Test konwersji wywołany wstrząsem w czasie rzeczywistym do wykrywania prionów CWD w materiale kałowym
29 września 2017
Tutaj prezentujemy protokół opisujący prostą, szybką i efektywną technikę wzmacniania prionów, metodę konwersji indukowanej wstrząsami w czasie rzeczywistym (RT-QuIC).
Ogólnym celem tego protokołu do oznaczania konwersji wywołanej wstrząsem w czasie rzeczywistym jest umożliwienie czułego wykrywania prionów przewlekłej choroby wyniszczającej w próbkach kału jeleniowatych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad CWD, takie jak to, kiedy zakażone priony CWD jeleniowatych znajdują się w kale. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest specyficzna, czuła i umożliwia wysoką przepustowość próbek.
Procedurę zademonstruje Ginny Cheng, laborantka z mojego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj jeden gram materiału kałowego do probówki zawierającej 10 mililitrów buforu ekstraktu z kału. Używając dysocjatora z zaprogramowanym programem dla białek, homogenizuj granulki kału przez jedną minutę w temperaturze pokojowej.
Powtórz to dwa do trzech razy, aż próbki kału zostaną całkowicie zhomogenizowane. Następnie użyj parafilmu, aby uszczelnić probówki i umieść je na platformie kołyszącej lub wytrząsarce obrotowej na godzinną inkubację w temperaturze pokojowej. Następnie odwirować przy 18 000 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.
Zebrać supernatanty i podzielić je na probówki o pojemności 1,5 mililitra. Przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będzie gotowy do użycia. Aby rozpocząć metodę wytrącania kwasu fosfowolframowego, dodaj 250 mikrolitrów sarkozylu do jednego mililitra ekstraktu z białka kałowego.
Za pomocą parafilmu uszczelnij rurkę. Umieścić probówkę w mieszalniku termicznym i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, stale wstrząsając przy 1 400 obr./min. Następnie dodać roztwór podstawowy zawierający 10% kwas fosforanowo-wolframowy sodu i 170 milimolowy chlorek magnezu tak, aby końcowe stężenie kwasu fosforowo-wolframowego sodu w próbkach wynosiło 3%Przenieść próbki do mieszalnika termicznego i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny przy ciągłym wstrząsaniu przy 400 obr./min.
Następnie odwirować w temperaturze 15 800 g przez 30 minut w temperaturze 14 stopni Celsjusza. Ostrożnie usunąć supernatanty i umyć granulki, umieszczając je ponownie w buforze do mycia. Następnie odwirować w temperaturze 15 800 g przez 15 minut w temperaturze 14 stopni Celsjusza.
Ostrożnie usunąć supernatanty i ponownie zawiesić granulki w 100 mikrolitrach buforu rozcieńczającego RT-QuIC. Próbki poddane działaniu środka należy przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do momentu, gdy będą gotowe do przeprowadzenia testu RT-QuIC. Na początek dodaj 0,032 grama tioflawiny T do 10 mililitrów podwójnie destylowanej wody, aby przygotować świeży 10-milimolowy roztwór podstawowy tioflawiny T.
Następnie użyj podwójnie destylowanej wody, aby rozcieńczyć roztwór podstawowy od 1 do 10, co daje końcowe stężenie jednego milimolowego tioflawiny T. Za pomocą strzykawki wyposażonej w filtr dyskowy Acro o średnicy 0,2 mikrometra, przefiltruj jeden milimolowy roztwór tioflawiny T. Następnie rozmrozić najbardziej rekombinowany substrat białka prionowego. Załaduj jednorazowo 500 mikrolitrów rekombinowanego substratu białka prionowego do 100-kilogramowych mikroprobówek z filtrem wykluczającym o wielkości daltona.
Wirować przy 14 000 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie przenieś wymyty substrat do sterylnej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będzie gotowy do użycia.
Następnie rozmrozić przechowywany bufor rozcieńczający RT-QuIC. Rozcieńczyć ziarno i przygotować roztwory podstawowe oraz mieszaninę reakcyjną RT-QuIC zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Za pomocą pipety z końcówką filtrującą wymieszać mieszaninę reakcyjną, pipetując w górę i w dół.
Wlej mieszaninę do 50-mililitrowego zbiornika do pipetowania. Za pomocą pipety wielokanałowej załaduj 98 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej RT-QuIC do każdej studzienki 96-dołkowej optycznej płytki dolnej. Do każdej reakcji dodaj dwa mikrolitry nierozcieńczonego lub 10-krotnie seryjnie rozcieńczonego ekstraktu z białka kałowego.
Następnie użyj taśmy uszczelniającej, aby uszczelnić płytkę. Inkubować w czytniku płytek w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 25 godzin z powtarzającymi się cyklami jednej minuty podwójnego wytrząsania orbitalnego przy 700 obr./min i jedną minutą odpoczynku przez cały czas inkubacji. W międzyczasie zdefiniuj ustawienia pomiaru fluorescencji zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
Po 25 godzinach wyjmij płytkę z czytnika płytek. Obracaj płytkę przy 3 000 g przez trzy minuty, aby uniknąć potencjalnego zanieczyszczenia między studzienkami. Następnie usuń uszczelkę z płyty.
Przygotować nową płytkę, dodając 90 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej RT-QuIC zawierającej świeży substrat i świeży barwnik fluorescencyjny tioflawiny T. Przenieś 10 mikrolitrów z każdego dołka pierwszej płytki na nowo przygotowaną płytkę 96-dołkową. Użyj taśmy uszczelniającej, aby uszczelnić nową płytę.
Po zdefiniowaniu ustawień pomiaru fluorescencji kontynuuj test przez dodatkowe 50 godzin. Odczytuj i dokumentuj sygnał fluorescencji tioflawiny T dla każdej studzienki co 15 minut. Następnie zbierz i wykreśl dane zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
W tym badaniu materiał kałowy od niezakażonych łosi lub mulaków jest homogenizowany w buforze ekstraktu z kału w celu uzyskania końcowego stężenia próbki 10% Niektóre homogenaty są następnie przetwarzane i 10-krotnie zagęszczane przez wytrącanie kwasu fosfowolframowego. Podczas gdy w oczyszczonych próbkach obserwuje się zmniejszenie spontanicznych konwersji, wszystkie próbki wykazały niskie sygnały fluorescencji w próbkach kału z dodatnim wynikiem CWD. Aby poprawić amplifikację prionów i zwiększyć czułość detekcji, włączono etap wymiany substratu.
Próbki, które przeszły wymianę substratu w ramach protokołu RT-QuIC, wykazują wzrost czułości i swoistości wykrywania, przy czym 14 z 18 próbek było dodatnich, a żadna z kontroli ujemnych nie została zarejestrowana jako fałszywie dodatnia. Po opanowaniu przygotowanie ekstraktu kałowego i stężenie PRP/SCRP można wykonać w ciągu około czterech godzin, a test RT-QuIC można skonfigurować w ciągu około 1/1-2 godzin, jeśli zostanie wykonany prawidłowo. Przystępując do zabiegu, należy pamiętać o filtrowaniu podłoża, ale nigdy nie należy go wirować.
Po procedurze można zastosować inne metody, takie jak western blotting, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak odporność proteaz na otrzymane produkty. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się badaniami nad prionami do badania obecności prionów u żywych zwierząt poprzez testowanie próbek kału. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować i skoncentrować PRP/SCRP z ekstraktów kałowych oraz jak wykonać zmodyfikowany test RT-QuIC, aby uzyskać czułe i specyficzne wykrywanie prionów.
Nie zapominaj, że praca z prionami może być niezwykle niebezpieczna i że ważne jest, aby nosić odpowiednie środki ochrony osobistej i pracować pod szafką bezpieczeństwa biologicznego podczas wykonywania zabiegu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół metody konwersji indukowanej wstrząsami w czasie rzeczywistym (RT-QuIC), która jest czułą techniką wykrywania prionów chronicznej wyniszczającej choroby (CWD) w próbkach kału jeleniowatych. Metoda ta została opracowana w celu udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące obecności prionów CWD w kale.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- neuronauka
- badania nad chorobami prionowymi
- zdrowie zwierząt
Wstęp
- Przewlekła wyniszczająca choroba (CWD) dotyka cervidów i budzi istotne obawy ekologiczne.
- Wykrywanie prionów w próbkach kału jest kluczowe dla zrozumienia transmisji choroby.
- RT-QuIC to nowatorska metoda, która zwiększa czułość i swoistość wykrywania prionów.
- Technika ta umożliwia wysokoprzepustową analizę próbek.
Cel badania
- Dostarczenie wiarygodnego protokołu wykrywania prionów CWD w odchodach.
- Ułatwienie badań nad czasem wydalania prionów u zakażonych jeleniowatych.
- Poprawa zrozumienia dynamiki CWD w populacjach dzikich zwierząt.
Zastosowane Metody
- Przygotowanie próbek kału z użyciem buforu do ekstrakcji kału.
- Homogenizacja kulek kałowych za pomocą dysocjatora.
- Zastosowanie testu RT-QuIC w celu wykrycia prionów.
- Prezentacja procedury przeprowadzona przez przeszkolonego technika laboratoryjnego.
Główne wyniki
- Metoda RT-QuIC skutecznie wykrywa priony CWD w próbkach kału.
- Protokół jest wydajny i umożliwia jednoczesną analizę wielu próbek.
- Wyniki wskazują, że można określić czas występowania prionów w kale.
- Metoda wykazuje wysoką swoistość i czułość w porównaniu z tradycyjnymi technikami.
Wnioski
- RT-QuIC jest cennym narzędziem w badaniach i monitorowaniu CWD.
- Protokół ten może zwiększyć zrozumienie dynamiki prionów u jeleniowatych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodzie w celu zbadania dróg transmisji prionów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wykrywanie wydalania prionów z materiału kałowego umożliwia nieinwazyjny nadzór nad chorobą wyniszczającą w populacjach dzikich zwierząt, wspierając strategie wczesnej interwencji. Test RT-QuIC stanowi wysokoprzepustową, swoistą i czułą metodę identyfikacji aktywności siewczej prionów, co jest kluczowe dla zrozumienia dynamiki transmisji i podejmowania decyzji w zakresie zwalczania choroby. Podejście to ogranicza zależność od inwazyjnego pobierania próbek i zwiększa skalowalność programów monitorowania na szeroką skalę w badaniach oraz w zastosowaniach dotyczących zdrowia dzikich zwierząt.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie aktywności inicjowania agregacji prionów jako biomarkera obecności choroby w etapach przedklinicznych i klinicznych.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację metod detekcji prionów z wykorzystaniem nieinwazyjnych matryc próbek.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe odczyty fluorescencji za pomocą tioflawiny T w celu monitorowania tworzenia się amyloidu w czasie rzeczywistym.
- Wartość operacyjna: Ułatwia standaryzację testu poprzez zestandaryzowane przygotowanie próbek, w tym homogenizację z użyciem detergentów oraz wytrącanie kwasem fosfotungstowym.
- Wartość naukowa: Poprawia czułość i swoistość poprzez wymianę substratu, co redukuje szum tła i zwiększa wykrywalność wyników prawdziwie dodatnich.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zapewnia istotny w kontekście choroby system do badania kinetyki wydalania prionów u przeżuwaczy z rodziny jeleniowatych, co wspiera dopasowanie translacyjnych biomarkerów.
- Wartość operacyjna: Umożliwia pobieranie próbek wzdłużnych w celu śledzenia pojawiania się i utrzymywania się prionów w kale na różnych etapach choroby.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesów odkrywczych – od weryfikacji hipotez we wczesnej fazie badań po przygotowanie testów do zastosowań w screeningu, szczególnie w przypadkach, gdy wymagane jest nieinwazyjne wykrywanie biomarkerów.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących czasu i częstotliwości wydalania prionów u zainfekowanych zwierząt.
- Przesiew: Zapewnia gotowość do analizy dzięki powtarzalnym etapom zagęszczania i oczyszczania próbek, które minimalizują obecność inhibitorów.
- Analityka: Generuje ilościowe sygnały fluorescencji Thioflawiny T, które umożliwiają porównanie aktywności zasiewania w różnych próbkach i warunkach.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez umożliwienie detekcji u żywych zwierząt, co ułatwia prowadzenie badań podłużnych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy uniwersalną platformę do detekcji prionów, która może zostać dostosowana do różnych rodzajów próbek i gatunków po odpowiedniej walidacji.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną wykrywania prionów poprzez redukcję wyników fałszywie ujemnych dzięki usuwaniu inhibitorów i wzmocnieniu sygnału.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i skalowalność dzięki standaryzowanym protokołom przetwarzania kału oraz detekcji z wykorzystaniem płytek 96-dołkowych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu działań w programach nadzoru poprzez zapewnienie wiarygodnej możliwości wczesnego wykrywania.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację wysiłków badawczych z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o wzorce wydalania prionów w populacjach docelowych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w pracy z prionami, stosowania zasad poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2+ oraz interpretacji wyników testów fluorescencyjnych.
- Zależy od dostępu do czytników płytek z funkcją wytrząsania i kontroli temperatury, wirówek oraz filtrów do chromatografii wykluczania cząsteczkowego.
- Wymaga standaryzacji pobierania, przechowywania (-80°C) i wstępnego przygotowania próbek pomiędzy zespołami w celu zapewnienia spójności wyników.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania metody do różnych matryc kałowych, co może wymagać optymalizacji składu buforu i warunków wytrącania.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak potencjalna zmienność ilości inhibitorów w poszczególnych próbkach, co wymaga empirycznej walidacji etapów oczyszczania.
