Test fagocytozy na obecność komórek apoptotycznych w zarodkach Drosophila

Opisujemy tutaj test fagocytozy z wykorzystaniem rozproszonych komórek embrionalnych Drosophila. Umożliwia nam łatwe i precyzyjne ilościowe określenie poziomów fagocytozy in vivo oraz identyfikację nowych cząsteczek wymaganych do fagocytozy komórek apoptotycznych.

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar fagocytozy in vivo u Drosophila w celu oceny udziału określonych genów będących przedmiotem zainteresowania w apoptotycznym pochłanianiu komórek. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu immunologii i biologii rozwoju dotyczące mechanizmów związanych z pochłanianiem komórek apoptotycznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że komórki można łatwo i precyzyjnie mierzyć poziomy fagocytozy in vivo.

Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię zaburzeń zapalnych i chorób autoimmunologicznych, ponieważ apoptoza komórek przez fagocytozę jest niezbędna do usunięcia niebezpiecznych komórek powodujących stan zapalny. Zacznij od dodania 200 dorosłych samic i 200 dorosłych samców muszek owocowych oraz talerza świeżego agaru z sokiem winogronowym na drożdżach do 50-mililitrowej stożkowej probówki. Zamknij rurkę nasadką z gąbki i wysiaduj muchy w świetle w temperaturze 16 stopni Celsjusza przez dwa do trzech dni.

Pod koniec inkubacji przenieś muchy do 25 stopni Celsjusza w ciemności na godzinę i zastąp starą płytkę nową płytką bez drożdży. Pozwól muchom złożyć jaja przez dwie godziny. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 16 stopni Celsjusza przez 26 godzin.

Następnego dnia za pomocą pędzla przenieś zarodki do jednego mililitra PBS uzupełnionego 0,2% Triton X-100. Po dwóch płukaniach dodaj 1,2 mililitra roztworu podchlorynu sodu do zarodków, aby usunąć kosmówkę. Po trzech minutach umyj zarodki cztery razy w świeżym PBS plus Triton X-100.

Przenieś umyte zarodki na sześciocentymetrową płytkę agarozową i umieść płytkę pod mikroskopem preparacyjnym. Zidentyfikuj zarodki w stadium 16 za pomocą mikrokońcówki. Użyj mikropipety, aby przenieść około 50 zarodków w stadium 16 do mikroprobówki o pojemności 1,5 mililitra.

Aby wyizolować komórki embrionalne, najpierw umyj zarodki dwa razy 150 mikrolitrami PBS. Przenieś zarodki do nowej mikroprobówki o pojemności 1,5 mililitra. Następnie dodaj 200 mikrolitrów kolagenazy i homogenizuj zarodki 30 razy za pomocą mieszalnika do peletów.

Pod koniec homogenizacji należy 10 razy rozcierać komórki embrionalne i przenieść zawiesinę komórkową do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną minutę. Następnie rozcieraj komórki jeszcze 10 razy i włóż je z powrotem do inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza na kolejną minutę.

Pod koniec drugiej inkubacji dodać 800 mikrolitrów PBS do komórek i zebrać komórki przez odwirowanie. Ponownie zawiesić osad w 200 mikrolitrach trypsyny przed przefiltrowaniem zawiesiny komórkowej przez sitko komórkowe o średnicy 70 mikronów. Zatrzymaj aktywność enzymatyczną za pomocą 40 mikrolitrów inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej w 800 mikrolitrach PBS i zbierz komórki przez odwirowanie.

Ponownie zawiesić wytrącone komórki w 200 mikrolitrach świeżego PBS i zebrać komórki za pomocą kolejnego wirowania. Zawiesić osad w 30 mikrolitrach PBS i zamontować komórki na szkiełku pokrytym aminopropylotrietoksysilanem. Po przyczepieniu się komórek użyj pipety, aby usunąć nadmiar PBS ze szkiełka i przymocuj komórki za pomocą 60 do 70 mikrolitrów 4% paraformaldehydu.

Po 10 do 15 minutach usuń utrwalacz i myj komórki w PBS przez jedną minutę. Aby wybarwić komórki przeciwciałem anty-Croquemort, najpierw seryjnie zanurz szkiełko w metanolu, następnie PBS uzupełniony 0,2% Triton X-100, a następnie sam PBS. Następnie zablokuj niespecyficzne wiązanie za pomocą 20 mikrolitrów 5% surowicy całej świni w PBS plus 0,2% Triton X-100 przez 20 minut w temperaturze pokojowej.

Usuń nadmiar roztworu blokującego i oznacz komórki 20 mikrolitrami surowicy anty-Croquemort w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego ranka umyj szkiełko w PBS plus Triton X-100 przez pięć 10-minutowych inkubacji. Po ostatnim praniu płucz szkiełko w PBS przez 10 minut.

Następnie oznacz komórki 20 mikrolitrami anty-szczurzej IgG znakowanej fosfatazą alkaliczną w temperaturze pokojowej przez godzinę. Pod koniec inkubacji przemyć szkiełko pięć razy w PBS plus Triton X-100, jak pokazano, a następnie zanurzyć się w roztworze buforowym przez 10 minut. Następnie oznacz komórki roztworem substratu fosfatazy i obserwuj komórki pod mikroskopem świetlnym.

Gdy w granulkach hemocytu pojawią się silne fioletowe sygnały, należy usunąć nadmiar substratu i zanurzyć szkiełko w buforze uzupełnionym EDTA na pięć do 10 minut. Pod koniec inkubacji przepłukać komórki dwoma pięciominutowymi płukaniami PBS i traktować je buforem równowagi przez 10 minut. Po usunięciu roztworu oznacz komórki 20 mikrolitrami końcowego roztworu transferazy deoksynukleotydylotransferazy w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną godzinę.

Następnie wyjmij roztwór ze szkiełka i namocz komórki w 0,5 mililitra buforu do przemywania w 17 mililitrach wody przez 10 minut. Następnie przepłucz komórki trzema pięciominutowymi płukaniami PBS i oznacz je 20 mikrolitrami peroksydazy anty-digoksygeninowej przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji umyj komórki czterokrotnie w PBS, jak pokazano, i zanurz szkiełko w substracie peroksydazy przez 30 sekund, aż komórki apoptozy staną się brązowe.

Po uzyskaniu optymalnego zabarwienia namocz szkiełko w wodzie, aby zatrzymać reakcję peroksydazy. Na tych obrazach makrofagi Drosophila zwane hemocytami zostały wybarwione pod kątem markera hemocytu Croquemort oraz obecności fagocytozowanych komórek apoptotycznych za pomocą TUNEL w rozproszonych komórkach embrionalnych, jak właśnie wykazano. Komórki Croquemort dodatnie wykazują fioletowe sygnały w małych ziarnistościach swoich komórek, podczas gdy komórki dodatnie TUNEL wykazywały brązowy sygnał w całych ciałach.

Alternatywnie, hemocyty można wybarwić przeciwciałem anty-GFP, które barwi cały hemocyt, a nie tylko granulki. W tym eksperymencie przeanalizowano stosunek hemocytów fagocytozujących do całkowitych hemocytów w zarodkach typu dzikiego lub pojedynczych zmutowanych, wykazując, że indeks fagocytarny był niższy w obu pojedynczych zmutowanych szczepach niż u much typu dzikiego, podczas gdy całkowita liczba hemocytów i komórek apoptotycznych była podobna, co wskazuje na zapotrzebowanie zmutowanych genów na pochłonięcie komórek apoptotycznych. Nokaut RNAi pojedynczych genów również zmniejsza indeks fagocytarny, podczas gdy całkowita liczba hemocytów i komórek apoptotycznych pozostała porównywalna, co dodatkowo podkreśla udział badanych receptorów fagocytozy w fagocytozie za pośrednictwem komórek apoptotycznych.

Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w około 15 godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Próbując tej procedury, należy pamiętać, aby unikać nadmiernego markera hemocytu i barwienia TUNEL w celu optymalnej oceny zdolności fagocytotycznych komórek. Po tej procedurze można przeprowadzić test fagocytozy in situ wszystkich zarodków Drosophila, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące miejsca pochłonięcia lub rozmieszczenia hemocytów.

Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny immunologii do zbadania mechanizmów pochłaniania komórek apoptotycznych u Drosophila. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć fagocytozę in vivo w zarodkach Drosophila.