Name: Test fagocytozy na obecność komórek apoptotycznych w zarodkach Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Poznaj test fagocytozy komórek apoptotycznych w zarodkach Drosophila. Ta metoda umożliwia precyzyjne pomiary in vivo i identyfikację genów kluczowych dla immunologii oraz biologii rozwoju.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Jesteśmy wdzięczni Kazowi Nagaosie i Akiko Shiratsuchi za ich rady.

1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Przygotowanie talerzy agarowych ze świeżym sokiem winogronowym
	<ol>
		<li>Dodaj 100 ml wody do 4,4 g agaru i podgrzej mieszaninę w kuchence mikrofalowej, aby rozpuścić agar.</li>
		<li>Do roztworu agaru dodać 80 ml świeżego soku winogronowego, 5 ml kwasu octowego i 5 ml etanolu.</li>
		<li>Wlać około 1,5 ml roztworu pipetą na każde szklane szkiełko i pozostawić do zestalenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie 6 cm talerzy z agarozą
	<ol>
		<li>Dodaj 50 ml wody do 0,5 g agarozy i podgrzej mieszaninę w kuchence mikrofalowej, aby rozpuścić agarozę.</li>
		<li>Wlać około 2,5 ml roztworu agarozy na 6 cm naczynie za pomocą pipety.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Etap 16 Pobieranie zarodków
<ol>
	<li>Zbierz dorosłe muchy i dodaj 200 samic i 200 samców do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Włóż talerz świeżego agaru z sokiem winogronowym na drożdżach do probówki o pojemności 50 ml i zamknij biszkoptem.</li>
	<li>Inkubować muchy w temperaturze 16 °C w świetle przez 2 - 3 dni. Zmieniaj talerz raz dziennie.</li>
	<li>Przenieś muchy do ciemności w temperaturze 25 °C na 1 godzinę.</li>
	<li>Wymień stary talerz na nowy bez drożdży. Pozwól muchom złożyć jaja przez 2 godziny.</li>
	<li>Zebrać płytkę i inkubować w temperaturze 16 °C przez 26 godzin.</li>
	<li>Zebrać zarodki z płytki za pomocą pędzla do 1 ml PBS zawierającego 0,2% (v/v) Triton X-100.</li>
	<li>Umyj zarodki dwukrotnie 1 ml PBS zawierającego 0,2% (v/v) Triton X-100.</li>
	<li>W celu usunięcia kosmówki należy dodać 1,2 ml roztworu podchlorynu sodu (2,2 - 3,4% Cl) do zarodków na 3 minuty.</li>
	<li>Umyj zarodki 4 razy 1 ml PBS zawierającego 0,2% (v/v) Triton X-100.</li>
	<li>Umieść zarodki na 6-centymetrowych talerzach z agarozą. Pobrać zarodki w stadium 16 pod mikroskopem zgodnie z opisem Roberts20. Zbierz około 50 zarodków do mikroprobówki Treff o pojemności 1,5 ml za pomocą mikropipety.</li>
</ol>
3. Przygotowanie komórek embrionalnych
<ol>
	<li>Umyj zarodki dwukrotnie 150 μl PBS.</li>
	<li>Homogenizować zarodki 30 razy w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml i mieszalniku granulek w obecności 200 μl kolagenazy (0,25% (w/v)) w PBS.</li>
	<li>Rozproszyć komórki embrionalne przez pipetowanie 10 razy i przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 1,5 ml. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 1 minutę w łaźni wodnej. Powtórz ten krok dwukrotnie.</li>
	<li>Dodać 800 μl PBS do zawiesiny komórek i odwirować przy 1400 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Usunąć supernatant i dodać do komórek 200 μl trypsyny (0,25% (w/v)) w PBS. Rozproszyć komórki embrionalne, pipetując 50 razy.</li>
	<li>Przefiltrować zawiesinę komórkową za pomocą sitka do komórek o wielkości 70 μm.</li>
	<li>W celu zatrzymania aktywności trypsyny należy dodać 40 μl inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej do zawiesiny przefiltrowanych komórek. Dodać 800 μl PBS i odwirować przy 1 400 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Usunąć supernatant, zawiesić wytrącone komórki w 200 μl PBS i odwirować w temperaturze 1400 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Usunąć supernatant i zawiesić wytrącone komórki w 30 μl PBS.</li>
	<li>Przygotować zawiesinę komórek zamontować na szkiełkach pokrytych aminopropylotrietoksysilanem i odczekać 10 - 15 minut, aż komórki przyczepią się do szkiełek.</li>
	<li>Usunąć pozostały roztwór ze szkiełek za pomocą pipety. Zamontuj 60 - 70 μl PBS zawierającego 4% (w/v) PFA (paraformaldehyd) na komórkach przez 10 - 15 minut w celu utrwalenia.</li>
	<li>Usuń roztwór utrwalający i umieść szkiełka szklane w PBS na dłużej niż 1 minutę.</li>
</ol>
4. Barwienie hemocytów
<ol>
	<li>Barwienie immunologiczne przeciwciałem anty-Croquemort
	<ol>
		<li>Szkiełka należy stopniowo moczyć w metanolu przez 10 min, w PBS zawierającym 0,2% (v/v) Triton X-100 przez 10 min, a następnie w PBS przez 10 min.</li>
		<li>Umieścić 20 μl 5% (v/v) surowicy całej świni w PBS zawierającym 0,2% (v/v) Triton X-100 na komórkach w celu zablokowania. Inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej przez 20 minut.</li>
		<li>Usuń roztwór ze szkiełek podstawowych i umieść 20 μl surowicy anty-Croquemort 19,21 (0,1% (v/v)) w PBS zawierającym 0,2% (v/v) Triton X-100 na komórkach. Szkiełka inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
		<li>Namocz szkiełka podstawowe w PBS zawierającym 0,2% (v/v) Triton X-100 przez 10 minut 5 razy.</li>
		<li>Namocz szkiełka podstawowe w PBS przez 10 minut.</li>
		<li>Umieścić 20 μl alkalicznej anty-szczurzej IgG znakowanej fosfatazą alkaliczną (0,5% (v/v)) w PBS zawierającym 0,2% (v/v) Triton X-100 i 5% (v/v) surowicy całej świni na komórkach w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
		<li>Namocz szkiełka podstawowe w PBS zawierającym 0,2% (v/v) Triton X-100 przez 10 minut 5 razy.</li>
		<li>Szkiełka podstawowe zanurzyć w buforze zawierającym 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl i 50 mM MgCl2 przez 10 minut.</li>
		<li>Zamontuj na komórkach roztwór substratu fosfatazy zawierający 0,23 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolilofosforanu (BCIP), 0,35 mg/ml nitro niebieskiego tetrazolu (NBT), 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl i 50 mM MgCl2</li>.
		<li>Obserwuj komórki pod mikroskopem pod kątem prawidłowego barwienia. Gdy w granulkach hemocytów pojawią się silne fioletowe sygnały, usuń roztwór substratu i zanurz szkiełka w buforze składającym się z 10 mM Tris-HCl, pH 8,5 i 1 mM EDTA. Zaleca się barwienie przez około 5 - 10 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie immunologiczne przeciwciałem anty-GFP (inna opcja barwienia hemocytów)
	<ol>
		<li>Szkiełka należy stopniowo moczyć w metanolu przez 10 min, PBS zawierające 0,2% (v/v) Triton X-100 przez 10 min, a PBS przez 10 min.</li>
		<li>Umieścić 20 μl 5% (v/v) surowicy całej świni w PBS zawierającym 0,2% (v/v) Triton X-100 na komórkach w celu zablokowania. Inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej przez 20 minut.</li>
		<li>Usunąć roztwór na szkiełkach i umieścić na komórkach 20 μl mysiego przeciwciała anty-GFP (1% (v/v))/PBS zawierającego 0,2% (v/v) Triton X-100. Inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej przez noc.</li>
		<li>Namocz szkiełka podstawowe w PBS zawierającym 0,2% (v/v) Triton X-100 przez 10 minut 5 razy.</li>
		<li>Namocz szkiełka podstawowe w PBS przez 10 minut.</li>
		<li>Umieścić 20 μl alkalicznej anty-mysiej IgG znakowanej fosfatazą alkaliczną (0,5% (v/v)) w PBS zawierającym 0,2% (v/v) Triton X-100 i 5% (v/v) surowicy całej świni na komórkach w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
		<li>Namocz szkiełka podstawowe w PBS zawierającym 0,2% (v/v) Triton X-100 przez 10 minut 5 razy.</li>
		<li>Szkiełka podstawowe należy namoczyć w buforze składającym się ze 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl i 50 mM MgCl2 przez 10 minut.</li>
		<li>Zamontuj na komórkach roztwór substratu fosfatazy zawierający 0,23 mg/ml BCIP, 0,35 mg/ml NBT, 100 mM Tris-HCl, pH 9,5, 100 mM NaCl i 50 mM MgCl2</li>.
		<li>Obserwuj komórki pod mikroskopem pod kątem prawidłowego barwienia. Gdy fioletowe sygnały pojawią się w całych hemocytach, usuń roztwór substratu i zanurz szkiełka w buforze składającym się z 10 mM Tris-HCl, pH 8,5 i 1 mM EDTA. Zaleca się barwienie przez około 10 - 15 minut.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Barwienie komórek apoptotycznych przez TUNEL
<ol>
	<li>Namocz szkiełka podstawowe w PBS przez 5 minut.</li>
	<li>Powtórz tę czynność z nowym PBS.</li>
	<li>Zamontuj bufor równowagi (patrz tabela materiałów) na komórkach na 10 minut.</li>
	<li>Wyjąć roztwór ze szkiełek podstawowych i umieścić 20 μl roztworu TdT zawierającego 5 μl końcowej deoksynukleotydylotransferazy i 15 μl buforu reakcyjnego na komórkach w temperaturze 37 °C na 1 godzinę.</li>
	<li>Usunąć roztwór ze szkiełek podstawowych i namoczyć szkiełka w buforze składającym się z 0,5 ml buforu STOP/Wash i 17 ml wody.</li>
	<li>Namocz szkiełka w PBS przez 5 minut 3 razy.</li>
	<li>Zamontuj 20 μl peroksydazy anty-digoxigeniny na komórkach w temperaturze pokojowej przez 30 minut.</li>
	<li>Namocz szkiełka szklane w PBS przez 5 minut 4 razy.</li>
	<li>Szkiełka podstawowe namoczyć w roztworze substratu peroksydazy składającym się z 30 ml 50 mM Tris-HCl o pH 7,5 zawierającym pełną mikroszpatułkę tetrahydrichlorku 3,3'-diaminobenzydyny (DAB) i 0,002% (v/v)H2O2 przez 30 s.</li>
	<li>Powtarzaj krok 5.9, aż komórki apoptotyczne zostaną zabarwione na brązowo. Namocz szkiełka szklane w wodzie, aby zatrzymać reakcję peroksydazy.</li>
	<li>Umieść komórki w wodzie do obserwacji.</li>
</ol>
6. Zmierz poziom fagocytozy komórek apoptotycznych
<ol>
	<li>Obserwuj próbki pod mikroskopem świetlnym w celu oceny poziomu fagocytozy. Policz komórki Croquemort-dodatnie lub komórki GFP-dodatnie jako hemocyty, komórki TUNEL-dodatnie jako komórki apoptotyczne i komórki podwójnie dodatnie jako hemocyty fagocytozujące.</li>
	<li>Indeks fagocytarny definiuje się jako liczbę komórek podwójnie dodatnich w stosunku do całkowitej liczby komórek Croquemort-dodatnich lub komórek GFP-dodatnich. Zaleca się obserwację ponad 300 hemocytów.</li>
</ol>

<ol><li>Danial, N. N., Korsmeyer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death%3A+critical+control+points%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell death: critical control points.</a> Cell. 116 (2), 205-219 (2004).</li>
<li>Vaux, D. L., Korsmeyer, S. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9988219">Cell death in development.</a> Cell. 96 (2), 245-254 (1999).</li>
<li>Savill, J., Fadok, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corpse+clearance+defines+the+meaning+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Corpse clearance defines the meaning of cell death.</a> Nature. 407 (6805), 784-788 (2000).</li>
<li>Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+apoptotic+cells%3A+getting+rid+of+the+corpses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses.</a> Mol Cell. 14 (3), 277-287 (2004).</li>
<li>Ravichandran, K. S., Lorenz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engulfment+of+apoptotic+cells%3A+signals+for+a+good+meal%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Engulfment of apoptotic cells: signals for a good meal.</a> Nat Rev Immunol. 7 (12), 964-974 (2007).</li>
<li>Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beginnings+of+a+good+apoptotic+meal%3A+the+find-me+and+eat-me+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Beginnings of a good apoptotic meal: the find-me and eat-me signaling pathways.</a> Immunity. 35 (4), 445-455 (2011).</li>
<li>Nakanishi, Y., Nagaosa, K., Shiratsuchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytic+removal+of+cells+that+have+become+unwanted%3A+implications+for+animal+development+and+tissue+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Phagocytic removal of cells that have become unwanted: implications for animal development and tissue homeostasis.</a> Dev Growth Differ. 53 (2), 149-160 (2011).</li>
<li>Reddien, P. W., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+engulfment+process+of+programmed+cell+death+in+caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The engulfment process of programmed cell death in caenorhabditis elegans.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 193-221 (2004).</li>
<li>Hedgecock, E. M., Sulston, J. E., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+affecting+programmed+cell+deaths+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mutations affecting programmed cell deaths in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Science. 220 (4603), 1277-1279 (1983).</li>
<li>Ellis, R. E., Jacobson, D. M., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+required+for+the+engulfment+of+cell+corpses+during+programmed+cell+death+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genes required for the engulfment of cell corpses during programmed cell death in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 129 (1), 79-94 (1991).</li>
<li>Gumienny, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CED-12%2FELMO%2C+a+novel+member+of+the+CrkII%2FDock180%2FRac+pathway%2C+is+required+for+phagocytosis+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CED-12/ELMO, a novel member of the CrkII/Dock180/Rac pathway, is required for phagocytosis and cell migration.</a> Cell. 107 (1), 27-41 (2001).</li>
<li>Hsu, T. Y., Wu, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engulfment+of+apoptotic+cells+in+C.+elegans+is+mediated+by+integrin+alpha%2FSRC+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Engulfment of apoptotic cells in C. elegans is mediated by integrin alpha/SRC signaling.</a> Curr Biol. 20 (6), 477-486 (2010).</li>
<li>Hanayama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+factor+that+links+apoptotic+cells+to+phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of a factor that links apoptotic cells to phagocytes.</a> Nature. 417 (6885), 182-187 (2002).</li>
<li>Tepass, U., Fessler, L. I., Aziz, A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+origin+of+hemocytes+and+their+relationship+to+cell+death+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Embryonic origin of hemocytes and their relationship to cell death in Drosophila.</a> Development. 120 (7), 1829-1837 (1994).</li>
<li>Gold, K. S., Bruckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+and+cellular+immunity+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophages and cellular immunity in Drosophila melanogaster.</a> Semin Immunol. 27, 357-368 (2015).</li>
<li>Abrams, J. M., White, K., Fessler, L. I., Steller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+cell+death+during+Drosophila+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Programmed cell death during Drosophila embryogenesis.</a> Development. 117 (1), 29-43 (1993).</li>
<li>Franc, N. C., Heitzler, P., Ezekowitz, R. A., White, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+croquemort+in+phagocytosis+of+apoptotic+cells+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement for croquemort in phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila.</a> Science. 284 (5422), 1991-1994 (1999).</li>
<li>Mukae, N., Yokoyama, H., Yokokura, T., Sakoyama, Y., Nagata, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+innate+immunity+in+Drosophila+by+endogenous+chromosomal+DNA+that+escaped+apoptotic+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Activation of the innate immunity in Drosophila by endogenous chromosomal DNA that escaped apoptotic degradation.</a> Genes Dev. 16 (20), 2662-2671 (2002).</li>
<li>Manaka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Draper-mediated+and+phosphatidylserine-independent+phagocytosis+of+apoptotic+cells+by+Drosophila+hemocytes%2Fmacrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Draper-mediated and phosphatidylserine-independent phagocytosis of apoptotic cells by Drosophila hemocytes/macrophages.</a> J Biol Chem. 279 (46), 48466-48476 (2004).</li>
<li>Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoberts%2C+DB+%22Drosophila%3A+A+Practical+Approach%22">Drosophila: A Practical Approach</a>. , IRL Press. Oxford. 3868-3878 (1998).</li>
<li>Kuraishi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretaporter%2C+a+Drosophila+protein+serving+as+a+ligand+for+Draper+in+the+phagocytosis+of+apoptotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+j%22%5BJournal%5D)">Pretaporter, a Drosophila protein serving as a ligand for Draper in the phagocytosis of apoptotic cells.</a> Embo j. 28 (24), 3868-3878 (2009).</li>
<li>Franc, N. C., Dimarcq, J. L., Lagueux, M., Hoffmann, J., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Croquemort%2C+a+novel+Drosophila+hemocyte%2Fmacrophage+receptor+that+recognizes+apoptotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Croquemort, a novel Drosophila hemocyte/macrophage receptor that recognizes apoptotic cells.</a> Immunity. 4 (5), 431-443 (1996).</li>
<li>Kuraishi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+calreticulin+as+a+marker+for+phagocytosis+of+apoptotic+cells+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of calreticulin as a marker for phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila.</a> Exp Cell Res. 313 (3), 500-510 (2007).</li>
<li>Nagaosa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+betanu-mediated+phagocytosis+of+apoptotic+cells+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Integrin betanu-mediated phagocytosis of apoptotic cells in Drosophila embryos.</a> J Biol Chem. 286 (29), 25770-25777 (2011).</li>
<li>Nonaka, S., Nagaosa, K., Mori, T., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+alphaPS3%2Fbetanu-mediated+phagocytosis+of+apoptotic+cells+and+bacteria+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Integrin alphaPS3/betanu-mediated phagocytosis of apoptotic cells and bacteria in Drosophila.</a> J Biol Chem. 288 (15), 10374-10380 (2013).</li>
<li>Fujita, Y., Nagaosa, K., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+NPxY+motif+in+Draper-mediated+apoptotic+cell+clearance+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Ther%22%5BJournal%5D)">Role of NPxY motif in Draper-mediated apoptotic cell clearance in Drosophila.</a> Drug Discov Ther. 6 (6), 291-297 (2012).</li>
<li>Bruckner, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PDGF%2FVEGF+receptor+controls+blood+cell+survival+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila.</a> Dev Cell. 7 (1), 73-84 (2004).</li>
<li>Nonaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+Pathway+for+Phagocyte+Priming+upon+Encounter+with+Apoptotic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Signaling Pathway for Phagocyte Priming upon Encounter with Apoptotic Cells.</a> J Biol Chem. 292 (19), 8059-8072 (2017).</li>
<li>Hanayama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+disease+and+impaired+uptake+of+apoptotic+cells+in+MFG-E8-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Autoimmune disease and impaired uptake of apoptotic cells in MFG-E8-deficient mice.</a> Science. 304 (5674), 1147-1150 (2004).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisaliśmy tutaj test fagocytozy z wykorzystaniem zarodków Drosophila . Wykorzystując rozproszone komórki embrionalne do ilościowego pomiaru fagocytozy, hemocyty, profesjonalne fagocyty Drosophila , są barwione immunologicznie pod kątem markera hemocytów Croquemort lub GFP sterowanego przez srpHemo, a komórki apoptotyczne są wykrywane przez TUNEL w tym protokole. Poziom fagocytozy jest wyrażony jako indeks fagocytarny poprzez zliczenie całkowitej liczby hemocytów i hemocytów fagocytozujących. Z...

U zwierząt metazoa, np. nicienia Caenorhabditis elegans, muszki owocowej Drosophila melanogaster oraz myszy i ludzi, duża liczba komórek ulega apoptozie podczas rozwoju, aby ukształtować swoje ciała, a w wieku dorosłym, aby utrzymać homeostazę1,2. Komórki apoptotyczne muszą być szybko usunięte, ponieważ wywołują stan zapalny w otaczających tkankach, uwalniając immunogenne materiały wewnątrzkomórkowe, jeśli nie zostaną całkowicie usunięte3. Aby ułatwić szybkie usunięcie, komórki apoptotyczne prezentują tak zwane sygnały eat-me, które są rozpoznawane przez receptory pochłaniania fagocytów i są eliminowane przez fagocytozę3,4,5,6. Tak więc fagocytoza odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu homeostazy gospodarza, a zatem ważne jest wyjaśnienie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw fagocytozy komórek apoptotycznych.
Mechanizmy odpowiedzialne za fagocytozę komórek apoptotycznych wydają się być ewolucyjnie zachowane wśród gatunków nicieni, much i myszy7. Obecnie dostępnych jest kilka testów fagocytozy do oceny pochłaniania komórek apoptotycznych u tych modelowych zwierząt. U C. elegans 131 komórek somatycznych ulega zaprogramowanej śmierci komórkowej podczas rozwoju, a zwłoki komórek są fagocytozowane przez sąsiednie komórki, które są nieprofesjonalnymi fagocytami8. Tak więc liczenie liczby pozostałych zwłok komórkowych u C. elegans wskazuje na poziom fagocytozy in vivo. Poszukując mutantów nicieni, które wykazują zwiększoną liczbę martwych komórek, zidentyfikowano i scharakteryzowano genetycznie kilka genów niezbędnych do fagocytozy9,10,11,12.
Testy fagocytozy ex vivo z pierwotnymi hodowlami fagocytów, zazwyczaj makrofagów, są często stosowane u myszy. Komórki apoptotyczne są przygotowywane przy użyciu linii komórkowych, takich jak komórki Jurkat, i są mieszane z pierwotnymi fagocytami. Po kilkugodzinnej inkubacji liczy się całkowitą liczbę fagocytów i fagocytów pochłaniających w celu oceny poziomu fagocytozy. Jako zaawansowaną modyfikację tej metody, grupa Nagaty opracowała test fagocytozy ex vivo z komórkami wykazującymi ekspresję opornej na kaspazę ICAD (inhibitora DNazy aktywowanej kaspazą), w której komórki apoptotyczne nie ulegają apoptotycznej fragmentacji DNA, ale DNA jest nadal rozszczepiane, gdy komórki są fagocytozowane. Kiedy komórki te są używane jako cele apoptotyczne w teście fagocytozy, tylko DNA pochłoniętych komórek apoptotycznych jest fragmentowane i barwione przez znakowanie końca nacięcia dUTP za pośrednictwem TdT (TUNEL). Dlatego poziom pochłonięcia komórek apoptotycznych mierzy się poprzez zliczanie sygnałów TUNEL w mieszaninie fagocytów i komórek apoptotycznych13.
U D. melanogaster, profesjonalne fagocyty zwane hemocytami, makrofagi Drosophila, są odpowiedzialne za fagocytozę komórek apoptotycznych14,15. Oprócz testów fagocytozy in vitro z liniami komórkowymi hodowli, dostępne są testy fagocytozy in vivo z całymi zarodkami Drosophila. Zarodki Drosophila są potężnym narzędziem do badania poziomu pochłaniania komórek apoptozy, ponieważ wiele komórek ulega apoptozie i jest fagocytozowanych przez hemocyty podczas rozwoju embrionalnego14,15,16. Przykładem testu fagocytozy in vivo jest metoda opracowana przez grupę Franka. W ich metodzie hemocyty są wykrywane przez barwienie immunologiczne peroksydazyny, markera hemocytu, komórki apoptotyczne są barwione za pomocą barwnika jądrowego, 7-aminoaktynomycyny D w całych zarodkach Drosophila, a liczba komórek podwójnie dodatnich jest liczona jako sygnał fagocytozy17. Inny przykład testu fagocytozy na zarodkach opiera się na opisanej powyżej koncepcji metody Nagaty; jednak fagocytozę in vivo ocenia się przy użyciu zarodków zmutowanych much dCAD (Drosophila caspase-activated DNase)18,19. Te testy fagocytozy in vivo są przydatne do bezpośredniej obserwacji fagocytozy in situ. Trudności wiążą się jednak z wykluczeniem ewentualnej stronniczości na etapie liczenia komórek fagocytozy, ponieważ ze względu na jego grubość trudno jest zaobserwować wszystkie fagocyty i komórki apoptotyczne w całych zarodkach.
Aby przezwyciężyć to ograniczenie, opracowaliśmy nowy test fagocytozy na zarodkach Drosophila. W naszej metodzie, aby łatwo policzyć hemocyty fagocytozy, całe zarodki są homogenizowane w celu przygotowania rozproszonych komórek embrionalnych. Fagocyty są wykrywane przez barwienie immunologiczne markera fagocytów, a komórki apoptotyczne są wykrywane przez TUNEL z tymi rozproszonymi komórkami embrionalnymi. Wykorzystanie rozproszonych komórek embrionalnych umożliwia nam pomiar poziomów fagocytozy in vivo, tak jakbyśmy przeprowadzili test fagocytozy in vitro, który precyzyjnie określa ilościowo poziom fagocytozy. Wszystkie genotypy much mogą być wykorzystane w tym teście, jeśli rozwiną się do stadium 16 zarodków20, stadium rozwoju, w którym apoptotyczne usuwanie komórek przez fagocytozę jest najobfitsze. Zaletą tej metody jest ilościowa ocena poziomu fagocytozy, a tym samym może przyczynić się do identyfikacji nowych cząsteczek biorących udział w fagocytozie komórek apoptotycznych in vivo.

<table><tbody><tr><td>surowica całej świni</td><td>MP Biomedicals</td><td>55993</td><td>Do blokowania</td></tr><tr><td>mikroprobówki Treff (łatwe dopasowanie)&nbsp; Dnaza, probówka bez rnazy, 1,5 ml</td><td>TreffLab</td><td>96. 4625. 9. 01</td><td>Do&nbsp; mieszalnik granulek homogenizacyjnych</td></tr><tr><td>&nbsp; 1,5 ml</td><td>TreffLab</td><td>96. 7339. 9. 03</td><td>Dla&nbsp; homogenizacja</td></tr><tr><td>Kolagenaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-0130</td><td>Do przygotowania komórek zarodkowych</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Thermo Fisher SCIENTIFIC</td><td>27250-018</td><td>Do przygotowania komórek zarodkowych</td></tr><tr><td>Kpl Anti-Rat IgG (H+L) Ab MSA, AP</td><td>KPL</td><td>475-1612</td><td>przeciwciało drugorzędowe dla hemocytów barwiących przeciwciałem</td></tr> <tr><td>anty-Croquemort5-bromo-4-chloro- 3-indolilo-fosforan</td><td>Roche</td><td>11383221001</td><td>BCIP, Do barwienia hemocytów</td></tr><tr><td>błękitu nitro tetrazolium</td><td>Roche</td><td>11383213001</td><td>NBT, Do barwienia hemocytów</td></tr><tr><td>Przeciwciało</td><td></td><td></td> anty-Croquemort <td>opisane wcześniej w Manaka et al., J. Biol. Chem., 279, 48466-48476</td></tr><tr><td>&nbsp; Anty-GFP od myszy IgG1&kappa; (klony 7.1 i 13.1)&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11814460001</td><td>Do barwienia hemocytów</td></tr><tr><td>Kozioł Anty-mysi koniugat IgG-AP</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6520</td><td>przeciwciało wtórne do barwienia hemocytów przeciwciałem anty-Croquemort</td></tr><tr><td>Apop Tag Peroksydaza in situ Zestaw do wykrywania apoptozy</td><td>Millipore</td><td>S7100</td><td>Do barwienia komórek apoptoitcznych. Ten zestaw zawiera bufor równoważący, bufor reakcyjny, bufor STOP/Wash, enzym TdT i peroksydazę anty-digoxigenin-peroksydazę.</td></tr><tr><td>3,3'-diaminobenzydyna tetrahydrichlorek</td><td>nacalai tesque</td><td>11009-41</td><td>DAB, Do barwienia komórek apoptoitcznych</td></tr><tr><td><silny>Tabela szczepów much</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Stock center</td><td>Stock ID</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>w1118</td><td></td><td></td><td>Muchy kontrolne, opisane w Freeman et al., Neuron, 38, 567-580</td></tr><tr><td>drpr&Delta; Mutant 5</td><td></td><td></td><td>drpr, opisany w Freeman et al., Neuron, 38, 567-580</td></tr><tr><td>Itgbn2</td><td></td><td></td><td>Itgbn, opisany w Devenport et al., Development, 131, 5405-5415</td></tr><tr><td>srpHemoGAL4 UAS-EGFP</td><td></td><td></td><td>opisany w Br&uuml; ckner et al., Dev. Cell., 7, 73-84</td></tr><tr><td>UAS-drpr-IR</td><td>VDRC</td> 4833-UAS-Itgbn-IR <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>NIG-fly</td><td>1762R-1</td><td>-</td></tr></tbody></table>

test fagocytozy na obecność komórek apoptotycznych w zarodkach drosophila

Phagocytosis Assay for Apoptotic Cells in Drosophila Embryos

Mechanizmy molekularne leżące u podstaw fagocytozy komórek apoptotycznych muszą być wyjaśnione bardziej szczegółowo ze względu na jej rolę w chorobach immunologicznych i zapalnych. W tym celu opracowaliśmy eksperymentalną metodę ilościowego badania fagocytozy przy użyciu muszki owocowej Drosophila, w której sieć genów kontrolujących reakcje pochłaniania jest ewolucyjnie zachowana u ssaków. W celu dokładnego wykrycia i zliczenia pochłaniających i odłączających się fagocytów przy użyciu całych zwierząt, zarodki Drosophila poddano homogenizacji w celu uzyskania rozproszonych komórek, w tym fagocytów i komórek apoptotycznych. Wykorzystanie rozproszonych komórek embrionalnych umożliwia nam pomiar poziomów fagocytozy in vivo, tak jakbyśmy wykonywali test fagocytozy in vitro, w którym można obserwować wszystkie fagocyty i komórki apoptotyczne w całych zarodkach i precyzyjnie określić ilościowo poziom fagocytozy. Potwierdziliśmy, że ta metoda odtwarza te z poprzednich badań, które zidentyfikowały geny wymagane do fagocytozy komórek apoptotycznych. Metoda ta pozwala na analizę pochłaniania martwych komórek, a w połączeniu z potężną genetyką Drosophila ujawni złożone reakcje fagocytarne składające się z migracji, rozpoznawania, pochłaniania i degradacji komórek apoptotycznych przez fagocyty.

Aby zbadać fagocytozę komórek apoptotycznych, Muszka owocówka zebrano zarodki w stadium rozwojowym 16, a następnie przygotowano z nich zawiesinę pojedynczych komórek. Hemocyty, Muszka owocówka makrofagi poddano barwieniu immunocytochemicznemu z użyciem markera hemocytów „Croquemort”17,22 przy użyciu specyficznego przeciwciała19,21a komórki apoptotyczne ba...

Opisujemy tutaj test fagocytozy z wykorzystaniem rozproszonych komórek embrionalnych Drosophila. Umożliwia nam łatwe i precyzyjne ilościowe określenie poziomów fagocytozy in vivo oraz identyfikację nowych cząsteczek wymaganych do fagocytozy komórek apoptotycznych.

Test fagocytozy na obecność komórek apoptotycznych w zarodkach Drosophila

The molecular mechanisms underlying the phagocytosis of apoptotic cells need to be elucidated in more detail because of its role in immune and ...

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar fagocytozy in vivo u Drosophila w celu oceny udziału określonych genów będących przedmiotem zainteresowania w apoptotycznym pochłanianiu komórek. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu immunologii i biologii rozwoju dotyczące mechanizmów związanych z pochłanianiem komórek apoptotycznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że komórki można łatwo i precyzyjnie mierzyć poziomy fagocytozy in vivo.Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię zaburzeń zapalnych i chorób autoimmunologicznych, ponieważ apoptoza komórek przez fagocytozę jest niezbędna do usunięcia niebezpiecznych komórek powodujących stan zapalny. Zacznij od dodania 200 dorosłych samic i 200 dorosłych samców muszek owocowych oraz talerza świeżego agaru z sokiem winogronowym na drożdżach do 50-mililitrowej stożkowej probówki. Zamknij rurkę nasadką z gąbki i wysiaduj muchy w świetle w temperaturze 16 stopni Celsjusza przez dwa do trzech dni.Pod koniec inkubacji przenieś muchy do 25 stopni Celsjusza w ciemności na godzinę i zastąp starą płytkę nową płytką bez drożdży. Pozwól muchom złożyć jaja przez dwie godziny. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 16 s

phagocytosis-assay-for-apoptotic-cells-in-drosophila-embryos

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Czynnikiem ograniczającym wykorzystanie oka dorosłych Drosophila w badaniach nad neurodegeneracją i biologią komórki jest trudność w obrazowaniu procesów wewnątrzkomórkowych. Opisujemy metodę preparowania pojedynczych ommatidiów w celu utworzenia właściwej pierwotnej hodowli komórek neuronalnych, która może być poddawana działaniu leków oraz zaawansowanemu obrazowaniu.

Disekcja i obrazowanie pojedynczego ommatidium Drosophila

Ten film demonstruje technikę barwienia immunologicznego, aby uwidocznić pochłanianie komórek apoptotycznych w homogenizowanych komórkach embrionalnych Drosophila melanogaster. Metoda ta zapewnia wgląd w fizjologię komórkową poprzez określenie zakresu apoptotycznego pochłaniania komórek.

Test fagocytozy: technika barwienia immunologicznego do wizualizacji pochłaniania komórek apoptotycznych w komórkach embrionalnych Drosophila melanogaster

W tym filmie demonstrujemy test efferocytozy do badania klirensu komórek apoptotycznych za pomocą mikroskopii konfokalnej. Efferocytoza to wieloetapowy proces, w którym komórki apoptotyczne są pochłaniane przez fagocyty i degradowane w pęcherzykach zwanych efferosomami. Protokół ten zapewnia metodę wizualizacji zinternalizowanych i niezinternalizowanych części poszczególnych komórek apoptotycznych oraz ilościowego określenia efferocytozy.

Test esterocytozy utrwalonych: metoda badania wychwytu efferocytarnego komórek apoptotycznych przez makrofagi przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej

Ten film demonstruje test in vivo przeznaczony do pomiaru fagocytozy bakteryjnej u dorosłych muszek Drosophila. Po wstrzyknięciu fluorescencyjnie znakowanych bakterii do brzucha dorosłych muszek, hemocyty związane z naczyniem grzbietowym angażują się w fagocytozę. Wprowadzenie barwnika błękitu trypanowego służy wygaszeniu fluorescencji emitowanej przez zewnątrzkomórkowe, niefagocytozowane bakterie. Ten proces wygaszania poprawia identyfikację bakterii fagocytozowanych, gdy są obserwowane pod...

Test in vivo do ilościowego określenia fagocytozy bakteryjnej u dorosłych much Drosophila

Tutaj opisujemy skuteczną metodę badania dynamiki apoptotycznego oczyszczania komórek in vivo. Metoda ta wykorzystuje żywe zarodki Drosophila jako potężny model do monitorowania fagocytozy komórek apoptotycznych przy użyciu specyficznego znakowania komórek apoptotycznych i fagocytów.

Obrazowanie na żywo apoptotycznego usuwania komórek podczas embriogenezy Drosophila

Tutaj opisujemy metody wykorzystujące mikroskopię konfokalną z wirującym dyskiem do obrazowania pojedynczych zdarzeń fagocytarnych przez makrofagi otrzewnowe rezydujące u myszy. Protokoły można rozszerzyć na inne komórki fagocytarne.

Poklatkowe obrazowanie 3D fagocytozy przez makrofagi myszy

Efferocytoza, fagocytarne usuwanie komórek apoptotycznych, jest niezbędna do utrzymania homeostazy i jest ułatwiana przez receptory i szlaki sygnałowe, które pozwalają na rozpoznawanie, wchłanianie i internalizację komórek apoptotycznych. W niniejszym artykule przedstawiamy protokół mikroskopii fluorescencyjnej do ilościowego oznaczania efferocytozy i aktywności efferocytarnych szlaków sygnałowych.

Kwantyfikacja efektozy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych komórek

Ten protokół opisuje test fagocytozy in vivo u dorosłych Drosophila melanogaster w celu ilościowego określenia rozpoznawania fagocytów i usuwania infekcji mikrobiologicznych.

Ocena komórkowej odpowiedzi immunologicznej muszki owocowej, Drosophila melanogaster, przy użyciu testu fagocytozy in vivo

Ten protokół opisuje test in vivo fagocytozy używany do oceny i ilościowego określenia zdolności młodych i starszych hemocytów Drosophila melanogaster do fagocytozy bakterii.

Ocena specyficznej dla wieku zdolności fagocytarnej dorosłych hemocytów Drosophila melanogaster za pomocą testu fagocytozy in vivo

Choroby neurodegeneracyjne są związane z rozregulowanymi funkcjami mikrogleju. W artykule przedstawiono test in vitro fagocytozy komórek nerwiaka zarodkowego za pomocą makrofagów iPSC. Odczyty z mikroskopii ilościowej opisano zarówno dla obrazowania poklatkowego żywych komórek, jak i obrazowania o wysokiej zawartości komórek stałych.

Test obrazowania ilościowego in vitro na fagocytozę martwych komórek nerwiaka zarodkowego za pomocą makrofagów iPSC

Poznaj test fagocytozy komórek apoptotycznych w zarodkach Drosophila. Ta metoda umożliwia precyzyjne pomiary in vivo i identyfikację genów kluczowych dla immunologii oraz biologii rozwoju.

Test fagocytozy na obecność komórek apoptotycznych w zarodkach Drosophila

Przeglądaj więcej filmów