Name: Metody obrazowania wewnątrzkomórkowego pH linii komórek macierzystych pęcherzyka w żywej tkance jajnika Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Poznaj metodę obrazowania wewnątrzkomórkowego pH w żywych tkankach jajnika Drosophila przy użyciu biosensora fluorescencyjnego. Technika ta umożliwia precyzyjne pomiary pH w komórkach macierzystych pęcherzyka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Bryne Ulmschneider za wkład w powstanie protokołu oraz Diane Barber za sugestie dotyczące rękopisu. Praca ta została sfinansowana z grantu Narodowego Instytutu Zdrowia GM116384 T.G. Nystul i D.L. Barber.

UWAGA: Aby zmierzyć pHi w linii FSC, obliczamy stosunek intensywności fluorescencji pHluorin do mCherry w FSC, pFC i komórkach pęcherzykowych w warunkach fizjologicznych, a następnie przeliczamy proporcje na wartości pH za pomocą standardowych krzywych kalibracyjnych dla każdego typu komórki7. Po pierwsze, przeprowadza się eksperymenty obrazowania na żywo w celu zmierzenia intensywności fluorescencji pHluorin i mCherry w germariach rozbiorowanych do buforu zawierającego NaHCO3, który naśladuje warunki fizjologiczne1,7. Następnie generowane są krzywe wzorcowe, mierząc intensywność fluorescencji pHluorin i mCherry w buforze K+ wolnym od Na+, K+ zawierającym jonofor nigerycynę dostosowaną do dwóch różnych wartości pH, 6,5 i 7,5. W obecności nigerycyny pH równoważy się z pH buforu przez błonę plazmatyczną, powodując, że pH jest zgodne z pH zewnątrzkomórkowym. Wreszcie, krzywe standardowe są używane do przeliczania stosunków pHluorin do mCherry na szacowane wartości pHi.
1. Badanie wstępne: Przygotowanie przed pomiarem pH in vivo
UWAGA: Aby zmierzyć pH in vivo, transgen mCherry::p Hluorin musi być wyrażony w typie komórki będącej przedmiotem zainteresowania. Poniżej znajduje się kilka typowych sposobów generowania transgenicznych much pHluorin w linii FSC. Generowanie klonów mCherry::p Hluorin jest szczególnie przydatne do identyfikacji FSC, które znajdują się na przedniej krawędzi klonu FSC. Specyficzna tkankowo ekspresja mCherry: :p Hluorin jest przydatna do pomiaru pH w całej tkance, a także jest wygodniejsza w połączeniu z ekspresją RNAi lub transgenu.
<ol>
	<li>Wytwarzanie transgenicznych much pHluorin
	<ol>
		<li>mCherry: klony FSC z oznaczeniem :p Hluorin
		<ol>
			<li>Aby stworzyć klony mCherry::p Hluorin FSC, skrzyżuj UAS-mCherry::p Hluorin1 z kolbą typu flipout Act-Gal4 lub inną kolbą z indukowanym Flp/FRT Gal4.</li>
			<li>Aby stworzyć klony wywołujące szok cieplny, dorosłe F1 poddane szokowi cieplnemu przez 2 dni po eklozji w pustych fiolkach przez 1 godzinę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, cztery razy mniej więcej co 12 godzin.</li>
			<li>Aby zapewnić normalny wzrost i maksymalne tempo oogenezy w tym okresie, utrzymuj muchy, dostarczając świeże mokre drożdże (w przybliżeniu równe części suchych drożdży piekarskich i wody) codziennie przez co najmniej 6 dni po indukcji klonu.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Specyficzna dla tkanek ekspresja mCherry: :p Hluorin</li>
		<li>Krzyż UAS-mCherry::p Hluorin1 do sterownika specyficznego dla komórek pęcherzykowych, y1w*; P{GawB}10930/CyO (Bloomington ID: 7023).</li>
		<li>3 dni po tym, jak muchy zaczną się zamykać, zebrać je i umieścić w fiolkach zawierających mokre drożdże, na co najmniej 24 godziny przed preparacją.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tworzenie rozwiązań 
	UWAGA: Ważne jest, aby w dniu eksperymentu przygotować następujące, ponieważ pH i stężenia substancji rozpuszczonej w buforze mogą się zmieniać w czasie.
	<ol>
		<li>Przygotuj wodorowęglanowe, nigerycyny i rozwarstwienia. Dodaj składniki w podanej kolejności, aby uniknąć tworzenia się osadów (patrz Tabela 1, Tabela 2 i Tabela 3).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Próba: Pomiar pH w linii FSC
UWAGA: Etapy sekcji, montażu i obrazowania na żywo dla buforu wodorowęglanowego i dwóch warunków buforu nigerycyny mogą wymagać dwukrotnego wykonania: raz w celu określenia ustawień mikroskopu, a drugi raz w celu zebrania danych eksperymentalnych. Więcej informacji można znaleźć w sekcji 2.2 poniżej.
<ol>
	<li>Rozwarstwienie i montaż 
	UWAGA: Aby uzyskać informacje o materiałach wymaganych do wykonania tego kroku, zapoznaj się z Rysunek 1 i Tabela materiałów. W przypadku komór montażowych drukowanych w 3D, pliki drukarki 3D są dostarczane jako plik uzupełniający 1 i plik uzupełniający 2.
	<ol>
		<li>Rozwarstwienie:
		<ol>
			<li>Przygotuj komory montażowe, nakładając cienką warstwę smaru próżniowego na bardziej płaską stronę wydrukowanej w 3D komory montażowej. Umieść tę stronę na szkiełku nakrywkowym o wymiarach 22 x 40 mM, aby uszczelnić szkiełko nakrywkowe w komorze montażowej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wypreparować jajniki dorosłych samic much w 500 μl buforu preparacyjnego (bufor wodorowęglanowy lub nigerycynowy, tabela 3)
		<ol>
			<li>Znieczulij 3-4 muchy za pomocą gazu CO2 i przenieś muchy na muchę wypełnioną gazem CO2.</li>
			<li>Podnieś znieczuloną muchę kleszczami i umieść w pożywce preparującej.</li>
			<li>Uszczypnij klatkę piersiową muchy jednym klesem, jednocześnie ciągnąc za czubek jej brzucha, aż jej jajniki zostaną odsłonięte.</li>
			<li>Po odłączeniu jajników od innych narządów, rozdzielić jajniki za pomocą 221/2 igły strzykawkowej. Ostrożnie oddziel osłonkę mięśniową od jajników i oddziel poszczególne jajniki od skupiska jajników. Skuteczną techniką izolowania pochewki mięśniowej jest użycie jednej igły strzykawkowej do przytrzymania skupiska jajników na miejscu na jego przednim końcu i przesuwanie w dół wzdłuż pojedynczych jajników.</li>
			<li>Inkubuj wypreparowane jajniki w pożywce do preparacji dokładnie przez 10 minut przed przejściem do etapu montażu, tak aby było wystarczająco dużo czasu, aby pH komórek w pełni zrównoważyło się z pH pożywki do rozwarstwiania nigeryny. 
			UWAGA: Upewnij się, że osłonka mięśniowa została usunięta z jajników. Osłonka mięśniowa może tłumić sygnał fluorescencyjny, co utrudnia identyfikację poszczególnych komórek za pomocą konkanawiliny-A i może powodować spontaniczne ruchy jajników podczas obrazowania na żywo.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Montażu
		<ol>
			<li>Umieść niewielką kroplę pożywki preparacyjnej na szklanym szkiełku nakrywkowym wewnątrz komory montażowej.</li>
			<li>Przenieś oddzielone jajniki za pomocą kleszczy.</li>
			<li>Oddziel komory jajowe na późniejszym etapie od germin związanych z komorami jajowymi na wcześniejszym etapie i spróbuj upewnić się, że wypreparowana germaria jest umieszczona w środku kropli pożywki rozwarstwiającej.</li>
			<li>Dodaj dwie małe krople lakieru do paznokci po przeciwnych stronach okrągłego szkiełka nakrywkowego o średnicy 12 mm i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez około 10 sekund.</li>
			<li>Umieść okrągłe szkiełko nakrywkowe na kropli pożywki preparacyjnej zawierającej oddzielone germary tak, aby strona z lakierem do paznokci była skierowana w dół i stykała się z pożywką separacyjną. Dociśnij części krawędzi lakierem do paznokci, aby spłaszczyć i zabezpieczyć germarię na miejscu. Zalecamy używanie starszego lakieru do paznokci, ponieważ mniej rozmazuje się on po powierzchni szkiełka nakrywkowego podczas jego mocowania.</li>
			<li>Napełnij komorę montażową dodatkowymi mediami preparacyjnymi. Do wypełnienia komory można użyć buforu specyficznego dla stanu, który nie zawiera barwnika Concanavalin-A. 
			UWAGA: Całkowity czas spędzony na preparowaniu i montażu nie powinien przekraczać 15 minut. Jest to ważne, aby zminimalizować skutki uszkodzenia tkanek i śmierci komórek.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie na żywo: 
	UWAGA: Na tym etapie najpierw zbierz obrazy z warunków wodorowęglanowych i dwóch warunków nigerycyny, aby określić właściwe ustawienia mikroskopu; W razie potrzeby dostosuj ustawienia mikroskopu, a następnie zbierz obrazy dla danych eksperymentalnych. Użyj mikroskopu konfokalnego zdolnego do obrazowania w 3 kanałach: GFP (wzbudzenie 475 / emisja 509), mCherry (wzbudzenie 575 / emisja 610) i dala czerwona (633 wzbudzenie / emisja 647). 
	UWAGA: Ustaw ustawienia mikroskopu: Intensywność pikseli zebranych obrazów zostanie określona ilościowo w celu określenia szacunków pHi, dlatego ważne jest, aby wartości intensywności sygnału w każdym zestawie obrazów nie były ani zbyt niskie, ani nasycone. Zakres intensywności, które można uchwycić na obrazie, jest definiowany przez głębię bitową obrazu. W wielu przypadkach obrazy 8-bitowe są generowane domyślnie, ale zalecamy pobieranie danych jako obrazów 16-bitowych, które mają szerszy zakres dynamiki. Ważne jest, aby upewnić się, że przesłuchy między kanałami fluorescencyjnymi są zminimalizowane, dlatego ustawienia należy dostosować tak, aby widmo emisyjne zebrane z każdego fluoroforu nie nakładało się na siebie. Aby przetestować te ustawienia, należy wykonać przykładowy obraz przy użyciu widma wzbudzenia dla GFP i zebrać widmo emisyjne dla mCherry i odwrotnie. Jeśli ustawienia zostały prawidłowo wyregulowane, w żadnym z tych przypadków nie powinno być sygnału. Ustaw ustawienia mikroskopu (tj. ustawienia napięcia w konfokale skaningu laserowego, moc lasera i rozmiar otworka) tak, aby intensywność pikseli sygnału we wszystkich trzech zestawach obrazów mieściła się w zakresie dynamicznym pliku obrazu. We wszystkich naszych eksperymentach używaliśmy laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego ze światłem białym z obiektywem 40x, aby uzyskać 16-bitowe obrazy w formacie 1024 × 1024, jednocześnie optymalizując wzmocnienie napięcia dla każdego eksperymentu w zależności od potrzeb. Na przykład w jednym eksperymencie ustaliliśmy wzmocnienie napięcia dla GFP, mCherry i far-red odpowiednio na 37,8%, 72,9% i 260%.
	<ol>
		<li>Zobrazuj jajniki w buforze preparacyjnym nigeryny o pH 6,5 i dostosuj ustawienia tak, aby intensywność pikseli obrazów pHluorin i mCherry była niska, ale nie poniżej granic wykrywalności kamery.</li>
		<li>Wyobraź sobie inny zestaw jajników w buforze do rozwarstwiania nigeryny o pH 7,5 i dostosuj ustawienia tak, aby intensywność pikseli obrazów pHluorin i mCherry była wysoka, ale nie nasycona.</li>
		<li>Jajniki obrazu w buforze rozwarstwiania wodorowęglanów i upewnij się, że intensywność pikseli obrazów pHluorin i mCherry nie jest nasycona wybranymi ustawieniami. Jeśli piksele są nasycone, dostosuj ustawienia zgodnie z potrzebami. 
		UWAGA: Parametry ustawień mikroskopu mogą się różnić w zależności od dokładnej konfiguracji używanego mikroskopu i muszą być zoptymalizowane dla każdego eksperymentu. Po ustawieniu ustawień mikroskopu nie zmieniaj ich do końca eksperymentu. Ustawienia powinny być spójne we wszystkich warunkach kontrolnych i eksperymentalnych. W naszych początkowych eksperymentach z pH wygenerowaliśmy 2 i 3-punktowe krzywe kalibracyjne nigerycyny i nie znaleźliśmy znaczącej różnicy między obliczonymi pHi przy użyciu którejkolwiek z metod. Jednak ogólnie rzecz biorąc, oczekuje się, że dodanie większej liczby punktów na krzywej kalibracyjnej poprawi dokładność. Dlatego zalecamy generowanie krzywych o różnej liczbie punktów w celu określenia, ile jest potrzebnych dla danego zestawu warunków eksperymentalnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gromadzenie danych:
	<ol>
		<li>Przeprowadzić sekcję, montaż i obrazowanie próbek w warunkach buforu wodorowęglanowego i nigerycynowego. Po rozbiorze i zamontowaniu maksymalny czas poświęcony na obrazowanie jednego zestawu próbek nie powinien przekraczać 45 minut, aby zapewnić wykonanie pomiarów intensywności fluorescencji w żywych, zdrowych tkankach.</li>
		<li>Dla każdego warunku uzyskaj obrazy dla co najmniej 5 germariów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Po procesie: Analiza obrazu
<ol>
	<li>Pomiar intensywności fluorescencji w FSC, pFC i komórkach pęcherzykowych
	<ol>
		<li>Odejmowanie tła:
		<ol>
			<li>Otwórz nieprzetworzone obrazy w FIDŻI z każdym kanałem w osobnym oknie (Rysunek 4C).</li>
			<li>Użyj narzędzia prostokąta, aby narysować obszar zainteresowania (ROI) w oknie kanału pHluorin w części obrazu bez sygnału.</li>
			<li>Opcjonalny krok: Ustaw dolną granicę progu, tak aby piksele o wartościach intensywności poniżej tła były wykluczane, a następnie ustaw górną granicę progu na maksimum. Gdy próg jest ustawiony w ten sposób, obszary obrazu bez sygnału są w większości niebieskie, a sygnał jest wyraźnie widoczny (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A).</li>
			<li>Zmierz średnią intensywność fluorescencji w ROI. Jeśli próg został ustawiony w kroku 3, upewnij się, że zaznaczyłeś pole "Ogranicz do progu" w oknie dialogowym Ustawianie pomiarów.</li>
			<li>Odejmij zmierzoną intensywność tła od każdego kanału i wycinka obrazu za pomocą funkcji Odejmij, która znajduje się w menu Proces → matematyki.</li>
			<li>Powtórz kroki 3.1.1.2-6 dla okna kanału mCherry, z tą różnicą, że w kroku 3.1.1.2, zamiast rysować nowy prostokąt za pomocą narzędzia prostokąt, użyj funkcji Przywróć zaznaczenie, znajdującej się w menu Edycja→ Zaznaczenie, aby dodać prostokąt o tych samych wymiarach i położeniu na obrazie.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zidentyfikuj FSC, pFC i komórki pęcherzykowe:
		<ol>
			<li>Zidentyfikuj FSC, pFC i komórki pęcherzykowe według morfologii i lokalizacji za pomocą barwienia Concanavalin-A, aby znaleźć granice komórek (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2).</li>
			<li>FSC to cienkie trójkątne komórki znajdujące się na krawędzi germarium na granicy Regionu 2a/2b. Jeśli mCherry::p Hluorin ulega ekspresji w klonie FSC, FSC można również zidentyfikować jako najbardziej przednią komórkę klonu.</li>
			<li>pFC to komórki o nieregularnym kształcie w regionie 2b, bezpośrednio przylegające do FSC i znajdujące się za nimi.</li>
			<li>Komórki pęcherzykowe to kwadratowe lub kolumnowe komórki, które otaczają torbiel komórki rozrodczej w regionie 3.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Uzyskiwanie wskaźników intensywności fluorescencji
		<ol>
			<li>Wybierz jeden lub więcej plasterków, w których interesująca komórka ma największą intensywność fluorescencji w kanale mCherry i upewnij się, że barwienie Concanavalin-A, widoczne w kanale dalekiej czerwieni, jest ostre w wybranym wycinku.</li>
			<li>Narysuj ROI wokół każdego FSC i zmierz średnią intensywność fluorescencji pHluorin i mCherry we wszystkich plasterkach wybranych do pomiarów.</li>
			<li>Podziel średnią intensywność fluorescencji kanału pHluorin przez średnią intensywność fluorescencji kanału mCherry, aby obliczyć stosunek fluorescencji pHluorin do mCherry.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyprowadzanie wartości pHi i generowanie pseudokolorowych obrazów
	<ol>
		<li>Wyprowadzanie wartości pH
		<ol>
			<li>We wszystkich przypadkach krzywa regresji liniowej powinna być wygenerowana przy użyciu jajników muszek o tym samym genotypie zarówno dla warunków doświadczalnych, jak i kontrolnych. Wygeneruj krzywą regresji liniowej dla każdego typu komórki, korzystając z danych z dwóch warunków buforowania nigeryny (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3). W programie Excel można to zrobić, wykreślając dane na wykresie i dodając liniową linię trendu. Alternatywnie zobacz:</li>
			<li>Użyj nachylenia i punktu przecięcia z osią y krzywej regresji liniowej obliczonej na podstawie warunków nigerycyny i równania linii (y = m + b), aby przeliczyć wartości stosunku pHluorin do mCherry obliczone na podstawie próbek w stanie wodorowęglanowym na wartości pH. W tym równaniu zastąp postać nachylenia (punkt przecięcia z osią y) dla b, wprowadź wartość współczynnika dla x i rozwiąż dla y.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wygeneruj pseudokolorowy obraz odzwierciedlający wartości proporcji na FIDŻI.
		<ol>
			<li>Postępuj zgodnie z powyższą procedurą, aby odjąć tło (krok 3.1.1 i Rysunek 4).</li>
			<li>Oddziel kanał pHluorin od kanału mCherry za pomocą funkcji Kalkulator obrazu, znajdującej się w menu Proces. Upewnij się, że pola wyboru "Utwórz nowe okno" i "Wynik 32-bitowy (zmiennoprzecinkowy)" są zaznaczone. Zmień tabelę przeglądową (LUT), znajdującą się w menu Obraz, na wybraną tabelę termiczną lub LUT. Zobacz Rysunek 4, aby zobaczyć inne odpowiednie opcje.</li>
			<li>W oknie dialogowym Dostosuj jasność i kontrast (Obraz → Dostosuj → Jasność/Kontrast) kliknij przycisk "Ustaw". Ustaw Minimalną wyświetlaną wartość na 0, a Maksymalną wyświetlaną wartość na współczynnik, który najlepiej oddaje dane, zwykle 1,0-2,0 (Rysunek 5).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Grillo-Hill, B. K., Choi, C., Jimenez-Vidal, M., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+H%2B+efflux+is+sufficient+to+induce+dysplasia+and+necessary+for+viability+with+oncogene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Increased H+ efflux is sufficient to induce dysplasia and necessary for viability with oncogene expression.</a> eLife. 03270, (2015).</li>
<li>Ulmschneider, B., Grillo-Hill, B. K., Benitez, M., Azimova, D. R., Barber, D. L., Nystul, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+intracellular+pH+is+necessary+for+adult+epithelial+and+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Increased intracellular pH is necessary for adult epithelial and embryonic stem cell differentiation.</a> J. Cell Biol. 215 (3), 345-355 (2016).</li>
<li>Han, J., Burgess, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Indicators+for+Intracellular+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+reviews%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Indicators for Intracellular pH.</a> Chemical reviews. 110 (5), 2709-2728 (2010).</li>
<li>Koivusalo, M., Welch, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amiloride+inhibits+macropinocytosis+by+lowering+submembranous+pH+and+preventing+Rac1+and+Cdc42+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling.</a> J. Cell Biol. 188 (4), 547-563 (2010).</li>
<li>Choi, C. -H., Webb, B. A., Chimenti, M. S., Jacobson, M. P., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH+sensing+by+FAK-His58+regulates+focal+adhesion+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">pH sensing by FAK-His58 regulates focal adhesion remodeling.</a> J. Cell Biology. 202 (6), 849-859 (2013).</li>
<li>Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+pH-indicators+reveal+activity-dependent+cytosolic+acidification+of+Drosophila+motor+nerve+termini+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo.</a> J. Phys. 591 (7), 1691-1706 (2013).</li>
<li>Grillo-Hill, B. K., Webb, B. A., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratiometric+imaging+of+pH+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ratiometric imaging of pH probes.</a> Methods in Cell Biol. 123, 429-448 (2014).</li>
<li>Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Kirilly, D., Xie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+ovary%3A+an+active+stem+cell+community%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+research%22%5BJournal%5D)">The Drosophila ovary: an active stem cell community.</a> Cell research. 17 (1), 15-25 (2007).</li>
<li>Sahai-Hernandez, P., Castanieto, A., Nystul, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+models+of+epithelial+stem+cells+and+their+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+interdisciplinary+reviews.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila models of epithelial stem cells and their niches.</a> Wiley interdisciplinary reviews. Dev. Biol. 1 (3), 447-457 (2012).</li>
<li>Losick, V. P., Morris, L. X., Fox, D. T., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+stem+cell+niches%3A+a+decade+of+discovery+suggests+a+unified+view+of+stem+cell+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila stem cell niches: a decade of discovery suggests a unified view of stem cell regulation.</a> Dev. Cell. 21 (1), 159-171 (2011).</li>
<li>Pocha, S. M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+single+and+collective+cell+migrations+in+Drosophila%3A+themes+and+variations%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev.+of+Gen%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of single and collective cell migrations in Drosophila: themes and variations.</a> Ann Rev. of Gen. 48, 295-318 (2014).</li>
<li>St Johnston, D., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+polarity+in+eggs+and+epithelia%3A+parallels+and+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell polarity in eggs and epithelia: parallels and diversity.</a> Cell. 141 (5), 757-774 (2010).</li>
<li>Castanieto, A., Johnston, M. J., Nystul, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR+signaling+promotes+self-renewal+through+the+establishment+of+cell+polarity+in+Drosophila+follicle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">EGFR signaling promotes self-renewal through the establishment of cell polarity in Drosophila follicle stem cells.</a> eLife. 3, (2014).</li>
<li>Margolis, J., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+behavior+of+epithelial+stem+cells+in+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Identification and behavior of epithelial stem cells in the Drosophila ovary.</a> Development. 121 (11), 3797-3807 (1995).</li>
<li>Nystul, T. G., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+epithelial+niche+in+the+Drosophila+ovary+undergoes+long-range+stem+cell+replacement%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">An epithelial niche in the Drosophila ovary undergoes long-range stem cell replacement.</a> Cell stem cell. 1 (3), 277-285 (2007).</li>
<li>Morris, L. X., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+live+imaging+provides+new+insight+into+stem+cell+regulation+and+germline-soma+coordination+in+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary.</a> Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+%28MARCM%29+for+Drosophila+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+neuro%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends in neuro. 24 (5), 251-254 (2001).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisujemy metodę pomiaru pH komórek w linii FSC w tkance typu dzikiego. Protokół ten został opracowany i udoskonalony w ciągu ostatnich pięciu lat, odkąd po raz pierwszy zaczęliśmy badać pH w tkance jajnikowej Drosophila . W tym czasie protokół był z powodzeniem stosowany przez wielu badaczy w naszym laboratorium oraz na co najmniej czterech różnych mikroskopach wirujących i skaningowych z wirującym dyskiem. Powtarzalność naszej pierwotnej obserwacji, że pH wzrasta, gdy komórki w linii FSC różnicuj...

Ostatnie badania wykazały rolę zmian w pH podczas różnicowania komórkowego i dysplazji in vivo1,2. Badania te wykazały, że pH jest niezwykle spójne w komórkach tego samego typu na tym samym etapie różnicowania, ale zmienia się, gdy komórki przechodzą z jednego etapu do drugiego. W niektórych przypadkach blokowanie zmian w pH częściowo zaburza różnicowanie, co sugeruje, że zmiana pH nie jest tylko konsekwencją zmian w losie komórki, ale zamiast tego pomaga promować zmianę losu komórki, być może poprzez wpływ na wrażliwe na pH białka regulatorowe lub reakcje chemiczne wymagane do różnicowania. Przyszłe badania mogą przynieść więcej informacji na temat wielu różnych ról dynamiki pH in vivo. Jednak jednym z wyzwań związanych z badaniem pH podczas różnicowania in vivo jest uzyskanie dokładnych pomiarów pHi. W przeciwieństwie do innych cech różnicowania, takich jak zmiany w morfologii komórek i ekspresji genów, pH jest labilną właściwością chemiczną komórki, która nie jest zachowana w komórkach, które zostały utrwalone i przepuszczalne standardowymi metodami. Ponadto pH może nie być stabilne w komórkach, które są zestresowane lub umierają w wyniku eksperymentalnej manipulacji. Dlatego ważne jest, aby podczas pomiaru pH komórki były żywe i tak zdrowe, jak to tylko możliwe. Dostępnych jest kilka ważnych barwników, które dobrze sprawdzają się w pomiarze pH komórek w hodowli3, ale w wielu przypadkach nie nadają się do badań in vivo, ponieważ nie wnikają w tkankę wystarczająco głęboko lub równomiernie, aby zapewnić dokładne pomiary.
Aby obejść problem słabej penetracji barwnika, my i inni użyliśmy genetycznie kodowanej sondy, mCherry::p Hluorin4,5,6,7, który może być wyrażony w interesujących typach komórek i zobrazowany w żywej tkance. pHluorin to wariant GFP o wyższym pKa (~ 7,0 vs. ~ 4,0), który łatwiej się fałduje przy wyższym pH; więc całkowita Intensywność fluorescencji emitowanej z populacji cząsteczek pHluorin w komórce wzrasta wraz ze wzrostem pHi8. Co ważne, fluorescencja jest liniowa w normalnym cytozolowym zakresie wartości pHi. Natomiast fluorescencja mCherry (pKa ~ 4,5) jest niewrażliwa na zmiany pH w zakresie cytozolowym. Te dwa reportery są kowalencyjnie połączone ze sobą jako pojedyncze białko chimeryczne, kodowane przez pojedynczą otwartą ramkę odczytu, dzięki czemu są zawsze obecne w równych ilościach. Dlatego stosunek intensywności fluorescencji pHluorin do mCherry zapewnia pomiar pHi, który jest znormalizowany do stężenia sondy w każdej komórce. Współczynniki można następnie przekonwertować na oszacowania wartości pH za pomocą krzywej standardowej, która jest generowana przez uzyskanie stosunków pHluorin do mCherry z tkanek, które zostały zrównoważone do znanych wartości pH.
Tutaj opisujemy metody użycia mCherry::p Hluorin do pomiaru pH nabłonkowej linii FSC w jajniku Drosophila. Ta dobrze scharakteryzowana tkanka została wykorzystana do modelowania wielu różnych aspektów biologii nabłonka, takich jak samoodnawianie i różnicowanie komórek macierzystych9,10,11, kolektywna migracja komórek12, oraz rozwój i utrzymanie polaryzacji komórek13,14. Nabłonek mieszków włosowych jest wytwarzany przez dwa FSC, które znajdują się na przedniej krawędzi tkanki w strukturze zwanej germarium15,16. Komórki te dzielą się regularnie w wieku dorosłym, aby samoodnawiać się i wytwarzać potomstwo, zwane komórkami prepęcherzykowymi (pFC), które mogą ponownie wejść do niszy i stać się FSC lub różnicować się w jeden z trzech różnych typów komórek pęcherzykowych: komórki polarne, komórki łodygi lub komórki pęcherzykowe głównego ciała. Wykazaliśmy wcześniej, że w tkance typu dzikiego pH stale wzrasta we wczesnych stadiach różnicowania, od pH około 6,8 w FSC do 7,0 w pFC, do 7,3 w komórkach pęcherzykowych2. Zablokowanie tego wzrostu przez knockdown RNAi wszechobecnie eksprymowanego wymieniacza sód/proton, DNhe2, poważnie upośledza różnicowanie pFC, podczas gdy zwiększenie pHi przez nadekspresję DNhe2 powoduje łagodny fenotyp nadmiernego różnicowania. Wyniki te pokazują, że pH jest stabilnie utrzymywane we wczesnej linii FSC i że może być eksperymentalnie zwiększane lub zmniejszane in vivo. Opisane tutaj metody mogą być stosowane do pomiaru pH w tkance typu dzikiego lub różnych formach zmutowanych tkanek, w tym knockdown lub nadekspresji RNAi przy użyciu interesującego Gal4 i klonów mitotycznych.

<table><tbody><tr><td>Fly Stocks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UAS-mCherry::p Hluorin[1]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>y1 w*; P{GawB}10930/CyO</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>7023</td><td></td></tr><tr><td>Act-Gal4 flipout stock</td><td>stock Bloomington Stock Center</td><td>4409</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company<</td><td>strong>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</strong</td></tr><tr><td>>Chemicals for Buffer preparation </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-3911</td><td></td></tr><tr><td>glukoza</td><td>Mallinckrodt</td><td>4912</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>M63</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C-5080</td><td></td></tr><tr><td>HCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-5761</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-9272</td><td></td></tr><tr><td>NMDG+</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M-2004</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Mallinckrodt</td><td>7088</td><td>Służy do wytwarzania KHPO4 pH 7,4</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP362</td><td>Służy do wytwarzania KHPO4 pH 7,4</td></tr><tr><td>Concanavalin A, Alexa Fluor 647 Conjugate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C21421</td><td>Rozcieńczenie 0,25 mg/ml</td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N1495</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>narzędzia do preparacji i montażu</td><td></td><td></td><td></td></tr>2 <tr><td>Dumont Kleszcze Inox (rozmiar 5)</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>NC9473431</td><td></td></tr><tr><td>2 igły strzykawkowe o rozmiarze 23</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z192457</td><td></td></tr><tr><td>9-dołkowa szklana naczynie presektoryjne</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-748B</td><td></td></tr><tr><td>Smar próżniowy</td><td>Dow Corning</td><td>1018817</td><td></td></tr><tr><td>22 X 40 mM szklane szkiełka nakrywkowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12545C</td><td></td></tr><tr><td>Okrągłe szkiełka nakrywkowe, średnica 12 mm, grubość 0,13-0,16 mm</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>26023</td><td></td></tr><tr><td>Komora montażowa 3D</td><td>custom manufactured.stl</td><td></td> <td>i .ipt pliki do drukarki 3D dołączone jako pliki uzupełniające</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Inne wyposażenie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH-metr</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-620-183A</td><td>Model: Mikroskop preparacyjny Accumet AB15</td></tr><tr><td></td><td>Olympus Corporation</td><td>0H11436</td><td>Model: Mikroskop konfokalny SZ2-ST</td></tr><tr><td></td><td>Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny Leica Biosystems SP5 lub SP8 z obiektywem 40 razy o aperturze numerycznej 1,3</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

metody obrazowania wewnątrzkomórkowego ph linii komórek macierzystych pęcherzyka w żywej tkance jajnika drosophila

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Zmiany w wewnątrzkomórkowym pH (pHi) odgrywają ważną rolę w regulacji wielu funkcji komórkowych, w tym metabolizmu, proliferacji i różnicowania. Zazwyczaj dynamika pH jest określana w hodowanych komórkach, które są podatne na pomiar i eksperymentalne manipulowanie pHi. Jednak niedawny rozwój nowych narzędzi i metodologii umożliwił badanie dynamiki pH w nienaruszonej, żywej tkance. Dla badań nad Drosophila jednym z ważnych osiągnięć było wygenerowanie transgenicznej linii przenoszącej bioczujnik pHi, mCherry::p Hluorin. Tutaj opisujemy protokół, którego rutynowo używamy do obrazowania żywych Drosophila ovarioles w celu pomiaru pH w linii komórek macierzystych pęcherzyków nabłonkowych (FSC) w transgenicznych liniach typu dzikiego mCherry: :p Hluorin; Jednak opisane tutaj metody można łatwo dostosować do innych tkanek, w tym krążków skrzydeł i nabłonka oka. Opisujemy techniki ekspresji mCherry::p Hluorin w linii FSC, utrzymywania tkanki jajnikowej podczas obrazowania na żywo oraz pozyskiwania i analizowania obrazów w celu uzyskania wartości pHi.

Opisano tutaj proces pomiaru pHi w nabłonku pęcherzyka, który składa się z kilku etapów. Najpierw jajniki są wycinane z much o odpowiednim genotypie przy użyciu narzędzi do sekcji i preparowania (Rycina 1). Następnie ovariole są obrazowane za pomocą ilościowej mikroskopii fluorescencyjnej, a uzyskane obrazy są analizowane w celu pomiaru pHi. Dla każdego obrazu identyfikuje się interesujące typy komórek zgodnie z opisem w sekcji 3.1 (Rycin...

Udostępniamy protokół obrazowania wewnątrzkomórkowego pH linii nabłonkowych komórek macierzystych w żywej tkance jajnika Drosophila. Opisujemy metody generowania transgenicznych muszek wykazujących ekspresję biosensora pH, mCherry::p Hluorin, obrazowania biosensora za pomocą ilościowego obrazowania fluorescencyjnego, generowania krzywych standardowych i konwersji wartości intensywności fluorescencji na wartości pH.

Metody obrazowania wewnątrzkomórkowego pH linii komórek macierzystych pęcherzyka w żywej tkance jajnika Drosophila

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar wewnątrzkomórkowego pH komórek pęcherzykowych w żywej eksplantowanej tkance jajnika Drosophila. Ta metoda może pomóc nam odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii komórek macierzystych i rozwoju, takie jak, w jaki sposób zmiany wewnątrzkomórkowego pH przyczyniają się do podejmowania decyzji dotyczących siarczanów. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona dokładne określenie ilościowe pH w żywej, nienaruszonej tkance.Aby rozpocząć eksperyment, przygotuj komory montażowe, nakładając cienką warstwę smaru próżniowego na bardziej płaską stronę wydrukowanej w 3D komory montażowej. Umieść bardziej płaską stronę na szkiełku nakrywkowym o wymiarach 22 x 40 milimetrów, aby uszczelnić szkiełko nakrywkowe do komory montażowej. Następnie wypreparuj jajniki od samic dorosłych much w 500 mikrolitrach buforu rozwarstwiającego.Znieczulij trzy do czterech much za pomocą gazu CO2 i przenieś muchy na muchę na muchę. Użyj kleszczy, aby wybrać muchę i umieścić ją w pożywce do preparacji. Uszczypnij klatkę piersiową muchy jedną parą kleszczy, jednocześnie ciągnąc za czubek jej brzucha, aż jej jajniki zostaną odsłonięte.Ustaw minutnik na dokład

methods-for-imaging-intracellular-ph-follicle-stem-cell-lineage-live

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Drosophila hemocyty rozprzestrzeniają się po całym rozwijającym się embrionie. Niniejszy protokół demonstruje sposób montowania i obrazowania tych migracji z wykorzystaniem embrionów z hemocytami znakowanymi fluorescencyjnie.

Obrazowanie na żywo migracji hemocytów embrionalnych Drosophila melanogaster

Opisano protokół obrazowania na żywo białek lub struktur autofluorescencyjnych oznaczonych GFP w pojedynczych oocytach Drosophila.

Obrazowanie na żywo białek znakowanych GFP w oocytach Drosophila

Specyficzna dla danego etapu izolacja mieszków włosowych Drosophila jest przydatna do różnych celów. Takie pęcherzyki rozwijają się w hodowli, co pozwala na połączenie manipulacji genetycznych i/lub farmakologicznych z testami rozwoju in vitro i obrazowaniem na żywo. Dodatkowo pęcherzyki mogą być wykorzystywane do badań molekularnych, takich jak izolowanie mRNA i białka.

Użyteczność specyficznej dla etapu izolacji mieszków włosowych Drosophila w połowie i późności

Ten artykuł demonstruje użycie szybkiego skaningowego mikroskopu konfokalnego do obrazowania zachowania komórek bezpośrednio przez poczwarkę. Pozostawiając nienaruszoną obudowę poczwarki, metoda ta umożliwia obserwację i pomiar dynamicznych procesów komórkowych na etapie rozwoju Drosophila, który jest trudny do bezpośredniego zbadania.

Obrazowanie przez poczwarkę Drosophila melanogaster

Ten protokół szczegółowo opisuje uproszczoną metodę używaną do przeprowadzania obrazowania żywych komórek w kontekście nienaruszonego mózgu larwy. Metody obrazowania żywych komórek są nieocenione w badaniu asymetrycznych podziałów nerwowych komórek macierzystych, a także innych procesów neurogennych i rozwojowych, konsekwentnie odkrywając mechanizmy, które wcześniej były pomijane.

Obrazowanie na żywo neuroblastów larw Drosophila

Metoda obrazowania pionowego opisana w tym protokole pozwala na szczegółową wizualizację biegunów rozwijającego się jaja Drosophila melanogaster.  Ten widok od początku zapewnia nową perspektywę na rozmieszczenie i morfologię wielu typów komórek w nabłonku pęcherzykowym.

Obrazowanie pionowe komór jajowych Drosophila

Analiza zależności między strukturą a funkcją mitochondriów jest niezbędna do dokładnego zrozumienia mechanizmów regulacyjnych funkcjonalności mitochondriów. W artykule opisano i zademonstrowano specyficzne metody badania struktury i funkcji mitochondriów w żywych i utrwalonych jajnikach Drosophila.

Badanie struktury i funkcji mitochondriów w jajnikach Drosophila

U Drosophila, jądro oocytu ulega migracji zależnej od mikrotubul podczas oogenezy. W tym miejscu opisujemy protokół, który został opracowany w celu śledzenia migracji poprzez wykonywanie obrazowania na żywo w komorach jajowych ex vivo. Nasza procedura utrzymuje komory jajowe przy życiu przez 12 godzin, aby uzyskać wielopozycyjne filmy poklatkowe 3D za pomocą mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem.

Migracja jądrowa w oocycie Drosophila

Błona podstawna jest niezbędna do morfogenezy tkanek i narządów podczas rozwoju. Aby lepiej zrozumieć mechanizmy prowadzące do prawidłowego umiejscowienia tej struktury, w przedstawionym protokole opisano metody wizualizacji i charakterystyki wewnątrzkomórkowego transportu i wydzielania białek błony podstawnej w komórkach nabłonka za pomocą mikroskopii konfokalnej i superrozdzielczej.

Obrazowanie konfokalne i superrozdzielcze spolaryzowanego transportu wewnątrzkomórkowego i wydzielania białek błony podstawnej podczas oogenezy Drosophila

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół do wykonywania na żywo obrazowania asymetrycznego podziału komórek macierzystych linii zarodkowej (GSC) w niszy jajnikowej Drosophila. Używamy linii transgenicznej, która wszechobecnie ulega ekspresji fuzji białka zielonej fluorescencji (GFP) białka spektrosomu Par-1.

Rozszerzone obrazowanie na żywo nisz komórek macierzystych linii zarodkowej Drosophila melanogaster

Poznaj metodę obrazowania wewnątrzkomórkowego pH w żywych tkankach jajnika Drosophila przy użyciu biosensora fluorescencyjnego. Technika ta umożliwia precyzyjne pomiary pH w komórkach macierzystych pęcherzyka.

Metody obrazowania wewnątrzkomórkowego pH linii komórek macierzystych pęcherzyka w żywej tkance jajnika Drosophila

Przeglądaj więcej filmów