Name: Obrazowanie tkanek amyloidowych barwionych luminescencyjnymi sprzężonymi oligotiofenami za pomocą hiperspektralnej mikroskopii konfokalnej i obrazowania fluorescencji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Poznaj metodę wykrywania agregatów białkowych za pomocą barwienia luminescencyjnymi oligotiofenami i mikroskopii hiperspektralnej. Technika ta umożliwia badanie depozytów amyloidowych w tkankach z większą czułością niż konwencjonalne metody.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Mikaelowi Lindgrenowi i Chananowi Służnemu za porady dotyczące mikroskopii fluorescencyjnej, a także Adriano Aguzzi, Johanowi Bijzetowi, Bouke Hazenbergowi, Frankowi Heppnerowi, Mathiasowi Juckerowi, Therese Klingstedt, Karin Magnusson, Christinie Sigurdson, Danielowi Sjölanderowi, Christophowi Röckenowi, Gunilli Westermark, Perowi Westermarkowi i Kurtowi Zatloukalowi za wkład w opracowanie przekrojów tkanek lub mikrofotografii zamieszczonych w tej publikacji. Zebranie prezentowanych danych zostało sfinansowane ze środków Szwedzkiej Fundacji Mózgu (Hjärnfonden), Szwedzkiego Towarzystwa Alzheimerowskiego (Alzheimerfonden), Szwedzkiej Rady ds. Badań Naukowych (VR), stowarzyszenia Görana Gustafssona, Georga i Astrid Olssonów, projektu zdrowotnego LUPAS w ramach 7PR UE oraz Uniwersytetu w Linköping.

UWAGA: Synteza LCO jest przeprowadzana w naszych laboratoriach od ponad dekady. Zasadniczo stosując protokoły do elektrofilowej substytucji aromatycznej, sprzęgania krzyżowego katalizowanego palladem, sprzęgania amidowego i hydrolizy estrów, syntetycznie dostosowujemy sondy do różnych celów5,12. Po syntezie, charakterystyce i oczyszczeniu produkt LCO jest liofilizowany i przechowywany w temperaturze pokojowej. Niektóre z sond (w tym hFTAA) są już dostępne na rynku (patrz tabela materiałów).
1. Roztwór do barwienia LCO
UWAGA: Jeśli hFTAA jest kupowany od komercyjnego dostawcy, proszę postępować zgodnie z instrukcjami dostawcy zamiast sekcji 1.
<ol>
	<li>Zawiesić liofilizowany hFTAA w 2 mM NaOH, aby przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 1 mg/ml. Przechowywać bulion w szklanej fiolce w temperaturze 4 °C. Zapasy mogą być przechowywane przez jeden rok.</li>
	<li>W dniu barwienia przygotuj roztwór roboczy, rozcieńczając bulion w stosunku 1:10 000 w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbek tkanek
UWAGA: Wiele typów tkanek można obrazować za pomocą hFTAA jako markera amyloidu. Zobacz Rysunek 1, aby zobaczyć przykłady. hFTAA jest wrażliwy na konformację agregatów. W związku z tym barwienie powinno być najlepiej przeprowadzane na nienaruszonych kruszywach bez ekspozycji epitopów. Optymalna jakość widmowa jest osiągana, jeśli utrwalenie tkanki jest ograniczone do minimum. Dlatego preferowany jest świeżo zamrożony materiał, delikatnie utrwalony w etanolu w czasie barwienia. Możliwe jest jednak wykrycie złogów amyloidu również w tkance, która została utrwalona np. formaliną. hFTAA na ogół dobrze przenika do tkanki. Wybierz grubość próbki, która jest zgodna z zamierzoną techniką obrazowania.
<ol>
	<li>Jeśli stosuje się plastry z zamocowaną formaliną, osadzone w parafinie, deparafinizuj w ksylenie przez noc. Zanurz sekcje w kolejnych kąpielach 99% etanolu, 70% etanolu,dH2Oi PBS, po 10 minut w każdej. Pozostaw skrawki tkanki do wyschnięcia w warunkach otoczenia. 
	Uwaga: Ksylen jest zawsze przenoszony w dygestorium chemicznym. Ksylen i inne rozpuszczalniki organiczne są szkodliwe.
	<ol>
		<li>Rozmrozić kriosekcje w temperaturze pokojowej. Utrwal skrawki tkanek w 10% formalinie przez noc i nawodnij, zanurzając je w kolejnych kąpielach 99% etanolu, 70% etanolu,dH2Oi PBS, po 10 minut w każdej. Pozostaw skrawki tkanki do wyschnięcia w warunkach otoczenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać kropelki roztworu roboczego hFTAA (około 200 μl) do skrawków tkanki, aby ją przykryć. Kropla powinna pozostać na miejscu dzięki napięciu powierzchniowemu. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w celu barwienia.</li>
	<li>Spłukać roztwór barwiący 500 μl PBS za pomocą pipety, a następnie zanurzyć szkiełko w kąpieli PBS na 10 minut. Pozostawić sekcję do wyschnięcia w warunkach otoczenia.</li>
	<li>Zamontuj za pomocą fluorescencyjnego medium montażowego. Odczekać, aż podłoże montażowe osiada przez noc. 
	UWAGA: barwienie hFTAA można przeprowadzić w połączeniu z innymi metodami barwienia, takimi jak immunofluorescencja, markery specyficzne dla komórek lub organelli itp. Aby przeprowadzić współbarwienie, uruchom kompletny wybrany protokół barwienia i dodaj barwienie hFTAA na końcu, zaczynając od kroku 2.2. Zobacz przykłady na Rysunek 2. W przypadku immunofluorescencji najlepiej wybrać przeciwciało drugorzędowe, które jest wzbudzone przy długości fali 640 nm lub wyższej. W tym zakresie długości fal hFTAA nie absorbuje, a zatem nie może być wzbudzony i nie ulega fluorescencji. Gwarantuje to, że nie widać krwawienia między hFTAA a przeciwciałem.</li>
</ol>
3. Mikroskopia
UWAGA: Użyj mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w filtry długoprzepustowe. Wszystkie poniższe ustawienia zostały użyte do wygenerowania obrazów w Rysunek 4. Może być konieczne dokonanie korekt w zależności od rodzaju amyloidu i próbki tkanki. Chociaż hFTAA związany z amyloidem jest stabilny w kierunku bielenia, zaleca się wyłączenie źródła światła, gdy próbka nie jest badana ani obrazowana.
<ol>
	<li>HIS 
	UWAGA: Eksperyment przeprowadzono przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego z długoprzepustowymi filtrami emisyjnymi i głowicą kamery do HIS (patrz Tabela Materiałów).
	<ol>
		<li>Użyj standardowego mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w filtry długoprzepustowe i kamerę hiperspektralną. Upewnij się, że kamera spektralna jest skalibrowana.</li>
		<li>W oprogramowaniu nazwij projekt, wybierz "obraz spektralny" i rozpocznij akwizycję.</li>
		<li>Wybierz interesujący Cię obiekt przez okular za pomocą filtra wzbudzenia 436 nm i przesuń ścieżkę światła do kamery.</li>
		<li>W Menedżerze danych przypadku (CDM) wybierz typ próbki Spectral, oznacz próbkę i naciśnij przycisk acquire. Otworzy się okno przejęcia.</li>
		<li>W oknie akwizycji "Obrazowanie spektralne" otwórz menu ustawień, wybierz właściwości akwizycji i ustaw zakres widmowy na 460 - 700, jakość prędkości przy maksymalnej prędkości oraz typ pomiaru przy filtrach gazowych/laserowych/wąskich. Zamknij okno dialogowe.</li>
		<li>W menu obrazu wybierz opcję na żywo w pełnej wersji. Na pasku ikon wyłącz otoczki. Wybierz lub zmień rozmiar regionu na obrazie, który ma szczytową wartość pamięci poniżej 800 MB. Ustaw czas ekspozycji na wartość, która daje całkowitą jasność obrazu w zakresie od 1 000 do 3 000. Na pasku ikon naciśnij kolorową kamerę. Rozpocznie się akwizycja. Po zakończeniu akwizycji obrazu naciśnij Zapisz w oknie dialogowym "Uzyskaj obraz spektralny" i "Nowa komórka" w oknie dialogowym menedżera danych przypadku.</li>
		<li>Z poziomu CDM otwórz zebrany obraz za pomocą przycisku rozpocznij analizę. Otworzy się okno analizy danych.</li>
		<li>Informacje spektralne można zbierać z każdego piksela obrazu, wybierając ROI za pomocą okna dialogowego Wyświetlanie spektralne. Wybierz "zdefiniuj" i wybierz ROI z odpowiednich obszarów obrazu.</li>
		<li>Zapisz dane spektralne jako plik tekstowy za pomocą przycisku Lib. Zapisany plik .txt można zaimportować do dowolnego oprogramowania analitycznego. Plik .slb może być używany do analizy w oprogramowaniu do analizy danych. Dane sześcianu hiperspektralnego z całego obrazu można również wyeksportować jako plik RAW, jako "warstwy jako tif" lub jako "warstwy w formacie tekstowym" do aplikacji do analizy danych i obrazów za pomocą zewnętrznego oprogramowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mikroskopia konfokalna 
	UWAGA: Mikroskop konfokalny jest wyposażony w przestrajalny laser jako źródło wzbudzenia. Dla wszystkich eksperymentów z emisją fluorescencji należy ustawić natężenie lasera na 0,2% (co odpowiada średniej mocy 3 μW), otworek na 1 jednostkę przewiewną, rozmiar klatki na 1 024 px x 1 024 px, prędkość skanowania na 7 i średnią z 16 skanów, a głębię bitową na 8 bitów (patrz Tabela materiałów). Ustawienia te należy dostosować do każdego indywidualnego systemu konfokalnego, źródła lasera i typu próbki.
	<ol>
		<li>Dla widma emisyjnego należy zebrać dane w trybie lambda i wzbudzeniu za pomocą lasera argonowego ustawionego na 488 nm. Zbieraj emisję w zakresie od 503 do 687 nm za pomocą 22 kanałów w 32-kanałowym detektorze GASP. Ustaw wzmocnienie na 755.</li>
		<li>Aby uzyskać obrazy jednokanałowe, użyj opcji inteligentnej konfiguracji. Dla FITC (zielony filtr) ustaw wzmocnienie na 750, a dla Alexa 535 (czerwony filtr) ustaw wzmocnienie na 845.</li>
		<li>Aby zebrać widmo wzbudzenia za pomocą przestrajalnego lasera, należy użyć wzbudzenia z krokami co 1 nm w zakresie od 490 do 545 nm, jednocześnie zbierając emisję w zakresie od 551 do 586 nm. Ustaw intensywność lasera na 2% (co odpowiada średniej mocy 30 μW), a wzmocnienie na 774.</li>
		<li>Aby zebrać stos Z w trybie spektralnym, skanuj głębokość przekroju w krokach co 0,96 μm. Można użyć tych samych ustawień wzbudzenia i emisji, co w kroku 3.2.1, ale ustaw wzmocnienie na 730.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>FLIM 
	UWAGA: Mikroskop konfokalny jest wyposażony w jednostkę FLIM (patrz Tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Ustaw następujące parametry mikroskopu konfokalnego: Otworek, 20; długość fali wzbudzenia, 490 nm; natężenie lasera, 0,5% (co odpowiada średniej mocy 7,5 μW). Używaj laserów impulsowych na częstotliwości 40 MHz.</li>
		<li>W oprogramowaniu FLIM ustaw zliczanie fotonów powyżej 550 nm. W oknie Parametry wyświetlania postępuj zgodnie ze zliczaniem fotonów, aż maksymalna liczba fotonów wyniesie około 4 000 zliczeń.</li>
		<li>Zapisz plik i wyeksportuj go jako obraz SPC.</li>
		<li>Dopasuj dane do 2-składnikowego rozkładu wykładniczego w oprogramowaniu FLIM. Dopasowanie, które daje χ2 < 2 jest dobre. Wartość na osi y to liczba zliczeń dla danego okresu istnienia.</li>
		<li>Wybierz próg, który ma zostać uwzględniony w liczbach, np. 100. Oznacz kolorem według T1 i wybierz zakres żywotności. Rozpad jest zależny od struktury amyloidu, w której związany jest hFTAA. Zaobserwowano czas życia fluorescencji od 300 do 1000 ps. Zapisz plik.</li>
		<li>Wyeksportuj nieprzetworzone dane za pomocą opcji eksportu i zapisz żądane dane w nowym folderze.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Sipe, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+fibril+proteins+and+amyloidosis%3A+chemical+identification+and+clinical+classification+International+Society+of+Amyloidosis+2016+Nomenclature+Guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Amyloid fibril proteins and amyloidosis: chemical identification and clinical classification International Society of Amyloidosis 2016 Nomenclature Guidelines.</a> Amyloid. 23, 209-213 (2016).</li>
<li>Buxbaum, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+amyloidoses%3A+are+transgenic+mice+worth+the+time+and+trouble%3F%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Animal models of human amyloidoses: are transgenic mice worth the time and trouble?</a> FEBS letters. 583, 2663-2673 (2009).</li>
<li>Hall, A. M., Roberson, E. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3546481/">Mouse models of Alzheimer's disease.</a> Brain Res Bull. 88, 3-12 (2012).</li>
<li>Westermark, G. T., Johnson, K. H., Westermark, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+methods+for+identification+of+amyloid+in+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Staining methods for identification of amyloid in tissue.</a> Methods in enzymology. , 3-25 (1999).</li>
<li>Klingstedt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+a+library+of+oligothiophenes+and+their+utilization+as+fluorescent+ligands+for+spectral+assignment+of+protein+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Org+Biomol+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis of a library of oligothiophenes and their utilization as fluorescent ligands for spectral assignment of protein aggregates.</a> Org Biomol Chem. 9, 8356-8370 (2011).</li>
<li>Klingstedt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminescent+conjugated+oligothiophenes+for+sensitive+fluorescent+assignment+of+protein+inclusion+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Luminescent conjugated oligothiophenes for sensitive fluorescent assignment of protein inclusion bodies.</a> Chembiochem. 14, 607-616 (2013).</li>
<li>Sjolander, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+the+fluorescent+amyloid+ligand+h-FTAA+for+studying+human+tissues+with+systemic+and+localized+amyloid%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Establishing the fluorescent amyloid ligand h-FTAA for studying human tissues with systemic and localized amyloid.</a> Amyloid. 23, 98-108 (2016).</li>
<li>Magnusson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+fluorescence+microscopy+of+prion+strain+specific+PrP+deposits+stained+by+thiophene-based+amyloid+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Multimodal fluorescence microscopy of prion strain specific PrP deposits stained by thiophene-based amyloid ligands.</a> Prion. 8, 319-329 (2014).</li>
<li>Radde, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abeta42-driven+cerebral+amyloidosis+in+transgenic+mice+reveals+early+and+robust+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Abeta42-driven cerebral amyloidosis in transgenic mice reveals early and robust pathology.</a> EMBO Rep. 7, 940-946 (2006).</li>
<li>Sturchler-Pierrat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+amyloid+precursor+protein+transgenic+mouse+models+with+Alzheimer+disease-like+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Two amyloid precursor protein transgenic mouse models with Alzheimer disease-like pathology.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 13287-13292 (1997).</li>
<li>Nystrom, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+age-dependent+in+vivo+conformational+rearrangement+within+Abeta+amyloid+deposits%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Evidence for age-dependent in vivo conformational rearrangement within Abeta amyloid deposits.</a> ACS chemical biology. 8, 1128-1133 (2013).</li>
<li>Aslund, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+pentameric+thiophene+derivatives+for+in+vitro+and+in+vivo+optical+imaging+of+a+plethora+of+protein+aggregates+in+cerebral+amyloidoses%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Novel pentameric thiophene derivatives for in vitro and in vivo optical imaging of a plethora of protein aggregates in cerebral amyloidoses.</a> ACS chemical biology. 4, 673-684 (2009).</li>
<li>Nilsson, K. P., Herland, A., Hammarstrom, P., Inganas, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjugated+polyelectrolytes%3A+conformation-sensitive+optical+probes+for+detection+of+amyloid+fibril+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Conjugated polyelectrolytes: conformation-sensitive optical probes for detection of amyloid fibril formation.</a> Biochemistry. 44, 3718-3724 (2005).</li>
<li>Mahajan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross+beta-sheet+conformation+of+keratin+8+is+a+specific+feature+of+Mallory-Denk+bodies+compared+with+other+hepatocyte+inclusions%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Cross beta-sheet conformation of keratin 8 is a specific feature of Mallory-Denk bodies compared with other hepatocyte inclusions.</a> Gastroenterology. 141, 1080-1090 (2011).</li>
<li>Sjolander, D., Bijzet, J., Hazenberg, B. P., Nilsson, K. P., Hammarstrom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+and+rapid+assessment+of+amyloid+by+oligothiophene+fluorescence+in+subcutaneous+fat+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Sensitive and rapid assessment of amyloid by oligothiophene fluorescence in subcutaneous fat tissue.</a> Amyloid. 22, 19-25 (2015).</li>
<li>Arja, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+fluorescent+assignment+of+protein+aggregates+by+an+oligothiophene-porphyrin-based+amyloid+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol+Rapid+Commun%22%5BJournal%5D)">Enhanced fluorescent assignment of protein aggregates by an oligothiophene-porphyrin-based amyloid ligand.</a> Macromol Rapid Commun. 34, 723-730 (2013).</li>
<li>Psonka-Antonczyk, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+Structure+and+Spectroscopic+Probing+of+Abeta1-40+Fibril+Bundle+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Chem%22%5BJournal%5D)">Nanoscale Structure and Spectroscopic Probing of Abeta1-40 Fibril Bundle Formation.</a> Front Chem. 4, 44(2016).</li>
<li>Herrmann, U. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-based+drug+design+identifies+polythiophenes+as+antiprion+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Structure-based drug design identifies polythiophenes as antiprion compounds.</a> Sci Transl Med. 7, 299ra123(2015).</li>
<li>Schutz, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.201008276/abstract">The amyloid-Congo red interface at atomic resolution.</a> Angewandte Chemie (International ed). 50 (26), 5956-5960 (2011).</li>
<li>Hammarstrom, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescent+pentameric+thiophene+derivative+detects+in+vitro-formed+prefibrillar+protein+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A fluorescent pentameric thiophene derivative detects in vitro-formed prefibrillar protein aggregates.</a> Biochemistry. 49, 6838-6845 (2010).</li>
<li>CORDIS. <a target="_blank" href="http://cordis.europa.eu/publication/rcn/15792_en.html">Final Report Summary - LUPAS (Luminescent polymers for in vivo imaging of amyloid signatures)</a>. , European Commision, Community Research and Developement Information Service. (2013).</li>
<li>Hahn, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+and+validating+the+fluorescent+amyloid+ligand+h-FTAA+%28heptamer+formyl+thiophene+acetic+acid%29+to+identify+transthyretin+amyloid+deposits+in+carpal+tunnel+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Establishing and validating the fluorescent amyloid ligand h-FTAA (heptamer formyl thiophene acetic acid) to identify transthyretin amyloid deposits in carpal tunnel syndrome.</a> Amyloid. , 1-9 (2017).</li>
<li>Johansson, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+azide+functionalized+oligothiophene+ligand--a+versatile+tool+for+multimodal+detection+of+disease+associated+protein+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">An azide functionalized oligothiophene ligand--a versatile tool for multimodal detection of disease associated protein aggregates.</a> Biosens Bioelectron. 63, 204-211 (2015).</li>
<li>Nordeman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%2811%29C+and+%2818%29F+Radiolabeling+of+Tetra-+and+Pentathiophenes+as+PET-Ligands+for+Amyloid+Protein+Aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">(11)C and (18)F Radiolabeling of Tetra- and Pentathiophenes as PET-Ligands for Amyloid Protein Aggregates.</a> ACS Med Chem Lett. 7, 368-373 (2016).</li>
</ol>

PH, PN, MB SN są mniejszościowymi udziałowcami Ebba Biotech, która komercjalizuje hFTAA pod marką Amytracker545.

Odkładanie się nieprawidłowo pofałdowanych białek w amyloid jest kluczowym zdarzeniem wielu procesów chorobowych. Zewnątrzkomórkowe blaszki amyloidowe zbudowane z peptydów Aβ i wewnątrzkomórkowych splątków neurofibrylarnych utworzonych przez hiperfosforylowane tau znajdują się w mózgu pacjentów z chorobą Alzheimera. Szereg różnych białek, np. transtyretyna (TTR), składnik amyloidu A w surowicy (SAA) i łańcuch lekki IgG, ulega nieprawidłowemu fałdowaniu i objawia się jako złogi amyloidu w tkankach poza OUN. Chociaż złogi amyloidu są znane i badane od ponad wieku, nadal brakuje nam szczegółowej wiedzy na temat tego, w jaki sposób odkładanie się amyloidu jest inicjowane na poziomie molekularnym i co można zrobić, aby zapobiec temu procesowi. W przypadku choroby Alzheimera konieczne jest potwierdzenie, w jaki sposób proces amyloidozy jest związany z neurodegeneracją. Jednym z kluczowych zadań w misji leczenia amyloidozy jest opracowanie nowych, precyzyjnie dostrojonych narzędzi do monitorowania inicjacji, progresji i regresji amyloidu; Dlatego kluczowe znaczenie ma ukierunkowane wykrywanie amyloidu. W dłuższej perspektywie diagnostyka kliniczna skorzysta na zwiększeniu czułości i selektywności metod barwienia amyloidu 7,15. Obecne wyzwania w tym zakresie są ogromne i jest to bardzo aktywny obszar badań. Jednym z głównych zagadnień związanych z rozwojem klinicznym i badaniami klinicznymi jest diagnoza prognostyczna. Choroby te prawdopodobnie zaczynają się na długo przed pojawieniem się objawów, ale aby rozpocząć leczenie, konieczna jest identyfikacja choroby. W tym przypadku wrażliwość jest kluczowym aspektem dla nowatorskich metodologii. Co więcej, kwestia ta jest jeszcze bardziej złożona, ponieważ niektóre agregaty białkowe są toksyczne, niektóre ochronne, a niektóre neutralne. W związku z tym możliwość monitorowania określonych zagregowanych morfotypów jest niezbędna, ponieważ zasugerowano istnienie odrębnych zagregowanych gatunków, aby wyjaśnić heterogeniczny fenotyp zgłaszany dla różnych chorób neurodegeneracyjnych agregacji białek. Na przykład białko prionowe jest klasycznym przykładem tego, jak identyczna pierwszorzędowa sekwencja aminokwasów może nieprawidłowo sfałdować się w odrębne morfotypy agregatów, które prowadzą do powstania określonych szczepów prionów. Podobny polimorfizm odnotowano również dla peptydu Aβ, α-synukleiny i tau. W związku z tym wykazano, że LCO są znakomitymi narzędziami do optycznego przypisywania odrębnych zagregowanych morfotypów. Specyficzne dla szczepu prionów agregaty białkowe, złogi białkowe występujące w kilku typach amyloidozy układowej, a także polimorficzne agregaty Aβ i tau zostały wyróżnione ze względu na konformacyjnie indukowane zjawisko optyczne obserwowane w LCO.
Odkładanie się amyloidu to zdarzenie, które ma miejsce w tkankach, które są trudne do penetracji metodami biochemicznymi lub biofizycznymi o precyzji molekularnej. Możliwość badania zdarzeń ex vivo, in vivo i in vitro przy użyciu tych samych cząsteczek LCO przygotowuje grunt pod rozwikłanie zdarzeń zachodzących in vivo przy użyciu technik, które są możliwe do zastosowania tylko na próbkach ex vivo lub in vitro 11,17. Niedawno opisany model strukturalny o wysokiej rozdzielczości pokazuje, że pentameryczny FTAA LCO (pFTAA) wiąże się we wnęce utworzonej przez wyrównane łańcuchy boczne równoległe do osi włókienki obejmującej 6 równoległych nici beta w rejestrze18, co pokazuje, że możliwe jest uzyskanie wiedzy o rozdzielczości atomowej na temat jednostek celu LCO. W istocie, wnęka wiążąca i sposób wiązania pFTAA są podobne do czerwieni Kongo19, podyktowane rowkiem wyłożonym powtarzającymi się dodatnio naładowanymi łańcuchami bocznymi Lys. Powinowactwo LCO wydaje się być lepsze w porównaniu z czerwienią kongijską, prawdopodobnie ze względu na elastyczność łańcucha i silne oddziaływania van der Waalsa atomów siarki pierścieni tiofenowych w kierunku wnęki hydrofobowej. Wykrywanie gatunków prefibrylarnych (przed odpowiedzią ThT)5,20 wydaje się zależne od powtarzających się arkuszy β, składających się z równoległych nici beta w rejestrze, które w przypadku hFTAA o dwie jednostki tiofenu dłuższe niż pFTAA obejmowałyby skrzyżowanie do 8 nici beta.
Protokół barwienia wymaga zwrócenia uwagi na rozwiązywanie problemów w następujących krokach: (i) Utrwalenie: Intensywne utrwalanie próbek tkanek może zakłócić strukturę amyloidu i ograniczyć możliwość wykrycia zmian w widmach fluorescencji wywołanych zniekształceniem konformacyjnym cząsteczki hFTAA. Preferowane jest łagodne utrwalanie kriosekcji ze świeżo mrożonego materiału w celu uzyskania optymalnej rozdzielczości spektralnej. Jednak hFTAA będzie barwić i fluoryzować amyloid w utrwalonej tkance, ale ze zmniejszoną skutecznością i mniejszą zmiennością spektralną. (ii) Ekspozycja na epitopy: Wstępna obróbka tkanki w celu uzyskania ekspozycji na epitopy w celu wiązania przeciwciał może czasami zmniejszyć zdolność wiązania hFTAA z powodu zaburzonej struktury amyloidu. Jeśli jest to problem, a ekspozycja na epitopy jest kluczowym krokiem w protokole barwienia przeciwciał, można rozważyć użycie kolejnych sekcji odpowiednio dla przeciwciał i hFTAA. (iii) Nadmierne barwienie: hFTAA jest niezwykle wrażliwy. Roztwory robocze należy utrzymywać w niskim stężeniu nM. Zmniejsz stężenie hFTAA, jeśli problemem jest barwienie tła. Jeśli pierwiastki wiążące hFTAA są rzadkie w tkance, nadmiar hFTAA może agregować się i gromadzić w podłożu mocującym. Jest to rozpoznawane jako fluorescencja, która nie znajduje się w płaszczyźnie ogniskowej samej tkanki. Jeśli tak się stanie, zanurz zamontowany suwak w PBS, aż będzie można zsunąć szkiełko nakrywkowe z sekcji, umyj PBS i ponownie zamontuj za pomocą świeżego podłoża montażowego i nowego szkiełka nakrywkowego. (iv) Obrazowanie oparte na filtrach: W tym artykule opisano głównie obrazowanie fluorescencyjne o rozdzielczości spektralnej przy użyciu filtrów długoprzepustowych lub wielu kanałów detekcji. hFTAA można również monitorować za pomocą filtrów krótkoprzepustowych. Należy pamiętać, że spowoduje to zmniejszenie kontrastu i zniesienie możliwości wykrywania wielu kolorów.
W ciągu ostatnich lat stało się oczywiste, że fluorescencyjne LCO, a w szczególności hFTAA, jako narzędzia badawcze, wykazują bardzo obiecujące właściwości. Wyniki wykazano dla szerokiej gamy białek i stanów chorobowych, począwszy od wykrywania hFTAA agregatów wewnątrz komórek (tau, zapalenie mięśni ciała inkluzyjnego), amyloidu układowego amyloidu A w surowicy, transtyretyny, łańcuchów lekkich immunoglobulin (kappa i lambda), seminogeliny 1, białka prionowego (w tym próbek klinicznych)21, polipeptydu amyloidu wysp trzustkowych i insuliny 7,15. Czynnikiem ograniczającym wdrożenie hFTAA jako narzędzia diagnostycznego jest to, że mikroskopia fluorescencyjna nie jest szeroko stosowana w rutynowych laboratoriach patologii amyloidu. Co więcej, HIS nie jest łatwo dostępny w klinice. Jednak barwienie amyloidem hFTAA i mikroskopia fluorescencyjna były stosowane w laboratoriach klinicznych w mikroskopie fluorescencyjnym opartym na filtrze i powinny być traktowane jako uzupełniająca metoda diagnostyczna. Zostało to ostatnio wykazane w biopsjach cieśni nadgarstka z amyloidozą transtyretynową przy użyciu podstawowych ustawień fluorescencji w sposób zautomatyzowany22.
Ponadto, oprócz różnych białek, fluorescencja hFTAA rozpoznaje szeroką gamę typów włókienek i prefibrylarnych agregatów amyloidowych, np. wykryto i scharakteryzowano gatunki fibrylarne szlaku. W niniejszej publikacji zademonstrowaliśmy jeden LCO na różnych typach próbek przy użyciu trzech technik mikroskopowych. Zastosowanie kontrolowanej syntezy pozwoliło również na opracowanie LCO do wszechstronnego wykrywania celów biomolekularnych, np. rejestracji oddziaływań za pomocą powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR)23 i znakowania radioaktywnego dla pozytonowej tomografii emisyjnej (PET)24.
Do tej pory opublikowano ponad 25 różnych LCO z tymi badaniami. Zwiększone wykorzystanie LCO do obrazowania złogów amyloidu zwiększy wiedzę i zrozumienie, w jaki sposób te związane z chorobą agregaty gromadzą się, rozkładają i zakłócają narządy i osoby, w których się znajdują.

Odkładanie się amyloidu w tkance jest patologicznym znakiem rozpoznawczym wielu chorób, takich jak choroba Alzheimera, choroba Parkinsona, amyloidoza układowa i choroby prionowe. Pomimo rozpowszechnienia chorób związanych z amyloidem i faktu, że do tej pory blisko 40 różnych białek zostało sklasyfikowanych jako prekursory amyloidu w human1, niewiele wiadomo na temat związku między odkładaniem się amyloidu a fenotypem choroby. Histologia próbek pobranych od ludzi została wykorzystana zarówno do celów diagnostycznych, jak i naukowych. Stworzono dużą liczbę modeli zwierzęcych w celu zbadania korelacji między obciążeniem amyloidem a zachowaniem, długością życia i wieloma innymi fenotypowymi odczytami progresji choroby2,3. Podejmowane są również duże wysiłki w zakresie odkrywania i projektowania leków w celu zwalczania niektórych z najbardziej rozpowszechnionych chorób, których najbardziej się obawiamy. Jednak ocena związku między genotypem, fenotypem, obciążeniem blaszką amyloidową i podawaniem leku nie jest prosta. Narzędzia do barwienia i obrazowania amyloidu w tkance są często i dostarczają informacji o niskiej rozdzielczości na temat powstawania i struktury amyloidu.
Kongo czerwona dwójłomność, ThT i fluorescencja ThS są przykładami klasycznych metod wykrywania i analizy obciążenia amyloidem w próbkach tkanek z biopsji pacjenta i próbek pośmiertnych oraz zwierzęcych modelach choroby4. Techniki te są stosowane od kilkudziesięciu lat (czerwień kongijska od lat 20. XX wieku, a ThT i jej pochodne od lat 60. XX wieku) i chociaż oprzyrządowanie zostało dopracowane i pozwala na szczegółową analizę, procedury barwienia i analizy są nadal wykonywane w taki sam sposób, jak prawie sto lat temu.
W tym artykule opisujemy zastosowanie bardzo czułego nowego barwnika amyloidowego, hFTAA5, który pozwala na wykrywanie małych niedojrzałych depozytów białkowych z dużą dokładnością, jak również wykrywanie dojrzałego amyloidu. W porównaniu z konwencjonalnymi barwnikami, udowodniono, że hFTAA wykrywa szerszy zakres agregatów białkowych związanych z chorobą5,6,7. Ponadto, hFTAA może być również stosowany do optycznego przypisywania odrębnych zagregowanych morfotypów8. W niniejszym artykule opisujemy barwienie hFTAA i analizę tkanek z uznanych modeli zwierzęcych choroby prionowej i transgenicznych myszy z białkiem prekursorowym amyloidu-β (APP), zaprojektowanych do naśladowania rozwoju płytki nazębnej w chorobie Alzheimera9,10. Pokazujemy również analizę próbek diagnostycznych i pośmiertnych pobranych od pacjentów cierpiących na amyloidozę układową. LCO mają wewnętrzne właściwości, które umożliwiają im raportowanie różnic konformacyjnych w obrębie jednej płytki; a dzięki połączeniu dwóch LCO o różnych właściwościach dotyczących wiązania i fluorescencji, różnica jest jeszcze bardziej wyraźna11. Mikroskop epifluorescencyjny wyposażony w filtry długoprzepustowe i głowicę kamery hiperspektralnej umożliwia obiektywną klasyfikację właściwości spektralnych i rejestrację mikrofotografii do analizy spektralnej. Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna z przestrajalnym laserem jako źródłem wzbudzenia służy do bardziej szczegółowej oceny trójwymiarowych właściwości płytki amyloidowej. Przestrajalny laser umożliwia zbieranie widma wzbudzenia, a bezstopniowy wybór długości fal emisyjnych na mikroskopie umożliwia jednoczesne obrazowanie fluorescencji LCO i immunofluorescencji w celu określenia kolokalizacji docelowego białka i amyloidu. FLIM oferuje bezprecedensową czułość na różnice konformacyjne nałożone na LCO i ujawnia różnice, które mogą nie być wykryte w widmach emisji fluorescencyjnej.
Głównym celem opisanej metody barwienia jest ułatwienie czułego wykrywania małych złogów amyloidu oraz scharakteryzowanie polimorfizmu konformacyjnego w obrębie złogów amyloidu. Wiedza ta jest ważna dla podstawowego zrozumienia chorób związanych z agregacją białek.

<table><tbody><tr><td>hFTAA/Amytracker545</td><td>Ebba Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dako medium do montażu fluorescencji</td><td>Agilent technologies</td><td>GM304</td><td></td></tr><tr><td>LeicaDM6000 Leica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lumen 200</td><td>Wcześniejszy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>system Spectraview</td><td>Obrazowanie</td><td></td><td></td>spektralne ASI</tr><tr><td>Oprogramowanie Spectraview</td><td>Obrazowanie</td> <td>spektralne ASI</td><td></td></tr><tr><td>LSM780</td><td>Oprogramowanie Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen 2010b v6.0</td><td>System Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FLIM</td><td>Becker & Hickl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ar/ML 458/488/514</td> Przestrajalny laser <td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>w stroju</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie tkanek amyloidowych barwionych luminescencyjnymi sprzężonymi oligotiofenami za pomocą hiperspektralnej mikroskopii konfokalnej i obrazowania fluorescencji

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Białka, które odkładają się jako amyloid w tkankach w całym ciele, mogą być przyczyną lub konsekwencją wielu chorób. Wśród nich znajdują się choroby neurodegeneracyjne, takie jak choroba Alzheimera i Parkinsona, dotykające przede wszystkim ośrodkowego układu nerwowego oraz amyloidoza układowa, w której amyloid A w surowicy, transtyretyna i łańcuchy lekkie IgG odkładają się w postaci amyloidu w wątrobie, cieśni nadgarstka, śledzionie, nerkach, sercu i innych tkankach obwodowych. Amyloid jest znany i badany od ponad wieku, często przy użyciu barwników specyficznych dla amyloidu, takich jak czerwień kongijska i tioflawina T (ThT) lub tioflawina (ThS). W niniejszej pracy przedstawiono kwas heptamerowo-formylodiofenooctowy (hFTAA) jako przykład niedawno opracowanych uzupełnień do tych barwników zwanych luminescencyjnymi sprzężonymi oligotiofenami (LCO). hFTAA jest łatwy w użyciu i jest kompatybilny z kobarwieniem w immunofluorescencji lub z innymi markerami komórkowymi. Szeroko zakrojone badania dowiodły, że hFTAA wykrywa szerszy zakres agregatów białkowych związanych z chorobą niż konwencjonalne barwniki amyloidowe. Ponadto hFTAA może być również stosowany do optycznego przypisywania odrębnych zagregowanych morfotypów, aby umożliwić badania polimorfizmu włókienek amyloidowych. Chociaż zastosowana metodologia obrazowania jest opcjonalna, tutaj pokazujemy obrazowanie hiperspektralne (HIS), laserową skaningową mikroskopię konfokalną i obrazowanie czasu życia fluorescencji (FLIM). Przykłady te pokazują niektóre techniki obrazowania, w których LCO mogą być wykorzystywane jako narzędzia do uzyskania bardziej szczegółowej wiedzy na temat powstawania i właściwości strukturalnych amyloidów. Istotnym ograniczeniem tej techniki jest, podobnie jak w przypadku wszystkich konwencjonalnych technik mikroskopii optycznej, wymóg mikroskopijnych rozmiarów agregatów w celu umożliwienia detekcji. Ponadto agregat powinien mieć powtarzalną strukturę β-arkuszową, aby umożliwić powiązanie hFTAA. Nadmierna fiksacja i/lub ekspozycja na epitopy, które modyfikują strukturę lub konformację agregatu, mogą powodować słabe wiązanie hFTAA, a tym samym stanowić ograniczenia dla dokładnego obrazowania.

Wrażliwe i selektywne barwienie złogów amyloidu pochodzących od dużej liczby białek w różnych typach tkanek zarówno od pacjentów ludzkich, jak i od zwierząt doświadczalnych, ma kluczowe znaczenie zarówno w diagnostyce klinicznej, jak i w badaniach naukowych. W tym artykule pokazujemy, jak można tego dokonać, wykorzystując LCO, na przykładzie hFTAA, do barwienia i wielomodalnego obrazowania amyloidu z wybranych typów tkanek. Od pierwszej publikacji ligandów amyloidu opartych na tiofenie, ponad dziesięć lat temu13, złogi amyloidu składające się z szerokiego zakresu białek w różnorodnych tkankach obrazowano za pomocą LCO6,7,11,14,15,16 (Rycina 1). W połączeniu z przeciwciałami lub innymi markerami histologicznymi, LCO stanowią doskonałe narzędzia zarówno do celów diagnostycznych, jak i naukowych (Rycina 1a, Rycina 2). Przy odpowiednim doborze znaczników fluorescencyjnych, na tym samym przekroju można obrazować kilka fluoroforów (Rycina 1a, hFTAA i DAPI, Rycina 2a hFTAA w układzie immunofluorescencji). Możliwe jest również stosowanie kolejnych przekrojów do barwienia metodą jasnego pola i fluorescencji (Rycina 2b, barwienie hFTAA i przeciwciałem DAB). Ostatnio hFTAA okazał się bardzo obiecującym uzupełnieniem barwienia czerwienią kongową w diagnostyce klinicznej7,15 (Rycina 3).
Rozwój technik obrazowania w ostatnich dziesięcioleciach zwiększył zapotrzebowanie na barwniki amyloidowe, które potrafią ilościowo odróżniać niewielkie, lecz jednocześnie istotne różnice w odkładach amyloidu. Układ sprzężony wewnątrz LCO nadaje mu wyjątkową zdolność sygnalizowania zmian sposobu wiązania. Skręcenie cząsteczki może prowadzić do zniekształcenia kątów wiązania w układzie sprzężonym i utrudniać transport elektronów (Rycina 4a). Odbija się to z kolei na właściwościach fluorescencyjnych LCO zarówno w zakresie długości fali wzbudzenia i emisji, jak i czasu trwania emisji. Wykorzystujemy HIS w pionowym mikroskopie fluorescencyjnym wyposażonym w filtry przepuszczające długie fale dla emisji. Do pomiaru widm wzbudzenia i emisji w mikroskopii konfokalnej oraz FLIM stosujemy LSM780 z laserem impulsowym. Aby zilustrować różne techniki, wykonano obraz jednego obiektu (plamy beta-amyloidu (Aβ) u transgenicznego mysiego modelu APP) (Rycina 4b-e). Hiperspektralne widma fluorescencyjne (Rycina 4b) pozwalają na ocenę przesunięć spektralnych i zmienności intensywności w różnych regionach plamy. Widmo wzbudzenia w mikroskopii konfokalnej (Rycina 4c) może służyć do wyznaczenia optymalnej długości fali wzbudzenia w dalszych eksperymentach, n.p., podwójnego barwienia z użyciem kilku fluoroforów. Ta metoda może również okazać się przydatna w wykrywaniu różnic konformacyjnych w sposobie wiązania LCO. Widmo emisji w trybie konfokalnym może być wykorzystane do określenia właściwości emisji fluorescencyjnej hFTAA lub kombinacji kilku fluoroforów w celu oceny kolokalizacji w eksperymentach łączących wiele LCO lub LCO z immunofluorescencją. Czas życia fluorescencji hFTAA jest silnie wpływany przez niewielkie zmiany w sposobie wiązania hFTAA. Dlatego FLIM stanowi potężne narzędzie do rozróżniania różnic wprowadzanych w hFTAA przez jego cel wiązania (Rycina 4d). Może to być wykorzystane na przykład do rozróżniania różnych szczepów prionów8. Obrazowanie konfokalne i przetwarzanie zestawów Z na trójwymiarowe obrazy to przydatne narzędzie do badania ogólnej struktury agregatu amyloidowego (Rycina 4e). Ponownie, zastosowanie dodatkowych fluoroforów może pomóc w zrozumieniu składu odkładu.
<img alt="Obrazy mikroskopowe przedstawiające analizę fluorescencyjną próbek w skali 20-100 µm, różne stopnie barwienia czerwienią kongową (CR)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56279/56279fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Różne typy tkanek i agregaty białkowe prezentujące barwienie h-FTAA: (a) ciała Mallory’ego-Denka złożone z agregatów keratyny w wątrobie (kontrastowane DAPI), (b) inkluzje dodatnie dla p62 w mięśniu przy sporadycznym zapaleniu mięśni typu zaawansowanego (s-IBM), (c) amyloid peptydu amyloidowego wysp trzustkowych w ludzkiej trzustce, (d) amyloid lekkich łańcuchów immunoglobulin w ludzkim jelitach, (e) scrapie owcy (priony) w mózgu myszy, (f) choroba wyczerpania organizmu (priony) w mózgu myszy, (g) płytki Aβ w mózgu myszy APP23, (h) patologia Aβ w mózgu myszy APP/PS1 oraz (i) preparaty z biopsji tłuszczu z próbek diagnostycznych amyloidu transtyretyny u ludzi, sklasyfikowane od 1 do 4 zgodnie ze standardową skalą oceny czerwienią kongową (CR). Żółte obszary pokazują odkładające się amyloid zbarwiony hFTAA, a niebieskie to autofluorescencja tkanki tłuszczowej. Długość szkalowalnej belki podano w każdym panelu. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56279/56279fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Obrazy mikroskopii fluorescencyjnej tkanki, pokazujące lokalizację białek i struktur w skali 100 µm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56279/56279fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 2"> 
Rysunek 2: Przykłady podwójnego barwienia przeciwciałami. (a) Podwójne barwienie surowicą przeciwbiałkową amyloidową A (AA) metodą immunofluorescencji oraz hFTAA ludzkich amyloidów AA na tym samym przekroju. Górny lewy panel: emisja przeciwciała przeciwko AA przy 640 nm; górny prawy panel: hFTAA przy 488 nm; dolny panel: obraz nakładki pokazujący kolokalizację w kolorze żółtym. (b) Barwienie przeciwciałami i fluorescencja hFTAA na kolejnych przekrojach. Górny panel: barwienie DAB przeciwciałem przeciwko AA, dolny panel: obraz hFTAA z zastosowaniem filtra długofalowego. Szerokość podziałki: 100 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56279/56279fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Diagram porównawczy histologii tkanki kostnej, podkreślający różnice w gęstości i strukturze na mikrofotografiach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56279/56279fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
Rycina 3: Porównanie fluorescencji z filtrami przepuszczającymi krótkie fale dla amyloidu transtyretynowego w ludzkim sercu barwionym hematoksyliną Mayersa/czerwienią Konga (a-d) oraz hematoksyliną Mayersa/hFTAA (e). (a) Obraz w polu jasnym, (b) Pole jasne + fluorescencja, (c) Pole jasne + skrzyżowane polaryzatory, (d) Pole jasne + fluorescencja + skrzyżowane polaryzatory, (e) Fluorescencja hFTAA przy wzbudzeniu 405 nm + 480 nm (przekroje kolejne do a-d). Szerokość sklali: 100 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56279/56279fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Fluorescencja polimeru; stan płaski a skręcony; diagram analizy spektroskopowej; wyniki dopasowania widm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56279/56279fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4"> 
Rysunek 4: Ten sam obiekt wybarwiony za pomocą hFTAA i zobrazowany różnymi technikami, przedstawiony na przykładzie jednej plamy Aβ u starego mysza APP23. (a) Właściwości fluorescencyjne hFTAA zależą od jego stanu konformacyjnego. Pokazano strukturę hFTAA w stanie płaskim i skręconym. (b) Obrazowanie hiperspektralne służące do oceny ciągłego widma emisyjnego. Widma na dolnym panelu są zakodowane kolorami zgodnie z oznaczonymi prostokątnymi obszarami interesującymi na obrazie. (c) (i) Obrazowanie konfokalne w celu wzbudzenia oraz (ii i iii) obrazowanie widma i emisji w trybie filtrów lub (iv) w trybie spektralnym. (d) Obrazowanie czasu życia fluorescencji w celu wykrycia różnic konformacyjnych w amyloidzie, gdzie krótsze czasy życia występują na obwodzie plamy Aβ, a dłuższe w jej centrum. Histogram na dolnym panelu przedstawia rozkład czasów życia dla całej plamy. Obraz został pokolorowany zgodnie z skalą umieszczoną pod histogramem. (e) Z-stos konfokalny zebrany w trybie filtrów, pokazujący trójwymiarową strukturę obiektów. Długość szkalibry podano na każdym panelu. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56279/56279fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Odkładanie się amyloidu jest cechą charakterystyczną różnych chorób i dotyka wiele różnych narządów. W pracy opisano zastosowanie luminescencyjnego sprzężonego barwienia fluorescencyjnego oligotiofenem w połączeniu z technikami mikroskopii fluorescencyjnej. Ta metoda barwienia stanowi potężne narzędzie do wykrywania i eksploracji agregatów białkowych zarówno w warunkach klinicznych, jak i naukowych.

Obrazowanie tkanek amyloidowych barwionych luminescencyjnymi sprzężonymi oligotiofenami za pomocą hiperspektralnej mikroskopii konfokalnej i obrazowania fluorescencji

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Ogólnym celem tej metody jest wykrywanie złogów agregatów białkowych zarówno w zastosowaniach klinicznych, jak i naukowych. Opisano barwienie kwasem heptaformylotiofenooctowym oraz analizę tkanek z modeli zwierzęcych chorób prionowych i choroby Alzheimera. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie amyloidoz, takie jak obecność niewielkich ilości agregatów białkowych oraz ich wewnętrzne warianty konformacyjne.Zaletą tej techniki jest to, że jest ona bardziej selektywna i czuła niż inne konwencjonalne metody. Zastosowania tej techniki obejmują terapię lub diagnostykę różnych chorób związanych z błędnym zwijaniem białek, dzięki możliwości dostosowania sond do wybranej techniki wizualizacji. Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie napotykają trudności, ponieważ hFTAA wymaga bardzo niskiego stężenia barwnika.HFTAA wykazuje również dłuższą długość fali wzbudzenia i emisji w porównaniu do konwencjonalnych barwników. Przygotować roztwór luminescencyjnego sprzężonego oligotiofenu, resuspendując liofilizowany hFTAA w 2 mM wodorotlenku sodu w celu przygotowania roztworu zapasu o stężeniu 1 mg/ml. Przenieść roztwór zapasu do szklanej fiolki i przechowywać w temperaturze 4 °C.W przypadku użycia skrawków utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie, przeprowadzić deparafinizację w ksylenie przez noc. W dniu barwienia zanurzyć skrawki w kolejnych kąpielach z 99% ethanol, 70% ethanol, dH2O oraz PBS przez dziesięć minut w każdym etapie. Następnie pozostawić skrawki tkanek do wyschnięcia w warunkach otoczenia.Podczas suszenia tkanki należy przygotować roztwór roboczy hFTAA, rozcieńczając roztwór zapasowy w PBS w stosunku 1:10 000. Gdy tkanka wyschnie, na każdy przekrój tkanki należy nanieść krople roztworu roboczego hFTAA tak, aby go całkowicie pokryć. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Spłukać roztwór barwiący 500 µL PBS, a następnie zanurzyć preparat w kąpieli z PBS na 10 minut. Po wysuszeniu przekroju w warunkach otoczenia, zamontować go za pomocą medium montażowego do fluorescencji. Pozostawić medium montażowe do utrwalenia przez noc.Wykrywanie amyloidu można przeprowadzić bezpośrednio po montażu preparatu lub nawet bez jego montowania. Jeśli jednak celem eksperymentu jest zebranie wysokiej jakości informacji spektralnych, zalecana jest inkubacja przez noc. Otwórz oprogramowanie mikroskopu, nazwij projekt, wybierz obrazowanie spektralne i rozpocznij akwizycję.Wybierz interesujący obiekt przez okular, używając filtra wzbudzenia 436 nanometrów, a następnie przekieruj drogę światła na kamerę. W menedżerze danych wybierz typ próbki spectral, opisz próbkę i naciśnij acquire. Otworzy się okno akwizycji.W trybie obrazowania spektralnego otwórz menu ustawień, wybierz właściwości akwizycji i ustaw zakres spektralny od 460 do 700, jakość prędkości na maksymalną prędkość oraz typ pomiaru na wąskopasmowe filtry lasera gazowego. Zamknij okno dialogowe. W menu obrazu wybierz tryb podglądu na żywo (live full).W pasku ikon wyłącz prążki (fringes). Wybierz obszar do obrazowania i upewnij się, że szczytowa wartość zużycia pamięci jest niższa niż 800 megabajtów. Ustaw czas ekspozycji na wartość, która zapewni całkowitą jasność obrazu w przedziale od 1 000 do 3 000.W pasku ikon naciśnij kolorową kamerę. Rozpocznie się akwizycja. Po zakończeniu akwizycji obrazu naciśnij przycisk „save” (zapisz) w oknie dialogowym akwizycji obrazu spektralnego oraz „new cell” (nowa komórka) w oknie dialogowym menedżera danych przypadku.W menedżerze danych przypadku otwórz zebrany obraz, klikając przycisk start analysis. Otworzy się okno analizy danych. Informacje spektralne z każdego piksela obrazu można zebrać, wybierając obszary ROI za pomocą okna dialogowego wyświetlania widm.Wybierz opcję definiowania i zaznacz ROI (regiony zainteresowania) w odpowiednich obszarach obrazu. Zapisz dane widmowe jako plik tekstowy za pomocą przycisku Lib. Zapisany plik txt można zaimportować do dowolnego wybranego oprogramowania analitycznego.Otwórz oprogramowanie mikroskopu i rozpocznij od konfiguracji mikroskopu konfokalnego. Ustaw natężenie lasera na 0.2%, aperturę pinhole na jedną jednostkę Airy’ego, rozmiar ramki na 1, 024 na 1, 024 pikseli, prędkość skanowania na siedem przy uśrednianiu z 16 skanów oraz głębię bitową na osiem bitów. Aby zebrać widmo emisji, wybierz tryb lambda i ustaw laser argonowy na 488 nanometrów.Zbierz emisję w zakresie od 499 do 691 nanometrów, wykorzystując 22 kanały w 32-kanałowym detektorze gasp. Ustaw wzmocnienie na 755. Kliknij przycisk live, zmień paletę na wskaźnik zakresu (range indicator) i dostosuj wzmocnienie tak, aby w kolorze czerwonym nie występowały przeładowane piksele.Kliknij przycisk stop, a następnie wykonaj zdjęcie za pomocą przycisku snap. Aby uzyskać obrazy jednokanałowe, wybierz opcję smart setup. Wybierz FITC oraz Alexa 532.Wybierz opcję linear unmixing i zatwierdź. Dostosuj wzmocnienie (gain), aby uniknąć przeładowania pikseli. W trybie na żywo ustaw wzmocnienie na 693 dla FITC oraz na 433 dla Alexa 532.Kliknij przycisk stop, a następnie wykonaj zdjęcie za pomocą przycisku snap. Przełącz mikroskop w tryb FLIM. Ustaw otwór pinhole na 20, długość fali wzbudzenia na 490 nanometrów, a intensywność lasera na 0.5%. Użyj laserów impulsowych o częstotliwości 40 megahertz.W oprogramowaniu FLIM skonfiguruj zliczanie fotonów dla zakresu powyżej 550 nanometrów. W oknie parametrów wyświetlania monitoruj zliczanie fotonów, aż maksymalna liczba zliczeń osiągnie około 4 000 zliczeń fotonów. Zapisz plik i wyeksportuj go jako obraz w formacie SPC.Na tym obrazie widoczne są ciałka Malloryego-Denka składające się z agregatów keratyny w hepatocytach wątroby z przeciwbarwieniem DAPI. Tutaj pokazano inkluzje dodatnie pod kątem P62 w tkance mięśni szkieletowych w przebiegu sporadycznego zapalenia mięśni z ciałkami inkluzyjnymi. Ten obraz przedstawia inkluzję amyloidu z polipeptydu amyloidu wysp w ludzkiej trzustce.Tutaj przedstawiono złóg amyloidu lekkich łańcuchów immunoglobulin w ludzkim jelicie. Ten obraz ukazuje złogi agregatów białka prionowego scrapie owiec w mózgu myszy. Tutaj przedstawiono agregaty białka prionowego w mózgu myszy zainfekowanej chroniczną wyniszczającą chorobą.Na tym obrazie widoczne są blaszki amyloidowe A-beta w mózgu myszy APP23. Ten obraz przedstawia patologię A-beta w mózgu myszy APP-PS1. Te rozmazy z biopsji tkanki tłuszczowej z próbek diagnostycznych amyloidy transtyretyny u pacjentów ludzkich, ocenione w skali od jeden do cztery zgodnie ze standardową punktacją dla czerwieni Kongo.Żółte obszary przedstawiają złogi amyloidu transtyretyny wybarwione hFTAA, natomiast kolor niebieski to autofluorescencja tkanki tłuszczowej. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o barwieniu przy odpowiednio niskim stężeniu. Należy również pamiętać o zastosowaniu filtrów długoprzepustowych, aby uzyskać maksymalny kontrast oraz uniknąć autofluorescencji i fluorescencji tła.Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak immunofluorescencja, w celu zidentyfikowania zagregowanego białka oraz białek współagregujących. Po opracowaniu technika ta utorowała badaczom w dziedzinie amyloidozy drogę do badania struktur agregatów białkowych, a chemikom organicznym pozwoliła na projektowanie nowych sond dla tych celów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak przeprowadzić barwienie LCO, aby obrazować je za pomocą różnych technik.

imaging-amyloid-tissues-stained-with-luminescent-conjugated

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film opisuje technikę barwienia amyloidów w skrawkach tkanek za pomocą luminescencyjnie sprzężonego barwnika oligotiofenowego - heptamer-formyl tiofenu octowego lub hFTAA - do obrazowania fluorescencyjnego. Amyloidy są bogatymi w β arkusze nieprawidłowymi agregatami białkowymi. Ich wykrywanie w próbkach tkanek jest pomocne w diagnostyce i leczeniu chorób związanych z amyloidem czy proteinopatii.

Barwienie złogów amyloidu hFTAA: technika wizualizacji włókienek amyloidowych przy użyciu barwnika na bazie oligotiofenu do obrazowania fluorescencyjnego w skrawkach tkanek

Źródło: Nyström, S., et al., Obrazowanie tkanek amyloidowych wybarwionych luminescencyjnymi sprzężonymi oligotiofenami za pomocą hiperspektralnej mikroskopii konfokalnej i obrazowania czasu życia fluorescencji. J. Vis. Exp. (2017). Ten film przedstawia analizę struktur amyloidowych za pomocą mikroskopii obrazowania fluorescencji (FLIM), przy użyciu barwnika hFTAA w celu ujawnienia zwartych rdzeni jako niebieskich/zielonych i niestabilnych peryferii jako czerwonych/żółtych na obrazach...

Analiza struktur amyloidowych w skrawku tkanki przy użyciu mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji

Prezentujemy otwarty instrument do analizy wysokiej zawartości (HCA) wykorzystujący automatyczne obrazowanie czasu życia fluorescencji (FLIM) do oznaczania interakcji białek za pomocą odczytów opartych na transferze energii rezonansu Förstera (FRET). Akwizycja danych dla tego urządzenia openFLIM-HCA jest kontrolowana przez oprogramowanie napisane w μManager, a analiza danych odbywa się w FLIMfit.

Analiza Open Source o wysokiej zawartości z wykorzystaniem zautomatyzowanej mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji

Autofluorescencja tła próbek biologicznych często komplikuje techniki obrazowania oparte na fluorescencji, szczególnie w starszych ludzkich tkankach postmitotycznych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób autofluorescencja z tych próbek może być skutecznie usunięta za pomocą dostępnego na rynku źródła światła z diodą elektroluminescencyjną do fotowybielania próbki przed barwieniem immunologicznym.

Prosta eliminacja fluorescencji tła w ludzkiej tkance mózgowej utrwalonej formaliną do mikroskopii immunofluorescencyjnej

Ten protokół opisuje nową metodę pozwalającą na ilościową wizualizację złożonego tworzenia białek SNARE, opartą na transferze energii rezonansu Förstera i mikroskopii obrazowania życia fluorescencji.

Wizualizacja wewnątrzkomórkowego transportu SNARE za pomocą mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji

Obrazowanie życia fluorescencji monitoruje, kwantyfikuje i rozróżnia tendencje agregacji białek w żywych, starzejących się i zestresowanych modelach choroby C. elegans.

Charakterystyka struktur amyloidowych u starzejących się C. elegans za pomocą obrazowania czasu życia fluorescencji

Ten artykuł opisuje użycie nowego, szybkiego imagera optycznego do makroskopowego obrazowania czasu życia fotoluminescencji próbek emitujących długie rozpady. Opisano procedury integracji, akwizycji i analizy obrazu, a także przygotowanie i charakterystykę materiałów sensorów do obrazowania oraz zastosowania imagera w badaniu próbek biologicznych.

Termoobrazownik o żywotności fluorescencji do zastosowań biomedycznych

Ten artykuł opisuje, jak można zastosować mikroskopię dwufotonową wrażliwą na polaryzację, aby scharakteryzować lokalną organizację w obrębie bezznacznikowych nadbudówek amyloidowych-sferulitów. Opisano w nim również, jak przygotować i zmierzyć próbkę, skompletować wymaganą konfigurację i przeanalizować dane w celu uzyskania informacji o lokalnej organizacji włókienek amyloidowych.

Czuła na polaryzację mikroskopia dwufotonowa do bezznacznikowej charakterystyki strukturalnej amyloidu

Tutaj opisujemy różne metody tworzenia wielokomórkowych sferoidów, aby przeprowadzić następczą wieloparametrową mikroskopię żywych komórek. Wykorzystując mikroskopię obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM), autofluorescencję komórkową, barwniki barwiące i nanocząstki, przedstawiono podejście do analizy metabolizmu komórkowego, niedotlenienia i śmierci komórki w żywych trójwymiarowych (3D) nowotworach i sferoidach pochodzących z komórek macierzystych.

Produkcja i wieloparametrowa mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji żywych komórek (FLIM) sferoid wielokomórkowych

Spektralne iteracyjne wybielanie rozszerza multipleksencję (IBEX) opiera się na podstawowej technice IBEX, dodając blokowanie heparyny w celu minimalizacji wiązania niespecyficznego oraz wykorzystując detekcję spektralną z obliczeniowym rozmieszaniem w celu tłumienia autofluorescencji. Takie podejście przyspiesza akwizycję obrazu, jednocześnie ograniczając źródła tła, umożliwiając solidne wielorundowe, wysokoparametryczne analizy przestrzenne proteomiczne.

Obrazowanie wysoko-plexowe z użyciem spektralnej mikroskopii konfokalnej w celu minimalizacji niespecyficznej fluorescencji tkanek

Poznaj metodę wykrywania agregatów białkowych za pomocą barwienia luminescencyjnymi oligotiofenami i mikroskopii hiperspektralnej. Technika ta umożliwia badanie depozytów amyloidowych w tkankach z większą czułością niż konwencjonalne metody.

Obrazowanie tkanek amyloidowych barwionych luminescencyjnymi sprzężonymi oligotiofenami za pomocą hiperspektralnej mikroskopii konfokalnej i obrazowania fluorescencji (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie tkanek amyloidowych barwionych luminescencyjnymi sprzężonymi oligotiofenami za pomocą hiperspektralnej mikroskopii konfokalnej i obrazowania fluorescencji

Przeglądaj więcej filmów