Name: Inżynieria tkanki rogówki: model in vitro interakcji zrębu-nerw ludzkiej rogówki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Poznaj trójwymiarowy model in vitro do badania interakcji komórek zrębu rogówki z komórkami nerwowymi. Ta metoda pozwala zrozumieć mechanizmy uszkodzenia i regeneracji nerwów rogówki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy serdecznie podziękować Dr. Benowi Fowlerowi za jego pomoc techniczną przy eksperymentach TEM.

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi Centrum Nauk o Zdrowiu/Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej Uniwersytetu Oklahoma (IRB #4509). Wszystkie części protokołu były zgodne z założeniami Deklaracji Helsińskiej. Próbki rogówki uzyskano z Narodowego Instytutu Rozwoju i Badań (NDRI) oraz Oklahoma Lions Eye Bank.
1. Izolacja komórek pierwotnych
<ol>
	<li>Po otrzymaniu próbek ludzkiej tkanki rogówki przenieść tkanki na szalkę Petriego o średnicy 21,5cm2 zawierającą 2 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami Dulbecco (DPBS) (1x).</li>
	<li>Zeskrob i usuń nabłonek rogówki, ustawiając kopułę rogówki skierowaną do góry. Aby zapewnić całkowite usunięcie, dokładnie zeskrob warstwę nabłonka za pomocą żyletki pod kątem 45°. Następnie odwróć kopułę rogówki do dołu i dokładnie zeskrob śródbłonek ze zrębu żyletką pod kątem 45°, aby zapewnić całkowite usunięcie. Umyj tkankę zrębu za pomocą DPBS.</li>
	<li>Pokrój tkanki zrębu na małe kawałki za pomocą ostrza chirurgicznego numer 10, utrzymując kawałki zrębu mokre przez cały czas za pomocą DPBS. Zebrać kawałki zrębu za pomocą sterylnych kleszczy i umieścić w kolbie hodowlanej T25 bez pożywki (4 lub 5 kawałków tkanki 2 x 2 mm na kolbę).</li>
	<li>Pozostawić eksplantaty do przylegania do dna kolby w temperaturze 37 °C przez około 30-40 minut. Po przyklejeniu powoli dodawać do kolby minimalną niezbędną pożywkę Eagle'a (EMEM) zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% antybiotyku/antybiotyku/antybiotyku, nie naruszając eksplantatów.</li>
	<li>Delikatnie umieścić kolbę w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Pozostawić eksplantaty w spokoju, aż komórki zaczną się izolować i migrować w kolbie. Po około 2 - 4 tygodniach komórki powinny osiągnąć 100% zbieżności. Po 100% konfluencji należy przejść przez komórki, usuwając pożywkę z hodowli tkankowej i przemyć komórki DPBS.</li>
	<li>Dodaj trypsynę do komórek, a następnie inkubuj je w temperaturze 37°C. Po około 5 minutach obejrzyj komórki pod mikroskopem świetlnym, aby potwierdzić, że się odłączyły, a następnie zatrzymaj proteolizę, dodając świeże podłoże.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml w celu odwirowania przy 1 000 x g. Ostrożnie usunąć supernatant bez naruszania osadu i zawiesić komórki w świeżym EMEM 10% FBS 1% antybiotyku. Policz komórki i zasiej około 1 x 106 komórek w kolbie hodowlanej T75 w celu dalszej ekspansji świeżym antybiotykiem EMEM 1% FBS 1%.</li>
</ol>
2. Podstawowa kultura HCF i montaż konstrukcji 3D
<ol>
	<li>Aby złożyć konstrukty 3D z eksplantacji wcześniej uprawianych w EMEM, 10% FBS 1% Antybiotyk/Antybiotyk, pasaż i liczenie HCF.</li>
	<li>Wysiewaj około 1 x 106 komórek / studzienkę pierwotnych HCF na wkładkach membrany poliwęglanowej z porami 0,4 μm z konstruktów 3D, wraz z 1,5 ml świeżego EMEM 10% FBS 1% antybiotyku/antybiotyku / antybiotyku na wierzch konstruktu. Dodaj kolejne 1,5 ml tej samej pożywki na dno każdej konstrukcji.</li>
	<li>Po 24 godzinach wysiewu komórek hoduj komórki za pomocą EMEM 10% FBS 1% Antybiotyku/Antybiotyku, stymulowanego 0,5 mM kwasem 2-O-α-D-glukopiranozylo-L-askorbinowym (witamina C), dodając 1,5 ml na górze i 1,5 ml na dole każdego konstruktu.</li>
	<li>Utrzymywać kultury w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5 % CO2 przez 3 tygodnie i dostarczać świeże pożywki co drugi dzień przez cały okres badania. Nie jest potrzebne dalsze przejście.</li>
</ol>
3. Różnicowanie komórek i kokultury
<ol>
	<li>Po 3 tygodniach dodaj 8 x 103 komórki / studzienkę ludzkich komórek nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y na wierzchu wcześniej zmontowanych konstruktów 3D zawierających 1,5 ml EMEM zawierającego 10% FBS, 1% antybiotyku/antybiotyku i 0,5 mM kwasu 2-O-α-D-glukopiranozylo-L-askorbinowego (witamina C).
	<ol>
		<li>Pozwól komórkom nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y rosnąć na komórkach zrębu rogówki przez co najmniej 24 godziny przed rozpoczęciem różnicowania komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zainicjuj różnicowanie komórek SH-SY5Y poprzez stymulację komórek EMEM zawierającym 1% FBS i 1,5 ml 10 μM kwasu retinowego na wierzchu konstruktu. Dodaj 1,5 ml EMEM 10% FBS 1% Antybiotyk/Antybiotyk 0,5 mM kwasu 2-O-α-D-glukopiranozylo-L-askorbinowego (witamina C) na dno konstruktu. Należy pamiętać, że etap kwasu retinowego powinien być wykonywany w ciemności.
	<ol>
		<li>Kontynuuj hodowlę komórek w tej pożywce różnicującej przez 5 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gdy komórki osiągną fazę różnicowania, należy przełączyć komórki na 1,5 ml pożywki wolnej od surowicy zawierającej 2 nM neurotroficznego czynnika pochodzenia mózgowego (BDNF) i 1% antybiotyku/antybiotyku dodanego do EMEM, dodając do górnej części konstruktu. Dodać 1,5 ml EMEM 10% FBS 1% Antybiotyk/Antybiotyk 0,5 mM kwasu 2-O-α-D-glukopiranozylo-L-askorbinowego (witamina C) na dno konstruktu. Należy pamiętać, że krok BDNF należy wykonywać w ciemności.</li>
	<li>Hodować komórki przez dodatkowe 2 dni przed przetworzeniem w celu przeprowadzenia dalszej analizy, jak wskazano w tabeli 1.</li>
</ol>

<ol><li>Pascolini, D., Mariotti, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+estimates+of+visual+impairment%3A+2010%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Global estimates of visual impairment: 2010.</a> Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).</li>
<li>Rönkkö, S., Vellonen, K. -S., Järvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+corneal+cell+culture+models+for+drug+toxicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Delivery+and+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Human corneal cell culture models for drug toxicity studies.</a> Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).</li>
<li>Ghezzi, C. E., Rnjak-Kovacina, J., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+tissue+engineering%3A+recent+advances+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Corneal tissue engineering: recent advances and future perspectives.</a> Tissue Eng Part B Rev. 21 (3), 278-287 (2015).</li>
<li>Shafaie, S., Hutter, V., Cook, M. T., Brown, M. B., Chau, D. Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Cell+Models+for+Ophthalmic+Drug+Development+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22BioResearch+Open+Access%22%5BJournal%5D)">In Vitro Cell Models for Ophthalmic Drug Development Applications.</a> BioResearch Open Access. 5 (1), 94-108 (2016).</li>
<li>Shaheen, B. S., Bakir, M., Jain, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+nerves+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Surv+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Corneal nerves in health and disease.</a> Surv Ophthalmol. 59 (3), 263-285 (2014).</li>
<li>Beuerman, R. W., Schimmelpfennig, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+denervation+of+the+rabbit+cornea+affects+epithelial+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Sensory denervation of the rabbit cornea affects epithelial properties.</a> Exp Neurol. 69 (1), 196-201 (1980).</li>
<li>Heigle, T. J., Pflugfelder, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqueous+tear+production+in+patients+with+neurotrophic+keratitis%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Aqueous tear production in patients with neurotrophic keratitis.</a> Cornea. 15 (2), 135-138 (1996).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+3D+corneal+tissue+model+with+epithelium%2C+stroma%2C+and+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">In vitro 3D corneal tissue model with epithelium, stroma, and innervation.</a> Biomaterials. 112, 1-9 (2017).</li>
<li>Ross, R. A., Spengler, B. A., Biedler, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinate+morphological+and+biochemical+interconversion+of+human+neuroblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Coordinate morphological and biochemical interconversion of human neuroblastoma cells.</a> J Natl Cancer Inst. 71 (4), 741-747 (1983).</li>
<li>Griffith, L. G., Naughton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+-+Current+challenges+and+expanding+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering - Current challenges and expanding opportunities.</a> Science. 295 (5557), (2002).</li>
<li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+characterization+of+organized+extracellular+matrix+deposition+by+ascorbic+acid-stimulated+human+corneal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Morphologic characterization of organized extracellular matrix deposition by ascorbic acid-stimulated human corneal fibroblasts.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (9), 4050-4060 (2007).</li>
<li>Karamichos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+tissue+engineering%3A+current+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Funct+Biomater%22%5BJournal%5D)">Ocular tissue engineering: current and future directions.</a> J Funct Biomater. 6 (1), 77-80 (2015).</li>
<li>Karamichos, D., Brown, R. A., Mudera, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+stiffness+regulates+cellular+contraction+and+matrix+remodeling+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Collagen stiffness regulates cellular contraction and matrix remodeling gene expression.</a> J Biomed Mater Res A. 83 (3), 887-894 (2007).</li>
<li>Ruberti, J. W., Zieske, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prelude+to+corneal+tissue+engineering+-+gaining+control+of+collagen+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Prelude to corneal tissue engineering - gaining control of collagen organization.</a> Prog Retin Eye Res. 27 (5), 549-577 (2008).</li>
<li>Karamichos, D., Guo, X. Q., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+corneal+fibrosis%3A+an+in+vitro+model%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Human corneal fibrosis: an in vitro model.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (3), 1382-1388 (2010).</li>
<li>Chen, F. M., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+biomaterials+of+human+origin+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Polym+Sci%22%5BJournal%5D)">Advancing biomaterials of human origin for tissue engineering.</a> Prog Polym Sci. 53, 86-168 (2016).</li>
<li>Priyadarsini, S., Sarker-Nag, A., Rowsey, T. G., Ma, J. X., Karamichos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+3D+In+Vitro+Model+to+Accelerate+the+Development+of+Human+Therapies+against+Corneal+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Establishment of a 3D In Vitro Model to Accelerate the Development of Human Therapies against Corneal Diabetes.</a> PLoS One. 11 (12), e0168845(2016).</li>
<li>Karamichos, D., Hjortdal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratoconus%3A+tissue+engineering+and+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Funct+Biomater%22%5BJournal%5D)">Keratoconus: tissue engineering and biomaterials.</a> J Funct Biomater. 5 (3), 111-134 (2014).</li>
<li>Wilson, S. L., Yang, Y., El Haj, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+Stromal+Cell+Plasticity%3A+In+Vitro+Regulation+of+Cell+Phenotype+Through+Cell-Cell+Interactions+in+a+Three-Dimensional+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Corneal Stromal Cell Plasticity: In Vitro Regulation of Cell Phenotype Through Cell-Cell Interactions in a Three-Dimensional Model.</a> Tissue Engineering Part A. 20 (1-2), 225-238 (2014).</li>
<li>Proulx, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+a+human+cornea+by+the+self-assembly+approach+of+tissue+engineering+using+the+three+native+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of a human cornea by the self-assembly approach of tissue engineering using the three native cell types.</a> Molecular Vision. 16 (234-236), 2192-2201 (2010).</li>
<li>Gonzalez-Andrades, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+novel+in+vitro+model+of+stratified+epithelial+wound+healing+with+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Establishment of a novel in vitro model of stratified epithelial wound healing with barrier function.</a> Sci Rep. 6, 19395(2016).</li>
<li>Hopkins, A. M., DeSimone, E., Chwalek, K., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+in+vitro+modeling+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">3D in vitro modeling of the central nervous system.</a> Prog Neurobiol. 125, 1-25 (2015).</li>
<li>Schulz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+Corneal+Cell-Based+Microenvironment+as+Prerequisite+for+Balanced+3D+Corneal+Epithelial+Morphogenesis%3A+A+Promising+Animal+Experiment-Abandoning+Tool+in+Ophthalmology%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C-Methods%22%5BJournal%5D)">Natural Corneal Cell-Based Microenvironment as Prerequisite for Balanced 3D Corneal Epithelial Morphogenesis: A Promising Animal Experiment-Abandoning Tool in Ophthalmology.</a> Tissue Engineering Part C-Methods. 20 (4), 297-307 (2014).</li>
<li>Gao, J., Wang, Y., Zhao, X., Chen, P., Xie, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-204-5p-Mediated+Regulation+of+SIRT1+Contributes+to+the+Delay+of+Epithelial+Cell+Cycle+Traversal+in+Diabetic+Corneas%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-204-5p-Mediated Regulation of SIRT1 Contributes to the Delay of Epithelial Cell Cycle Traversal in Diabetic Corneas.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (3), 1493-1504 (2015).</li>
<li>Koulikovska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+regeneration+of+corneal+tissue+via+a+bioengineered+collagen+construct+implanted+by+a+nondisruptive+surgical+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Enhanced regeneration of corneal tissue via a bioengineered collagen construct implanted by a nondisruptive surgical technique.</a> Tissue Eng Part A. 21 (5-6), 1116-1130 (2015).</li>
<li>Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+corneal+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+retinal+and+eye+research%22%5BJournal%5D)">Progress in corneal wound healing.</a> Progress in retinal and eye research. 49, 17-45 (2015).</li>
<li>Zieske, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+and+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix and wound healing.</a> Curr Opin Ophthalmol. 12 (4), 237-241 (2001).</li>
<li>Karamichos, D., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor-beta3+regulates+assembly+of+a+non-fibrotic+matrix+in+a+3D+corneal+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor-beta3 regulates assembly of a non-fibrotic matrix in a 3D corneal model.</a> J Tissue Eng Regen Med. 5 (8), e228-e238 (2011).</li>
<li>Karamichos, D., Lakshman, N., Petroll, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+model+for+assessing+fibroblast+migration+in+3-D+collagen+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">An experimental model for assessing fibroblast migration in 3-D collagen matrices.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66 (1), 1-9 (2009).</li>
<li>Karamichos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+in+Vitro+Model+for+Keratoconus+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Funct+Biomater%22%5BJournal%5D)">Novel in Vitro Model for Keratoconus Disease.</a> J Funct Biomater. 3 (4), 760-775 (2012).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Kilka badań koncentrowało się na opracowaniu różnych modeli zwierzęcych, które mogą pomóc w lepszym zrozumieniu chorób rogówki, a także w odkryciu metod leczenia. Jednak istotna wartość tych badań dla ludzi nie została zweryfikowana. Do tej pory opracowano i szeroko zbadano różne modele in vitro ze względu na ich niezwykłe znaczenie kliniczne. Nasz wcześniej opracowany model 3D in vitro jest nowatorskim systemem, który znacząco przyczynia się do postępu nauk medycznych w badaniach nad wzrokiem i wykazuj...

W ludzkim ciele rogówka jest najgęściej unerwioną tkanką. Nerwy są odpowiedzialne za różne odczucia, takie jak dotyk, ból, temperatura, a także odgrywają istotną rolę w gojeniu się ran, odruchach mrugania, produkcji łez i wydzielaniu5,6,7. W rogówce pnie nerwów zrębowych wyrastają ze splotu rąbka i promieniście wchodzą do obwodowego zrębu rogówki. Organizacja nerwów zrębowych jest równoległa do blaszek kolagenowych i dalej rozgałęziają się na mniejsze pęczki, gdy podążają w kierunku powierzchownego zrębu 5,8. Włókna nerwowe dalej wnikają w warstwę nabłonkową, a tym samym unerwienie jest szeroko rozprzestrzenione po nabłonku rogówki i zrębie. Dlatego unerwienie odgrywa zasadniczą rolę w zdrowym i chorobowym stanie rogówki. W tym protokole ujawniamy postęp w pracach nad nowatorskim modelem 3D in vitro, który jest pierwszym tego rodzaju naśladującym interakcje zrębu i nerwów in vivo. Do tego badania wykorzystano linię komórkową SH-SY5Y, ponieważ jest to jedna z najbardziej ugruntowanych, dobrze scharakteryzowanych linii wykorzystywanych do badania wzrostu neuronów. Linia komórkowa SH-SY5Y została opisana jako wytwarzająca zarówno komórki przylegające do substratu (typ S), jak i neuroblastyczne (typ N), które mogą ulegać transdyferencjacji9. W rezultacie, mimo że ta linia komórkowa pochodzi z potrójnej sekwencyjnej selekcji subklonów komórek typu N, zawiera również niewielką liczbę komórek typu S zdolnych do różnicowania się w neurony przy użyciu kwasu retinowego i czynnika neurotroficznego pochodzenia mózgowego9. Stanowi to narzędzie, które może prowadzić do lepszego zrozumienia powikłań rogówkowych związanych z retinopatią cukrzycową (DM) i innymi chorobami oczu. Ze względu na trudności związane z pozyskiwaniem i hodowlą neuronów od pacjentów z chorobami oczu, ten model 3D in vitro zapewnia istotne implikacje w badaniu interakcji neuronalnych i sygnalizacji ze zrębem rogówki.
Choroby często wpływają na różne tkanki ciała na bardzo dużą skalę, prowadząc do pogorszenia jakości życia. Dystrofie oczne są częstymi powikłaniami, często związanymi z chorobami ogólnoustrojowymi i prowadzą do utraty ostrości wzroku, a nawet trwałej utraty wzroku. Kompleksowe badania są często niezbędne do lepszego zrozumienia stanu chorobowego, a także skutków na poziomie podstawnokomórkowym. Aby zbadać skutki takich chorób, opracowano różne modele in vivo i in vitro za pomocą zastosowań inżynierii tkankowej. Zastosowania inżynierii tkankowej rogówki cieszą się dużym zainteresowaniem w różnych dziedzinach nauki10,11,12,13,14, ale nadal istnieją poważne ograniczenia podczas faktycznego stosowania, w tym odrzucenie przeszczepu rogówki, infekcje i blizny10,11, 12,13,14. Istnieje kilka badań, w których z powodzeniem opracowano i ustanowiono różne modele in vitro3,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Modele 3D in vitro są najbardziej obiecujące i cieszą się dużym zainteresowaniem naukowym. Modele 3D są znane z tego, że lepiej odzwierciedlają zdarzenia komórkowe i fizjologiczne in vivo, które są krytyczne podczas zwłóknienia i gojenia się ran15,27,28,29. Te modele in vitro odgrywają integralną rolę w poszukiwaniu nowych podejść terapeutycznych do leczenia różnych schorzeń, w tym powikłań rogówkowych. Pomimo krytycznej roli unerwienia w funkcjach rogówki, niewiele wysiłku włożono w promowanie proliferacji nerwów obwodowych w konstruktach inżynierii tkankowej rogówki2,3. Jednak proponowane konstrukcje komórkowe 3D in vitro naśladują tkankę docelową w celu osiągnięcia pożądanej funkcjonalności tkanki.
Podczas gdy keratopatia cukrzycowa jest oczywistym zastosowaniem dla opisywanego tutaj modelu ze względu na defekty neuronalne, istnieje kilka innych chorób rogówki, które mogą skorzystać z ludzkiego modelu in vitro, w tym dystrofie stożka rogówki i Fuchsa. Nasz model 3D wyłania się z tej perspektywy i proponuje opracowanie reprezentacji tkanki rogówki in vitro w celu oceny dostarczania leków i bezpieczeństwa nowych leków okulistycznych.

<table><tbody><tr><td>Zdrowa tkanka rogówki</td><td>NDRI</td><td></td><td>Próbki od dawców bez urazu oka lub choroby ogólnoustrojowej</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Roztwór buforowany fosforanami (1X)</td><td>Gibco firmy Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne kleszcze</td><td>Fischer Scientific</td><td>13-812-42</td><td>Fisherbrand Preparujące ekstra drobno spiczaste szczypce odłamkowe</td></tr><tr><td>Jednokrawędziowe żyletki</td><td>Personna</td><td>270100</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne ostrza do skalpela chirurgicznego No.10</td><td>Feather Surgical Blade</td><td>2976#10</td><td></td></tr><tr><td>Eagle' s Minimum Essential Medium</td><td>ATCC</td><td>30-2003</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td>10% FBS jest wymagane do przygotowania pożywki</td></tr><tr><td>Antybiotyk-Antybiotyk (100X)</td><td>Gibco firmy Life Technologies</td><td>15240-062</td><td>1% Antybiotyk-Antybiotyk jest wymagany do przygotowania pożywki</td></tr><tr><td>0,05% Trypsyna EDTA(1X)</td><td>Gibco firmy Life Technologies</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>Wkłady membranowe z poliwęglanu o grubości 0,4 &mu; m pory</td><td>Corning Costar</td><td>3412</td><td></td></tr><tr><td>Kwas 2-O-&alfa;-Dglukopiranozylo-L-askorbinowy (Witamina C)</td><td>Do</td> badania <td>SMB00390</td><td>należy zastosować stężenie 0,5 mM</td></tr><tr><td>Blok woskowy</td><td>VWR</td><td>50-949-027</td><td></td></tr><tr><td>SH-SY5Y Komórki nerwiaka zarodkowego</td><td>ATCC</td><td>SHSY5YATCC CRL-2266</td><td></td></tr><tr><td>Kwas retinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SRP3014-10UG</td><td>Należy zastosować końcowe stężenie 10uM</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625-100MG</td><td>Należy zastosować końcowe stężenie 2nM</td></tr><tr><td>Sulfonek dimetylu (DMSO)</td> <td>VWR-Alfa Aesar</td><td>67-68-5</td><td>Ultra Pure Grade-Steryl DMSO do użycia</td></tr><tr><td>Thermo Scientific EasYFlasks (T25)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-351</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Easy do hodowli komórek nunc (T75)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-349</td><td></td></tr></tbody></table>

inżynieria tkanki rogówki: model in vitro interakcji zrębu-nerw ludzkiej rogówki

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

Inżynieria tkankowa zyskała duże uznanie ze względu na duże zapotrzebowanie na zamienniki ludzkiej rogówki, a szacuje się, że 10 milionów ludzi na całym świecie cierpi na utratę wzroku rogówki1. Aby sprostać zapotrzebowaniu na żywotne ludzkie rogówki, poczyniono znaczne postępy w trójwymiarowej (3D) inżynierii tkankowej2,3,4. Te modele rogówki obejmują zarówno proste systemy jednowarstwowe, jak i modele wielowarstwowe, co prowadzi do pełnowymiarowych odpowiedników rogówki 3D2.
Jednak użycie 3D tkankowej rogówki w kontekście badanych do tej pory modeli chorób in vitro nie przypomina wielowarstwowej struktury tkanki rogówki 3D, funkcji i sieci różnych typów komórek (tj. nerwu, nabłonka, zrębu i śródbłonka)2,3. Ponadto wzrosło zapotrzebowanie na modele tkanek rogówki in vitro w celu ograniczenia testów na zwierzętach w przypadku produktów farmaceutycznych. W związku z tym potrzebne są bardziej wyrafinowane modele, aby lepiej dopasować systemy do wymagań fizjologicznych człowieka, a opracowanie modelu, który jest bardziej odpowiedni dla populacji pacjentów, jest absolutnie konieczne. Biorąc pod uwagę, że wiele typów komórek w rogówce jest dotkniętych chorobami i dystrofiami, takimi jak stożek rogówki, keratopatia cukrzycowa i Fuchs, model ten obejmuje model kohodowli 3D pierwotnych ludzkich fibroblastów rogówki (HCF) od zdrowych dawców i neuronów z linii komórkowej SH-SY5Y. Dzięki temu po raz pierwszy możemy zbadać interakcje między dwoma typami komórek w ludzkiej tkance rogówki. Uważamy, że ten model może potencjalnie przeanalizować mechanizmy leżące u podstaw interakcji zrębu i nerwów w chorobach rogówki, które wykazują uszkodzenia nerwów. Ten model 3D odzwierciedla podstawową anatomiczną i fizjologiczną naturę tkanki rogówki in vivo i może być wykorzystany w przyszłości jako narzędzie do badania wad rogówki, a także do badania przesiewowego skuteczności różnych środków przed testami na zwierzętach.

Rycina 1 przedstawia krok po kroku reprezentacyjny obraz działającego modelu 3D in vitro. W pierwszym etapie komórki są izolowane z ludzkich rogówek. Następnie są one hodowane na membranie z poliwęglanu i stymulowane witaminą C w celu wytworzenia wydzielanej przez komórki macierzy 3D. Ten system konstrukcji 3D indukuje syntezę wielowarstwowej, przypominającej in vivo komórkowej macierzy zrębowej. Następnie na powierzchni komórek zrębu wysiew...

Ten protokół opisuje nowatorski trójwymiarowy model in vitro, w którym komórki zrębu rogówki i zróżnicowane komórki neuronalne są hodowane razem, aby pomóc w badaniu i zrozumieniu interakcji dwóch typów komórek.

Inżynieria tkanki rogówki: model in vitro interakcji zrębu-nerw ludzkiej rogówki

Tissue engineering has gained substantial recognition due to the high demand for human cornea replacements with an estimated 10 million people worldwide ...

Ogólnym celem tego protokołu jest zbadanie interakcji komórkowych między ludzkimi komórkami zrębu rogówki a komórkami neuronalnymi w ich naturalnej macierzy zewnątrzkomórkowej. Protokół można rozszerzyć o badania chorób rogówki i dystrofii, takich jak stożek rogówki, keratopatia cukrzycowa i dystrofia Fuchsa. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii rogówki człowieka, identyfikując mechanizmy leżące u podstaw i defekty w interakcjach nerwowych zrębu podczas określonej choroby rogówki lub dystrofii.Główną zaletą tej techniki jest to, że komórki mogą wydzielać własną macierz zewnątrzkomórkową in vitro, która zapewnia lepszy i dokładniejszy model rzeczywistej ludzkiej tkanki rogówki in vivo. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię chorób rogówki, ponieważ ocena interakcji komórka-komórka i macierzy zewnątrzkomórkowej komórki zapewni dokładne odwzorowanie tkanki rogówki i umożliwi bardziej ukierunkowane opracowywanie leków. Teraz ta metoda może zapewnić wgląd w uszkodzenie i regenerację nerwów rogówki.Może być również stosowany w innych systemach, takich jak badania przesiewowe i opracowywanie leków. Po otrzymaniu próbek ludzkiej tkanki rogówki przenieś tkanki do naczynia o powierzchni 21,5 centymetra kwadratowego zawierającego dwa mililitry sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem Dulbecco. Ustaw kopułę rogówki skierowaną do góry i użyj żyletki pod kątem 45 stopni, aby zeskrobać warstwę nabłonka.Następnie odwróć kopułę rogówki twarzą w dół i dokładnie zeskrob śródbłonek ze zrębu. Umyj tkankę zrębu za pomocą DPBS. Utrzymuj kawałki zrębu w mokrej wodzie za pomocą DPBS i użyj ostrza chirurgicznego numer 10, aby pociąć tkanki zrębu na małe kawałki.Użyj sterylnych kleszczy, aby przenieść kawałki zrębu do kolby hodowlanej T25 bez pożywki. Pozwól eksplantatom przylegać do dna kolby w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez około 30 do 40 minut. Po dokładnym przecięciu tkanki zrębu ostrożnie przenieść kolbę do inkubatora.Ważne jest, aby odczekać od 30 do 40 minut, a następnie powoli dodawać multimedia. Ten krok ma kluczowe znaczenie, aby umożliwić całkowite przyleganie eksplantatów i zapobiec ich oderwaniu. Po przyklejeniu powoli dodawać do kolby Eagle's Minimum Essential Media, zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% antybiotyko-antybiotyku przeciwgrzybiczego, nie naruszając eksplantatów.Delikatnie umieścić kolbę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Pozostawić eksplantaty w spokoju, aż komórki zaczną się izolować i migrować w kolbie. Po około dwóch do czterech tygodniach komórki powinny osiągnąć 100% zbieżności.Po 100% konfluencji przeprowadź komórki poprzez usunięcie pożywki do hodowli tkankowej i przemycie komórek DPBS. Dodaj trypsynę do komórek, a następnie inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po około pięciu minutach obejrzyj komórki pod mikroskopem świetlnym, aby potwierdzić, że się odłączyły.Zatrzymaj proteolizę, dodając świeżą pożywkę i przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Odwirować probówki o masie 1000 x g, aby osadzać komórki. Ostrożnie usunąć sklarowany osad, nie naruszając osadu i zawiesić komórki w świeżym podłożu.Po przeprowadzeniu zliczania komórek, wysiewaj około 10 do sześciu komórek w kolbie hodowlanej T75 ze świeżą pożywką w celu dalszej ekspansji. Aby złożyć konstrukcję 3D, najpierw przejdź i policz ludzkie fibroblasty rogówki, a następnie wysiew około jeden razy 10 do sześciu HCF na wkładce z membrany poliwęglanowej z porami 0,4 mikrona. Dodaj 1,5 mililitra świeżej pożywki na wierzch konstruktu.Następnie odpipetuj kolejne 1,5 mililitra tego samego podłoża na dno każdej konstrukcji. Po 24 godzinach dodaj 1,5 mililitra pożywki, uzupełnionej 0,5 milimolową witaminą C na górę i dół każdego konstruktu. Inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez trzy tygodnie, dodając świeżą pożywkę zawierającą witaminę C co drugi dzień.To pobudzi komórki do wydzielania i składania własnej macierzy zewnątrzkomórkowej. Po trzech tygodniach dodaj osiem razy 10 do trzecich ludzkich komórek nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y na wierzchu wcześniej zmontowanych konstruktów 3D. Na tym etapie bardzo ważne jest obliczenie dokładnej liczby komórek i odczekanie 24 godzin przed rozpoczęciem różnicowania komórek.Po 24 godzinach inkubacji zainicjuj różnicowanie komórek SH-SY5Y, stymulując komórki 1,5 mililitra EMEM z 10% FBS i 10 mikromolowym kwasem retinowym. Następnie dodaj 1,5 mililitra pożywki zawierającej witaminę C na dno konstruktu. Kwas retinowy jest wrażliwy na światło, dlatego ten krok należy wykonywać w ciemności.Po pięciu dniach, gdy komórki osiągną fazę różnicowania, dodaj 1,5 mililitra pożywki bez surowicy zawierającej dwa nanomolowe BDNF i 1% antybiotyk-antybiotyk przeciwgrzybiczy do górnej części konstruktu. Dodaj świeżą pożywkę z dodatkiem witaminy C na dno konstruktu. Hodować komórki przez dodatkowe dwa dni przed przetworzeniem do dalszej analizy.Jest to obraz z transmisyjnej mikroskopii elektronowej o dużym powiększeniu samoorganizującej się konstrukcji 3D, przedstawiający membranę poliwęglanową i komórki zrębu rogówki osadzone na górze. Ten obraz pokazuje zróżnicowane komórki neuronalne siedzące na górze, które wykazują układ komórek zrębowo-neuronalnych. Strzałki na obrazie pokazują komórki neuronalne.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby tkanka rogówki była zawsze mokra podczas cięcia eksplantatów oraz aby narzędzia chirurgiczne i ostrza były sterylne. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skonfigurować i używać tego modelu in vitro do badania interakcji komórkowych między ludzkimi komórkami zrębu rogówki a komórkami neuronalnymi w ich naturalnej macierzy zewnątrzkomórkowej. Nie zapominaj, że praca z BDNF, kwasem retinowym i ostrzami chirurgicznymi może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiedniej odzieży ochronnej.

corneal-tissue-engineering-an-vitro-model-stromal-nerve-interactions

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Ten film demonstruje technikę generowania trójwymiarowego systemu modeli wspólnej hodowli pierwotnych ludzkich fibroblastów rogówki i zróżnicowanych komórek neuronalnych. Ten system kohodowli może być wykorzystany do badania interakcji zrębu i nerwów.

Generowanie modelu 3D kokultury ludzkich fibroblastów i neuronów rogówki

Przedstawiamy technikę wytwarzania mikrokieszeni w membranach elektroprzędzonych, w których można badać zachowanie komórek. W szczególności opisujemy połączenie mikrostereolitografii i elektroprzędzenia w celu produkcji urządzeń z biomateriału rogówki PLGA (poli(laktyd-ko-glikolid)) wyposażonych w mikrocechy.

Połączenie mikrostereolitografii i elektroprzędzenia w celu wytworzenia membran wyposażonych we wnęki do regeneracji rogówki

Pierwotna hodowla bydlęcych komórek śródbłonka rogówki została wykorzystana do zbadania mechanizmu przejścia śródbłonka rogówki na mezenchym. Ponadto wykorzystano model kriouszkodzenia śródbłonka rogówki szczura, aby zademonstrować przejście śródbłonka rogówki i mezenchymów in vivo.

Modele in vitro i in vivo do badania przejścia śródbłonka rogówki i mezenchymów

Opisano protokół dla modelu hodowli narządów rogówki ex vivo, przydatnego do badań nad gojeniem się ran. Ten system modelowy może być używany do oceny działania środków wspomagających regeneracyjne gojenie lub toksyczność leków w zorganizowanym środowisku wielokomórkowym 3D.

Model hodowli narządów rogówki ex vivo do badań nad gojeniem się ran

Tutaj przedstawiono krok po kroku protokół przygotowania i uprawy rozszczepionych guzików rogówki u świń. Ponieważ ten typowy dla organoorganizacji model hodowli narządów wykazuje wskaźnik umieralności komórek w ciągu 15 dni, porównywalny z ludzkimi rogówkami dawców, stanowi on pierwszy model umożliwiający długotrwałą hodowlę rogówek innych niż ludzkie bez dodawania toksycznego dekstranu.

Model hodowli śródbłonka śródbłonka rogówki świni przy użyciu podzielonych guzików rogówki

Tutaj prezentujemy protokół odłączania komórek śródbłonka rogówki (CEC) od błony Descemeta (DM) za pomocą lasera neodymowego:YAG (Nd:YAG) jako model choroby ex vivo dla keratopatii pęcherzowej (BK).

Opracowanie nieinwazyjnego, wspomaganego laserem eksperymentalnego modelu utraty komórek śródbłonka rogówki

Ten protokół opisuje kluczowe kroki wymagane do założenia i wyhodowania hodowli komórek śródbłonka rogówki z eksplantatów tkanek ludzkich lub owczych. Przedstawiono również metodę subhodowli komórek śródbłonka rogówki na biomateriałach błoniastych.

Wzrost warstw komórek śródbłonka rogówki ludzi i owiec na błonach biomateriałowych

Tutaj tworzone są modele zwierzęce oparte na myszach i królikach do mechanicznego i chemicznego uszkodzenia nabłonka rogówki, aby przebadać nowe terapie i leżący u ich podstaw mechanizm.

Modele zwierzęce ex vivo i in vivo do mechanicznych i chemicznych urazów nabłonka rogówki

Stripping Only Descemeta to eksperymentalna procedura, w której pacjenci z centralnym gutem rogówki wynikającym z dystrofii śródbłonka Fuchsa mają usuniętą błonę Descemeta na potrzeby komórek obwodowych w celu regeneracji warstwy śródbłonka. Przedstawiono nowatorską metodologię symulującą DSO w dystroficznych rogówkach ludzkich ex vivo z przyspieszonym gojeniem stymulowanym przez eFGF1 (NM141).

Model hodowli ludzkiego narządu rogówki z usuwaniem Descemeta tylko z przyspieszonym gojeniem stymulowanym przez zmodyfikowany czynnik wzrostu fibroblastów 1

Obecny protokół pokazuje różne etapy związane z uszkodzeniem rogówki embrionalnego pisklęcia in ovo. Regenerujące się lub w pełni odbudowane rogówki mogą być analizowane pod kątem potencjału regeneracyjnego przy użyciu różnych technik komórkowych i molekularnych po zabiegu zranienia.

Badanie bezbliznowatej regeneracji tkanek w zarodkach zranionych rogówek piskląt

Tutaj proponujemy trzy różne metody uszkadzania włókien czuciowych unerwiających rogówkę. Metody te ułatwiają badanie regeneracji aksonów u myszy. Te trzy metody, które można dostosować do innych modeli zwierzęcych, są idealne do badania fizjologii i regeneracji unerwienia rogówki.

Trzy strategie wywoływania neurotroficznego zapalenia rogówki i regeneracji nerwów w rogówce myszy

Poznaj trójwymiarowy model in vitro do badania interakcji komórek zrębu rogówki z komórkami nerwowymi. Ta metoda pozwala zrozumieć mechanizmy uszkodzenia i regeneracji nerwów rogówki.

Inżynieria tkanki rogówki: model in vitro interakcji zrębu-nerw ludzkiej rogówki

Przeglądaj więcej filmów