Inżynieria tkanki rogówki: model in vitro interakcji zrębu-nerw ludzkiej rogówki

Ogólnym celem tego protokołu jest zbadanie interakcji komórkowych między ludzkimi komórkami zrębu rogówki a komórkami neuronalnymi w ich naturalnej macierzy zewnątrzkomórkowej. Protokół można rozszerzyć o badania chorób rogówki i dystrofii, takich jak stożek rogówki, keratopatia cukrzycowa i dystrofia Fuchsa. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii rogówki człowieka, identyfikując mechanizmy leżące u podstaw i defekty w interakcjach nerwowych zrębu podczas określonej choroby rogówki lub dystrofii.

Główną zaletą tej techniki jest to, że komórki mogą wydzielać własną macierz zewnątrzkomórkową in vitro, która zapewnia lepszy i dokładniejszy model rzeczywistej ludzkiej tkanki rogówki in vivo. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię chorób rogówki, ponieważ ocena interakcji komórka-komórka i macierzy zewnątrzkomórkowej komórki zapewni dokładne odwzorowanie tkanki rogówki i umożliwi bardziej ukierunkowane opracowywanie leków. Teraz ta metoda może zapewnić wgląd w uszkodzenie i regenerację nerwów rogówki.

Może być również stosowany w innych systemach, takich jak badania przesiewowe i opracowywanie leków. Po otrzymaniu próbek ludzkiej tkanki rogówki przenieś tkanki do naczynia o powierzchni 21,5 centymetra kwadratowego zawierającego dwa mililitry sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem Dulbecco. Ustaw kopułę rogówki skierowaną do góry i użyj żyletki pod kątem 45 stopni, aby zeskrobać warstwę nabłonka.

Następnie odwróć kopułę rogówki twarzą w dół i dokładnie zeskrob śródbłonek ze zrębu. Umyj tkankę zrębu za pomocą DPBS. Utrzymuj kawałki zrębu w mokrej wodzie za pomocą DPBS i użyj ostrza chirurgicznego numer 10, aby pociąć tkanki zrębu na małe kawałki.

Użyj sterylnych kleszczy, aby przenieść kawałki zrębu do kolby hodowlanej T25 bez pożywki. Pozwól eksplantatom przylegać do dna kolby w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez około 30 do 40 minut. Po dokładnym przecięciu tkanki zrębu ostrożnie przenieść kolbę do inkubatora.

Ważne jest, aby odczekać od 30 do 40 minut, a następnie powoli dodawać multimedia. Ten krok ma kluczowe znaczenie, aby umożliwić całkowite przyleganie eksplantatów i zapobiec ich oderwaniu. Po przyklejeniu powoli dodawać do kolby Eagle's Minimum Essential Media, zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% antybiotyko-antybiotyku przeciwgrzybiczego, nie naruszając eksplantatów.

Delikatnie umieścić kolbę w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Pozostawić eksplantaty w spokoju, aż komórki zaczną się izolować i migrować w kolbie. Po około dwóch do czterech tygodniach komórki powinny osiągnąć 100% zbieżności.

Po 100% konfluencji przeprowadź komórki poprzez usunięcie pożywki do hodowli tkankowej i przemycie komórek DPBS. Dodaj trypsynę do komórek, a następnie inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po około pięciu minutach obejrzyj komórki pod mikroskopem świetlnym, aby potwierdzić, że się odłączyły.

Zatrzymaj proteolizę, dodając świeżą pożywkę i przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Odwirować probówki o masie 1000 x g, aby osadzać komórki. Ostrożnie usunąć sklarowany osad, nie naruszając osadu i zawiesić komórki w świeżym podłożu.

Po przeprowadzeniu zliczania komórek, wysiewaj około 10 do sześciu komórek w kolbie hodowlanej T75 ze świeżą pożywką w celu dalszej ekspansji. Aby złożyć konstrukcję 3D, najpierw przejdź i policz ludzkie fibroblasty rogówki, a następnie wysiew około jeden razy 10 do sześciu HCF na wkładce z membrany poliwęglanowej z porami 0,4 mikrona. Dodaj 1,5 mililitra świeżej pożywki na wierzch konstruktu.

Następnie odpipetuj kolejne 1,5 mililitra tego samego podłoża na dno każdej konstrukcji. Po 24 godzinach dodaj 1,5 mililitra pożywki, uzupełnionej 0,5 milimolową witaminą C na górę i dół każdego konstruktu. Inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez trzy tygodnie, dodając świeżą pożywkę zawierającą witaminę C co drugi dzień.

To pobudzi komórki do wydzielania i składania własnej macierzy zewnątrzkomórkowej. Po trzech tygodniach dodaj osiem razy 10 do trzecich ludzkich komórek nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y na wierzchu wcześniej zmontowanych konstruktów 3D. Na tym etapie bardzo ważne jest obliczenie dokładnej liczby komórek i odczekanie 24 godzin przed rozpoczęciem różnicowania komórek.

Po 24 godzinach inkubacji zainicjuj różnicowanie komórek SH-SY5Y, stymulując komórki 1,5 mililitra EMEM z 10% FBS i 10 mikromolowym kwasem retinowym. Następnie dodaj 1,5 mililitra pożywki zawierającej witaminę C na dno konstruktu. Kwas retinowy jest wrażliwy na światło, dlatego ten krok należy wykonywać w ciemności.

Po pięciu dniach, gdy komórki osiągną fazę różnicowania, dodaj 1,5 mililitra pożywki bez surowicy zawierającej dwa nanomolowe BDNF i 1% antybiotyk-antybiotyk przeciwgrzybiczy do górnej części konstruktu. Dodaj świeżą pożywkę z dodatkiem witaminy C na dno konstruktu. Hodować komórki przez dodatkowe dwa dni przed przetworzeniem do dalszej analizy.

Jest to obraz z transmisyjnej mikroskopii elektronowej o dużym powiększeniu samoorganizującej się konstrukcji 3D, przedstawiający membranę poliwęglanową i komórki zrębu rogówki osadzone na górze. Ten obraz pokazuje zróżnicowane komórki neuronalne siedzące na górze, które wykazują układ komórek zrębowo-neuronalnych. Strzałki na obrazie pokazują komórki neuronalne.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby tkanka rogówki była zawsze mokra podczas cięcia eksplantatów oraz aby narzędzia chirurgiczne i ostrza były sterylne. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skonfigurować i używać tego modelu in vitro do badania interakcji komórkowych między ludzkimi komórkami zrębu rogówki a komórkami neuronalnymi w ich naturalnej macierzy zewnątrzkomórkowej. Nie zapominaj, że praca z BDNF, kwasem retinowym i ostrzami chirurgicznymi może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiedniej odzieży ochronnej.