetra. Następnie ściśnij powięź i pociągnij w górę, aby utworzyć trójkątny klin za pomocą kleszczy zębatych o średnicy 0,12 milimetra.
Włóż dolne ostrze nożyczek sprężynowych Vannas w obszar nacięcia i rozetnij powięź w tym samym kierunku ścinania, co skóra nożyczek. Szczególnie podczas przecinania powięzi podskórnej w zewnętrznej bocznej kancie, użyj ostrych ząbkowanych kleszczy, aby pociągnąć w górę powięź podskórną na powierzchni powięzi w pionie i przeciąć powięź nożyczkami sprężynowymi Vannas, aby uniknąć uszkodzenia żyły oczodołowej na zewnętrznej kancie, aby spowodować awarię modelu przez nadmierne krwawienie. Przetnij powięź nożyczkami do tęczówki i odsłoń żyłę oczodołu.
Użyj rozwarstwienia, aby otworzyć obie strony nacięcia. Zaletą tej procedury jest to, że może zapobiegać krwawieniu przy bezpośrednim odcięciu naczyń krwionośnych. Następnie użyj nożyczek do tęczówki, aby rozciąć prawą boczną kantę wzdłuż linii nacięcia, aby w pełni odsłonić dostęp chirurgiczny i całkowicie odsłonić pole widzenia w celu późniejszego rozwarstwienia mięśni oczodołu.
Kontynuuj zaciskanie foldera mięśnia podpowięziowego oczodołu i stępiaj separację pionowo do kierunku nacięcia skóry i powięzi. Następnie stopniowo rozdzielaj wzdłuż boków, aby osiągnąć głębokość oczodołu, aż do pojawienia się tkanki tłuszczowej oczodołu. Procedura ta otworzy głębsze części jamy oczodołu, zapewniając większe okno chirurgiczne do pracy i umożliwiając niezakłócony dostęp do tkanek pokrywających nerw wzrokowy.
W powyższych zabiegach, jeśli dojdzie do krwawienia, należy zastosować ucisk, używając sterylnych wacików chirurgicznych lub wacików. Po odsłonięciu tkanki tłuszczowej na orbicie zmień kierunek głowy szczura z pionowej strony chirurga na prawą stronę chirurga. Odetnij oczodołowe tkanki tłuszczowe pokryte stożkiem mięśnia oczodołu wokół nerwu wzrokowego.
To działanie może zapewnić, wyeksponować odpowiednie podejście chirurgiczne. Należy pamiętać, aby utrzymać objętość wyciętej tkanki tłuszczowej w rozsądnym zakresie, aby uniknąć utrzymującego się krwawienia. Po przecięciu tkanki tłuszczowej odsłania się mięsień prosty boczny.
Zaciśnij boczny odbytnik na zewnątrz, a następnie przetnij go nożyczkami sprężynowymi Vannas. Celem tej procedury jest uzyskanie lepszej ekspozycji nerwu wzrokowego, ponieważ boczny odbytnik prosty jest znacznie szerszy i w oczywisty sposób blokuje widok nerwu wzrokowego. Jeśli pod mięśniem prostym bocznym nadal znajduje się tkanka tłuszczowa, podciągnij tłuszcz pokrywający nerw wzrokowy za pomocą kleszczy zębatych o średnicy 0,12 milimetra i przetnij nożyczkami sprężynowymi Vannas.
Wtedy widoczna jest osłonka tkankowa wokół nerwu wzrokowego. Kontynuuj oddzielanie osłonki tkankowej wzdłuż kierunku nerwu wzrokowego w głębokości oczodołu, aż do całkowitego odsłonięcia nerwu wzrokowego. Utrzymuj obszar w czystości za pomocą wacików chirurgicznych do czyszczenia niewielkich ilości krwi, które powstają w wyniku usunięcia tkanek.
Teraz nerw wzrokowy powinien być widoczny. Aby uzyskać dostęp do nerwu, usuń osłonkę opony mózgowej, która otacza nerw, nie uszkadzając tętnicy ocznej. Delikatnie obróć osłonę, aby zbadać wzór naczyniowy opony twardej przy większym powiększeniu mikroskopu operacyjnego.
Poszukaj obszaru, który jest pozbawiony naczyń krwionośnych i pozwól na podłużne cięcie opony twardej. Ostrożnie rozerwać osłonkę równolegle do kierunku nerwu wzrokowego za pomocą końcówki igły lub noża, aby uniknąć uszkodzenia układu krwionośnego bocznymi cięciami. Jedyną pozostałością po pokryciu nerwu była błona pajęczynówkowa.
Jest bardzo cienki i przezroczysty. Podobnie jak w poprzednim kroku, delikatnie rozerwij błonę pajęczynówki, czubkiem igły lub nożem, równolegle do kierunku nerwu wzrokowego. Ułóż nerw wzrokowy w rowku instrumentu miękko i ostrożnie, tak aby grzbietowy nerw wzrokowy znajdował się nieco wyżej niż krawędź głowy rowka.
Następnie przeciąć grzbietowy nerw wzrokowy powyżej krawędzi platformy główki rowka za pomocą końcówki igły lub ostrza noża, aby zakończyć częściową transsekcję nerwu wzrokowego. Przesuń instrument nieco głębiej, w kierunku pionowym nerwu wzrokowego, aby uwolnić nerw wzrokowy. Następnie delikatnie wyjmij rowek w głowicy instrumentu.
Staraj się nie drapać mięśni oka ani innych tkanek, aby uniknąć dodatkowych uszkodzeń. Następnie można zaobserwować kikut częściowego przecięcia nerwu wzrokowego. Wymień boczną odbytnicę, powięź i inne tkanki wokół oka do pierwotnej pozycji.
Następnie zszyj kolejno warstwę mięśniową i warstwę skóry oczodołu. Nałóż maść z antybiotykiem na ranę, aby zapobiec infekcji po założeniu szwu. W procesie reanimacji szczurów przygotuj izolację termiczną za pomocą podgrzewanej maty lub przykryj suchą wyściółką w klatce.
Przykryj je kocem, aby się ogrzać. Zapewnić drożność dróg oddechowych szczura podczas procesu rekonwalescencji. Zwierzęta były trzymane niezależnie i dokładnie monitorowane po operacji.
W celu zweryfikowania sukcesu w ustaleniu modelu urazu wtórnego z nowym podejściem operacyjnym przy użyciu samodzielnie zaprojektowanego narzędzia asystenta chirurgicznego, RGC zostały oznaczone wstecznie natychmiast po ustaleniu modelu. Celem tej procedury było znakowanie RGC wstecz poprzez wstrzyknięcie barwnika znacznikowego neuronalnego do górnego wzgórka. Barwnik byłby wstecznie pobierany przez RGC w siatkówce i stanowi marker dla żywych RGC z nieprzeciętymi aksonami w prawym oku.
Podczas gdy RGC odpowiadające aksonom nerwu wzrokowego, które zostały częściowo przecięte w prawym oku, nie mogły być oznaczone fluoro-złotem, jako oko kontrolne, lewe oko bez żadnej operacji, RGC wzdłuż nerwu wzrokowego na siatkówce były wszystkie oznaczone fluorescencyjnym barwnikiem złota w sposób wsteczny od górnego wzgórka. Przedstawiono wyniki znakowanych fluorescencyjnie RGC z częściową transsekcją nerwu wzrokowego lub bez niej. Tylko RGC w prawej siatkówce odpowiadające nienaruszonej części nerwu wzrokowego zostały oznaczone fluorescencyjnym złotem, a wyraźna granica nieznakowanych i znakowanych RGC została uwidoczniona, co wykazało częściową transsekcję nerwu wzrokowego.
Jako oko kontrolne, wszystkie RGC siatkówki lewego oka zostały oznaczone fluorescencyjnym złotem. Obrazy te pokazują, że dopływ krwi do prawego oka obserwowano przed i po operacji. Po operacji tętnice nadal wypełniały się krwią i nie zaobserwowano niedrożności żył.
Wskazywało to, że podczas operacji nie doszło do uszkodzenia układu krwionośnego. Udało się opracować model wtórnej degeneracji RGC. Model potencjalnej transsekcji nerwu wzrokowego jest użytecznym modelem zwierzęcym do badania mechanizmu wtórnej degeneracji i badań przesiewowych pod kątem leków neuroprotekcyjnych w walce z wtórnym zwyrodnieniem.
Mariaż tego modelu polega na zdolności do oddzielenia zwyrodnienia pierwotnego od wtórnego dokładnie w lokalizacji, zarówno w nerwie wzrokowym, jak i w siatkówce. Główną zaletą zaprojektowanego przez nas urządzenia jest większa powtarzalność i łatwiejsza obsługa. Przy odrobinie wprawy wszystkie etapy pełnej procedury chirurgicznej można wykonać w ciągu 10 do 15 minut na oko po wykonaniu wstępnych nacięć wejściowych.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia innowacyjne podejście chirurgiczne do częściowej transekcji nerwu wzrokowego, mające na celu badanie wtórnej degeneracji komórek zwojowych siatkówki (RGCs) w jaskrze. Metoda ta zwiększa możliwość badania mechanizmów wtórnego uszkodzenia RGCs, zapewniając jednocześnie oszczędny pod względem przestrzeni model operacyjny.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Okulistyka
- Choroby neurodegeneracyjne
Wstęp
- Wtórna degeneracja komórek zwojowych siatkówki (RGC) jest powszechna w jaskrze.
- Nadciśnienie wewnątrzgałkowe jest główną przyczyną jaskry.
- Zrozumienie mechanizmów wtórnej degeneracji ma kluczowe znaczenie dla procesu leczenia.
- Obecne terapie koncentrują się na kontrolowaniu nadciśnienia wewnątrzgałkowego.
Cel badania
- Opracowanie niskokosztowego instrumentu chirurgicznego do częściowej transekcji nerwu wzrokowego.
- Ułatwienie podawania leków oraz prowadzenia badań z użyciem znaczników w komórkach zwojowych siatkówki (RGCs).
- Zbadanie mechanizmów wtórnego uszkodzenia w komórkach zwojowych siatkówki (RGCs).
Zastosowane metody
- Projekt ręcznego narzędzia chirurgicznego z rowkowaną końcówką.
- Częściowa przecięcie nerwu wzrokowego przy jednoczesnej ochronie jego części brzusznej.
- Zastosowanie izofluranu do znieczulenia podczas procedur chirurgicznych.
- Szczegółowe etapy chirurgiczne w celu odsłonięcia nerwu wzrokowego i wykonania przecięcia.
Główne wyniki
- Nowa metoda chirurgiczna umożliwia precyzyjne przecięcie nerwu wzrokowego.
- Ułatwia badanie wtórnej degeneracji w RGCs.
- Poprawia dostęp w celu podawania leków i aplikacji znaczników.
- Wykazuje potencjał w rozwoju badań nad jaskrą.
Wnioski
- Innowacyjny model chirurgiczny zwiększa możliwości badawcze w zakresie jaskry.
- Zrozumienie mechanizmów wtórnej degeneracji może prowadzić do opracowania lepszych metod leczenia.
- Podejście to może dostarczyć informacji pomocnych w opracowywaniu strategii leczenia neurotraumy oraz chorób neurodegeneracyjnych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Częściowe przerwanie nerwu wzrokowego u szczurów stanowi solidny model przedkliniczny do analizy pierwotnej i wtórnej degeneracji komórek zwojowych siatkówki, co jest kluczowym wyzwaniem w badaniach nad chorobami neurodegeneracyjnymi. Model ten umożliwia precyzyjną lokalizację i mechanistyczną weryfikację szlaków wtórnych uszkodzeń istotnych w przypadku jaskry i zaburzeń z nią związanych. Jego powtarzalność i efektywność operacyjna wspierają ciągłość translacyjną oraz selekcję projektów w procesie odkrywania leków neuroprotekcyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia mechaniczną analizę wtórnej degeneracji, odróżniając ją od pierwotnego uszkodzenia komórek zwojowych siatkówki.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów dla strategii neuroprotekcyjnych w jaskrze i neurodegeneracji.
- Ułatwia przewidywanie skuteczności punktów interwencji specyficznych dla szlaków w przypadku wtórnego uszkodzenia.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia powtarzalny system in vivo do oceny potencjalnych związków neuroprotekcyjnych ukierunkowanych na wtórną degenerację.
- Umożliwia standaryzowane podawanie leków, nośników lub znaczników bezpośrednio do kikuta nerwu wzrokowego.
- Pozwala na ilościową ocenę przeżywalności RGC oraz granic uszkodzenia w celu opracowania testów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z mechanizmami istotnymi dla rozwoju choroby obserwowanymi w jaskrze i przewlekłych stanach neurodegeneracyjnych.
- Wspiera ciągłość procesu od odkrycia mechanistycznego do przedklinicznej walidacji interwencji neuroprotekcyjnych.
- Zmniejsza ryzyko translacyjne poprzez modelowanie procesów wtórnego uszkodzenia w sposób kontrolowany i mierzalny.
Integracja potoków i przepływów pracy
Model ten integruje się z kontinuum od odkryć do badań przedklinicznych, umożliwiając testowanie hipotez dotyczących mechanizmów degeneracji wtórnej oraz potencjalnych interwencji.
- Biologia odkrywcza: Analizuje różnice między urazem pierwotnym a wtórnym, wyjaśniając szlaki mechanistyczne w degeneracji RGC.
- Przesiewanie: Umożliwia powtarzalną, ilościową ocenę agentów neuroprotekcyjnych w standaryzowanym modelu zwierzęcym.
- Analityka: Zapewnia przejrzyste odczyty znakowania RGC oraz granic urazu do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia mechanistyczne z przedklinicznymi badaniami skuteczności w systemach istotnych dla danej jednostki chorobowej.
- Zastosowania w przedsiębiorstwach: Oferuje skalowalny, niskokosztowy model, który można dostosować do różnych projektów badawczych nad neurodegeneracją.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechaniczną w badaniach nad neurodegeneracją.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność, standaryzację i efektywność w tworzeniu modeli przedklinicznych.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) nad kandydatami na leki neuroprotekcyjne celujące w uszkodzenia wtórne.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację programów terapeutycznych ukierunkowanych na degenerację wtórną z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w technikach mikrosurgicalnych oraz w obchodzeniu się z modelami zwierzęcymi.
- Wymaga dostępu do specjalistycznych instrumentów chirurgicznych oraz infrastruktury do znakowania RGC opartego na fluorescencji.
- Wymaga rygorystycznej standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia powtarzalności i porównywalności danych.
- Metoda jest adaptowalna dla różnych modeli gryzoni, lecz w przypadku innych gatunków może wymagać optymalizacji protokołu.
- Potencjalne ograniczenia obejmują czas nauki technik chirurgicznych oraz konieczność przeprowadzenia precyzyjnej dyssekcji anatomicznej.
