Name: Masowa izolacja i hodowla in vitro wewnątrzmięczakowych stadiów ludzkiej krwi Fluke Schistosoma mansoni (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 5 s
Description: Poznaj protokół masowej izolacji miracidiów Schistosoma mansoni z jaj odzyskanych z wątrób myszy i ich hodowlę in vitro. Ta metoda wspiera badania nad schistosomatozą.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Częściowo finansowane z grantu NIH RO1AI015503. Myszy zakażone schistosomatozą zostały dostarczone przez NIAID Schistosomasis Resource Center w Instytucie Badań Biomedycznych (Rockville, MD) za pośrednictwem NIH-NIAID Contract HHSN272201000005I do dystrybucji za pośrednictwem BEI Resources.

Wszystkie procedury opieki nad zwierzętami i eksperymentów zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Wisconsin-Madison na mocy Protokołu nr V005717. Poniższy protokół obejmuje pracę w obiekcie o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2) dla ludzkich patogenów, chociaż żaden ze stadiów schistosomów przedstawionych w tym protokole nie jest zakaźny dla ludzi lub innych ssaków. Postępuj zgodnie z zasadami instytucjonalnymi dotyczącymi postępowania z ludzkimi patogenami z grupy ryzyka 2 (RG2).
UWAGA: Używamy samic myszy Swiss-Webster (6-tygodniowych) ze względu na ich większą podatność na infekcje10, co daje większe ilości jaj. Tucker i in. opisują protokoły infekcji myszy i ślimaków używane w tym systemie modelowym11. Tabela materiałów zawiera listę wszystkich konkretnych urządzeń, materiałów, odczynników i źródeł zwierzęcych potrzebnych do przeprowadzenia tego protokołu eksperymentalnego.
1. Przetwarzanie zakażonych wątrób
<ol>
	<li>Eutanazja myszy, 6-7 tygodni po zakażeniu, przez uduszenie CO2 (szybkość 10-30% objętości komory na minutę). Monitoruj myszy pod kątem ustania oddychania i bicia serca. 
	UWAGA: Zazwyczaj w danym momencie można przetworzyć do 20 myszy.</li>
	<li>Po przeniesieniu uśpionych myszy do szafy bezpieczeństwa biologicznego, połóż myszy na ich grzbietach i spryskaj ich powierzchnie brzuszne 70% etanolem. Pozostaw do namoczenia na 1 minutę.</li>
	<li>Uszczypnij i podciągnij skórę dolnej części brzucha i przetnij podstawę uszczypniętej skóry najbliżej brzucha sterylnymi nożyczkami chirurgicznymi. Pociągnij przeciętą skórę do przodu (tj. w kierunku głowy), aby odsłonić wątrobę. Należy pamiętać, że wątroba powinna być powiększona i nakrapiana z powodu reakcji ziarniniakowej wywołanej przez jajo (<silna klasa = "xfig" >Ryc. 2A).</li>
	<li>Wyjąć wątrobę i umieścić ją w zlewce zawierającej 200 ml sterylnego 1,2% roztworu NaCl zawierającego wstrzykiwacz/paciorkowiec.</li>
	<li>Powtórz kroki 1.3 i 1.4 z pozostałymi myszami. 
	UWAGA: Dwadzieścia myszy jest zwykle przetwarzanych podczas jednego zbioru.</li>
	<li>Umieść wątroby na sterylnej szalce Petriego i usuń tłuszcz niewątrobowy/tkankę łączną za pomocą sterylnych kleszczy.</li>
	<li>Przenieś przycięte/oczyszczone wątroby do sterylnej butelki wirówki o pojemności 250 ml zawierającej ~200 ml sterylnego 1,2% roztworu NaCl za pomocą wstrzykiwacza/paciorkowca.</li>
	<li>Energicznie wstrząśnij butelką zawierającą wątroby i za pomocą sterylnej jednorazowej pipety usuń nadmiar piany powierzchniowej/pływających zanieczyszczeń. Powoli odlej pozostały roztwór soli fizjologicznej do pojemnika lub zlewu zawierającego 1% wybielacza (środka dezynfekującego).</li>
	<li>Dodaj ~200 ml świeżego roztworu soli fizjologicznej do wątroby i powtórz krok 1.8 jeszcze trzy razy.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja wątroby i izolacja mikwasowa
<ol>
	<li>Umieść wątroby w małym sterylnym kubku blendera ze stali nierdzewnej i dodaj ~ 2 ml 1,2% roztworu NaCl (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2B).</li>
	<li>Przykryj kubek folią i szalką Petriego, aby zapobiec rozlaniu, i miksuj przez 1 minutę, naprzemiennie z niską i wysoką prędkością (20 s niska prędkość / 10 s wysoka prędkość; powtórz) (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C).</li>
	<li>Zmiksowaną zawiesinę wątroby równomiernie rozprowadzić w sterylnych butelkach wirówkowych o pojemności 250 ml (na 20 wątróbek należy użyć 4 butelek).</li>
	<li>Dodaj sterylną sól fizjologiczną z antybiotykami do ~200 ml całkowitej objętości / butelkę. Zważyć/zrównoważyć butelki przed odwirowaniem.</li>
	<li>Odwirować zmiksowane wątroby w temperaturze 290 x g przez 15 minut w temperaturze 4 o°C. Przed wyrzuceniem delikatnie odlać supernatanty do pojemnika z wybielaczem.</li>
	<li>Powtórz kroki 2.4-2.5 raz. Pamiętaj, aby dokładnie zawiesić osad wątroby przed odwirowaniem.</li>
	<li>Po odrzuceniu ostatniego płukania solą fizjologiczną (krok 2.6), dodaj 200 ml sterylnej wody ze stawu za pomocą wstrzykiwacza/paciorkowca do granulowanej tkanki wątroby, wstrząśnij w celu ponownego zawieszenia osadu i przenieś zawiesinę do wysterylizowanej 1-litrowej kolby miarowej, która została całkowicie pokryta folią aluminiową, z wyjątkiem górnych 3 cm szyjki (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2D). 
UWAGA: Użyć dwóch butelek (= 10 wątróbek) na kolbę o pojemności 1 l. Woda w stawie symuluje naturalne środowisko słodkowodne potrzebne do stymulowania cudownego wylęgu z jaj.</li>
	<li>Używając sterylnej wody ze stawu, napełnij kolbę do około 3 cm powyżej folii pokrywającej szyję. Następnie, bez zwłoki (ponieważ miracidia wkrótce zaczną się wykluwać), usuń resztki piany i tkanki wątroby unoszące się na powierzchni, szybko pipetując ~12 ml wody ze stawu zawierającej zanieczyszczenia i wyrzucając ją do oddzielnej probówki. Zastąp świeżą sterylną wodą ze stawu.</li>
	<li>Powtórz krok 2.8 jeszcze trzy razy, sprawdzając, czy w probówce do wyrzucania nie ma miracidii. Przerwij powtarzanie kroku czyszczenia, jeśli w roztworze myjącym pojawią się miracidie.</li>
	<li>Po ostatnim myciu powoli dodaj ~12 ml ciepłej sterylnej wody ze stawu (wstępnie podgrzanej do 30 oC), aby utworzyć gradient temperatury z czystą, sterylną ciepłą wodą na wierzchu. 
	UWAGA: Najlepiej jest to osiągnąć, powoli spuszczając wodę wzdłuż boku szyjki kolby, aby uniknąć mieszania.</li>
	<li>Umieść małą pokrywę szalki Petriego nad otworem kolby i skieruj jasne światło na górną część kolby powyżej foliowej pokrywy, aby oświetlić górną powierzchnię wody. 
	UWAGA: Zazwyczaj, w ciągu 5-10 minut, pływające miracidia, przyciągane przez światło, koncentruje się w dużych ilościach w ciągu pierwszych 2-3 cm wody w stawie (<silna klasa = "xfig" >Ryc. 3A).</li>
</ol>
3. Cudowne zbiory i uprawa
<ol>
	<li>Gdy miracidia zgromadzą się na powierzchni po 10 minutach, za pomocą sterylnej pipety transferowej usuń ~8 ml wody ze stawu i przenieś do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Umieść probówkę zawierającą miracidię na lodzie.</li>
	<li>Dodać z powrotem 8 ml ciepłej, sterylnej wody ze stawu wzdłuż wnętrza kolby miarowej i odczekać kolejne 10 minut.</li>
	<li>Używając za każdym razem nowych probówek, powtórz kroki 3.1 i 3.2 jeszcze trzy razy. Po 4zebraniu trzymaj ostatnią tubkę na lodzie przez 10 minut, aby miracidia mogła się uspokoić. Ten zestaw probówek składa się z pierwszych zbiorów.</li>
	<li>Probówki wirówkowe zawierające miracidię w stężeniu 290 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 o temperaturzeC we wstępnie schłodzonej wirówce z chłodzeniem.</li>
	<li>Natychmiast usuń większość supernatantu (~7 ml), uważając, aby nie naruszyć osadu pasożyta (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B).</li>
	<li>Zbierz wszystkie miracidia z tego pierwszego zbioru w jednej probówce, a następnie przepłucz wszystkie oryginalne probówki sterylną wodą ze stawu ~1 ml i dodaj do "połączonej" probówki.</li>
	<li>Pozwól pasożytom osiąść na lodzie przez ~5 minut i ponownie odwiruj pasożyty w temperaturze 290 x g przez 1 minutę w temperaturze 4 oC.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć supernatant i dodać 6-8 ml sterylnego zbilansowanego roztworu soli Chernina (CBSS+; patrz Tabela Materiałów) zawierającego wstrzykiwacz/paciorkowiec.</li>
	<li>Delikatnie zawiesić miracidię i podzielić je na 24-dołkową płytkę hodowlaną (1 ml na studzienkę), a następnie przepłukać probówkę w 6-8 ml CBSS+ i dodać 1 ml płukania do każdej studzienki. Inkubować pasożyty w temperaturze 26 oC w warunkach normoksyjnych. Stężenia izolowanych miracidii będą się różnić, ale zwykle wynoszą średnio ~ 7000 / ml.</li>
	<li>Jeśli pasożyty nadal koncentrują się na źródle światła, powtórz kroki od 3.1 do 3.9, aby kontynuować zbieranie późno wylęgających się miracidii, ale zwiększ odstęp czasu między pobranymi do 15-20 min. 
	UWAGA: Ten nowy zestaw probówek reprezentuje drugie zbiory. Ponieważ jednak liczba miracidów jest zazwyczaj niska, larwy ze wszystkich probówek są zwykle gromadzone w jednej studzience hodowlanej zawierającej 2 ml CBSS+.</li>
	<li>Po 24 godzinach od zbiorów i uprawy należy delikatnie zawiesić sporocysty w ich studzienkach za pomocą pipetowania.</li>
	<li>Odczekaj kilka minut, aby pasożyty mogły osiąść na dnie studni. Gdy już się usiądą, ostrożnie usuń supernatant (~1,5 ml), który będzie zawierał większość rzęskowych płytek naskórka zrzucanych przez miracidia podczas przemiany larwalnej. Ten supernatant "transformacyjny" może być albo odrzucony, albo włączony do dalszych badań produktów wydzielniczych larw.</li>
	<li>Dodaj 1,5 ml świeżego CBSS+ do każdego dołka i delikatnie odpipetuj w celu ponownego zawieszenia sporocyst. Powtórz krok 3.12, jeśli pożądane jest dalsze mycie lub zmiana na inne medium.</li>
</ol>

<ol><li>Colley, D. G., Bustinduy, A. L., Secor, W. E., King, C. H. <a target="_blank" href="http://www.thelancet.com/journals/lancet/article/PIIS0140-6736(13)61949-2/abstract">Human schistosomiasis.</a> Lancet. 383, 2253-2264 (2014).</li>
<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosomiasis%3A+number+of+people+treated+worldwide+in+2013%5BTitle%5D)+AND+%22Wkly.+Epidemiol.+Rec%22%5BJournal%5D)">Schistosomiasis: number of people treated worldwide in 2013.</a> Wkly. Epidemiol. Rec. 5 (90), 25-32 (2015).</li>
<li>Yoshino, T. P., Gourbal, B., Théron, A. Schistosoma sporocysts. <a target="_blank" href="https://www.routledge.com/Schistosoma-Biology-Pathology-and-Control/Jamieson/p/book/9781498744256">Schistosoma: biology, pathology and control</a>. Jamieson, B. G. M. , CRC Press. Boca Raton. 118-148 (2017).</li>
<li>Bayne, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+parasitism+of+vector+snail+Biomphalaria+glabrata+by+the+human+blood+fluke+%28trematode%29+Schistosoma+mansoni%3A+a+2009+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biochem.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Successful parasitism of vector snail Biomphalaria glabrata by the human blood fluke (trematode) Schistosoma mansoni: a 2009 assessment.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 165 (1), 8-18 (2009).</li>
<li>Yoshino, T. P., Coustau, C. Immunobiology of Biomphalaria-trematode interactions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYoshino%2C+TP+%22Biomphalaria+snails+and+larval+trematodes%22">Biomphalaria snails and larval trematodes</a>. Toledo, R., Fried, B. , Springer. New York. 159-189 (2011).</li>
<li>Coustau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+gastropod+immunity+from+the+study+of+the+interaction+between+the+snail+Biomphalaria+glabrata+and+its+parasites%3A+A+review+of+research+progress+over+the+last+decade%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+Shellfish+Immunol%22%5BJournal%5D)">Advances in gastropod immunity from the study of the interaction between the snail Biomphalaria glabrata and its parasites: A review of research progress over the last decade.</a> Fish Shellfish Immunol. 46 (1), 5-16 (2015).</li>
<li>Bayne, C. J., Hahn, U. K., Bender, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+molluscan+host+resistance+and+of+parasite+strategies+for+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of molluscan host resistance and of parasite strategies for survival.</a> Parasitology. 123, S159-S167 (2001).</li>
<li>McMullen, D. B., Beaver, P. C. <a target="_blank" href="https://www.cabdirect.org/cabdirect/abstract/19462900219">Studies on schistosome dermatitis. IX. The life cycles of three dermatitis-producing schistosomes from birds and a discussion of the subfamily Bilharziellinae (Trematoda: Schistosomatidae).</a> Amer. J. Hyg. 42, 128-154 (1945).</li>
<li>Voge, M., Seidel, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+in+vitro+of+miracidia+of+Schistosoma+mansoni+and+S.+japonicum+into+young+sprocysts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Transformation in vitro of miracidia of Schistosoma mansoni and S. japonicum into young sprocysts.</a> J. Parasitol. 58 (4), 699-704 (1972).</li>
<li>Eloi-Santos, S., Olsen, N. J., Correa-Oliveira, R., Colley, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosoma+mansoni%3A+mortality%2C+pathophysiology%2C+and+susceptibility+differences+in+male+and+female+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Schistosoma mansoni: mortality, pathophysiology, and susceptibility differences in male and female mice.</a> Exp. Parasitol. 75 (2), 168-175 (1992).</li>
<li>Tucker, M. S., Karunaratne, L. B., Lewis, F. A., Freitas, T. C., Liang, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Proto+Immunol%22%5BJournal%5D)">Schistosomiasis.</a> Curr Proto Immunol. 103, 19.1:19.1.1-19.1.58 (2013).</li>
<li>Basch, P. F., DiConza, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+miracidium-sporocyst+transition+in+Schistosoma+mansoni%3A+surface+changes+in+vitro+with+ultrastructural+correlation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">The miracidium-sporocyst transition in Schistosoma mansoni: surface changes in vitro with ultrastructural correlation.</a> J. Parasitol. 60 (6), 935-941 (1974).</li>
<li>Hansen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+daughter+sporocysts+of+Schistosoma+mansoni%3A+their+occurrence+and+cultivation%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.+Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Secondary daughter sporocysts of Schistosoma mansoni: their occurrence and cultivation.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 266, 426-436 (1975).</li>
<li>Stibbs, H. H., Owczarzak, O., Bayne, C. J., DeWan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosome+sporocyst-killing+amoebae+Isolated+from+Biomphalaria+glabrata%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invertebr.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Schistosome sporocyst-killing amoebae Isolated from Biomphalaria glabrata.</a> J. Invertebr. Pathol. 33, 159-170 (1979).</li>
<li>DiConza, J. J., Basch, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axenic+cultivation+of+Schistosoma+mansoni+daughter+sporocysts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Axenic cultivation of Schistosoma mansoni daughter sporocysts.</a> J. Parasitol. 60 (5), 757-763 (1974).</li>
<li>Hansen, E. L. A cell line from embryos of Biomphalaria glabrata (Pulmonata): Establishment and characteristics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHansen%2C+EL+%22Invertebrate+tissue+culture%3A+Research+applications%22">Invertebrate tissue culture: Research applications</a>. Maramorosch, K. , Academic Press. New York. 75-97 (1976).</li>
<li>Yoshino, T. P., Laursen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+Schistosoma+mansoni+daughter+sporocysts+from+mother+sporocysts+maintained+in+synxenic+culture+with+Biomphalaria+glabrata+embryonic+%28Bge%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Production of Schistosoma mansoni daughter sporocysts from mother sporocysts maintained in synxenic culture with Biomphalaria glabrata embryonic (Bge) cells.</a> J. Parasitol. 81 (5), 714-722 (1995).</li>
<li>Ivanchenko, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+in+vitro+propagation+and+differentiation+of+cultures+of+the+intramolluscan+stages+of+the+human+parasite+Schistosoma+mansoni%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Continuous in vitro propagation and differentiation of cultures of the intramolluscan stages of the human parasite Schistosoma mansoni.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 4965-4970 (1999).</li>
<li>Yoshino, T. P., Bayne, C. J., Bickham, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molluscan+cells+in+culture%3A+primary+cell+cultures+and+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Zool%22%5BJournal%5D)">Molluscan cells in culture: primary cell cultures and cell lines.</a> Can. J. Zool. 91, 391-404 (2013).</li>
<li>Coustau, C., Yoshino, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flukes+without+snails%3A+Advances+in+the+in+vitro+cultivation+of+intramolluscan+stages+of+trematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Flukes without snails: Advances in the in vitro cultivation of intramolluscan stages of trematodes.</a> Exp. Parasitol. 94, 62-66 (2000).</li>
<li>Milligan, J. N., Jolly, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cercarial+transformation+and+in+vitro+cultivation+of+Schistosoma+mansoni+schistosomules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Cercarial transformation and in vitro cultivation of Schistosoma mansoni schistosomules.</a> J. Vis. Exp. (54), e3191(2011).</li>
<li>Basch, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+Schistosoma+mansoniin+vitro.+II+production+of+infertile+eggs+by+worm+pairs+cultured+from+cercariae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Cultivation of Schistosoma mansoniin vitro. II production of infertile eggs by worm pairs cultured from cercariae.</a> J. Parasitol. 67 (2), 186-190 (1981).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Miracidia S. mansoni, wyizolowana i poddana manipulacji w sposób opisany w niniejszym dokumencie, może zakażać tylko żywiciela pośredniego ślimaka, a zatem nie stanowi zagrożenia biologicznego dla człowieka w tej fazie rozwoju larw. Jednakże, aby uniknąć przypadkowego narażenia/zakażenia ślimaków, należy zachować ostrożność w celu przeprowadzenia izolacji mikwasowej w innym miejscu niż obszary, na których mogą występować lub utrzymywać się podatne gatunki ślimaków Biomphalaria. Zdecydowanie zaleca się o...

Ludzkie przywry krwiowe Schistosoma spp., są czynnikami wywołującymi schistosomatozę, zaniedbaną chorobę tropikalną, która dotyka około 230 milionów ludzi na całym świecie1. Najbardziej rozpowszechniony gatunek, Schistosoma mansoni, występuje geograficznie w Ameryce Południowej, na Archipelagu Karaibskim, na Bliskim Wschodzie i w Afryce Subsaharyjskiej2. Cykl życiowy S. mansoni i innych schistosomów jest złożony, obejmuje ostatecznego żywiciela ssaków i ślimaki słodkowodne z rodzaju Biomphalaria, które służą jako obligatoryjni żywiciele pośredni.
S. dorosłe pary robaków męskich i żeńskich mansoni żyjące w tylnych żyłach krezkowych żywiciela ssaków rozmnażają się, co powoduje uwolnienie zarodkowych jaj (komórek jajowych), które zagnieżdżają się w małych żyłkach błony śluzowej jelit. Jaja następnie przebijają się przez ściany naczyń, migrują przez tkankę błony śluzowej i ostatecznie dostają się do światła jelita, gdzie są oddawane w powietrze wraz z kałem. Kiedy komórki jajowe dostaną się do wody słodkiej i wylęgają się swobodnie pływające larwy (miracidia), muszą w krótkim czasie znaleźć odpowiedniego ślimaka Biomphalaria do zarażenia, aby kontynuować swój cykl życiowy. Ten proces infekcji polega na cudownym przyczepieniu się do zewnętrznej powierzchni ciała ślimaka, a następnie aktywnej penetracji i wniknięciu larwy do organizmu żywiciela. Wkrótce po wejściu miracidium zaczyna zrzucać zewnętrzne rzęskowe płytki naskórka, tworząc syncytium, które stanie się nową zewnętrzną powierzchnią (powłoką) następnego stadium larwalnego, pierwotną lub macierzystą sporocystą. Poprzez rozmnażanie bezpłciowe każda pierwotna sporocysta wytwarza i uwalnia drugie pokolenie sporocyst, zwane sporocystami wtórnymi lub potomnymi, które z kolei generują i uwalniają dużą liczbę końcowych etapów wewnątrzmięczakowych, cercaria3. Po ucieczce od żywiciela ślimaka, swobodnie pływające cerkarie są w stanie przyczepić się do skóry ludzkiego lub innego odpowiedniego ssaka i bezpośrednio przeniknąć przez nią. Po wejściu do nowego żywiciela cerkarie przekształcają się w stadium pasożytniczej schistosomuli i atakują układ naczyniowy. One z kolei migrują do płuc, a następnie do żyły wątrobowej, gdzie dojrzewają do dorosłych robaków, tworzą pary męskie i żeńskie i przemieszczają się do żył krezkowych, aby zakończyć swój cykl życiowy.
Pomyślny rozwój schistosomów larwalnych w fazie ślimaka jest niezbędny do kontynuacji cyklu przenoszenia się z człowieka na gospodarza. Decydujące znaczenie ma okres następujący po wejściu swobodnie pływającego miracidium do żywiciela ślimaka i jego wczesnej transformacji do pierwotnego stadium sporocysty. W zależności od fizjologicznej i immunologicznej zgodności między żywicielem a pasożytem, to właśnie w tej fazie rozwoju larwalnego określa się początkowy sukces lub porażkę w zapoczątkowaniu infekcji4,5,6. Późniejszy rozwój pierwotnych sporocyst zdolnych do bezpłciowego wytwarzania wtórnych sporocyst, które następnie generują zakaźne dla człowieka cerkarie, wymaga ponadto pobłażliwego fizjologicznego środowiska gospodarza, które zaspokaja wszystkie potrzeby wzrostu i reprodukcji pasożyta.
Do tej pory niewiele wiadomo o podstawowych procesach fizjologicznych, biochemicznych i molekularnych kontrolujących interakcje schistosomów ze ślimakiem, zwłaszcza o cząsteczkach i szlakach związanych z regulacją rozwoju i rozmnażania larw lub modulowaniem odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Łatwy dostęp do dużej liczby tych stadiów larwalnych w warunkach hodowli in vitro, które pozwalają na eksperymentalną manipulację, znacznie ułatwiłby odkrycie szlaków rozwojowych i mechanizmów leżących u podstaw wzrostu, różnicowania i rozmnażania komórek. Krytyczne szlaki lub mechanizmy pasożytów, zidentyfikowane w wyniku eksperymentów in vitro, mogą być następnie wykorzystane do zakłócenia wzrostu/rozmnażania larw w żywicielu ślimaka lub do identyfikacji mechanizmów immunologicznych gospodarza ślimaka zaangażowanych w rozpoznawanie i eliminację stadiów miracidialnych lub sporocyst.
W tym artykule i prezentacji wideo szczegółowo opisujemy metodę izolowania dużej liczby swobodnie pływających S. mansoni miracidia w celu wprowadzenia do hodowli in vitro, które następnie mogą zostać poddane dalszej manipulacji eksperymentalnej (zobacz Rysunek 1 dla schematycznego przeglądu przepływu pracy protokołu). Chociaż podobne procedury zostały opisane wcześniej7,8,9, uznaliśmy, że szczegółowy protokół byłby przydatny dla badaczy, którzy chcą zastosować ten model do odpowiedzi na wciąż nierozwiązane pytania związane z rozwojem larw, proliferacją komórkową i interakcjami immunologicznymi schistosomów i ślimaków. Ponadto podejście to można łatwo zaadaptować do izolacji jaj z innych ważnych z medycznego punktu widzenia przywr, takich jak S. haematobium żyjące w pęcherzu moczowym, przywry wątrobowe lub przywry płucne.

<table><tbody><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Chernina (CBSS+)</td><td></td><td></td><td>Na 1L roztworu</td></tr><tr><td>2,8 g chlorku sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>Rozpuścić sole, z wyjątkiem chlorku wapnia, i&nbsp;</td></tr><tr><td>0,15 g chlorku potasu&nbsp;</td><td>Cukry Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>w 800 ml ddH2O</td></tr><tr><td>0,07 g fosforanu sodu, dwuzasadowego bezwodnego</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td>Chlorek wapnia rozpuścić oddzielnie w 200&nbsp;</td></tr><tr><td>0,45 g siarczanu magnezu siedmiowodnego&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880</td><td>mL ddH2O</td></tr><tr><td>0,53 g dwuwodnego chlorku wapnia&nbsp;</td><td>Mallinckrodt</td><td>4160</td><td>Powoli dodawać roztwór wapnia do roztworu sól/cukier za pomocą&nbsp;</td></tr><tr><td>0,05 g wodorowęglanu sodu&nbsp; &nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-3</td><td>ze stałym mieszaniem</td></tr><tr><td>1 g glukozy</td><td>MP Biomedicals</td><td>152527</td><td>Dostosuj do pH 7,2 i sterylizuj filtrem za pomocą&nbsp;</td></tr><tr><td>1 g trehalozy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0167</td><td>0,22 &mikro; m jednorazowy filtr butelkowy</td></tr><tr><td>10 ml 100X penicylina/streptomycyna</td><td>Klon SV30010</td><td></td><td>Dodaj przefiltrowaną penicylinę i streptomycynę soln&nbsp; wcześniejsze użycie</td></tr><tr><td><silny>Niekompletny Bge&nbsp; średni (Ibge)</silny></td><td></td><td></td><td><silny>Na 900 ml roztworu</mocny></td></tr><tr><td>220 ml Schneidera' s Pożywka Drosophila modyfikowana</td><td>Lonza</td><td>04-351Q</td><td>Wymieszaj pożywkę Schneidera z 680 ml ddH2O</td></tr><tr><td>4,5 g hydrolizatu enzymatycznego laktoalbuminy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9010</td><td>Dodaj hydrolizat laktoalbuminy i galaktozę</td></tr><tr><td>1,3 g galaktoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0625</td><td>Dostosuj do pH 7,2 i sterylizuj filtrem za pomocą 0,22 &mikro; m wstępnie sterylizowany jednorazowy filtr butelkowy</td></tr> <tr><td>Complete Bge medium (cBge)</td><td></td><td></td><td>Na 100 ml roztworu</td></tr><tr><td>90 mL Niekompletna pożywka</td><td></td><td></td> Bge <td>Do inaktywacji termicznej FBS: Inkubować rozmrożony FBS w&nbsp;</td></tr><tr><td>9 ml termoaktywnej płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (Optima)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450</td><td>kąpiel wodna w temperaturze 60&deg; C przez 1 godzinę delikatnie&nbsp;</td></tr><tr><td>1 ml 100X penicyliny/streptomycyny</td><td>Hyklon</td><td>SV30010</td><td>wirowanie butelki co 10 min Porcja inaktywowanego termicznie FBS do probówek o pojemności 15 ml&nbsp; i przechowywać w temperaturze -20&deg;C.&nbsp; Wymieszaj pożywkę + FBS i filtr, sterylizuj za pomocą 0,22 &mikro; m wstępnie sterylizowane&nbsp; Jednorazowy filtr butelkowy&nbsp; Przed użyciem dodać penicylinę i streptomycynę</td></tr><tr><td>Woda w stawie (roztwór podstawowy)</td><td></td><td></td><td>1L roztworu podstawowego</td></tr><tr><td>12,5 g węglanu wapnia</td><td>Fisher Scientific</td><td>C64-500</td><td>Wymieszaj wszystkie sole w 1L ddH2O</td></tr><tr><td>1,25 g węglanu magnezu</td><td>Fisher Scientific</td><td>M27-500</td><td>Zwróć uwagę, że sole nie będą miały całkowicie&nbsp;</td></tr><tr><td>1,25 g&nbsp; chlorek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>rozpuszczony.&nbsp; Wstrząśnij energicznie, aby zawiesić&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>0,25 g&nbsp; chlorek potasu</td><td>sole Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>przed wykonaniem roztworu roboczego&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td><mocny>Woda w stawie (roztwór roboczy)</mocny></td><td></td><td></td><td><mocny>1,5 l roztworu</mocny></td></tr><tr><td>0,8 ml wody w stawie z roztworem podstawowym (wstrząsnąć przed użyciem) w&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td><td>Wymieszaj bulion z ddH2O</td></tr><tr><td>1500 ml ddH2O</td><td></td><td></td><td>Sterylizuj wodę w stawie przez autoklawowanie (powoli&nbsp; cykl)</td></tr><tr><td>1,5 ml 100X penicyliny/streptomycyny&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td>Dodaj penicylinę i streptomycynę przed użyciem</td></tr><tr><td><silny>roztwór soli fizjologicznej (1,2% NaCl)</td><td></td><td></td><td>1,5 l roztworu</td></tr><tr><td>18 g chlorku sodu w 1500 ml ddH2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>Autoklaw roztwór soli fizjologicznej do sterylizacji</td></tr><tr><td>1,5 ml 100X penicyliny/streptomycyny</td><td>Hyklon</td><td>SV30010</td><td>Dodaj penicylinę i streptomycynę przed użyciem</td></tr> <tr><td>Dodatkowe wyposażenie i materiał:&nbsp; Komora</td> do eutanazji myszy <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>7-L</td><td>Zgodnie z zatwierdzonym protokołem IACUC nr V001551</td>Myszy Taconic Biosciences Swiss-Webster, samica, 6-tygodnika, myszy&nbsp;<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> &nbsp;</td></tr><tr><td>Zbiornik CO2 i regulator</td><td></td><td></td><td>wolna od patogenów</td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka do hodowli tkankowej</td><td>TPP</td><td>92424</td><td></td></tr><tr><td>1-litrowe kolby</td><td></td><td></td><td></td>miarowe</tr><tr><td>Źródło światła (150 W)</td><td>Chiu Tech Corp</td><td>Model F0-150</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka, chłodzona, wahadłowa</td><td>Eppendorf</td><td>Model 5810R</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka butelki (250 ml)</td><td>Probówki</td> wirówkowe Nalgene <td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL, sterylne</td><td>Corning</td><td>430053</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne jednorazowe pipety transferowe&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>1371120</td><td></td></tr><tr><td>0,22 &mikro; M Wstępnie sterylizowany jednorazowy filtr butelkowy&nbsp;</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGPS05RE</td><td></td></tr><tr><td>Blender ze stali nierdzewnej</td><td>Waring Model komercyjny</td><td>51BL31</td><td></td></tr><tr><td>Kubek blendera, pojemność 100 ml</td><td>Waring Komercyjny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>odwrócony mikroskop złożony</td><td>Nikon Instruments&nbsp;</td><td>Zaćmienie TE300</td><td></td></tr></tbody></table>

masowa izolacja i hodowla in vitro wewnątrzmięczakowych stadiów ludzkiej krwi fluke schistosoma mansoni

Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

Przywry ludzkiej krwi, Schistosoma spp., mają złożony cykl życiowy, który obejmuje fazy rozwoju bezpłciowego i płciowego odpowiednio u ślimaka pośredniego i ssaka końcowego. Możliwość izolowania i podtrzymywania różnych etapów cyklu życiowego w warunkach hodowli in vitro znacznie ułatwiła badania nad komórkowymi, biochemicznymi i molekularnymi mechanizmami regulującymi wzrost, rozwój i interakcje pasożytów z gospodarzami. Przenoszenie schistosomatozy wymaga rozmnażania bezpłciowego i rozwoju wielu stadiów larwalnych w żywicielu ślimaka; od zakaźnego miracidium, przez pierwotne i wtórne sporocysty, aż do końcowego stadium cerkarialnego, które jest zakaźne dla ludzi. W niniejszej pracy przedstawiono krok po kroku protokół masowego wylęgu i izolacji Schistosoma mansoni miracidia z jaj uzyskanych z wątroby zakażonych myszy, a następnie ich wprowadzenia do hodowli in vitro. Oczekuje się, że szczegółowy protokół zachęci nowych badaczy do zaangażowania się i poszerzenia tej ważnej dziedziny badań nad schistosomami.

Zdecydowana większość miracidiów zostanie zazwyczaj zebrana podczas pierwszych dwóch „zbiorów”. Inkubacja wyizolowanych miracidiów w CBSS+ inicjuje proces transformacji miracidium w sporocystę (Rysunek 4A-C). W ciągu pierwszej godziny po przeniesieniu do studzienek hodowlanych zawierających CBSS+, większość miracidiów przestaje pływać (Rysunek 4A). Po 6 h hodowli miracidia znajdują się w procesie aktywnego zrzuca...

Ten artykuł opisuje protokół na dużą skalę izolacji aksenicznej i zbierania swobodnie pływających miracidii ludzkiej krwi przywry Schistosoma mansoni oraz ich późniejszego przetwarzania w celu wprowadzenia do hodowli in vitro.

Masowa izolacja i hodowla in vitro wewnątrzmięczakowych stadiów ludzkiej krwi Fluke Schistosoma mansoni

Human blood flukes, Schistosoma spp., have a complex life cycle that involves asexual and sexual developmental phases within a snail intermediate and ...

W tym filmie opisujemy szczegółowy protokół wylęgu i izolacji na dużą skalę swobodnie pływającego Schistosoma mansoni miracidia, a następnie wprowadzenia do hodowli in vitro. Schistosoma mansoni jest jednym z czterech głównych gatunków motyli krwi, które zarażają ponad dwieście milionów ludzi na całym świecie, powodując zaniedbaną chorobę tropikalną znaną jako schistosomatoza. Cykl życiowy schistosomów jest złożony, obejmując ślimaki jako żywicieli pośrednich i ssaki, w tym ludzi, jako żywicieli ostatecznych.Hodowla in vitro larw i dorosłych schistosomów stanowi nieocenione narzędzie do postępu badań nad kontrolą i eliminacją tej choroby pasożytniczej. W tym filmie, używając modelu mysiego do produkcji jaj S.mansoni zawierających stadium miracidial zakażone ślimakiem, ilustrujemy krok po kroku procedurę masowej izolacji miracidii wyklutych z jaj odzyskanych z wątroby i ich hodowli in vitro. W tej demonstracji pomagają mi Nathalie Dinguirard i Codie Heinemann.Poniżej znajduje się diagram przepływu pracy ilustrujący trzy główne kroki, które należy omówić w załączonym filmie. W pierwszym segmencie ilustrujemy przetwarzanie zakażonych wątrob. Korzystając z myszy zakażonych dorosłymi os

mass-isolation-vitro-cultivation-intramolluscan-stages-human-blood

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisujemy metodę in vitro hodowli schistosomul pasożytniczego płazińca Schistosoma mansoni, polegającą na pozyskiwaniu i transformacji zakaźnych cerkariów z pośredniego żywiciela – słodkowodnego ślimaka Biomphalaria glabrata.

Transformacja cerkarii i hodowla in vitro schistosomul Schistosoma mansoni

Schistosoma mansoni jaja są silnymi stymulatorami odpowiedzi immunologicznej typu Th2 (T helper type 2), charakterystycznej dla infekcji pasożytniczych, astmy i zapalenia alergicznego. Niniejszy protokół wykorzystuje wstrzykiwanie jaj S. mansoni w celu wywołania indukowanej cytokinami CD4 Th2 odpowiedzi zapalnej w płucach, charakteryzującej się tworzeniem ziarniaków wokół jaj, eozynofilią oraz alternatywną aktywacją makrofagów.

Wykorzystanie jaj Schistosoma mansoni jako modelu in vivo stanu zapalnego płuc wywołanego przez helminty

Opracowaliśmy model koinfekcji malarią i HIV-1 in vitro, aby zbadać wpływ Plasmodium falciparum na cykl replikacyjny HIV-1 w ludzkich pierwotnych makrofagach pochodzących z monocytów. Ten wszechstronny system można łatwo dostosować do innych typów komórek pierwotnych podatnych na zakażenie HIV-1.

Model koinfekcji In vitro do badania interakcji między Plasmodium falciparum a HIV-1 w ludzkich pierwotnych komórkach odpornościowych pochodzących z monocytów

Heligmosomoides polygyrus to mysi nicień o potężnych zdolnościach immunomodulacyjnych, które są bardzo podobne do tych z bardzo rozpowszechnionej infekcji ludzkim robakiem pasożytniczym. W tym miejscu opisujemy protokół długoterminowego utrzymania cyklu życiowego H. polygyrus.

Hodowla Heligmosomoides polygyrus: immunomodulującego pasożyta nicieni i wydzielanych przez niego produktów

Opisujemy tutaj najnowsze osiągnięcia w izolacji wirusów w celu scharakteryzowania nowych genotypów wirusa Faustowirusa, nowej linii gigantycznych wirusów związanej z asfarwirusem. Protokół ten może być stosowany do wysokoprzepustowej izolacji wirusów, zwłaszcza gigantycznych wirusów infekujących ameby.

Szybka strategia izolacji nowych faustowirusów z próbek środowiskowych przy użyciu Vermamoeba vermiformis

Opisujemy mysi model eksperymentalnej malarii mózgowej i pokazujemy, jak można śledzić stan zapalny i patologię mikrokrążenia in vivo za pomocą rezonansu magnetycznego.

In vivo (in vivo) Śledzenie rozwoju obrzęku i patologii mikrokrążenia w modelu eksperymentalnej malarii mózgowej z wykorzystaniem rezonansu magnetycznego

Tutaj prezentujemy protokół opisujący izolację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) w pożywce hodowlanej in vitro od dorosłego Schistosoma japonicum.

Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych dorosłego Schistosoma japonicum

Tutaj dostarczyliśmy metodę osiągnięcia stabilnej transfekcji pasożytów Eimeria kurczaka poprzez nukleofektyczne sporozoity lub merozoity drugiej generacji. Genetycznie zmodyfikowane pasożyty eimeriańskie wykazujące ekspresję heterologicznych genów antygenowych mogą być wykorzystywane jako nośniki szczepionek.

Nukleofekcja i rozmnażanie in vivo pasożytów Eimeria kurczaka

Używanie mielenia skupionej wiązki jonów do produkcji szklistych blaszek na siatce z zamrożonych próbek biologicznych do krioelektronowej tomografii.

Przygotowanie blaszek z szklistych próbek biologicznych przy użyciu dwuwiązkowego skaningowego mikroskopu elektronowego do kriotomografii elektronowej

Opisujemy technikę szybkiej transdukcji przejściowej w różnych stadiach rozwojowych Echinococcus granulosus przy użyciu wektorów lentiwirusowych trzeciej generacji.

Przejściowa transdukcja strobilowanych form Echinococcus granulosus

Tutaj opisujemy warunki hodowli in vitro, izolację i zwiększoną generację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z Echinococcus granulosus. Małe pojazdy elektryczne charakteryzowały się dynamicznym rozpraszaniem światła i transmisyjną mikroskopią elektronową. Wychwyt przez komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego i ich modulację fenotypową badano za pomocą mikroskopii konfokalnej i cytometrii przepływowej.

Izolacja i wychwyt komórek dendrytycznych małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Echinococcus granulosus

Poznaj protokół masowej izolacji miracidiów Schistosoma mansoni z jaj odzyskanych z wątrób myszy i ich hodowlę in vitro. Ta metoda wspiera badania nad schistosomatozą.

Masowa izolacja i hodowla in vitro wewnątrzmięczakowych stadiów ludzkiej krwi Fluke Schistosoma mansoni

Przeglądaj więcej filmów