Name: In vitro Fagocytoza resztek mieliny przez makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Poznaj metodę oceny fagocytozy resztek mieliny przez makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego myszy. Technika fluorescencyjna pozwala badać odpowiedź immunologiczną w kontekście neurotraumatologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Glennowi Sanger-Hodgsonowi, specjaliście ds. mediów w FSU College of Medicine, za całą jego pracę przy produkcji wideo, edycji i podkładaniu głosu.
Ta praca była wspierana przez Narodowe Instytuty Zdrowia (R01GM100474 i R01GM072611).

Metody opisane tutaj i w sekcji 2 zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Stanowego Florydy (IACUC) i są zgodne z wytycznymi zawartymi w Przewodniku do opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych, wydanie 8. Wszystkie zwierzęta wykorzystane w tym protokole są trzymane w dedykowanym pomieszczeniu dla zwierząt laboratoryjnych do czasu wykorzystania. Nie przeprowadzono żadnych eksperymentów in vivo przed uśmierceniem. Liczebność zwierząt oparto na potrzebach eksperymentalnych, wykorzystując średnie zbiory komórek i mieliny jako wskazówkę w celu zminimalizowania użycia.
UWAGA: Ten protokół opisuje wytwarzanie makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego (BMDM) (Sekcja 1), przygotowanie fluorescencyjnie znakowanych resztek mieliny pochodzących z mózgu (Sekcja 2), ogólną procedurę analizy fagocytozy resztek mieliny (Sekcja 3) oraz ogólną procedurę analizy akumulacji lipidów w resztkach mieliny (Sekcja 4). Przygotowanie odczynników, pobieranie i manipulowanie komórkami, pobieranie i znakowanie mieliny oraz wykonywanie testów powinny być zakończone w komorze bezpieczeństwa biologicznego z laminarnym przepływem powietrza.
1. Wytwarzanie pierwotnych makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego
<ol>
	<li>Przygotowanie kompletnej pożywki do hodowli makrofagów (CMCM) 
	UWAGA: Wytwarzanie makrofagów ze szpiku kostnego wymaga użycia czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF). Preparat ten wykorzystuje pożywkę kondycjonowaną mysimi fibroblastami L929 jako źródło M-CSF.
	<ol>
		<li>Wytwarzaj mysie pożywki kondycjonowane fibroblastami L929 poprzez hodowlę komórek w 145 mm szalkach z 50 ml wysokiej glukozy (4500 mg / L glukozy) Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) uzupełnionej 5% surowicą nowonarodzonych cieląt (NCS) i penicyliną/streptomycyną przez 7 dni.</li>
		<li>Zebrać pożywkę z kultur do stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml i wirować przez 30 minut w temperaturze 3500 x g, 4 °C.</li>
		<li>Przefiltrować supernatanty przez filtr strzykawkowy 0,2 μm do nowej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Kondycjonowane media można przechowywać w temperaturze -80 °C do 6 miesięcy.</li>
		<li>Do DMEM o wysokim poziomie glukozy dodaj 5% obj. / obj. NCS, 15% obj. / obj. L929 mysiego fibroblastu kondycjonowanego DMEM i 1% penicyliny / streptomycyny. Media można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 2-3 miesiące. Przed użyciem podgrzać do 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobieranie pierwotnych komórek szpiku kostnego i indukcja makrofagów 
	nuta: Korzystając z tego protokołu, jedna mysz wygeneruje około 20 milionów makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego (BMDM).
	<ol>
		<li>Poddaj eutanazji pożądaną liczbę myszy w wieku 8-10 tygodni, stosując standardowe wytyczne dotyczące uduszenia CO2, a następnie zwichnięcia szyjki macicy.</li>
		<li>Zdezynfekuj zwierzę za pomocą 70% (obj./obj.) etanolu:H2O, nasycając futro.</li>
		<li>Wytnij mały otwór w jamie brzusznej i ostrożnie odciągnij skórę, aby odsłonić znajdującą się pod spodem tkankę. Uważaj, aby nie przebić jamy otrzewnej.</li>
		<li>Usuń obie tylne nogi, zaczynając od biodra i kończąc na kostce. Umieść pobraną tkankę na szalce Petriego o średnicy 100 mm zawierającej 5-10 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) uzupełnionego 1% penicyliną/streptomycyną. 
		nuta: Podczas przetwarzania kilku zwierząt upewnij się, że naczynia są na lodzie, aby ograniczyć degradację tkanek.</li>
		<li>Usuń mięśnie i tkankę łączną z kości za pomocą skalpela. Tylko kość udowa i piszczelowa są używane do pobierania komórek, kość strzałkową można wyrzucić.</li>
		<li>Odsłoń jamę szpikową pobranych kości, przycinając niewielką część z każdego końca skalpelem.</li>
		<li>Za pomocą igły o wadze 25 g przepłukać jamy szpiku za pomocą CMCM do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Kości będą wydawały się białe, gdy zostaną wystarczająco zarumienione.</li>
		<li>Po zakończeniu zbierania mieszadło zasysa igłą 18 g przez 30-90 s, aby wytworzyć zawiesinę pojedynczej komórki. 
		nuta: W tym momencie można przeprowadzić opcjonalny etap lizy krwinek czerwonych (RBC). Ostatnio zasugerowano, że wewnątrzkomórkowa zawartość żelaza może wpływać na wpływ resztek mieliny na polaryzację makrofagów16. Aby uzyskać informacje na temat włączenia etapu lizy RBC, patrz Trouplin i wsp. 17.</li>
		<li>Przefiltruj zawiesinę przez sitko sterylne o pojemności 70 μm do nowej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Nasiona zebrały komórki równomiernie do 145 mm szalek do hodowli komórkowych zawierających 15-20 ml CMCM. Użyj około trzech naczyń hodowlanych na każdą ofiarowaną mysz. Inkubować kultury w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
		<li>Po 72 godzinach umyj płytki sterylnym PBS, aby usunąć nieprzylegające komórki, a następnie dodaj 15-20 ml świeżego CMCM. Inkubować kultury przez dodatkowe 4 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Po 7 dniach całkowitej hodowli, początkowo wyizolowane krwiotwórcze komórki szpiku kostnego będą dojrzałymi BMDM (<silna klasa = "xfig" >Ryc. 1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wytwarzanie fluorescencyjnie znakowanych resztek mieliny pochodzących z mózgu
UWAGA: Wszystkie odczynniki mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
<ol>
	<li>Przygotowanie odczynników do zbierania resztek mieliny 
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór buforowy Tris·Cl.
		<ol>
			<li>Do 800 ml destylowanego dejonizowanego H2O (ddiH2O) dodać 20 ml 1 M Tris·Cl, pH 7,45 (20 mM stężenie końcowe) i 20 ml 100 mM Na2EDTA (2 mM stężenie końcowe).</li>
			<li>Dostosuj pH do 7,45. Dostosuj objętość do 1000 ml za pomocą ddiH2O. Roztwór filtrujący przez jednostkę filtracyjną 0,2 μm.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotować 1 M roztwór sacharozy.
		<ol>
			<li>Do 100 ml roztworu buforowego Tris·Cl dodać 68,46 g sacharozy. Dostosować objętość do 200 ml za pomocą roztworu buforowego Tris·Cl. Roztwór filtracyjny przez jednostkę filtracyjną 0,2 μm.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotować 200 ml 0,32 M roztworu sacharozy, rozcieńczając 1 M roztwór roztworem buforowym Tris·Cl 0,83:0,16 (vol/vol).</li>
		<li>Przygotować 150 ml 0,83 M roztworu sacharozy, rozcieńczając 1 M roztwór roztworem buforowym Tris·Cl 0,83:0,16 (obj./obj.).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbieranie surowych szczątków mieliny pochodzących z mózgu 
	nuta: Opisana tutaj metoda zbierania służy do izolacji surowych szczątków mieliny.
	<ol>
		<li>Poddaj eutanazji 10-12 myszy w wieku 8-10 tygodni przy użyciu standardowych wytycznych dotyczących uduszenia CO2, a następnie zwichnięcia szyjki macicy.</li>
		<li>Wypreparuj mózgi i umieść je w naczyniu o średnicy 100 mm zawierającym 10 ml 0,32 M roztworu sacharozy. Trzymaj danie na lodzie.</li>
		<li>Za pomocą sterylnych nożyczek chirurgicznych pokrój mózg na kawałki o wielkości około 5mm3.</li>
		<li>Przenieść tkankę do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i dodać około 30 ml 0,32 M roztworu sacharozy.</li>
		<li>Homogenizować za pomocą sterylnego ręcznego homogenizatora obrotowego, aż do uzyskania gładkiego roztworu.</li>
		<li>Rozcieńczyć homogenizowane mózgi do końcowej objętości 90 ml 0,32 M roztworem sacharozy.</li>
		<li>Do sześciu cienkościennych probówek ultrawirówek polipropylenowych o pojemności 38,5 ml dodaj 20 ml 0,83 M roztworu sacharozy.</li>
		<li>Delikatnie dodać homogenizowany roztwór mózgu do wierzchu 0,83 M roztworu sacharozy, uważając, aby nie wymieszać dwóch warstw.</li>
		<li>Zrównoważyć każdą probówkę 0,32 M roztworem sacharozy.</li>
		<li>Wirować przy 100 000 x g przez 45 minut w temperaturze 4°C przy użyciu odpowiedniego, wstępnie schłodzonego wirnika ultrawirówki. Ustaw przyspieszenie i opóźnienie wirnika na ich minimalne wartości, aby zmniejszyć utratę resztek mieliny.</li>
		<li>Zbierz resztki mieliny z granicy faz dwóch gęstości sacharozy. 
		UWAGA: Zanieczyszczenia powinny pojawiać się jako biały pasek w kierunku środka rury.</li>
		<li>Połączyć surowe resztki mieliny w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml i dostosować objętość do około 35 ml za pomocą roztworu buforowego Tris·Cl.</li>
		<li>Homogenizuj surowe resztki mieliny za pomocą sterylnego ręcznego homogenizatora obrotowego przez 30-60 s.</li>
		<li>Równomiernie podzielić zawiesinę między 6 czystych probówek ultrawirówek i zrównoważyć odpowiednią objętością roztworu buforowego Tris·Cl.</li>
		<li>Wirować przy 100 000 x g przez 45 minut w temperaturze 4°C przy użyciu odpowiedniego, wstępnie schłodzonego wirnika ultrawirówki. Ustaw maksymalne wartości przyspieszania i zwalniania wirnika.</li>
		<li>Ponieważ stałe białe granulki będą teraz widoczne, wyrzuć supernatant i ponownie zawieś osadki w 10-15 ml roztworu buforowego Tris·Cl.</li>
		<li>Równomiernie podzielić zawiesinę między 2 czyste probówki ultrawirówki i zrównoważyć odpowiednią objętością roztworu buforowego Tris·Cl.</li>
		<li>Ponownie odwirować przy 100 000 x g przez 45 minut w temperaturze 4 °C, używając odpowiedniego, wstępnie schłodzonego wirnika ultrawirówki. Ustaw maksymalne wartości przyspieszania i zwalniania wirnika.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki w 5-6 ml sterylnego PBS i podzielić zawiesinę między odpowiednią liczbę wstępnie zważonych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Wirować przy 22 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i określić masę osadków mieliny.</li>
		<li>Ponownie zawiesić granulki w PBS do końcowego stężenia 100 mg/ml. 
		UWAGA: Dziesięć do dwunastu mózgów wystarcza do wytworzenia 10-15 ml resztek mieliny o stężeniu 100 mg/mL. Resztki mieliny można przechowywać w temperaturze -80 °C przez 6 miesięcy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Etykietowanie fluorescencyjne resztek mieliny
	<ol>
		<li>Bezpośrednio przed użyciem przygotować roztwór 50 μM estru sukcynimidylu karboksyfluoresceiny (CFSE).
		<ol>
			<li>Używając sterylnego PBS, rozcieńczyć 5 mM roztwór podstawowy CFSE przygotowany ze 100% dimetylosulfotlenku (DMSO) do końcowego stężenia roboczego 50 μM.</li>
			<li>Przefiltruj roztwór przez filtr strzykawkowy 0,2 μm.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Rozmrozić żądaną ilość resztek mieliny 100 mg/ml i ponownie zawiesić sterylną igłą 29 g. 
		UWAGA: Zamrożenie resztek mieliny spowoduje, że wypadnie ona z roztworu, co wymaga ponownego zamieszania przed użyciem.</li>
		<li>Przenieś resztki mieliny do wstępnie zważonej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Wirować przy 14 800 x g przez 10 minut w temperaturze 4°C. Odrzucić supernatant.</li>
		<li>Ponownie zawiesić resztki mieliny w 200 μl roztworu CFSE na 100 μl granulowanych szczątków mieliny.</li>
		<li>Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT), chroniąc przed światłem.</li>
		<li>Wirować przy 14 800 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.</li>
		<li>Zawiesić osad w 600-800 μl buforu do przemywania (filtr 0,2 μm wysterylizowany 100 mM glicyny w PBS).</li>
		<li>Wirować przy 14 800 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.</li>
		<li>Powtórz kroki 2.3.8-2.3.9 jeszcze dwa razy.</li>
		<li>Po ostatnim przemyciu określić masę osadu resztek mieliny i ponownie zawiesić do 100 mg/ml za pomocą sterylnego PBS. 
		Uwaga: Oznaczone resztki mieliny można przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do 6 miesięcy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Test fagocytozy szczątków mieliny
UWAGA: Poniżej znajduje się podstawowa metoda obserwacji fagocytozy fluorescencyjnie znakowanych resztek mieliny. Dodanie innych metod leczenia i warunków eksperymentalnych będzie musiało zostać zoptymalizowane przez badacza.
<ol>
	<li>Przygotowanie płytek zabiegowych
	<ol>
		<li>Na każdą płytkę o średnicy 145 mm zebrać dojrzałe BMDM do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml, używając 5-6 ml 10 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) w buforowanym fosforanem soli fizjologicznej (dPBS) (pH 7,4) firmy Dulbecco. 
		nuta: Nie należy stosować trypsyny, ponieważ może ona zmienić stan aktywacji komórek18.</li>
		<li>Dodaj równą objętość wstępnie podgrzanego CMCM do każdej probówki z zebranymi komórkami.</li>
		<li>Wirować przy 180 x g przez 8 minut w temperaturze 20 °C. Odrzucić supernatant.</li>
		<li>Ponownie zawieś komórki w CMCM i zlicz.</li>
		<li>Do każdego dołka 24-dołkowej płytki do hodowli komórkowej dodać 1x105 komórek w 1 ml CMCM.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 24 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie i analiza resztek mieliny
	<ol>
		<li>Dodaj 10 μl 100 mg/ml resztek mieliny znakowanych CFSE do każdej studzienki (1 mg/ml stężenie końcowe).</li>
		<li>Inkubować przez 1-3 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
		<li>Umyj płytkę 3 razy sterylnym PBS, aby usunąć niepochłonięte resztki mieliny.</li>
		<li>Do każdej studzienki dodać 400 μl 4% paraformaldehydu. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umyj płytkę 2 razy sterylnym PBS.</li>
		<li>Dodać 400 μl roztworu Hoechst 33258 do każdej studzienki. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem.</li>
		<li>Umyj płytki 2 razy sterylnym PBS.</li>
		<li>Dodaj 200 μl żelu fluorowego z buforem Tris do każdego dołka, aby zmniejszyć fotowybielanie.</li>
		<li>Obrazowanie komórek za pomocą odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego. 
		nuta: Długości fal wzbudzenia i emisji CFSE wynoszą odpowiednio 494 nm i 521 nm.</li>
		<li>Podziel liczbę komórek CFSE dodatnich przez liczbę jąder, aby określić względny wychwyt resztek mieliny.</li>
		<li>Przed przystąpieniem do obrazowania płytki należy przechowywać do 7 dni w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Kwantyfikacja lipidów wewnątrzkomórkowych za pomocą barwienia olejem Red-O
UWAGA: Poniżej znajduje się podstawowa metoda obserwacji wewnątrzkomórkowych lipidów pochodzących z resztek mieliny. Stosowanie resztek mieliny znakowanych CFSE nie jest zalecane do fluorescencyjnej kwantyfikacji barwienia ORO ze względu na nakładanie się widma. Dodanie innych metod leczenia i warunków eksperymentalnych będzie musiało zostać zoptymalizowane przez badacza.
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworów barwiących
	<ol>
		<li>Przygotować 0,5% roztwór barwiący Oil Red-O (ORO).
		<ol>
			<li>Powoli dodawać 100 ml 100% glikolu propylenowego (1,2-propanodiolu) do 0,5 g ORO (1-([4-(Xylylazo)xylyl]azo)-2-naftol), mieszając.</li>
			<li>Podgrzewać roztwór w temperaturze 95 °C przez 15 minut lub do momentu, gdy wszystkie duże cząstki się rozpuszczą. 
			UWAGA: Nie podgrzewać powyżej 100 °C.</li>
			<li>Przefiltruj roztwór przez kawałek bibuły filtracyjnej, będąc jeszcze ciepłym, do nowego pojemnika.</li>
			<li>Pozostawić roztwór do ostygnięcia przez noc w temperaturze pokojowej. Roztwór można przechowywać do 1 roku w temperaturze pokojowej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotować 85% roztwór glikolu propylenowego.
		<ol>
			<li>Dodaj 85 ml 100% glikolu propylenowego do 15 ml ddiH2O. Mieszaj, aż się wymieszają. Roztwór może być przechowywany przez okres do 1 roku w RT.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie płytek zabiegowych
	<ol>
		<li>Przygotować płytkę 24-dołkową zgodnie z metodą opisaną w sekcji 3.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 24 godziny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Leczenie resztek mieliny 
	<ol>
		<li>Dodać 10 μl 100 mg/ml resztek mieliny do każdej studzienki (1 mg/ml stężenie końcowe).</li>
		<li>Inkubować przez 1-3 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
		<li>Umyj płytkę 3 razy sterylnym PBS, aby usunąć niestrawione resztki mieliny. 
		Uwaga: W tym momencie płytki mogą zostać poddane natychmiastowemu utrwaleniu lub można dodać nowy CMCM, a komórki powrócić do inkubacji w celu uzyskania dodatkowych punktów czasowych.</li>
		<li>Do każdej studzienki dodać 400 μl 4% paraformaldehydu. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umyj płytkę 2 razy sterylnym PBS, a następnie poddaj barwieniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie i analiza ORO
	<ol>
		<li>Umyć płytkę stałą 3 razy za pomocą ddiH2O.</li>
		<li>Dodać 400 μl 100% glikolu propylenowego do każdego dołka i inkubować przez 5 minut w temperaturze RT. 
		UWAGA: Zmniejszy to przenoszenie ddiH2O.</li>
		<li>Odessać glikol propylenowy i dodać 400 μl roztworu ORO do każdej studzienki.</li>
		<li>Inkubować przez 8 minut w temperaturze 60 °C.</li>
		<li>Zassać roztwór ORO. Następnie dodaj 400 μl 85% glikolu propylenowego do każdego dołka i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umyj płytkę 3 razy za pomocą ddiH2O.</li>
		<li>Dodać 400 μl roztworu Hoechst 33258 do każdej studzienki. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem.</li>
		<li>Umyj płytki 2 razy sterylnym PBS.</li>
		<li>Do każdego dołka dodać 200 μl żelu fluorowego z buforem Tris.</li>
		<li>Obrazuj komórki za pomocą odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego. ORO można obrazować przy użyciu standardowego zestawu filtrów Texas Red lub DsRed.</li>
		<li>Określ ilościowo względną retencję lipidów, określając obszar dodatni ORO w każdym polu obrazu i dzieląc go przez liczbę jąder.</li>
		<li>Płytki należy przechowywać przez 7 dni w temperaturze 4 °C, chronić przed światłem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+biology+in+development%2C+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Macrophage biology in development, homeostasis and disease.</a> Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).</li>
<li>Unanue, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-presenting+function+of+the+macrophage%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen-presenting function of the macrophage.</a> Annu Rev Immunol. 2, 395-428 (1984).</li>
<li>Cavaillon, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Cytokines and macrophages.</a> Biomed Pharmacother. 48 (10), 445-453 (1994).</li>
<li>Ren, Y., Savill, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis%3A+the+importance+of+being+eaten%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Apoptosis: the importance of being eaten.</a> Cell Death Differ. 5 (7), 563-568 (1998).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+in+spinal+cord+injury%3A+phenotypic+and+functional+change+from+exposure+to+myelin+debris%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Macrophages in spinal cord injury: phenotypic and functional change from exposure to myelin debris.</a> Glia. 63 (4), 635-651 (2015).</li>
<li>Goodrum, J. F., Earnhardt, T., Goines, N., Bouldin, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+myelin+lipids+during+degeneration+and+regeneration+of+peripheral+nerve%3A+an+autoradiographic+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fate of myelin lipids during degeneration and regeneration of peripheral nerve: an autoradiographic study.</a> J Neurosci. 14 (1), 357-367 (1994).</li>
<li>Greenhalgh, A. D., David, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+Phagocytic+Response+of+Microglia+and+Peripheral+Macrophages+after+Spinal+Cord+Injury+and+Its+Effects+on+Cell+Death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differences in the Phagocytic Response of Microglia and Peripheral Macrophages after Spinal Cord Injury and Its Effects on Cell Death.</a> J Neurosci. 34 (18), 6316(2014).</li>
<li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+activates+FAK%2FAkt%2FNF-kappaB+pathways+and+provokes+CR3-dependent+inflammatory+response+in+murine+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Myelin activates FAK/Akt/NF-kappaB pathways and provokes CR3-dependent inflammatory response in murine system.</a> PLoS One. 5 (2), e9380(2010).</li>
<li>Gensel, J. C., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+and+its+role+in+repair+and+pathology+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation and its role in repair and pathology after spinal cord injury.</a> Brain Res. , 1-11 (2015).</li>
<li>Bourre, J. M., Pollet, S., Daudu, O., Le Saux, F., Baumann, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+consists+of+a+continuum+of+particles+of+different+density+with+varying+lipid+composition%3A+major+differences+are+found+between+normal+mice+and+quaking+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Myelin consists of a continuum of particles of different density with varying lipid composition: major differences are found between normal mice and quaking mutants.</a> Biochimie. 59 (10), 819-824 (1977).</li>
<li>Larocca, J. N., Norton, W. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLarocca%2C+JN+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22">Current Protocols in Cell Biology</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Norton, W. T., Poduslo, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+in+rat+brain%3A+method+of+myelin+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Myelination in rat brain: method of myelin isolation.</a> J Neurochem. 21 (4), 749-757 (1973).</li>
<li>Wang, X. Q., Duan, X. M., Liu, L. H., Fang, Y. Q., Tan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carboxyfluorescein+diacetate+succinimidyl+ester+fluorescent+dye+for+cell+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim+Biophys+Sin+%28Shanghai%29%22%5BJournal%5D)">Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester fluorescent dye for cell labeling.</a> Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 37 (6), 379-385 (2005).</li>
<li>Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+dyes+for+lymphocyte+migration+and+proliferation+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies.</a> Immunol Cell Biol. 77 (6), 499-508 (1999).</li>
<li>Deutsch, M. J., Schriever, S. C., Roscher, A. A., Ensenauer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+image+analysis+approach+for+lipid+droplet+size+quantitation+of+Oil+Red+O-stained+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Digital image analysis approach for lipid droplet size quantitation of Oil Red O-stained cultured cells.</a> Anal Biochem. 445, 87-89 (2014).</li>
<li>Kroner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF+and+increased+intracellular+iron+alter+macrophage+polarization+to+a+detrimental+M1+phenotype+in+the+injured+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">TNF and increased intracellular iron alter macrophage polarization to a detrimental M1 phenotype in the injured spinal cord.</a> Neuron. 83 (5), 1098-1116 (2014).</li>
<li>Trouplin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marrow-derived+Macrophage+Production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Marrow-derived Macrophage Production.</a> J Vis Exp. (81), e50966(2013).</li>
<li>Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Detachment+Methods+on+M2+Macrophage+Phenotype+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function.</a> J Immunol Methods. 426, 56-61 (2015).</li>
<li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescuing+macrophage+normal+function+in+spinal+cord+injury+with+embryonic+stem+cell+conditioned+media%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Rescuing macrophage normal function in spinal cord injury with embryonic stem cell conditioned media.</a> Mol Brain. 9 (1), 48(2016).</li>
<li>Bosco, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+synthetic+matrix+metalloproteinase+inhibitor+reduces+human+mesenchymal+stem+cell+adipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">A new synthetic matrix metalloproteinase inhibitor reduces human mesenchymal stem cell adipogenesis.</a> PLOS ONE. 12 (2), e0172925(2017).</li>
<li>Ramírez-Zacarías, J. L., Castro-Muñozledo, F., Kuri-Harcuch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+adipose+conversion+and+triglycerides+by+staining+intracytoplasmic+lipids+with+oil+red+O%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem%22%5BJournal%5D)">Quantitation of adipose conversion and triglycerides by staining intracytoplasmic lipids with oil red O.</a> Histochem. 97 (6), 493-497 (1992).</li>
<li>Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimisation+of+oil+red+staining+permits+combination+with+immunofluorescence+and+automated+quantification+of+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimisation of oil red staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids.</a> Histochem Cell Biol. 116 (1), 63-68 (2001).</li>
<li>Fang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-Induced+Macrophage+Inflammatory+Response+Is+Regulated+by+SHIP%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-Induced Macrophage Inflammatory Response Is Regulated by SHIP.</a> J Immunol. 173 (1), (2004).</li>
<li>Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+and+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation and polarization.</a> Front Biosci. 13, (2008).</li>
<li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

Opisane tutaj procedury wykorzystują zarówno świeżo wyizolowane surowe szczątki mieliny OUN, jak i pierwotne makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego. Aby zmniejszyć wydatki zwierząt, zalecamy, aby zarówno mózg, jak i komórki szpiku kostnego były pobierane od każdej myszy w momencie składania ofiary. Dwóch badaczy współpracujących ze sobą może przygotować oba materiały jednocześnie. Alternatywnie, mózgi mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C w PBS uzupełnionym antybiotykami przed izolacją resztek mieliny. Z naszego ...

Makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego (BMDM) są ważnym ogniwem między wrodzonym i adaptacyjnym układem odpornościowym. Jako komórki prezentujące antygen (APC) mogą komunikować się z limfocytami zarówno poprzez prezentację antygenu, jak i uwalnianie cytokin1,2,3. Jednak jako profesjonalne fagocyty, ich podstawową funkcją jest usuwanie patogenów, starzejących się komórek i resztek komórkowych1,4. Po urazie rdzenia kręgowego (SCI) znaczne ilości mieliny są generowane z umierających oligodendrocytów, typu komórek odpowiedzialnych za mielinizację aksonów OUN5. My i inni wykazaliśmy, że usuwanie resztek mieliny jest przede wszystkim odpowiedzialne za infiltrację BMDMs5,6,7. Sugeruje się jednak, że w obrębie miejsc uszkodzenia rdzenia kręgowego pochłonięcie resztek mieliny przesuwa te normalnie przeciwzapalne komórki w stan prozapalny5,8,9. Jako kluczowe mediatory zapalenia układu nerwowego w uszkodzonym rdzeniu kręgowym, BMDM są ważnymi celami klinicznymi.
Aby pomóc w zbadaniu wpływu BMDM na uszkodzony rdzeń kręgowy, opracowaliśmy model in vitro, aby bezpośrednio badać, jak BMDM reagują na resztki mieliny. Aby poprawić znaczenie biologiczne, w badaniach tych wykorzystuje się zarówno pierwotne mysie BMDM, jak i świeżo wyizolowane szczątki mieliny. W związku z tym przedstawione tutaj metody szczegółowo opisują również izolację i hodowlę pierwotnych mysich BMDM oraz zmodyfikowaną technikę gradientu sacharozy stosowaną do izolowania resztek mieliny pochodzących z mysich OUN 10,11,12. Szczątki mieliny można łatwo oznaczyć barwnikiem fluorescencyjnym, estrem sukcynimidylu karboksyfluoresceiny (CFSE), w celu śledzenia jej internalizacji przez BMDM. CFSE dobrze nadaje się do tego zastosowania, ponieważ nie jest cytotoksyczny, a jego wąskie spektrum fluorescencyjne pozwala na multipleksowanie z innymi sondami fluorescencyjnymi13,14. Po fagocytozie lipidy resztki mieliny są transportowane przez lizosomy i pakowane jako obojętne lipidy w wewnątrzkomórkowe kropelki lipidów5. Aby określić ilościowo tę wewnątrzkomórkową akumulację lipidów, przedstawiamy metodę barwienia czerwienią olejową O (ORO) zoptymalizowaną pod kątem ilościowej analizy obrazu. Ta prosta metoda barwienia daje solidne, powtarzalne wyniki i kwantyfikację15. Metody te ułatwiają badanie fagocytozy resztek mieliny i retencji lipidów przy użyciu ograniczonego specjalistycznego sprzętu.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30243.01</td><td>Wysoka glukoza z L-glutaminą, pirogronianem sodu</td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny-streptomycyny Corning</td><td></td><td>30-002-CI</td><td>100X Roztwór</td></tr><tr><td>Surowica dla noworodków cielęcych (NCS)</td><td>Rocky Mountain Biologics</td><td>NBS-BBT-5XM</td><td>Pochodzenie ze Stanów Zjednoczonych</td></tr><tr><td>Klon NCTC 929 [komórka L, L-929, pochodna szczepu L]&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td>L929 Linia komórkowa do przygotowania kondycjonowanych pożywek</td></tr><tr><td>24-dołkowe płytki do hodowli komórkowych</td><td>VWR</td><td>10062-896&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych</td><td>Greiner Bio-One</td><td>639960</td><td>Polistyren, 145/20mm</td></tr><tr><td>Zestaw do proliferacji komórek CFSE</td><td>Thermo Fisher</td><td>C34570</td><td>DMSO do rekonstytucji</td></tr><tr><td>Dostarczony Fluoro-żel z buforem Tris&nbsp;</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>17985-11</td><td></td></tr><tr><td>Olej Czerwony O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td><silny>Sprzęt</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><silny>Materiały</mocny></td><td><silny>Firma</silny></td><td><silny>Numer katalogowy</strong</td><td>>Uwagi</td></tr><tr><td>Ultrawirówki</td><td>Redlica Beckman</td><td>326823</td><td>cienkościenna, polipropylen, 38,5 mL, 25 x 89 mm</td></tr><tr><td>SW 32 Ti Ultrawirówka Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>369650</td><td>SW 32 Ti Rotor, Wahadłowa łyżka, Tytanowy</td></tr><tr><td>ręczny homogenizator obrotowy</td><td>Fisher Science</td><td>08-451-71</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro fagocytoza resztek mieliny przez makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego

In Vitro Phagocytosis of Myelin Debris by Bone Marrow-Derived Macrophages

Makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego (BMDM) to dojrzałe leukocyty, które pełnią kluczową rolę fizjologiczną jako profesjonalne fagocyty zdolne do usuwania różnych cząstek. Zwykle BMDM są ograniczone do ośrodkowego układu nerwowego (OUN), ale po urazie mogą łatwo infiltrować. Po dotarciu do uszkodzonej tkanki OUN BMDM są podstawowym typem komórek odpowiedzialnym za usuwanie resztek komórkowych pochodzących z urazu, w tym dużych ilości bogatych w lipidy resztek mieliny. Neuropatologiczne konsekwencje naciekania BMDM i fagocytozy resztek mieliny w obrębie OUN są złożone i nie są dobrze poznane. Opisane tutaj protokoły pozwalają na bezpośrednie badanie in vitro BMDM w kontekście uszkodzenia OUN. Zajmujemy się izolacją i hodowlą mysiego BMDM, przygotowaniem resztek mieliny oraz testami oceniającymi fagocytozę szczątków mieliny BMDM. Techniki te dają solidne, wymierne wyniki bez konieczności stosowania znacznego specjalistycznego sprzętu lub materiałów, a mimo to można je łatwo dostosować do potrzeb badaczy.

Inkubacja BMDM z resztkami mieliny znakowanymi CFSE powinna wykazać wyraźną internalizację (Rysunek 2). Chociaż 3-godzinny czas interakcji jest wystarczający, aby BMDM fagocytowały ilość dodanych resztek mieliny umożliwiającą silną detekcję w dalszych etapach, akumulacja wewnątrzkomórkowa może być obserwowana już po 1 godzinie interakcji. Niemniej jednak, po przemyciu na powierzchni komórek mogą nadal znajdować się niektóre resztki mieliny. Może to wynikać z niewystarczającego przemycia lub ...

Prezentujemy metody oceny zdolności fagocytarnej pierwotnych makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego myszy za pomocą fluorescencyjnie znakowanych resztek mieliny i wewnątrzkomórkowego barwienia kropelkami lipidów.

In vitro Fagocytoza resztek mieliny przez makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) are mature leukocytes that serve a critical physiological role as professional phagocytes capable of clearing a ...

Ogólnym celem tego protokołu jest ocena fagocytozy makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego resztek mieliny pochodzących z mózgu. Protokół ten ma na celu udzielenie odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie neurotraumy. Zaletą tej metody jest to, że pozwala na wydajną i stosunkowo opłacalną analizę odpowiedzi makrofagów in vitro, w szczególności zdolności fagocytarnej makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego do resztek mieliny.Metodę tę można łatwo dostosować do badania wpływu modulatorów zewnętrznych. Po nasyceniu myszy 70% etanolem zrób otwór w skórze brzucha. Odciągnij skórę do tyłu, aby odsłonić nogi do rozwarstwienia.Należy uważać, aby podczas tego procesu nie przebić jamy otrzewnej. Po odsłonięciu zdejmij nogi, przecinając kostkę i biodro. Umieść nogi w lodowatym PBS uzupełnionym antybiotykami.Powtórz dla drugiej nogi. Umyj tkankę w świeżym, lodowatym PBS uzupełnionym antybiotykami, aby usunąć wszelkie cząstki, które mogły przylgnąć do tkanki podczas sekcji. Delikatny ruch skrobania zastosowany wzdłuż mięśnia usunie większość niechcianej tkanki.Za pomocą skalpela i pęsety uwolnij kość piszczelową od mięśni i tkanki łącznej. Po uwolnieniu usuń oba końce, aby odsłonić jamę szpiku. Powtórz ten proces dla kości udowej.Przymocuj igłę o rozmiarze 25 do 20-milimetrowej strzykawki wypełnionej kompletną pożywką makrofagową pochodzącą ze szpiku kostnego. Następnie przepłukać jamę szpiku kostnego. Kość będzie wydawała się biała, gdy zostanie wystarczająco zaczerwieniona.Mieszać pobrany szpik za pomocą igły o rozmiarze 18 przez 30 do 90 sekund w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki. Następnie przepuść zawiesinę przez sterylne sitko o wielkości porów 70 mikrometrów. Równomiernie podziel zawiesiny komórkowe w 145-centymetrowych szalkach do hodowli komórkowych.Każda mysz wystarczy na łącznie trzy dania. Po siedmiu dniach hodowli potrawy te zazwyczaj zlewają się w 70 do 80% z dojrzałymi makrofagami. Aby wyizolować surowe szczątki mieliny z mózgów, przeprowadza się szereg etapów ultrawirowania w gradiencie sacharozy.Na początek od 10 do 12 mózgów myszy w wieku od 8 do 10 tygodni jest preparowanych. Mózgi są następnie homogenizowane w 0,32-molowym roztworze sacharozy, a następnie nakładane na poduszkę z 0,383-molowym roztworem sacharozy, aby utworzyć nieciągły gradient. Po odwirowaniu surowe szczątki mieliny znajdują się na granicy między warstwami.Jest on zbierany i dozowany do roztworu buforowego Tris i ponownie odwirowywany w celu osadnienia resztek mieliny. Osad jest ponownie zawieszany w roztworze buforowym Tris i dzielony między dwie probówki w celu dodatkowej cenetrifugacji. Na początek usuń cały mózg i umieść go w naczyniu z lodowatym roztworem sacharozy o stężeniu 0,32 mola.Za pomocą sterylnych nożyczek chirurgicznych pokrój zebrane mózgi na kawałki o wielkości około pięciu milimetrów. Ten krok pomaga w późniejszym procesie homogenizacji. Zbierz tkankę do 50-mililitrowej probówki.Za pomocą homogenizatora obrotowego homogenizuj tkankę do gładkiej zawiesiny. Upewnij się, że wszystkie duże, widoczne bryły mózgu zostały dokładnie zhomogenizowane. Do probówki ultrawirówkowej zawierającej 20 mililitrów 0,83-molowego roztworu sacharozy wytworzyć i homogenować, uważając o utrzymanie separacji.Ostrożnie zrównoważyć każdą probówkę za pomocą 0,32-molowego roztworu sacharozy. Po zakończeniu przenieś probówki do odpowiedniego wirnika wirówki i wiruj przez 45 minut w temperaturze 100 000 razy większej niż grawitacja, cztery stopnie Celsjusza. Upewnij się, że przyspieszenie i opóźnienie są ustawione na wartości minimalne.Po zakończeniu wirowania resztki mieliny będą widoczne między granicami gęstości sacharozy. Delikatnie zbierz resztki mieliny. Po zebraniu dodaj bufor Tris do resztek mieliny.Ponownie homogenizować za pomocą homogenizatora obrotowego. Podzielić homogenat na sześć czystych probówek ultrawirówek i w razie potrzeby zrównoważyć probówki dodatkowym buforem Tris. Ponownie odwiruj zebrane resztki mieliny pod ciśnieniem 100 000 razy większym niż grawitacja, cztery stopnie Celsjusza przez 45 minut, z przyspieszeniem i opóźnieniem ustawionym na maksymalne wartości.Po odwirowaniu mielina zostanie ogranulowana. Korzystając z bufora Tris, ponownie zawiesić osad. Połączyć zawiesiny i ponownie ultrawirować.Po odwirowaniu tworzy się szczelnie upakowany granulek. Zdekantować supernate. Zawiesić osad w sterylnym PBS.Równo podzielić zawieszone resztki mieliny na wstępnie zważone probówki do mikrowirówek. Po odwirowaniu przez 10 minut przy 22 000 razy większej grawitacji, usuń supernat PBS. Po zważeniu granulatu ponownie zawiesić do stężenia 100 miligramów na mililitr za pomocą PBS.Powstałe w ten sposób surowe szczątki mieliny nadają się teraz do badania fagocytozy. Resztki mieliny znakowane przez CFSE mogą być wykorzystywane do śledzenia wczesnej internalizacji, a także transportu wewnątrzkomórkowego. Nieznakowane szczątki mieliny są kompatybilne z barwieniem lipidów Oil Red-O w celu oceny przechowywania i metabolizmu zinternalizowanych lipidów.Jeśli używasz resztek mieliny, które były przechowywane w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, najpierw będziesz chciał ponownie zawiesić za pomocą igły o rozmiarze 29. Ponownie zawiesić 10 miligramów granulowanych resztek mieliny w 200 mikrolitrach PBS. Następnie dodaj dwa mikrolitry pięciomilimolowego roztworu CFSE.Odpipetować do mieszania. Po 30-minutowej inkubacji, chronionej przed światłem i późniejszym myciem, ponownie zawiesić resztki mieliny do 100 miligramów na mililitr za pomocą PBS. Po posiewie i utrwaleniu za pomocą 4% paraformaldehydu, dodaj 100% glikolu propylenowego do każdej studzienki.Po inkubacji przez pięć minut w temperaturze pokojowej dodaj roztwór barwiący Oil Red-O do każdej studzienki. Inkubować przez osiem minut w temperaturze 60 stopni Celsjusza, delikatnie mieszając. Delikatnie przechyl płytkę, aby umożliwić całkowite zassanie plamy Oil Red-O.Do każdej studzienki dodaj 85% glikolu propylenowego. Po pięciu minutach inkubacji w temperaturze pokojowej umyj studzienki PBS i wybarwij komórki wybranym barwnikiem jądrowym. Reprezentatywne obrazy mikroskopowe komórek szpiku kostnego podczas hodowli.24 godziny po początkowym wysiewie obecnych jest niewiele przylegających komórek. Jednak w obecności czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów, M-CSF, komórki prekursorowe leukocytów zaczynają się różnicować. Po siedmiu dniach hodowli w obecności M-CSF komórki prekursorowe są w pełni zróżnicowane w dojrzałe makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego zdolne do fagocytozy.Korzystając z tej metody, pojedyncza ośmio- do 10-tygodniowa mysz C57 6J zwykle daje od 18 do 24 milionów makrofagów szpiku kostnego. Aby uwidocznić internalizację, do kultur makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego dodaje się resztki mieliny znakowane CFSE. Komórki traktowano jednym miligramem na mililitr resztek mieliny znakowanych CFSE przez godzinę przed myciem i utrwalaniem 4% paraformaldehydem.Zinternalizowane szczątki mieliny można wizualizować za pomocą standardowych zestawów filtrów GFP na mikroskopie zdolnym do epifluorescencji. Aby zademonstrować, jak akumulacja lipidów mieliny zmienia się w czasie, makrofagi traktowano nieznakowanymi szczątkami mieliny przez 90 minut, a następnie myto i utrwalano w różnych punktach czasowych. Bezpośrednio po umyciu widocznych jest niewiele kropelek lipidów.Jednak w miarę upływu czasu widocznych staje się więcej kropelek lipidów, osiągając maksimum po około 24 godzinach od umycia. Makrofagi zaczną metabolizować przepływ do magazynów lipidów, zmniejszając liczbę barwiących się kropel. Aby określić ilościowo barwienie Oil Red-O, za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego uzyskano pięć losowo uzyskanych obrazów z każdej próbki punktu czasowego.Obszar zabarwiony czerwienią olejową wyznaczono dla każdego odwiertu za pomocą obrazów wykonanych w kanale DsRed. Całkowitą liczbę komórek określa się poprzez zliczenie liczby jąder obecnych w każdym polu. Ten wykres przedstawia wynikową kwantyfikację.Typowy jest stały wzrost sygnału Oil Red-O-dodatniego, ponieważ makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego przekształcają zinternalizowane lipidy mielinowe w lipidy obojętne. Spadek sygnału Oil Red-O-dodatniego następuje po szczycie po 24 godzinach, gdy makrofagi zaczynają metabolizować lub wypływać lipidy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobre pojęcie o tym, jak izolować i hodować pierwotne makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego, a także jak badać ich interakcję ze świeżo wyizolowanymi szczątkami mieliny pochodzącymi z mózgu.Najważniejszą częścią tych procedur jest prawidłowe utrzymanie techniki aseptycznej przez cały czas. Ponieważ makrofagi mogą silnie reagować na niewielkie ilości cząsteczek związanych z patogenami, bardzo ważne jest, aby zminimalizować wszelkie potencjalne interakcje, które mogą zniekształcić wyniki. Główną zaletą tych technik jest to, że sprawiają one, że składamy się z biologicznie istotnych komórek pierwotnych i świeżych szczątków mieliny, jednocześnie eliminując ilość potrzebnego specjalistycznego sprzętu.Dodatkowo, przy pewnej optymalizacji przez użytkownika, metody te można łatwo dostosować, aby odpowiedzieć na wiele różnych pytań dotyczących odpowiedzi makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego na szczątki mieliny. Wykorzystując zarówno znakowane fluorescencyjnie szczątki mieliny, jak i barwienie mielinizowane makrofagi Oil Red-O, możliwe jest zbadanie potencjalnych interwencji terapeutycznych dla pacjentów cierpiących na różne neurotraumy. Ogólnym celem takich prac jest zdalne usuwanie zanieczyszczeń komórkowych za pośrednictwem makrofagów, aby przyspieszyć ustąpienie stanu zapalnego.

in-vitro-phagocytosis-myelin-debris-bone-marrow-derived

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Makrofagi od dawna są uznawane za kluczowy składnik wrodzonej i adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej. Niedawna eksplozja wiedzy dotyczącej ewolucyjnych, genetycznych i biochemicznych aspektów interakcji między makrofagami a mikroorganizmami ponownie zwróciła uwagę naukowców na makrofagi. W artykule opisano metodę różnicowania makrofagów od szpiku kostnego myszy.

Produkcja makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Badanie biogenezy fagolizosomów w żywych makrofagach

Opisujemy, jak wizualizować interakcje makrofagów-C. neoformansów (Cn) w czasie rzeczywistym, ze szczególnym naciskiem na proces egzocytozy nielitycznej za pomocą cyfrowej mikroskopii świetlnej. Za pomocą tej techniki można badać indywidualnie zakażone makrofagi w celu ustalenia różnych aspektów tego zjawiska.

Wizualizacja egzocytozy nielitycznej Cryptococcus neoformans z makrofagów przy użyciu cyfrowej mikroskopii świetlnej

Tutaj prezentujemy protokół izolacji mikrogleju od pourodzeniowych szczeniąt myszy (dzień 1) do eksperymentów in vitro. Ta improwizowana metoda izolacji zapewnia zarówno wysoką wydajność, jak i czystość, co stanowi znaczną przewagę nad alternatywnymi metodami, która pozwala na szeroki zakres eksperymentów w celu wyjaśnienia biologii mikrogleju.

Szybka i udoskonalona izolacja magnetyczna CD11b pierwotnego mikrogleju o zwiększonej czystości i wszechstronności

Opisujemy tutaj prostą i szybką metodę izolacji fagosomów zawierających Salmonella typhimurium od makrofagów poprzez pokrycie bakterii biotyną i streptawidyną.

Izolacja fagosomów zawierających Salmonella typhimurium od makrofagów

Tutaj opisujemy metody wykorzystujące mikroskopię konfokalną z wirującym dyskiem do obrazowania pojedynczych zdarzeń fagocytarnych przez makrofagi otrzewnowe rezydujące u myszy. Protokoły można rozszerzyć na inne komórki fagocytarne.

Poklatkowe obrazowanie 3D fagocytozy przez makrofagi myszy

Choroby neurodegeneracyjne są związane z rozregulowanymi funkcjami mikrogleju. W artykule przedstawiono test in vitro fagocytozy komórek nerwiaka zarodkowego za pomocą makrofagów iPSC. Odczyty z mikroskopii ilościowej opisano zarówno dla obrazowania poklatkowego żywych komórek, jak i obrazowania o wysokiej zawartości komórek stałych.

Test obrazowania ilościowego in vitro na fagocytozę martwych komórek nerwiaka zarodkowego za pomocą makrofagów iPSC

Obecny protokół opisuje izolację i hodowlę makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego od myszy.

Izolacja i hodowla makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego od myszy

Ten protokół opisuje nieenzymatyczną i prostą metodę izolowania 7-9-dniowych komórek szpiku kostnego myszy noworodków i generowania zróżnicowanych makrofagów przy użyciu supernatantu komórek L929 jako źródła czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów (M-CSF). Makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego poddano dalszej analizie pod kątem antygenów powierzchniowych F4/80, CD206, CD11b i kompetencji funkcjonalnych.

Izolacja szpiku kostnego noworodków myszy i przygotowanie makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

Obecny protokół został opracowany do oceny wpływu powtarzalnej stymulacji magnetycznej na zdolność mikrogleju do fagocytozy resztek mieliny. W tym celu stworzono system kohodowli mikrogleju i szczątków mieliny in vitro.

Ocena fagocytozy mikrogleju resztek mieliny in vitro pod wpływem wielokrotnej stymulacji magnetycznej

Poznaj metodę oceny fagocytozy resztek mieliny przez makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego myszy. Technika fluorescencyjna pozwala badać odpowiedź immunologiczną w kontekście neurotraumatologii.

In vitro Fagocytoza resztek mieliny przez makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego

Przeglądaj więcej filmów