Nierówne nanowzorce na bazie dendrymerów do lokalnej kontroli adhezji powierzchni: metoda kierowania różnicowaniem chondrogennym

Ogólnym celem tego protokołu jest uzyskanie nierównych nanowzorów na bazie dendrymerów na dużą skalę, które umożliwiają kontrolę lokalnej adhezji powierzchni w nanoskali. Opisana metoda jest stosowana do badania adhezji komórek i różnicowania chondrogennego. Nanowzory wypukłe metodą dendrymeru pozwalają na lokalną kontrolę adhezji powierzchni w nanoskali.

Do tworzenia nanowzorów wykorzystuje się polinanomery pierwszej generacji modyfikowane peptydem RGD za pomocą adhezji komórkowej. Charakteryzują się one techniką skanowania według mikroskopii i są stosowane w badaniach adhezji i różnicowania komórek. Następnie analizujemy wyniki badań mikroskopowych i technik barwienia immunologicznego.

Pierwszym krokiem jest przygotowanie podłoży roboczych. Niestandardowe kwadratowe szkiełka szklane są produkowane przez cięcie szkiełek mikroskopowych za pomocą frezu z diamentową końcówką. Twórz slajdy o wymiarach 1,25 na 1,25 centymetra.

Umyj szkiełka wodą dejonizowaną, a następnie 96% etanolem i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Przygotuj roztwór 2% PLLA, dodając 200 miligramów PLLA do rurki ciśnieniowej i dodaj 10 mililitrów dioksanu. Dodaj mieszadło i szczelnie zamknij tubkę.

Podgrzej mieszaninę w kąpieli glicerynowej w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 24 godziny, delikatnie mieszając. Umieścić szkiełka podstawowe w szklanej fiolce zawierającej roztwór PLLA na czystej, gorącej płycie w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Odczekaj co najmniej 10 minut, aby osiągnąć wymaganą temperaturę.

Wiruj szklane podłoża roztworem PLLA, umieszczając szkiełko szklane na stoliku wirowej powlekarki i uruchamiając wybrany program. Wybieramy 3 000 obr./min przez 30 sekund z przyspieszeniem 1 500 obr./min na sekundę z krokiem wstępnym 500 obr./min po pięciu sekundach przy 300 obr./min, aby zapewnić jednorodną powłokę. Szklanki z powłoką wirową można przechowywać w lodówce.

Przygotuj i poddaj sonikacji przez 10 minut roztwór A, 0,77 miligrama na mililitr roztworu dendrymeru RGD-Cys-D1 w wodzie dejonizowanej. Następnie przygotuj roztwory dendrymerów odpowiednio 10 do 2% i 10 do 5% roztworu B i C w wodzie dejonizowanej. Sonikować roztwór C przez 10 minut i przygotować następujące roztwory dendrymerów, D, E i F, również w wodzie dejonizowanej.

Roztwór D, 2,5x10 do 8% roztwór E, 10 do 8%i roztwór F, 4 10 do 9%Roztwory te należy przechowywać w lodówce do czasu użycia. Kończysz z lampą UV kabiny do hodowli komórkowych 18 okularów powlekanych PLLA przez 13 minut, aby były sterylne. Poddaj sonikacji każdy z roztworów dendrymeru przez 10 minut.

Przefiltrować roztwory dendrymera przez filtry o średnicy 0,22 mikrometra na szkiełkach szklanych pokrytych PLLA na 12-dołkowej płytce pod przepływem laminarnym w kabinie hodowli komórkowej. Pozostaw je w kabinie w temperaturze pokojowej na 16 godzin i umyj sterylną, dejonizowaną wodą. Dla dodatnich próbek kontrolnych należy przygotować sterylny roztwór fibronektyny w PBS i inkubować repliki z roztworem przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej w kabinie hodowli komórkowej.

Umyj je PBS. Pozostałe trzy podłoża pokryte PLLA posłużą jako repliki dla kontroli ujemnej. Topografia nanowzorca jest analizowana za pomocą AFM działającego w trybie stukania w powietrzu.

Zamontuj silikonowy wspornik o stałej sprężystości 40 niutonów na metr i częstotliwości rezonansowej 300 kiloherców w uchwycie końcówki AFM. Z substratem nanowzoru na stoliku AFM, zbliż się do powierzchni aż do kontaktu i wybierz nastawę amplitudy, która umożliwia obrazowanie konfiguracji dendrymerów bez wywierania nadmiernego nacisku na powierzchnię. Zarejestruj co najmniej trzy reprezentatywne obrazy o wymiarach 5 x 5 mikrometrów na podłoże z trzech niezależnych substratów na warunek.

Uzyskane obrazy należy przetwarzać za pomocą oprogramowania do przetwarzania AFM. Wybierz dendrymery na przetworzonych obrazach wysokości AFM i uzyskaj odpowiednie progi obrazu. Uzyskaj precyzję cząstek i użyj jej do uzyskania minimalnych odległości między cząstkami.

Przyjmijmy, że minimalne odległości między cząstkami w Z odpowiadają im dokładności cząstek, aby uzyskać zatyczki kontrolne prawdopodobieństwa dla minimalnych odległości między cząstkami. Dostosuj skalę kolorów wykresu, aby zobrazować obszary, w których lokalna gęstość powierzchni RGD jest mniejsza niż 70 nanometrów. Określ ilościowo obszar tych obszarów, zaznaczając je na obrazie i generując próg.

Używaj komercyjnej ludzkiej tkanki tłuszczowej pochodzącej z mezenchymalnych komórek macierzystych z wczesnych pasaży, najlepiej poniżej piątego roku życia. Hoduj je w temperaturze 37 stopni i 4,6% CO2 w pożywce do wzrostu komórek macierzystych, aż do osiągnięcia 70 lub 80% konfluencji. Zasiej komórki o gęstości komórek 3 000 komórek na centymetr kwadratowy na substratach w pożywce indukującej chondrogenezę.

Zmieniaj podłoże co trzy dni. Etap kondensacji można obserwować od pierwszego dnia w hodowli, a ich ewolucję można śledzić za pomocą optycznego mikroskopu kontrastu fazowego we wszystkich laboratoriach hodowlanych. Utrwal komórki 10% roztworem formaliny w temperaturze pokojowej przez 20 minut, a następnie umyj PBS.

Zablokuj grupy furaldehydowe, dodając 50-milimolowy roztwór chlorku amonu do PBS. Pozostaw na 20 minut w temperaturze pokojowej. Umyć PBS.

Przepuszczalność komórek 0,1% roztworem saponiny w blokującym roztworze 1% albuminy w PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi w roztworze blokującym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Umyć PBS.

Inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi w roztworze blokującym przez godzinę w temperaturze pokojowej, unikając ekspozycji na światło. Umyć PBS i wysuszyć. Nałożyć podłoże do mikroskopii na próbki i delikatnie przykryć je szkiełkami nakrywkowymi.

Zobrazuj próbki barwione immunologicznie dla ogniskowego białka adhezyjnego paxillin po jednym dniu indukcji chondrogennej oraz dla wczesnego markera chondrogennego, kolagenu II alfa I po pięciu dniach indukcji chondrogennej za pomocą pionowego mikroskopu konfokalnego. Zbieraj skrawki w reprezentatywnych odstępach, na przykład 0,5 lub 1 mikrometra. Przefiltruj obrazy wybarwione na obecność paxillin ze strefy podstawowej kondensatów komórkowych.

Usuń tło, wygładź i przekonwertuj na pliki ośmiobitowe. Uczyń je binarnymi, ustawiając empirycznie wybrany próg. Poddać działaniu co najmniej trzy kondensaty komórkowe na każdy warunek trzech niezależnych próbek.

Określ ilościowo wybrane obszary i wyraź je jako odpowiedni procent powierzchni podzielony przez liczbę jąder komórkowych na obrazie. Aby określić ilościowo barwienie kolagenu II alfa I, utwórz konfokalne projekcje Z. Przefiltruj wynikowe obrazy, usuń tło, wygładź i ustaw próg.

Określić ilościowo sumę przewidywanej powierzchni, maksymalnej powierzchni kolagenu II alfa I na próbkę w stosunku do powierzchni odpowiedniego kondensatu komórkowego. Można uzyskać różne konfiguracje nanowzorów, modyfikując początkowe stężenie dendrymerów w roztworze. Nanowzorce można wizualizować za pomocą analizy AFM i wykresów konturowych prawdopodobieństwa dla minimalnej skonstruowanej odległości między cząstkami.

Wyróżniają one obszary na powierzchni o największej lokalnej gęstości powierzchni RGD. Nanowzorce dendrymerowe są wykorzystywane w badaniach adhezji komórek. Adhezja wzrasta wraz z lokalną gęstością powierzchni RGD.

W przypadku kontroli dodatniej i powierzchni zawierających agregaty dendrymerowe korelacja ta jest tracona. Badano wpływ lokalnej gęstości powierzchniowej RGD na chondrogenezę, zarówno kondensacji, jak i różnicowaniu komórek sprzyjają nanowzorce o pośredniej adhezji. Podsumowując, nanowzór oparty na dendrymerach w metodzie trzech tabel, aby zająć się wpływem lokalnej gęstości RGD na odpowiedź komórki.

Nanowzorce skuteczniej utrzymują adhezję komórek na odpowiedniej jednorodnej powierzchni powszechnie stosowanej w hodowlach komórkowych. W eksperymentach różnicujących pośrednia adhezjalność komórek do podłoża sprzyjała mezenchymalnej kondensacji komórek i wczesnemu różnicowaniu chrondogennemu. Ze względu na łatwą modyfikację obwodowego wzrostu dendrymerów, opisana tutaj metoda może być dalej rozszerzona na wszystkie nadmierne warstwy reumatyczne mające wpływ na gęstość komórek.