Name: Nowe zastosowanie strumienia plazmy pod ciśnieniem atmosferycznym jako środka neuroprotekcyjnego przeciwko uszkodzeniom komórek SH-SY5Y wywołanym deprywacją glukozy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 34 s
Description: Poznaj zastosowanie strumienia plazmy pod ciśnieniem atmosferycznym jako środka neuroprotekcyjnego w komórkach SH-SY5Y. Ta metoda chroni przed uszkodzeniami wywołanymi deprywacją glukozy i oferuje obiecujące rozwiązanie w terapii niedokrwienia mózgu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Fundusz Innowacji Instytutu Neurochirurgii w Pekinie (2014-11), Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (nr 11475019 i 81271286) oraz Pekińską Fundację Nauk Przyrodniczych (nr 7152027).

1. Przygotowanie urządzenia APPJ
UWAGA: Proszę zapoznać się ze wszystkimi odpowiednimi kartami charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS) przed użyciem. Podczas wykonywania wszystkich eksperymentów należy stosować odpowiednie zasady bezpieczeństwa, w tym używać dygestorium i środków ochrony osobistej (okulary ochronne, rękawice ochronne, fartuch laboratoryjny itp.). Protokół wymaga standardowych technik obchodzenia się z komórkami (sterylizacja, odzyskiwanie komórek, pasażowanie komórek, zamrażanie komórek, barwienie komórek itp.).
<ol>
	<li>Wybierz rurkę kwarcową o średnicy wewnętrznej 1 mm i średnicy zewnętrznej 3 mm. Wygładź przekroje na obu końcach za pomocą folii polerskiej.</li>
	<li>Jako elektrodę wysokonapięciową należy użyć niklowanej igły ze stali nierdzewnej o średnicy 1.0 mm. Oszlifuj jego końcówkę do promienia krzywizny 0,05 mm.</li>
	<li>Owiń folię aluminiową (o szerokości 2 mm) wokół rurki kwarcowej w odległości 1 cm od dyszy rurki kwarcowej. Zamocuj końcówkę igły ze stali nierdzewnej w odległości 1 cm od drugiego końca folii aluminiowej. Użyj pierścienia z folii aluminiowej jako elektrody niskiego napięcia.</li>
</ol>
2. Przejęcie odrzutowców
<ol>
	<li>Aby dostarczyć sygnał AC, podłącz wysokonapięciowy wzmacniacz mocy do funkcyjnego generatora sygnału, który służy jako źródło zasilania. Aby zarejestrować przebiegi przyłożonego napięcia do elektrody wysokiego napięcia, podłącz jeden koniec sondy wysokonapięciowej do oscyloskopu cyfrowego, a drugi koniec podłącz do zasilacza. Aby chronić obwód, użyj rezystora 2 kΩ jako rezystora ochronnego. Podłącz obwód, jak pokazano w <silna klasa="xfig">Rysunek 2. 
	UWAGA: Nie dotykaj dużej objętościtage linie.</li>
	<li>Stale przepuszczaj hel (ułamek objętościowy, 99,999%) przez rurkę kwarcową i kontroluj natężenie przepływu gazu na stabilnym poziomie 1,4 litra standardowego na minutę (SLM). 
	UWAGA: Nie używamy filtra przed leczeniem kultur komórkowych. Udział objętościowy helu użytego w eksperymencie wynosi 99,999%, a większość mikroorganizmów nie może żyć w tych warunkach.</li>
	<li>Włącz zasilanie oscyloskopu, generatora sygnału i wysokonapięciowego wzmacniacza mocy. Obróć pokrętło regulacji częstotliwości na 5 kHz. Stopniowo zwiększaj napięcie do wartości międzyszczytowej 6 kV. 
	UWAGA: Strumień jest wystarczająco długi (około 3 cm), gdy wartość międzyszczytowa napięcia przyłożonego do igły wynosi około 6 kV.</li>
</ol>
3. Przygotowanie komórek SH-SY5Y
<ol>
	<li>Hodować ludzką linię komórkową pochodzącą z nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y w kolbie o średnicy 25cm2 w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej 15% płodową surowicą cielęcą (FBS). Utrzymuj komórki w nawilżonym inkubatorze zawierającym 5%CO2 i 95% powietrza w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Gdy komórki osiągną 85% konfluencji, ostrożnie odessaj pożywkę hodowlaną i dodaj 1 ml 0,25% trypsyny + 0,1% EDTA do komórek.</li>
	<li>Po 15 sekundach inkubacji w temperaturze pokojowej ostrożnie odessać trypsynę i dodać 2 ml RPMI 1640 zawierające 15% FBS w celu zneutralizowania.</li>
	<li>Delikatnie pipetuj w górę iw dół, myjąc dno studzienki, aż monowarstwa SH-SY5Y zostanie całkowicie odłączona.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru i dostosuj stężenie komórek do 2 x 105 komórek/ml, dodając pożywkę RPMI 1640 +15% FBS, a następnie przenieś 100 μl zawiesiny komórek do każdego dołka na 96-dołkowej płytce.</li>
	<li>Pozwól komórkom przyczepić się przez 12 godzin w inkubatorze komórkowym przed leczeniem APPJ.</li>
</ol>
4. Leczenie metodą APPJ SH-SY5Y
<ol>
	<li>Dostosuj odległość między dyszą rurki kwarcowej a platformą, na której zostanie umieszczona 96-dołkowa płytka, do 3 cm. Upewnij się, że wiązka może dotykać powierzchni pożywki hodowlanej. 
	UWAGA: Odległość nie jest mierzona od spodu płyty. Najpierw ustawia się go na 3 cm między dyszą rurki kwarcowej a platformą służącą do umieszczania płytki 96-dołkowej.</li>
	<li>Przed poddaniem działaniu APPJ należy zmienić pożywkę hodowlaną w każdym dołku z wyjątkiem studzienek kontrolnych na RPMI 1640 bez pożywki glukozowej.</li>
	<li>Umieść płytkę pod dyszą APPJ i upewnij się, że dysze mogą strzelać pionowo do każdej studzienki.</li>
	<li>Traktuj komórki w oddzielnych studzienkach za pomocą APPJ przez 0 s, 1 s, 2 s, 4 s, 8 s i 12 s. 
	UWAGA: APPJ jest generowany przez jonizację helu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Komórki uszkodzone przez deprywację glukozy są leczone przepływem helu przez 4 s i 8 s w celu wyeliminowania wpływu helu na komórki. Wszystkie zabiegi należy wykonać w trzech egzemplarzach.</li>
</ol>
5. Test żywotności komórek
UWAGA: Nie zmieniaj medium w tym kroku.
<ol>
	<li>Po zabiegu APPJ inkubować komórki przez 1 godzinę w inkubatorze komórkowym.</li>
	<li>Dodaj 10 μl roztworu Cell Counting Kit-8 (CCK-8) do każdej studzienki.</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 4 h. 
	UWAGA: Linia komórkowa SH-SY5Y jest wrażliwa na warunki niedoboru glukozy12. Żywotność komórek spada do blisko 50% po 1 godzinie deprywacji glukozy, co jest optymalnym warunkiem żywotności komórek w badaniach farmakodynamicznych. CCK-8 nie ma cytotoksyczności dla komórek, a komórki inkubuje się z odczynnikiem CCK-8 przez kolejne 4 godziny w warunkach deprywacji glukozy po leczeniu APPJ w celu sprawdzenia żywotności komórek. Po 8 godzinach deprywacji glukozy i leczeniu APPJ ochronne działanie APPJ zostało znacznie zmniejszone, ponieważ długotrwała deprywacja glukozy doprowadziła do poważnego uszkodzenia komórek SH-SY5Y. Nie znaleziono dowodów na istnienie żywych komórek po 24 godzinach deprywacji glukozy11.</li>
	<li>Zmierzyć absorbancję przy długości fali 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek.</li>
</ol>

<ol><li>Yang, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+mitochondrial+electron+transfer+for+the+treatment+of+neurodegenerative+diseases+and+cancers%3A+Methylene+blue+connects+the+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Alternative mitochondrial electron transfer for the treatment of neurodegenerative diseases and cancers: Methylene blue connects the dots.</a> Prog. Neurobiol. , (2015).</li>
<li>Bhat, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress%2C+mitochondrial+dysfunction+and+neurodegenerative+diseases%3B+a+mechanistic+insight%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress, mitochondrial dysfunction and neurodegenerative diseases; a mechanistic insight.</a> Biomed. Pharmacother. 74, 101-110 (2015).</li>
<li>Bullon, P., Newman, H. N., Battino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity%2C+diabetes+mellitus%2C+atherosclerosis+and+chronic+periodontitis%3A+a+shared+pathology+via+oxidative+stress+and+mitochondrial+dysfunction%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Periodontol.+2000%22%5BJournal%5D)">Obesity, diabetes mellitus, atherosclerosis and chronic periodontitis: a shared pathology via oxidative stress and mitochondrial dysfunction?</a> Periodontol. 2000. 64 (1), 139-153 (2014).</li>
<li>Sutherland, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotection+for+ischaemic+stroke%3A+translation+from+the+bench+to+the+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Stroke%22%5BJournal%5D)">Neuroprotection for ischaemic stroke: translation from the bench to the bedside.</a> International Journal of Stroke. 7 (5), 407-418 (2012).</li>
<li>Yan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+using+Cold+Atmospheric+Plasma+Stimulated+Media+for+Cancer+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Principles of using Cold Atmospheric Plasma Stimulated Media for Cancer Treatment.</a> Scientific Reports. 5 (5), 18339(2015).</li>
<li>Lu, X., Laroussi, M., Puech, V. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/0963-0252/21/3/034005/meta">On atmospheric-pressure non-equilibrium plasma jets and plasma bullets.</a> Plasma Sources Science & Technology. 21 (3), 034005(2012).</li>
<li>Lu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0370157316300187">Reactive species in non-equilibrium atmospheric-pressure plasmas: Generation, transport, and biological effects.</a> Phys. Rep. 630, 1-84 (2016).</li>
<li>Lu, X., Naidis, G. V., Laroussi, M., Ostrikov, K. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0370157314000441">Guided ionization waves: Theory and experiments.</a> Phys. Rep. 540 (3), 123-166 (2014).</li>
<li>Di, M. S., Reed, T. T., Venditti, P., Victor, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+ROS+and+RNS+Sources+in+Physiological+and+Pathological+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Oxid.+Med.+Cell+Longev%22%5BJournal%5D)">Role of ROS and RNS Sources in Physiological and Pathological Conditions.</a> Oxid. Med. Cell Longev. 2016 (22), 1245049(2016).</li>
<li>Contestabile, A., Ciani, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+nitric+oxide+in+the+regulation+of+neuronal+proliferation%2C+survival+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Role of nitric oxide in the regulation of neuronal proliferation, survival and differentiation.</a> Neurochemistry International. 45 (6), 903-914 (2004).</li>
<li>Yan, X., et al. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/1361-6463/aa5603">Protective effect of atmospheric pressure plasma on oxidative stress-induced neuronal injuries: an in vitro study.</a> J. Phys. D: Appl. Phys. 50 (9), 095401(2017).</li>
<li>Xie, H. R., Hu, L. S., Li, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SH-SY5Y+human+neuroblastoma+cell+line%3A+in+vitro+cell+model+of+dopaminergic+neurons+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Chin.+Med.+J%22%5BJournal%5D)">SH-SY5Y human neuroblastoma cell line: in vitro cell model of dopaminergic neurons in Parkinson's disease.</a> Chin. Med. J. 123 (8), 1086-1092 (2010).</li>
<li>Tsutsui, C., et al. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.7567/JJAP.53.060309/pdf">Treatment of cardiac disease by inhalation of atmospheric pressure plasma.</a> Japanese Journal of Applied Physics. 53 (6), 060309(2014).</li>
<li>Graves, D. B. <a target="_blank" href="http://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.4892534">Low temperature plasma biomedicine: A tutorial review.</a> Physics of Plasmas. 21 (8), 104-117 (2014).</li>
</ol>

W odniesieniu do niniejszego artykułu nie stwierdzono konfliktu interesów.

Komórki SH-SY5Y są ludzką linią komórkową pochodzącą z nerwiaka zarodkowego i są szeroko stosowane jako odpowiedni model komórkowy do badań in vitro nad neurotoksycznością lub neuroprotekcją12. Linia komórkowa SH-SY5Y była wrażliwa na warunki niedoboru glukozy. Żywotność komórek zmniejszyła się do prawie 50% po 1 godzinie deprywacji glukozy, co jest optymalnym warunkiem żywotności komórek dla badań farmakodynamicznych. Ponadto odczynnik CCK-8 nie ma cytotoksyczności dla komórek, a komórki...

Mózg dorosłego człowieka prawie wyłącznie wykorzystuje glukozę jako substrat do metabolizmu energetycznego w normalnych warunkach fizjologicznych. Ludzki mózg stanowi tylko 2% masy ciała, ale zużywa około 25% całkowitej ilości glukozy w organizmie1. Jest dobrze udokumentowane, że dysfunkcja metabolizmu glukozy jest jedną z głównych zmian patologicznych podczas udaru niedokrwiennego i różnych chorób neurodegeneracyjnych, w tym choroby Alzheimera (AD), choroby Huntingtona (HD) i choroby Parkinsona (PD)2,3. Brak glukozy i upośledzony wychwyt glukozy lub fosforylacja oksydacyjna mogą bezpośrednio wpływać na produkcję ATP i dalej indukować śmierć komórek nerwowych, co może zwiększać ryzyko dysfunkcji neuronów, co sugeruje, że utrzymanie żywotności komórek lub opóźnienie uszkodzenia komórek po deprywacji glukozy może być rozsądnym podejściem do leczenia tych chorób. Interesujące było badanie efektów neuroprotekcyjnych poprzez modulację glukozy, koncentrując się na środkach przeciwzapalnych, modulatorach kanałów jonowych, wymiataczach wolnych rodników, czynnikach neurotroficznych itp. Jednak przełożenie tych podejść neuroprotekcyjnych z laboratorium na praktykę kliniczną nie powiodło się4.
Strumienie plazmy pod ciśnieniem atmosferycznym (APPJ) to nowy rodzaj technologii atmosferycznego wyładowania gazu o niskiej temperaturze, która w ostatnich latach przyciągnęła uwagę wielu badaczy z wielu dyscyplin. APPJ są używane od dziesięcioleci w różnych zastosowaniach biomedycznych, takich jak leczenie komórek rakowych, inaktywacja bakterii, krzepnięcie krwi, gojenie ran, medycyna jamy ustnej itp.5,6, ze względu na emisję wielu rodzajów reaktywnych form azotu (RNS) i reaktywnych form tlenu (ROS) (Rysunek 1)7. Poprzednie zastosowania biomedycyny plazmowej koncentrowały się głównie na stresie oksydacyjnym i/lub nitratywnym na bakteriach, komórkach i tkankach8. Jednak APPJ może być również "mieczem obosiecznym", ponieważ RNS i ROS są ważnymi wewnątrzkomórkowymi cząsteczkami sygnałowymi związanymi z wieloma procesami fizjologicznymi i patofizjologicznymi9. Podtlenek azotu (NO) kontroluje szeroki zakres procesów biologicznych i odgrywa podwójną rolę w organizmie człowieka, zwłaszcza w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN). Niskie poziomy NO wykazały ich działanie neuroprotekcyjne zarówno in vitro, jak i in vivo za pośrednictwem wielu szlaków sygnałowych10. Nasze poprzednie badanie po raz pierwszy wykazało, że produkcja NO indukowana przez hel APPJ była zaangażowana w neuroprotekcyjne działanie APPJ przeciwko urazom wywołanym stresem oksydacyjnym11. Nie zgłoszono jednak wpływu APPJ na inne urazy. W związku z tym celem niniejszego badania jest przedstawienie protokołu leczenia in vitro dotyczącego neuroprotekcyjnych zastosowań helu APPJ w uszkodzeniach wywołanych deprywacją glukozy w komórkach SH-SY5Y. W odróżnieniu od poprzednich badań, nasz protokół wykorzystywał leczenie osoczem w niskich dawkach do zastosowań neuroprotekcyjnych bez konsekwencji nadmiernych uszkodzeń wywołanych osoczem, co wskazuje, że leczenie APPJ może być potencjalnie stosowane jako nowy "lek dawcy NO" do przyszłych badań, a nawet do translacji klinicznej. Zasugerowano również, że protokół ten powinien być stosowany jako zastosowanie cytoprotekcyjne dla innych typów komórek z różnymi zaburzeniami, ale warunki leczenia APPJ powinny zostać ponownie dostosowane, a dawka leczenia musi być stosunkowo niska.

<table><tbody><tr><td>Linia komórkowa SH-SY5Y</td><td>Chińskie Centrum Zbierania Kultur Typu</td><td>3111C0001CCC000026</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium</td><td>Thermo Scientific</td><td>21875091</td><td>przechowywane w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>RPMI 1640 podłoże bez glukozy</td><td>Thermo Scientific</td><td>11879020</td><td>przechowywany w temperaturze 4 & st.; C</td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu</td><td>Thermo Scientific</td><td>16000044</td><td>przechowywana w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>roztwór tripsin-EDTA</td><td>Solarbio</td><td>T1300</td><td>przechowywany w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>96 dołków płytkowych</td><td>corning</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do liczenia komórek-8 (CCK-8)</td><td>Dojindo Laboratories</td><td>CK04</td><td>przechowywany w temperaturze 4 &; C</td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek</td><td>Tecan</td><td>M200 Pro</td><td>do pomiaru absorbancji przy 450 nm</td></tr><tr><td>Wysokonapięciowy wzmacniacz mocy</td><td>Trek</td><td>PD06087</td><td>do wzmacniania mocy</td></tr><tr><td>Funkcja Generator sygnału</td><td>MaZe Electronics Science& Technologia</td><td>AT30120</td><td>do dostarczania określonego sygnału</td></tr><tr><td>High &ndash; Sonda napięciowa</td><td>Tektronix</td><td>P6015A</td><td>do wykrywania wysokiego napięcia</td></tr><tr><td>Oscyloskop cyfrowy</td><td>Tektronix</td><td>DPO4104B</td><td>do wyświetlania sygnału</td></tr></tbody></table>

nowe zastosowanie strumienia plazmy pod ciśnieniem atmosferycznym jako środka neuroprotekcyjnego przeciwko uszkodzeniom komórek sh-sy5y wywołanym deprywacją glukozy

New Application of an Atmospheric Pressure Plasma Jet as a Neuro-protective Agent Against Glucose Deprivation-induced Injury of SH-SY5Y Cells

Strumień plazmy atmosferycznej (APPJ) przyciągnął uwagę wielu badaczy z wielu dyscyplin w ostatnich latach, ponieważ jego emisje obejmują wiele rodzajów reaktywnych form azotu (RNS) i reaktywnych form tlenu (ROS). Nasze poprzednie badanie wykazało cytoprotekcyjne działanie APPJ przeciwko urazom wywołanym stresem oksydacyjnym. Celem niniejszego badania jest przedstawienie szczegółowego protokołu leczenia in vitro dotyczącego neuroprotekcyjnego zastosowania helu APPJ w uszkodzeniach wywołanych deprywacją glukozy w komórkach SH-SY5Y. Ludzka linia komórkowa pochodząca z nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y była utrzymywana w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej 15% płodową surowicą cielęcą. Pożywka hodowlana została następnie zmieniona na RPMI 1640 bez glukozy przed leczeniem APPJ. Po 1-godzinnej inkubacji w inkubatorze komórkowym żywotność komórek określono za pomocą zestawu do liczenia komórek 8. Wyniki wykazały, że w porównaniu z grupą z deprywacją glukozy, komórki leczone APPJ wykazywały znacznie zwiększoną żywotność komórek w sposób zależny od dawki, przy czym 8 s / dobrze obserwowano jako dawkę optymalną. Tymczasem przepływ helu nie miał wpływu na upośledzenie komórek wywołane deprywacją glukozy. Nasze wyniki wskazują, że APPJ może być potencjalnie stosowany jako metoda leczenia chorób ośrodkowego układu nerwowego związanych z deprywacją glukozy. Protokół ten może być również stosowany jako zastosowanie cytoprotekcyjne dla innych komórek z różnymi zaburzeniami, ale warunki hodowli komórkowej i leczenia APPJ powinny zostać ponownie dostosowane, a dawka leczenia musi być stosunkowo niska.

Dane przedstawiono jako średnia ± SD z co najmniej trzech niezależnych eksperymentów. Wyniki grup przeanalizowano pod kątem wariancji za pomocą testu ANOVA. Wszystkie analizy wykonano przy użyciu oprogramowania do analizy statystycznej Prism, a próg istotności statystycznej określono jako p&lt;0.05.
Żywotność komórek zmierzono po 4 h inkubacji z CCK-8. Jak pokazano na Rysunku 3, deprywacja glukozy zmniejszyła żywotność komórek SH-SY5Y do 44,1 ± 2,6% w porównaniu z...

Protokół neuroprotekcyjnej aplikacji niskodawkowego leczenia plazmą atmosferyczną w przypadku urazów SH-SY5Y wywołanych deprywacją glukozy.

Nowe zastosowanie strumienia plazmy pod ciśnieniem atmosferycznym jako środka neuroprotekcyjnego przeciwko uszkodzeniom komórek SH-SY5Y wywołanym deprywacją glukozy

The atmospheric pressure plasma jet (APPJ) has attracted the attention of many researchers from multiple disciplines in recent years because its emissions ...

Ogólnym celem tej metody leczenia jest zapewnienie szczegółowego protokołu leczenia in vitro do neuroprotekcyjnych zastosowań strumieni plazmy pod ciśnieniem atmosferycznym helu na uszkodzenia wywołane deprywacją glukozy w komórkach SH-SY5Y. Ta metoda może pomóc w rozwiązaniu kluczowych pytań w dziedzinie zastosowań plazmy, takich jak medycyna plazmowa. Główną zaletą tej techniki jest to, że działa ona jako leczenie osoczem stosunkowo nisko w porównaniu z poprzednimi metodami, zapewniając spójne zabiegi.I każdy z nas może zapobiec nadmiernym urazom wywołanym przez plazmę. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię przypadków niedokrwiennych mózgu, ponieważ niewystarczająca podaż glukozy jest częstą cechą tej choroby. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w nowe medyczne zastosowania osocza, może być również stosowana w innych układach, takich jak układ sercowo-naczyniowy.Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają stosować tę metodę, mogą mieć trudności, ponieważ parametry leczenia muszą być dostosowane do różnych urządzeń plazmowych. Najpierw podłącz wysokonapięciowy wzmacniacz mocy do funkcyjnego generatora sygnału, który służy jako źródło zasilania w celu dostarczenia sygnału AC. Aby zarejestrować przebiegi napięcia przyłożonego do elektrody wysokiego napięcia, podłącz jeden koniec sondy wysokiego napięcia do oscyloskopu cyfrowego, a drugi koniec podłącz do zasilania.Stale przepuszczaj hel przez rurkę kwarcową urządzenia do strumienia plazmy pod ciśnieniem atmosferycznym i kontroluj natężenie przepływu gazu na stabilnym poziomie 1,4 litra na minutę. Następnie włącz oscyloskop, generator sygnału i wzmacniacz mocy wysokiego napięcia. Obróć pokrętło regulacji częstotliwości do pięciu kiloherców.Następnie stopniowo zwiększaj napięcie do wartości szczytowej wynoszącej sześć kilowoltów. Po wyhodowaniu ludzkiej linii komórkowej pochodzącej z nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y, ostrożnie odessaj pożywkę komórkową, gdy komórki osiągną 85% zbieżności. Dodaj jeden mililitr 0,25% trypsyny zawierającej 0,1% EDTA do komórek.Po inkubacji przez 15 sekund w temperaturze pokojowej ostrożnie zassaj trypsynę i dodaj dwa mililitry RPMI 1640 zawierającego 15% FBS w celu zneutralizowania. Delikatnie pipetować w górę iw dół, myjąc dno każdej studzienki, aż monowarstwa SH-SY5Y zostanie całkowicie odłączona. Następnie policz komórki za pomocą hemocytometru i dostosuj stężenie komórek, dodając pożywkę RPMI 1640 zawierającą 15% FBS.Następnie przenieś sto mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdej studzienki na 96-dołkowej płytce. Dostosuj odległość między dyszą rurki kwarcowej a platformą, na której zostanie umieszczona płytka 96-dołkowa, do trzech centymetrów, aby upewnić się, że wiązka może dotykać powierzchni podłoża hodowlanego. Przed poddaniem działaniu należy zmienić pożywkę hodowlaną w każdym dołku na pożywkę RPMI 1640 bez pożywki glukozowej.Teraz umieść płytkę pod dyszą strumienia plazmy pod ciśnieniem atmosferycznym. Następnie traktuj komórki w oddzielnych studzienkach przez zero, jeden, dwa, cztery, osiem i 12 sekund. Po poddaniu działaniu należy inkubować komórki przez godzinę w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Po inkubacji dodaj dziesięć mikrolitrów zestawu do liczenia komórek po osiem roztworów do każdej studzienki. Następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery godziny. Na koniec zmierz absorbancję przy 450 nanometrach za pomocą czytnika mikropłytek.Deprywacja glukozy zmniejszyła żywotność komórek SH-SY5Y do 44,1 plus minus 2,6 procent w porównaniu z grupą kontrolną. Leczenie strumieniem plazmy pod ciśnieniem atmosferycznym znacznie zwiększyło żywotność komórek w sposób zależny od dawki przy optymalnej dawce ośmiu sekund na studzienkę. A żywotność komórek osiągnęła 62,27 plus minus 3,1%Przepływ gazu nie miał wpływu na upośledzenie komórek wywołane deprywacją glukozy.Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu 30 godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby przed użyciem zapoznać się ze wszystkimi kartami charakterystyki. Po opracowaniu, technologia ta otwiera naukowcom zajmującym się medycyną plazmową drogę do odkrywania nowych zastosowań w innych rodzajach urazów mózgu i tworzenia nowszych modeli urazów.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać strumienia plazmy pod ciśnieniem atmosferycznym do nowych praktycznych zastosowań. Nie zapominaj, że praca ze wzmacniaczem mocy wysokiego napięcia może być bardzo niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak nie dotykanie linii wysokiego napięcia.

new-application-an-atmospheric-pressure-plasma-jet-as-neuro

Research

JoVE Journal

Engineering

Inżynieria

Opracowano nowy eksperyment impulsowego zwiększania ciśnienia w komórkach z wykorzystaniem pręta Kolsky'ego w celu zbadania mechanizmów molekularnych i komórkowych urazowego uszkodzenia mózgu wywołanego falą uderzeniową.

Impulsywne zwiększanie ciśnienia w komórkach neuronalnych na potrzeby badań nad urazowym uszkodzeniem mózgu

Weźmy mysz poddaną wywołanemu laserem uszkodzeniu głowy nerwu wzrokowego w oku.Uszkodzenie powoduje uszkodzenie komórek śródbłonka i tworzenie się skrzepów krwi w naczyniach krwionośnych zaopatrujących nerwy, zmniejszając przepływ krwi i powodując niedokrwienie.Niedokrwienie pozbawia tlenu aksony komórek zwojowych siatkówki w głowie nerwu wzrokowego.W ciałach komórek RGC zakłócenie to upośledza funkcję mitochondriów i zwiększa produkcję reaktywnych form tlenu.Wynikający z tego stres oksydacyjny...

 Tlenoterapia hiperbaryczna jako strategia neuroprotekcyjna w przedniej niedokrwiennej neuropatii nerwu wzrokowego

Ten film przedstawia metodę wywoływania różnicowania w nerwowych komórkach macierzystych za pomocą zimnego plazmy atmosferycznej. Generuje to promieniowanie UV i reaktywne cząsteczki, które stymulują komórki nerwowe do wytwarzania wypustek, wskazujących na różnicowanie komórek neuronalnych.

Stymulacja różnicowania nerwowych komórek macierzystych za pomocą leczenia zimną plazmą atmosferyczną

Źródło: Yan, X., et al., Nowe zastosowanie strumienia plazmy pod ciśnieniem atmosferycznym jako środka neuroprotekcyjnego przeciwko uszkodzeniom komórek SH-SY5Y wywołanym deprywacją glukozy. J. Vis. Exp. (2017)Film demonstruje neuroprotekcyjne działanie leczenia osoczem o niskim ciśnieniu atmosferycznym w komórkach neuroblastoma pozbawionych glukozy poprzez modulację stresu oksydacyjnego i zwiększanie żywotności komórek.

Ocena leczenia osoczem pod ciśnieniem atmosferycznym w komórkach nerwiaka zarodkowego pozbawionego glukozy 

Udar niedokrwienny jest złożonym zdarzeniem, w którym trudno jest zbadać specyficzny wpływ astrocytów na dotknięty obszar mózgu narażony na tlen, deprywację glukozy (OGD). W artykule przedstawiono metodologię otrzymywania izolowanych astrocytów oraz badania ich reaktywności i proliferacji w warunkach OGD.

Monitorowanie reaktywności i proliferacji astrocytów in vitro w warunkach podobnych do niedokrwiennych

Kwaśne kondycjonowanie końcowe chroni przed niedokrwieniem mózgu. Poniżej przedstawiamy dwa modele do uruchamiania APC. Osiąga się je odpowiednio poprzez przeniesienie wycinków korowo-prążkowych do buforu kwaśnego po deprywacji tlenu i glukozy in vitro oraz przez wdychanie 20% CO2 po niedrożności tętnicy środkowej mózgu in vivo.

Modele eksperymentalne do badania neuroprotekcji kwaśnego kondycjonowania końcowego przeciwko niedokrwieniu mózgu

Ten artykuł opisuje nowy model pierwotnego uszkodzenia mózgu spowodowanego wybuchem. Rurka uderzeniowa napędzana sprężonym powietrzem służy do wystawiania in vitro mysich kultur hipokampa na pojedynczą falę uderzeniową. Jest to prosty i szybki protokół generujący powtarzalne uszkodzenie tkanki mózgowej o wysokiej przepustowości.

Nowatorski model in vitro urazowego uszkodzenia mózgu

Ten protokół ma na celu dostarczenie szczegółowych etapów eksperymentalnych leczenia komórkami macierzystymi układu nerwowego zimną plazmą atmosferyczną oraz wykrywania immunofluorescencji w celu poprawy różnicowania.

Różnicowanie nerwowych komórek macierzystych za pomocą jednoetapowej obróbki zimną plazmą atmosferyczną in vitro

Zgłaszana jest metoda dostarczania nerwowych komórek macierzystych, przystosowanych do wstrzykiwania roztworów lub zawiesin, przez wspólną tętnicę szyjną (mysz) lub tętnicę szyjną zewnętrzną (szczur) po udarze niedokrwiennym. Wstrzyknięte komórki są szeroko rozmieszczone w miąższu mózgu i można je wykryć do 30 dni po porodzie.

Dotętnicze dostarczanie nerwowych komórek macierzystych do mózgu szczura i myszy: zastosowanie do niedokrwienia mózgu

Ta praca opisuje rozwój elastycznych elektrod międzypalcowych do implementacji w modelach 3D guzów mózgu, a mianowicie w hodowli in vitro, modelu in ovo i modelu mysim in vivo. Proponowana metoda może być wykorzystana do oceny wpływu pulsacyjnych pól elektrycznych na nowotwory na różnych poziomach złożoności.

Elastyczne organiczne urządzenia elektroniczne do terapii pulsacyjnym polem elektrycznym glejaka

Mezenchymalne komórki zrębowe pochodzące z tkanki tłuszczowej (AdMSC) mają silne właściwości immunomodulacyjne, przydatne w leczeniu chorób związanych ze stanem zapalnym. Pokazujemy, jak izolować i hodować mysie AdMSC i pierwotny mieszany glej, stymulować AdMSC do zwiększania poziomu genów przeciwzapalnych i czynników wzrostu, oceniać migrację AdMSC i kohodować AdMSC z pierwotnym mieszanym glejem zakażonym prionami.

Mezenchymalne komórki zrębowe pochodzące z tkanki tłuszczowej współhodowane z pierwotnym mieszanym glejem w celu zmniejszenia stanu zapalnego wywołanego prionami

Poznaj zastosowanie strumienia plazmy pod ciśnieniem atmosferycznym jako środka neuroprotekcyjnego w komórkach SH-SY5Y. Ta metoda chroni przed uszkodzeniami wywołanymi deprywacją glukozy i oferuje obiecujące rozwiązanie w terapii niedokrwienia mózgu.

Nowe zastosowanie strumienia plazmy pod ciśnieniem atmosferycznym jako środka neuroprotekcyjnego przeciwko uszkodzeniom komórek SH-SY5Y wywołanym deprywacją glukozy (Wideo) | JoVE Journal

Nowe zastosowanie strumienia plazmy pod ciśnieniem atmosferycznym jako środka neuroprotekcyjnego przeciwko uszkodzeniom komórek SH-SY5Y wywołanym deprywacją glukozy

Przeglądaj więcej filmów