Obrazowanie tkanek amyloidowych barwionych luminescencyjnymi sprzężonymi oligotiofenami za pomocą hiperspektralnej mikroskopii konfokalnej i obrazowania fluorescencji

Ogólnym celem tej metody jest wykrywanie złogów białkowych zarówno w warunkach klinicznych, jak i naukowych. Opisano barwienie kwasem hepta formyl tiofenu octowego oraz analizę tkanek z modeli zwierzęcych choroby prionowej i choroby Alzheimera. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie amyloidu, takie jak obecność niewielkich ilości agregatów białkowych i ich wewnętrzne zmiany konformacyjne.

Zaletą tej techniki jest to, że jest bardziej selektywna i bardziej czuła niż inne konwencjonalne techniki. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię lub diagnostykę różnych chorób związanych z nieprawidłowym fałdowaniem białek ze względu na możliwość dostosowania sond do pożądanej techniki wizualizacji. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają stosować tę metodę, mają trudności, ponieważ hFTAA wymaga tak niskiego stężenia barwienia.

HFTAA wykazuje również dłuższą długość fali wzbudzenia i emisji w porównaniu z konwencjonalnymi barwnikami. Przygotować luminescencyjny sprzężony roztwór oligotiofenu przez ponowne wymieszanie liofilizowanego hFTAA w dwumilimolowym wodorotlenku sodu w celu przygotowania roztworu podstawowego o stężeniu jeden miligram na mililitr. Przenieść roztwór podstawowy do szklanej fiolki i przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Jeśli używane są skrawki utrwalone formaliną i zatopione w parafinie, należy odparafinować ksylen przez noc. W dniu barwienia zanurz skrawki w kolejnych kąpielach 99% etanolu, 70% etanolu, dH2O i PBS na dziesięć minut za każdym razem. Następnie pozwól skrawkom tkanki wyschnąć w warunkach otoczenia.

Podczas wyschnięcia tkanki przygotuj roztwór roboczy hFTAA, rozcieńczając bazę od 1 do 10 000 w PBS. Gdy tkanka jest sucha, dodaj kropelki roztworu roboczego hFTAA do każdego odcinka tkanki, aby ją przykryć. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.

Spłucz roztwór barwiący 500 mikrolitrami PBS, a następnie zanurz szkiełko w kąpieli PBS na 10 minut. Po pozostawieniu sekcji do wyschnięcia w warunkach otoczenia, zamontuj ją za pomocą fluorescencyjnego medium montażowego. Poczekaj, aż podłoże montażowe osiądzie przez noc.

Detekcja amyloidu może być wykonana bezpośrednio po zamontowaniu, a nawet bez montażu. Jeśli jednak celem eksperymentu jest zebranie wysokiej jakości informacji spektralnych, preferowana jest inkubacja przez noc. Otwórz oprogramowanie mikroskopu, nazwij projekt, wybierz obraz spektralny i rozpocznij akwizycję.

Wybierz interesujący Cię obiekt przez okular za pomocą filtra wzbudzenia 436 nanometrów i przesuń ścieżkę światła do kamery. W menedżerze danych przypadku wybierz typ próbki spektralnej, oznacz próbkę etykietą i naciśnij przycisk pobierz. Otworzy się okno przejęcia.

W obszarze obrazowanie spektralne otwórz menu ustawień, wybierz właściwości akwizycji i ustaw zakres widmowy na 460 do 700, jakość prędkości przy maksymalnej prędkości oraz typ pomiaru na wąskie filtry lasera gazowego. Zamknij okno dialogowe. W menu obrazu wybierz opcję na żywo w pełnej wersji.

Na pasku ikon wyłącz otoczki. Wybierz region do zobrazowania i upewnij się, że szczytowa wartość pamięci jest mniejsza niż 800 megabajtów. Ustaw czas ekspozycji na wartość, która daje całkowitą jasność obrazu z zakresu od 1 000 do 3 000.

Na pasku ikon naciśnij kolorową kamerę. Rozpocznie się akwizycja. Po zakończeniu akwizycji obrazu naciśnij przycisk Zapisz w oknie dialogowym pobierania obrazu spektralnego i nową komórkę w oknie dialogowym menedżera danych przypadku.

W menedżerze danych sprawy otwórz zebrany obraz za pomocą przycisku Rozpocznij analizę. Otworzy się okno analizy danych. Informacje spektralne można zbierać z każdego piksela obrazu, wybierając ROI za pomocą okna dialogowego wyświetlania spektralnego.

Wybierz, zdefiniuj i wybierz ROI z odpowiednich obszarów obrazu. Zapisz dane spektralne jako plik tekstowy za pomocą przycisku Lib. Zapisany plik txt można zaimportować do dowolnego oprogramowania analitycznego.

Otwórz oprogramowanie mikroskopu i zacznij od skonfigurowania mikroskopu konfokalnego. Ustaw intensywność lasera na 0,2%, otworek na jedną jednostkę Airy, rozmiar klatki na 1 024 na 1 024 piksele, prędkość skanowania na siedem średnio na 16 skanów, a głębię bitową na osiem bitów. Aby zebrać widmo emisyjne, wybierz tryb lambda i ustaw laser argonowy na 488 nanometrów.

Zbieraj emisję od 499 do 691 nanometrów za pomocą 22 kanałów w 32-kanałowym detektorze oddechu. Ustaw wzmocnienie na 755. Kliknij przycisk na żywo i zmień paletę na wskaźnik zakresu i dostosuj wzmocnienie, aby umożliwić nieprzeciążone piksele w kolorze czerwonym.

Kliknij przycisk zatrzymania, a następnie przechwyć obraz za pomocą przycisku przyciągania. Aby uzyskać obrazy jednokanałowe, wybierz opcję inteligentnej konfiguracji. Wybierz FITC i Alexa 532.

Wybierz opcję liniowego rozmieszania i zastosuj. Dostosuj wzmocnienie, aby umożliwić nieprzeciążone piksele. W przypadku FITC ustaw wzmocnienie na 693, a w przypadku Alexa 532 ustaw wzmocnienie na 433 w trybie na żywo.

Kliknij przycisk zatrzymania, a następnie przechwyć obraz za pomocą przycisku przyciągania. Przełącz mikroskop w tryb FLIM. Ustaw otwór na 20, długość fali wzbudzenia na 490 nanometrów, a intensywność lasera na 0.5%Użyj laserów impulsowych o częstotliwości 40 megaherców.

W oprogramowaniu FLIM ustaw zliczanie fotonów powyżej 550 nanometrów. W oknie parametrów wyświetlania postępuj zgodnie ze zliczaniem fotonów, aż maksymalna liczba fotonów wyniesie około 4 000 zliczeń. Zapisz plik i wyeksportuj go jako obraz SPC.

Ten obraz przedstawia ciała Mallory'ego-Denka składające się z agregatów keratynowych w hepatocytach wątroby podbarwionych przeciwwagowo DAPI. W tym przypadku inkluzje P62 dodatnie są pokazane w sporadycznym włączeniu tkanki mięśni szkieletowych zapalenia mięśni szkieletowych. Obraz ten przedstawia inkorporcję amyloidu polipeptydu amyloidowego wysp trzustkowych w ludzkiej trzustce.

Pokazano tutaj złogi amyloidowe łańcucha lekkiego immunoglobuliny w jelicie człowieka. Zdjęcie przedstawia osady agregatów białka prionowego trzęsawki owiec w mózgu myszy. Pokazano tutaj agregaty białka prionowego w mózgu myszy zakażonym przewlekłą chorobą wyniszczającą.

Ten obraz pokazuje blaszki A-beta-amyloidowe w mózgu myszy APP23. A ten obraz pokazuje patologię A-beta w mózgu myszy APP-PS1. Te rozmazy z biopsji tłuszczu z próbek diagnostycznych amyloidu transtyretyny u ludzi zostały ocenione od jednego do czterech zgodnie ze standardową punktacją Congo Red.

Żółte obszary pokazują złogi amyloidu transtyretynowego barwione hFTAA, a niebieskie to autofluorescencja z tkanki tłuszczowej. Podejmując się tego zabiegu, należy pamiętać o barwieniu w odpowiednio niskim stężeniu. Pamiętaj również, aby używać filtrów długoprzepustowych, aby uzyskać maksymalny kontrast, a także unikać autofluorescencji i fluorescencji barwienia tła.

Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak immunofluorescencja, w celu identyfikacji zagregowanego białka i identyfikacji białek skoagregowanych. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się amyloidozą do badania struktur agregatów białkowych, a chemii organicznej do projektowania nowych sond dla tych celów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać barwienie LCO, aby obrazować każdy z nich różnymi technikami.