Name: Test konwersji wywołany wstrząsem w czasie rzeczywistym do wykrywania prionów CWD w materiale kałowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Poznaj metodę RT-QuIC do wykrywania prionów CWD w materiale kałowym jeleniowatych. Ta technika umożliwia czułą i specyficzną detekcję prionów choroby chronicznego zmęczenia w próbkach kałowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Dr. Byronowi Caughey'owi (NIH Rocky Mountain Laboratories) za zapewnienie szkolenia i badania plazmidu ekspresji bakteryjnej PrP jeleniowatej. SG jest wspierany przez program Canada Research Chair. Dziękujemy, że SG otrzymuje fundusze na te badania od Genome Canada, Alberta Prion Research Institute oraz Alberta Agriculture and Forestry za pośrednictwem Genome Alberta i University of Calgary w celu wsparcia tych prac. Potwierdzamy grant badawczy przyznany przez Margaret Gunn Foundation for Animal Research.

1. RT-QuIC przy użyciu materiału kałowego
<ol>
	<li>Przygotowanie ekstraktów z kału jeleniowatych
	<ol>
		<li>Wykonaj homogenat kału, dodając 1 g materiału kałowego do 10 ml buforu ekstraktu z kału (20 mM fosforanu sodu, pH 7,1, 130 mM NaCl, 0,05% Tween 20, 1 mM PMSF i 1x kompletne inhibitory proteazy, wolne od EDTA), aby uzyskać końcowe stężenie 10% (w/v). Bufor homogenizacyjny może być przygotowany przed utylizacją i przechowywany w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Homogenizować granulki kału (1 g) i bufor (10 ml) w probówkach (np. probówkach gentleMACS M) za pomocą dysocjatora z wstępnie ustawionym programem producenta dla białek przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Powtórz ten krok dwa do trzech razy, aż próbki kału zostaną całkowicie zhomogenizowane w buforze.</li>
		<li>Uszczelnij probówki parafilmem i umieść je na platformie kołyszącej lub wytrząsarce obrotowej na 1 godzinę inkubacji w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odwirować probówki o stężeniu 18 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zebrać sklarowane nad osadem zawierające ekstrakty białkowe i rozdzielić je na probówki o pojemności 1,5 ml. Podwielokrotności mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C do dalszych zastosowań.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Stężenie PrPSc w ekstraktach z kału 
	UWAGA: W celu skoncentrowania prionów CWD w próbkach ekstraktu kału, poprawiając w ten sposób czułość wykrywania przez RT-QuIC, do protokołu dodaje się etap wytrącania białka.
	<ol>
		<li>Metoda wytrącania NaPTA</li>
		<li>Dodać 250 μl 10% (w/v) N-lauryl sarkozynianu (sarkozylu) do 1 ml ekstraktu z białka kałowego, aby uzyskać końcowe stężenie sarkozylu 2% (v/v).</li>
		<li>Szczelnie zamknąć probówki zawierające próbki parafilmem i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut przy ciągłym wytrząsaniu z prędkością 1 400 obr./min w termomieszalniku.</li>
		<li>Dostosować mieszaninę ekstraktu z białek kałowych i sarkozylu z roztworem podstawowym zawierającym 10% (m/v) kwasu fosfatungsowego sodu i 170 mM chlorku magnezu o pH 7,4, aby uzyskać końcowe stężenie 0,3% (w/v) kwasu fosfatungsowego sodu w próbkach.</li>
		<li>Inkubować próbki w temperaturze 37 °C przez 2 godziny, stale wstrząsając przy 400 obr./min.</li>
		<li>Odwirować próbki w temperaturze 14 °C przez 30 minut w temperaturze 15 800 x g. Ostrożnie usunąć supernatanty.</li>
		<li>Przemyć granulki, ponownie umieszczając je w buforze do przemywania (10 mM Tris-Cl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5% Triton-X 100, 10 mM EDTA, 0,5% deoksycholanu sodu (w/v) i 0,1% sarkozylu (w/v)).</li>
		<li>Odwirować próbki w temperaturze 14 °C przez 15 minut przy 15 800 x g. Ostrożnie usunąć supernatanty.</li>
		<li>Zawiesić granulki w 100 μl (1/10 pierwotnej objętości ekstraktu z białek kału) buforu rozcieńczającego RT-QuIC. 
		UWAGA: Bufor rozcieńczający RT-QuIC (20 mM fosforan sodu, pH 6,9, 130 mM NaCl, 0,1% SDS (w/v) i 1 X N2 suplement) przygotowuje się przed użyciem. Całkowita objętość 10 ml jest filtrowana przez filtr strzykawkowy acrodisc o średnicy 0,2 μm za pomocą strzykawki, a następnie przechowywana w temperaturze -20 °C do momentu użycia.</li>
		<li>Próbki poddane działaniu NaPTA należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu wykorzystania ich w teście RT-QuIC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test RT-QuIC
	<ol>
		<li>Przygotować świeży 10 mM roztwór podstawowy Th-T (0,032 g Th-T w 10 ml podwójnie destylowanegoH2O).</li>
		<li>Rozcieńczyć roztwór podstawowy Th-T w stosunku 1:10 w podwójnie destylowanymH2O, aby uzyskać końcowe stężenie Th-T wynoszące 1 mM, przefiltrować go przez filtr strzykawkowy akrotarczowy 0,2 μm za pomocą strzykawki.</li>
		<li>Rozmrozić rekombinowany substrat PrP (rPrP, aa 23-231) myszy (10 μg/ml na reakcję RT-QuIC) przechowywany w temperaturze -80 °C na lodzie.</li>
		<li>Załaduj jednorazowo 500 μl substratu rPrP do mikroprobówek z filtrem wykluczającym o wielkości 100 kDa i odwiruj przy 14 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (jedna probówka/filtr może być użyta do dwóch razy).</li>
		<li>Uwolniony substrat przenieść do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.</li>
		<li>Rozmrozić bufor rozcieńczający RT-QuIC przechowywany w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Rozcieńczyć nasiona (ekstrakt z białka kału) w buforze rozcieńczającym RT-QuIC: 
		Próbka nierozcieńczona: użyć nierozcieńczonego ekstraktu z białka kału 
		Rozcieńczony 2 x 10-1 
		Rozcieńczony 2 x 10-2 
		Rozcieńczony 2 x 10-3</li>
		<li>Przygotować roztwory podstawowe dla mieszaniny reakcyjnej RT-QuIC: 
		Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS): 5X 
		NaCl: 2 M roztwór podstawowy NaCl przygotowany w podwójnie destylowanymH2O. 
		EDTA: 100 mM roztwór podstawowy EDTA przygotowany w podwójnie destylowanymH2O.</li>
		<li>Przed użyciem wszystkich roztworów (krok 1.3.8) należy przefiltrować każdy roztwór oddzielnie przez filtr strzykawkowy acrodisc o średnicy 0,2 μm za pomocą strzykawki i utrzymywać je w sterylnej temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przygotować całkowitą objętość mieszaniny reakcyjnej RT-QuIC zgodnie z liczbą próbek (98 μl objętości reakcji na próbkę i cztery kontrpróby na próbkę), która ma być użyta, plus 10% tej objętości, aby upewnić się, że mieszanina jest wystarczająca do przeprowadzenia wszystkich reakcji.
		<ol>
			<li>Za pomocą probówki o pojemności 15 ml przygotować mieszaninę reakcyjną RT-QuIC (20 mM fosforanu sodu, pH 6,9, 300 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 μM Th-T, 10 μg/ml substratu rPrP i podwójnie destylowaną wodę w celu dostosowania końcowego stężenia rPrP w reakcji) przy użyciu roztworów podstawowych.</li>
			<li>Dobrze wymieszaj wszystkie roztwory, pipetując w górę i w dół za pomocą pipety z końcówką filtrującą. Unikaj w jak największym stopniu stosowania wiru.</li>
			<li>Wlej mieszaninę do jednorazowego zbiornika do pipetowania o pojemności 50 ml.</li>
			<li>Za pomocą pipety wielokanałowej załadować 98 μl mieszaniny reakcyjnej RT-QuIC do każdej studzienki 96-dołkowej optycznej płytki dennej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Do każdej reakcji RT-QuIC dodać 2 μl nierozcieńczonego lub 10-krotnie seryjnie rozcieńczonego ekstraktu z białek kału. Przetestuj każdą próbkę w czterech powtórzeniach. 
		UWAGA: W każdym eksperymencie seryjne rozcieńczenia próbek kału (od nierozcieńczonych do 2 x 10-3) od zwierząt z ujemnym CWD i zweryfikowanych CWD są stosowane odpowiednio jako kontrole negatywne i pozytywne.</li>
		<li>Uszczelnić płytkę taśmą uszczelniającą przed inkubacją w czytniku płytek w temperaturze 42 °C przez 25 godzin, z powtarzającymi się cyklami 1 minuty, podwójnym wytrząsaniem orbitalnym (700 obr./min) i 1 minutą odpoczynku przez cały czas inkubacji.</li>
		<li>Zdefiniuj ustawienia pomiaru fluorescencji: 
		Wzbudzenie: 450 nm 
		Emisja: 480 nm 
		Odczyt od dołu, liczba błysków: 20 
		Wzmocnienie ręczne: 1000 (w zależności od maszyny) 
		Czas integracji: 20 μs</li>
		<li>Po upływie 25 godzin wyjąć płytkę z czytnika płytek.</li>
		<li>Obracaj płytkę przy 3 000 x g przez 3 minuty, aby uniknąć potencjalnego zanieczyszczenia między studzienkami.</li>
		<li>Usuń uszczelkę z płyty.</li>
		<li>Przygotować nową 96-dołkową płytkę, dodając 90 μl mieszaniny reakcyjnej RT-QuIC zawierającej świeży substrat i świeży barwnik fluorescencyjny Th-T, jak opisano w sekcjach 1.3.1-1.3.6.</li>
		<li>Przenieść 10 μl z każdego dołka pierwszej płytki do nowo przygotowanej płytki 96-dołkowej.</li>
		<li>Zapieczętować nową płytkę i kontynuować test RT-QuIC przez dodatkowe 50 godzin, postępując zgodnie z krokami opisanymi w kroku 1.3.13. Ten dodatkowy krok trwający 50 godzin sprawi, że całkowity czas reakcji wyniesie 75 h. 
		UWAGA: Wszystkie procedury testu RT-QuIC są wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
		<li>Zbierz dane.
		<ol>
			<li>Odczytuj i dokumentuj sygnał fluorescencji Th-T każdej studzienki co 15 minut.</li>
			<li>Zbierz dane z całkowitych cykli za pomocą oprogramowania do analizy danych i przenieś je do arkusza kalkulacyjnego ze średnią czterokrotnych reakcji.</li>
			<li>Wykreśl średnie dane. Oś x odpowiada czasowi reakcji RT-QuIC (h), a oś y odpowiada względnym jednostkom fluorescencji (RFU). Każda krzywa odpowiada rozcieńczeniu znanej próbki.</li>
			<li>W każdym eksperymencie należy wyznaczyć próg, obliczając najwyższe średnie wartości kontroli ujemnej plus 5 odchyleń standardowych, zgodnie z opisem w aktualnie opublikowanej literaturze 41. 
			UWAGA: Wszystkie kontrpróby, które przekroczyły zdefiniowany próg, uznaje się za dodatnie. Jeżeli co najmniej dwie z czterech kontrprób przekroczą próg, próbkę uznaje się za dodatnią.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Oczyszczanie rekombinowanego białka prionowego (rPrP)
<ol>
	<li>Wzrost populacji bakteryjnej i ekspresja rPrP 
	UWAGA: Do przygotowania rPrP użyto szczepu Escherichia coli (E. coli) Rosetta (DE3) przekształconego za pomocą wektora pET-24 kodującego mysi PrP (reszty 23-231).
	<ol>
		<li>Rozmrozić zapas glicerolu Rosetty (DE3) przekształcony za pomocą pEt-24 mPrP(23-231) na lodzie.</li>
		<li>Smuga LB (Luria Bertani) z końcowym stężeniem kanamycyny 50 μg/ml i inkubować przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Upewnij się, że płytki są odwrócone do góry nogami, aby uniknąć kondensacji wilgoci w pożywkach stałych zawierających bakterie. Przygotuj dwie płytki, aby upewnić się, że co najmniej jedna z nich rośnie.</li>
		<li>Przygotuj 1 l LB i sterylizuj go w autoklawie, aby był sterylny.</li>
		<li>Uzupełnij 1 l sterylnej pożywki LB 1 ml kanamycyny (50 mg/ml) i 1 ml chloramfenikolu (34 mg/ml).</li>
		<li>Wybierz jedną kolonię z każdej płytki, używając jednorazowej pętli inokulacyjnej, aby zaszczepić 3 ml pożywki LB zawierającej kanamycynę i chloramfenikol.</li>
		<li>Umieścić minikultury w inkubatorze w temperaturze 37 °C ze stałym wytrząsaniem przy 225 obr./min przez 5-6 godzin.</li>
		<li>Dodaj mini-kultury do reszty oryginalnego 1 l pożywki LB razem z Express Autoinduction System 1 w celu indukcji ekspresji białka.</li>
		<li>Umieścić kulturę w kolbie o pojemności 2 l lub większej w inkubatorze w temperaturze 37 °C z ciągłym wytrząsaniem przy 200 obr./min przez 20-24 godziny.</li>
		<li>Podziel 1 l kultury na 4 x 250 ml probówek wirówkowych.</li>
		<li>Wirować probówki zawierające kulturę o masie 3 750 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odrzucić supernatant i zebrać granulki bakteryjne w probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml, a następnie zamrozić je w temperaturze -80 °C do czasu dalszego przetwarzania. Powstałe granulki ważyły od 3 do 4 g, co zapewnia dobry plon białka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie organu integracyjnego
	<ol>
		<li>Rozmrażać zamrożone granulki (3-4 g) w temperaturze 37 °C przez kilka minut.</li>
		<li>Zamrozić granulat jeszcze raz na 10 minut w temperaturze -80 °C i ponownie rozmrozić. Powtórz ten krok zamrażania i rozmrażania jeszcze dwa razy.</li>
		<li>Zawiesić osad bakteryjny w odczynniku do lizy 1X (np. BugBuster Master Mix), dokładnie pipetując. Użyj 5 ml odczynnika na 1 g osadu bakteryjnego. Upewnij się, że mieszanka jest całkowicie homogenizowana.</li>
		<li>Inkubować homogenat na bujaku przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odwirować homogenat przy 16 000 x g przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Wyrzuć supernatanty, ostrożnie je wylewając.</li>
		<li>Homogenizować granulki w tej samej objętości odczynnika do lizy 1X, jak użyto w poprzednim kroku.</li>
		<li>Inkubować homogenat przez 15 minut na bujaku w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodaj wystarczającą objętość odczynnika do lizy w proporcji 1:10 (0,1x), aby uzyskać całkowitą objętość homogenatu 40 ml. Wymieszaj przez odwrócenie, aby upewnić się, że dobrze się homogenizuje.</li>
		<li>Odwirować homogenat o stężeniu 7 900 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Wyrzucić supernatant, ostrożnie go wlewając.</li>
		<li>Zawiesić osad w 40 ml 0,1x odczynnika do lizy</li>.
		<li>Odwirować homogenat przy 16 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Sklarowany osad należy ostrożnie wyrzucić, wlewając go i przechowywać osad zawierający inkluzje w temperaturze -20 °C do czasu dalszego przetwarzania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie białek
	<ol>
		<li>Rozmrozić inkluzje w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Rozpuścić rozmrożone ciała inkluzyjne w 14 ml 8 M chlorowodorku guanidyny (38 g chlorowodorku guanidyny w 0,1 M NaPO4 pH 8,0 i napełnić zawiesinęH2Odo 50 ml; nie dostosowywać pH w roztworze końcowym) w celu rozpuszczenia białek.</li>
		<li>Upewnij się, że dobrze homogenizujesz, pipetując w górę i w dół.</li>
		<li>Inkubować lizat na bujaku w temperaturze pokojowej przez 50 minut.</li>
		<li>Przygotuj 18 g kulek z żywicy Ni-NTA (18 g na 3 do 4 g granulek bakteryjnych); przepłucz je 100 ml wody za pomocą próżni i 100 ml filtra butelkowego o pojemności 0,22 μm.
		<ol>
			<li>Umieścić 18 g kulek żywicy Ni-NTA w probówce o pojemności 50 ml i dodać wystarczającą objętość buforu denaturującego (100 mM fosforanu sodu, 10 mM Tris, pH 8,0, 6 M chlorowodorku guanidyny, pH 8), aby uzyskać ostateczną objętość do 50 ml.</li>
			<li>Równowaga kulek w buforze denaturującym przez 50 minut na bujaczku w temperaturze pokojowej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Odwirować lizat inkluzji o stężeniu 16 000 x g przez 5 minut, aby usunąć nierozpuszczalne zanieczyszczenia.</li>
		<li>Dodać supernatant do zrównoważonych kulek i wyrzucić granulki.</li>
		<li>Umieść mieszankę na rockerze na 40 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić wiązanie białka z żywicą Ni-NTA. 
		UWAGA: Kulki chelatu niklu służą do oczyszczania PrP przez jego powinowactwo do niklu. Bogaty w histydynę N-końcowy region PrP powoduje powinowactwo do niklu(II), co pozwala białku wiązać się z jonami niklu bez żadnego jego tagu.</li>
		<li>Umyj FPLC wodą, aby wyczyścić obie linie (A i B).</li>
		<li>Przepuścić bufor denaturujący (100 mM fosforanu sodu, 10 mM Tris, pH 8,0, 6 M chlorowodorku guanidyny, pH 8) przez obie linie (A i B) w celu zalania układu (kolumna nie jest jeszcze podłączona).</li>
		<li>Załaduj żywicę na kolumnę. Upewnij się, że zminimalizowałeś pęcherzyki powietrza.</li>
		<li>Podłącz kolumnę do FPLC i uruchom gradient liniowy od 100% buforu denaturującego A i 0% buforu ponownie składającego B (100 mM fosforanu sodu, 10 mM Tris, pH 8,0) na początku do 0% buforu denaturującego i 100% buforu ponownego składania na końcu. Ta stopniowa zmiana odbywa się przy natężeniu przepływu 0,75 ml/min przez 240 minut i jest potrzebna do prawidłowego składania PrP. 
		UWAGA: Podczas procesu oczyszczania chromatograficznego zdenaturowany PrP jest najpierw powoli ponownie fałdowany na żywicy poprzez zastosowanie liniowego gradientu buforu do ponownego fałdowania w celu zastąpienia buforu denaturującego. Ten krok usuwa również chaotropową guanidynę-HCl.</li>
		<li>Upewnij się, że 100% bufor do ponownego składania nadal przepływa przez kolumnę przez dodatkowe 30 minut z prędkością 0,75 ml/min.</li>
		<li>Przepłukać linię A wodą, a następnie roztworem buforowym elucyjnym (100 mM fosforanu sodu, 10 mM Tris, 500 mM imidazolu, pH 5,8) omijając kolumnę. Spowoduje to oczyszczenie buforu denaturującego, który został zastąpiony buforem elucyjnym w systemie AKTA.</li>
		<li>Elutować białko z prędkością 2 ml/min, prowadząc gradient liniowy przez 40 minut od 100% buforu do ponownego fałdowania B i 0% buforu elucyjnego A na początku do 0% buforu do ponownego fałdowania i 100% buforu elucyjnego. 
		UWAGA: Wysokie stężenie imidazolu w buforze elucyjnym będzie konkurować z wiązaniem PrP z niklem(II). Pierwszorzędowy pik białka powinien zacząć eluować około 1/3 drogi przez gradient.
		<ol>
			<li>Obserwuj chromatogram dla wzrostu OD 280 nm.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zbierz tylko probówki zawierające białko w środku dużego piku. 
		UWAGA: Wymyte frakcje o objętości 2 ml każda zbiera się do probówek o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Białko zawarte w probówkach należy natychmiast rozcieńczyć około 1/3 objętości (1 ml) buforu do dializy (10 mM fosforanu sodu, pH 5,8).</li>
		<li>Natychmiast umieść probówki na lodzie.</li>
		<li>Zebrać eluowane białko zawarte w probówkach.</li>
		<li>Ubogie białko w kasety dializacyjne (odcięcie masy cząsteczkowej 10 kDa).</li>
		<li>Umieścić kasety we wstępnie schłodzonym buforze do dializy (3,6 l) na 2 godziny w temperaturze 4 °C, a następnie przenieść kasety do nowego buforu do dializy (3,6 l) na noc. Należy upewnić się, że bufor dializacyjny jest w ciągłym pobudzeniu.</li>
		<li>Przefiltrować białko po dializie przez filtr strzykawkowy 0,2 μm acrodisc za pomocą strzykawki.</li>
		<li>Zmierz stężenie białka za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA.</li>
		<li>W razie potrzeby zagęścić lub rozcieńczyć, aby dostosować stężenie białka do 0,3 mg/ml. 
		UWAGA: Potwierdź czystość za pomocą barwienia SDS-PAGE i Coomassie Blue.</li>
		<li>Przygotować 1 ml porcji białka w probówkach do mikrowirówek i natychmiast przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia, zgodnie z opisem w protokole RT-QuIC.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

RT-QuIC był wcześniej stosowany do wykrywania prionów CWD w moczu i ekstraktach kałowych zakażonych doustnie jeleni białoogonowych i mulaków 38. System przedstawiony w tym manuskrypcie jest zaadaptowaną metodą testu RT-QuIC. Do "klasycznego" testu RT-QuIC włączono dodatkowe kroki w celu poprawy wykrywania i czułości testu na obecność prionów CWD w materiale kałowym zakażonych zwierząt.
Niska czułość detekcji w ekstraktach z kału doprowadziła nas do udoskonalenia protoko...

Choroby prionowe lub pasażowalne encefalopatie gąbczaste (TSE) są zaburzeniami neurodegeneracyjnymi, w tym chorobą Creutzfeldta-Jakoba (CJD) u ludzi, gąbczastą encefalopatią bydła (BSE) u bydła, trzęsawką owiec i kóz oraz przewlekłą chorobą wyniszczającą (CWD) u jeleniowatych 1,2. TSE charakteryzują się charakterystycznym gąbczastym wyglądem i utratą neuronów w mózgu. Zgodnie z hipotezą "tylko białko", priony składają się głównie z PrPSc ("Sc" dla trzęsawki) 3, nieprawidłowo sfałdowanej izoformy kodowanego przez gospodarza komórkowego białka prionowego, PrPC. PrPSc powstaje w wyniku przekształcenia PrPC w konformację wzbogaconą w arkusze β 4,5,6, który może działać jako ziarno do wiązania i przekształcania innych cząsteczek PrPC. Nowo wygenerowane cząsteczki PrPSc są włączane do rosnącego polimeru 7,8, który rozpada się na mniejsze oligomery, co skutkuje większą liczbą zakaźnych jąder. PrPSc jest podatny na agregację i jest częściowo odporny na proteazy 9,10.
CWD dotyka dzikich i hodowlanych łosi (Cervus canadensis), mulaków (Odocoileus hemionus), jeleni białoogonowych (WTD; Odocoileus virginianus), łoś (Alces alces) i renifer (Rangifer tarandus tarandus) 11,12,13. Uważa się, że jest to najbardziej zaraźliwa choroba prionowa z transmisją poziomą, której sprzyjają interakcje jeleniowatych i środowiskowe utrzymywanie się zakaźności 14,15. W przeciwieństwie do innych chorób prionowych, w których akumulacja i zakaźność PrPSc są ograniczone do mózgu, w CWD występują one również w tkankach obwodowych i płynach ustrojowych, np. ślinie, moczu i kale. 16,17,18.
Immunohistochemia jest uważana za złoty standard w diagnostyce CWD do wykrywania dystrybucji PrPSc i zmian gąbczastych 19,20. Test ELISA, a w rzadszych przypadkach western blot są również wykorzystywane w diagnostyce CWD. Tak więc obecna diagnostyka choroby prionowej opiera się głównie na wykrywaniu prionów w tkankach pośmiertnych. Diagnostyka przedśmiertna CWD jest dostępna poprzez pobranie migdałków lub biopsji tkanki limfatycznej związanej z błoną śluzową odbytu i odbytu (RAMALT); Procedura ta jest jednak inwazyjna i wymaga schwytania zwierząt. W związku z tym wykorzystanie łatwo dostępnych próbek, takich jak mocz i kał, byłoby praktycznym sposobem wykrywania prionów CWD. Jednak odchody te zawierają stosunkowo niskie stężenia prionów poniżej granicy wykrywalności obecnych metod diagnostycznych. W związku z tym potrzebne jest bardziej czułe i wysokowydajne narzędzie diagnostyczne. Systemy konwersji in vitro, takie jak test cyklicznej amplifikacji nieprawidłowego fałdowania białek (PMCA) 21, test wysiewu amyloidu i test konwersji indukowanej wstrząsaniem w czasie rzeczywistym (RT-QuIC) 22,23,24 są bardzo potężnymi narzędziami do wykorzystania zdolności PrPSc do samorozprzestrzeniania się do naśladowania in vitro proces konwersji prionów, a tym samym zwiększyć obecność niewielkich ilości PrPSc do wykrywalnych poziomów 25,26. Metoda RT-QuIC wykorzystuje jednak fakt, że produkt konwersji wzbogacony w strukturę drugorzędową β arkuszy może specyficznie wiązać tioflawinę T (Th-T). Dlatego rekombinowany PrP (rPrP) po konwersji wysiewu wyrasta na fibryle amyloidowe, które wiążą Th-T, a tym samym można je wykryć w czasie rzeczywistym, mierząc fluorescencję Th-T wyrażoną jako względne jednostki fluorescencji (RFU) w czasie. Po monitorowaniu RFU może być używany do oceny względnych działań wysiewu i parametrów ilościowych, takich jak faza opóźnienia. Faza opóźnienia reprezentuje czas (h) wymagany do osiągnięcia progu, podczas którego konwersja rPrP na wczesnym etapie reakcji jest poniżej granicy wykrywalności fluorescencji Th-T. Koniec pozornej fazy opóźnienia, towarzyszący tworzeniu się wystarczającej ilości jądra amyloidu (zarodkowanie/wydłużenie), następuje, gdy fluorescencja Th-T przekracza poziom progowy i staje się dodatnia. Wzrost włókienek amyloidowych można wykryć w czasie rzeczywistym, a początkowa aktywność PrP,Sc lub wysiewu zawarta w próbce jest wzmacniana przez segmentację, która generuje więcej nasion. Nasiona te z kolei indukują szybką fazę wykładniczą wzrostu włókien amyloidowych.
Ponieważ ten test jest w stanie wykryć zaledwie 1 fg PrPSc 24, wysoka czułość kwalifikuje tę technikę do osiągnięcia diagnozy ante mortem lub nieinwazyjnej poprzez wykrycie PrPSc w różnych tkankach obwodowych, wydalinach lub innych rodzajach próbek o niskim poziomie zakaźności. RT-QuIC zdecydowanie zapewnia przewagę nad innymi testami ze względu na powtarzalność, praktyczność, szybkość (mniej niż 50 godzin) i niskie koszty w porównaniu z testami biologicznymi. Pozwala to uniknąć zawiłości technicznych, takich jak sonikacja stosowana w PMCA; Odbywa się to również w mikropłytce uszczelnionej taśmą, co minimalizuje ryzyko zanieczyszczenia aerozolem każdej studzienki. Format wielodołkowy umożliwia analizę do 96 próbek w tym samym eksperymencie. Aby przeciwdziałać nawracającemu problemowi wyników fałszywie dodatnich i spontanicznej konwersji rPrP w testach konwersji in vitro, bardzo przydatne jest zastosowanie progu (punktu odcięcia) w RT-QuIC. Rzeczywiście, na podstawie wyników kontroli ujemnej (średnia RFU próbek ujemnych +5 SD 27) ustala się linię bazową, na podstawie której można dokonać rozróżnienia między próbkami dodatnimi i ujemnymi. Użycie czterech powtórzeń dla każdej próbki może zatem pomóc w zdefiniowaniu próbki jako dodatniej, gdy co najmniej 50% powtórzeń wykazuje sygnał pozytywny, tj. przecina granicę odcięcia 28. Homologia między nasionem a substratem nie jest wymagana w RT-QuIC, ponieważ np. w poprzednim badaniu stwierdzono, że rPrP chomika jest bardziej wrażliwym substratem w porównaniu z substratem homologicznym w ludzkich reakcjach wysiewanych PrPvCJD i zasiewanych trzęsawką owiec 29. Zasugerowano również, że chimeryczny rPrP chomika i owcy jest bardziej odpowiednim substratem niż ludzki rPrP do wykrywania ludzkich wariantów prionów CJD 30. W związku z tym stosowanie substratów rPrP z różnych gatunków jest bardzo powszechne w tym teście. Test ten został z powodzeniem zastosowany w kilku chorobach prionowych, takich jak sporadyczne CJD 31,32,33, genetyczne choroby prionowe 34, BSE 35,36,37, trzęsawka 23,36 oraz CWD 38,39,40,41,42. Badania z użyciem przetworzonego płynu mózgowo-rdzeniowego, krwi pełnej, śliny i moczu jako nasion w RT-QuIC zakończyły się sukcesem w wykrywaniu PrPSc 38,39,40,41,42. Aby zwiększyć zdolność wykrywania w próbkach takich jak osocze krwi, które mogą zawierać inhibitory tworzenia amyloidu, Orrú i wsp. (2011) opracował strategię usuwania potencjalnych inhibitorów powstawania amyloidu poprzez połączenie etapu immunoprecypitacji PrPSc (IP) i RT-QuIC, nazwanego testem "enhanced QuIC" (eQuIC). Ponadto zastosowano etap wymiany substratu po ~24 h czasie reakcji w celu poprawy czułości. Ostatecznie, już 1 ag PrPSc było wykrywalne przez eQuIC 30.
W celu oczyszczenia ekstraktów z kału i usunięcia ewentualnych inhibitorów testów w kale, próbki kału pobrane na etapie przedklinicznym i klinicznym od łosia po eksperymentalnym zakażeniu jamy ustnej zostały zhomogenizowane w buforze zawierającym detergenty i inhibitory proteazy. Ekstrakty z kału poddano następnie różnym metodologiom w celu zagęszczenia PrPSc w próbkach wykorzystujących wytrącanie białek poprzez wytrącanie kwasu fosforaungstycznego sodu (NaPTA). Metoda wytrącania NaPTA, po raz pierwszy opisana przez Safara i wsp.43, służy do koncentracji PrPSc w próbkach testowych. Inkubacja NaPTA z próbką skutkuje preferencyjnym wytrącaniem PrPSc zamiast PrPC. Jednak mechanizm molekularny jest nadal niejasny. Ten krok pomógł również powstrzymać i zapobiec spontanicznej konwersji rPrP, którą obserwuje się w niektórych przypadkach. Na koniec ekstrakty z kału przetestowano za pomocą zoptymalizowanego RT-QuIC przy użyciu mysiego rPrP (aa 23-231) jako substratu i z uwzględnieniem wymiany substratu w protokole w celu poprawy czułości wykrywania.
Wyniki tutaj pokazują, że ta ulepszona metoda może wykrywać bardzo niskie stężenia prionów CWD i zwiększa czułość wykrywania i swoistości w próbkach kału w porównaniu do protokołu bez wytrącania NaPTA i wymiany substratu. Metoda ta potencjalnie może być stosowana do innych tkanek i płynów ustrojowych i może być bardzo przydatna do nadzoru nad CWD u dzikich i żyjących w niewoli jeleniowatych.

<table><tbody><tr><td>Materiały</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc filtry do seringów</td><td>PALL</td><td>4652</td><td></td></tr><tr><td>amicon Ultra-15 Filtr odśrodkowy</td><td>Millipore</td><td>UCF901024</td><td></td></tr><tr><td>BD 10 ml seringe</td><td>VWR</td><td>CA75846-842</td><td></td></tr><tr><td>Chloramfenikol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>Corning Filtry próżniowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431118</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS M Tube</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek guanidyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4505</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>Izopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan kanamycyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>Rosół Luria-Bertani (LB)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12780029</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>Suplement N2 (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15502048</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa N-lauroilsarkozyny (sarkozyl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ML9150</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenia odśrodkowe Nanosep z membraną omega 100K</td><td>Taśmy uszczelniające PALL</td><td>OD100C34</td><td></td></tr><tr><td>Nunc</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>232702</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Tabletka inhibitora proteazy</td><td>Roche</td><td></td><td></td>4693159001</tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Deoksycholan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Calbiochem</td><td>7910-OP</td><td></td></tr><tr><td>fosforan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy bezwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy jednowodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Hydrat fosforanu sodu (NaPTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>496626</td><td></td></tr><tr><td>Tioflawina T</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3516</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Hydroksy-Metylo-Amino-Methan (Tris)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Triton-100</td><td>Calbiochem</td><td>9410-OP</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</strong</td><td>>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Komercyjne i roztwory</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BugBuster Master Mix</td><td>Nogagen</td><td>71456-4</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA superflow</td><td>Qiagen</td><td>1018401</td><td></td></tr><tr><td>sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) pH 7,4 (1X)</td><td>Life Technoligies</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>Ultraczysta woda destylowana</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze </td></tr><tr><td>Standardy i zestawy komercyjne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Express Autoinduction System 1</td><td>Novagen</td><td>71300-4</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Zestaw do oznaczania białek</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</strong</td></tr><tr><td>>Konfiguracja sprzętu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AKTA systemy oczyszczania białek FPLC</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman Avanti J-25 Wirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman Rotor JA-25.50</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beckman JA-10</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek FLUOstar Omega</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Disocjator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Sofware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analiza danych MARS Oprogramowanie</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism6</td><td>GraphPad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

test konwersji wywołany wstrząsem w czasie rzeczywistym do wykrywania prionów cwd w materiale kałowym

Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

Technika RT-QuIC to czuły test amplifikacji prionów in vitro bez komórek, oparty głównie na nieprawidłowym fałdowaniu i agregacji substratu rekombinowanego białka prionowego (PrP) przy użyciu nasion prionów jako matrycy do konwersji. RT-QuIC to nowatorska technika wysokoprzepustowa, która jest analogiczna do reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (PCR). Wykrywanie wzrostu włókien amyloidowych opiera się na barwniku Tioflavinie T, który fluoryzuje po specyficznej interakcji z białkami bogatymi w β arkusze. W ten sposób tworzenie się amyloidu może być wykrywane w czasie rzeczywistym. Podjęliśmy próbę opracowania wiarygodnego nieinwazyjnego testu przesiewowego do wykrywania prionów przewlekłej choroby wyniszczającej (CWD) w ekstrakcie kałowym. W tym przypadku specjalnie dostosowaliśmy technikę RT-QuIC, aby ujawnić aktywność wysiewu PrPSc w kale jeleniowatych zakażonych CWD. Początkowo aktywność wysiewu przygotowanych przez nas ekstraktów kałowych była stosunkowo niska w RT-QuIC, prawdopodobnie ze względu na potencjalne inhibitory oznaczania w materiale kałowym. Aby poprawić aktywność wysiewu ekstraktów z kału i usunąć potencjalne inhibitory testów, zhomogenizowaliśmy próbki kału w buforze zawierającym detergenty i inhibitory proteazy. Poddaliśmy również próbki różnym metodologiom w celu zagęszczenia PrPSc na podstawie wytrącania białek przy użyciu kwasu fosforofosforanowego sodu i siły odśrodkowej. Na koniec ekstrakty z kału zostały przetestowane za pomocą zoptymalizowanego RT-QuIC, który obejmował wymianę substratu w protokole w celu poprawy czułości wykrywania. W związku z tym opracowaliśmy protokół czułego wykrywania aktywności wysiewu prionów CWD w kale przedklinicznych i klinicznych jeleniowatych za pomocą RT-QuIC, który może być praktycznym narzędziem do nieinwazyjnej diagnostyki CWD.

Ekstrakty kałowe CWD przygotowane w stężeniu 10% (w/v) były w stanie zainicjować reakcję RT-QuIC, jednak czułość detekcji była niska 27. Zastosowanie specyficznego buforu do homogenizacji kału było krytycznym krokiem w celu uniknięcia wysokiej fluorescencji tła w reakcjach RT-QuIC, co wraz z wykorzystaniem substratu rPrP mysiego zamiast jeleniego pozwoliło na uzyskanie bardziej specyficznych wyników 27. Dodanie precypitacji NaPTA zredukowało...

Tutaj prezentujemy protokół opisujący prostą, szybką i efektywną technikę wzmacniania prionów, metodę konwersji indukowanej wstrząsami w czasie rzeczywistym (RT-QuIC).

Test konwersji wywołany wstrząsem w czasie rzeczywistym do wykrywania prionów CWD w materiale kałowym

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant ...

Ogólnym celem tego protokołu do oznaczania konwersji wywołanej wstrząsem w czasie rzeczywistym jest umożliwienie czułego wykrywania prionów przewlekłej choroby wyniszczającej w próbkach kału jeleniowatych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad CWD, takie jak to, kiedy zakażone priony CWD jeleniowatych znajdują się w kale. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest specyficzna, czuła i umożliwia wysoką przepustowość próbek.Procedurę zademonstruje Ginny Cheng, laborantka z mojego laboratorium. Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj jeden gram materiału kałowego do probówki zawierającej 10 mililitrów buforu ekstraktu z kału. Używając dysocjatora z zaprogramowanym programem dla białek, homogenizuj granulki kału przez jedną minutę w temperaturze pokojowej.Powtórz to dwa do trzech razy, aż próbki kału zostaną całkowicie zhomogenizowane. Następnie użyj parafilmu, aby uszczelnić probówki i umieść je na platformie kołyszącej lub wytrząsarce obrotowej na godzinną inkubację w temperaturze pokojowej. Następnie odwirować przy 18 000 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Zebrać supernatanty i podzielić je na probówki o pojemności 1,5 mililitra. Przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będzie gotowy do użycia. Aby rozpocząć metodę wytrącania kwasu fosfowolframowego, dodaj 250 mikrolitrów sarkozylu do jednego mililitra ekstraktu z białka kałowego.Za pomocą parafilmu uszczelnij rurkę. Umieścić probówkę w mieszalniku termicznym i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut, stale wstrząsając przy 1 400 obr./min. Następnie dodać roztwór podstawowy zawierający 10% kwas fosforanowo-wolframowy sodu i 170 milimolowy chlorek magnezu tak, aby końcowe stężenie kwasu fosforowo-wolframowego sodu w próbkach wynosiło 3%Przenieść próbki do mieszalnika termicznego i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny przy ciągłym wstrząsaniu przy 400 obr./min.Następnie odwirować w temperaturze 15 800 g przez 30 minut w temperaturze 14 stopni Celsjusza. Ostrożnie usunąć supernatanty i umyć granulki, umieszczając je ponownie w buforze do mycia. Następnie odwirować w temperaturze 15 800 g przez 15 minut w temperaturze 14 stopni Celsjusza.Ostrożnie usunąć supernatanty i ponownie zawiesić granulki w 100 mikrolitrach buforu rozcieńczającego RT-QuIC. Próbki poddane działaniu środka należy przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do momentu, gdy będą gotowe do przeprowadzenia testu RT-QuIC. Na początek dodaj 0,032 grama tioflawiny T do 10 mililitrów podwójnie destylowanej wody, aby przygotować świeży 10-milimolowy roztwór podstawowy tioflawiny T.Następnie użyj podwójnie destylowanej wody, aby rozcieńczyć roztwór podstawowy od 1 do 10, co daje końcowe stężenie jednego milimolowego tioflawiny T. Za pomocą strzykawki wyposażonej w filtr dyskowy Acro o średnicy 0,2 mikrometra, przefiltruj jeden milimolowy roztwór tioflawiny T. Następnie rozmrozić najbardziej rekombinowany substrat białka prionowego. Załaduj jednorazowo 500 mikrolitrów rekombinowanego substratu białka prionowego do 100-kilogramowych mikroprobówek z filtrem wykluczającym o wielkości daltona.Wirować przy 14 000 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie przenieś wymyty substrat do sterylnej probówki o pojemności 1,5 mililitra. Przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będzie gotowy do użycia.Następnie rozmrozić przechowywany bufor rozcieńczający RT-QuIC. Rozcieńczyć ziarno i przygotować roztwory podstawowe oraz mieszaninę reakcyjną RT-QuIC zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Za pomocą pipety z końcówką filtrującą wymieszać mieszaninę reakcyjną, pipetując w górę i w dół.Wlej mieszaninę do 50-mililitrowego zbiornika do pipetowania. Za pomocą pipety wielokanałowej załaduj 98 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej RT-QuIC do każdej studzienki 96-dołkowej optycznej płytki dolnej. Do każdej reakcji dodaj dwa mikrolitry nierozcieńczonego lub 10-krotnie seryjnie rozcieńczonego ekstraktu z białka kałowego.Następnie użyj taśmy uszczelniającej, aby uszczelnić płytkę. Inkubować w czytniku płytek w temperaturze 42 stopni Celsjusza przez 25 godzin z powtarzającymi się cyklami jednej minuty podwójnego wytrząsania orbitalnego przy 700 obr./min i jedną minutą odpoczynku przez cały czas inkubacji. W międzyczasie zdefiniuj ustawienia pomiaru fluorescencji zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Po 25 godzinach wyjmij płytkę z czytnika płytek. Obracaj płytkę przy 3 000 g przez trzy minuty, aby uniknąć potencjalnego zanieczyszczenia między studzienkami. Następnie usuń uszczelkę z płyty.Przygotować nową płytkę, dodając 90 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej RT-QuIC zawierającej świeży substrat i świeży barwnik fluorescencyjny tioflawiny T. Przenieś 10 mikrolitrów z każdego dołka pierwszej płytki na nowo przygotowaną płytkę 96-dołkową. Użyj taśmy uszczelniającej, aby uszczelnić nową płytę.Po zdefiniowaniu ustawień pomiaru fluorescencji kontynuuj test przez dodatkowe 50 godzin. Odczytuj i dokumentuj sygnał fluorescencji tioflawiny T dla każdej studzienki co 15 minut. Następnie zbierz i wykreśl dane zgodnie z opisem w protokole tekstowym.W tym badaniu materiał kałowy od niezakażonych łosi lub mulaków jest homogenizowany w buforze ekstraktu z kału w celu uzyskania końcowego stężenia próbki 10% Niektóre homogenaty są następnie przetwarzane i 10-krotnie zagęszczane przez wytrącanie kwasu fosfowolframowego. Podczas gdy w oczyszczonych próbkach obserwuje się zmniejszenie spontanicznych konwersji, wszystkie próbki wykazały niskie sygnały fluorescencji w próbkach kału z dodatnim wynikiem CWD. Aby poprawić amplifikację prionów i zwiększyć czułość detekcji, włączono etap wymiany substratu.Próbki, które przeszły wymianę substratu w ramach protokołu RT-QuIC, wykazują wzrost czułości i swoistości wykrywania, przy czym 14 z 18 próbek było dodatnich, a żadna z kontroli ujemnych nie została zarejestrowana jako fałszywie dodatnia. Po opanowaniu przygotowanie ekstraktu kałowego i stężenie PRP/SCRP można wykonać w ciągu około czterech godzin, a test RT-QuIC można skonfigurować w ciągu około 1/1-2 godzin, jeśli zostanie wykonany prawidłowo. Przystępując do zabiegu, należy pamiętać o filtrowaniu podłoża, ale nigdy nie należy go wirować.Po procedurze można zastosować inne metody, takie jak western blotting, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak odporność proteaz na otrzymane produkty. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się badaniami nad prionami do badania obecności prionów u żywych zwierząt poprzez testowanie próbek kału. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować i skoncentrować PRP/SCRP z ekstraktów kałowych oraz jak wykonać zmodyfikowany test RT-QuIC, aby uzyskać czułe i specyficzne wykrywanie prionów.Nie zapominaj, że praca z prionami może być niezwykle niebezpieczna i że ważne jest, aby nosić odpowiednie środki ochrony osobistej i pracować pod szafką bezpieczeństwa biologicznego podczas wykonywania zabiegu.

real-time-quaking-induced-conversion-assay-for-detection-cwd-prions

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W niniejszej pracy opisujemy nową metodę monitorowania pobierania i transportu prionów przez komórki odpornościowe bezpośrednio po inokulacji doprzewnowej, polegającą na oczyszczaniu i znakowaniu fluorescencyjnym zagregowanych prętów prionowych z zakażonego materiału mózgowego, a następnie śledzeniu ich pobierania i przemieszczania się z miejsca wstrzyknięcia oraz charakteryzacji komórek pośredniczących w tych zdarzeniach.

Monitorowanie przemieszczania się komórek odpornościowych do fluorescencyjnych pręcików prionowych w godzinach po zakażeniu drogą dosytrychialną

Cykliczna amplifikacja błędnego fałdowania białek (PMCA) jest testem in vitro służącym do badania konwersji prionów oraz barier szczepowych i gatunkowych. Może być również wykorzystywana jako test detekcji prionów.

Cykliczna amplifikacja błędnego fałdowania białek prionów

Padlinożercy mają potencjał do przenoszenia zakaźnych prionów gąbczastej encefalopatii w swoim kale do obszarów wolnych od chorób.  Szczegółowo opisujemy metody stosowane do określenia, czy priony trzęsawki przystosowane do myszy pozostają zakaźne po przejściu przez przewód pokarmowy wron amerykańskich (Corvus brachyrhynchos), powszechnego konsumenta martwych zwierząt.

Procedury identyfikacji zakaźnych prionów po przejściu przez układ pokarmowy gatunku ptaków

Ten protokół opisuje wykrywanie wirusa cytomegalii metodą qPCR w tkance biopsyjnej utrwalonej w formalinie, zatopionej w parafinie, co jest szybkie, czułe, specyficzne i przydatne do interpretacji niejednoznacznych wzorców barwienia hematoksyliną i eozyną lub immunohistochemicznych.

qPCR jest czułą i szybką metodą wykrywania DNA wirusa cytomegalii w tkance biopsyjnej utrwalonej w formalinie, zatopionej w parafinie

Pomiar bariery dla międzygatunkowego przenoszenia chorób prionowych jest trudny i zazwyczaj wiąże się z wyzwaniami zwierzęcymi lub testami biochemicznymi. W tym miejscu przedstawiamy test konwersji białka prionowego in vitro z możliwością przewidywania barier gatunkowych.

Ocena barier gatunkowych pasażowalnej encefalopatii gąbczastej za pomocą testu konwersji białka prionowego in vitro

Dostarczony jest protokół do opracowania testu amplifikacji polimerazy rekombinazy w czasie rzeczywistym w celu ilościowego określenia początkowego stężenia próbek DNA za pomocą termocyklera lub mikroskopu i podgrzewacza scenicznego. Opisano również rozwój wewnętrznej kontroli pozytywnej. Dostępne są skrypty do przetwarzania surowych danych fluorescencyjnych w czasie rzeczywistym.

Opracowanie ilościowego testu amplifikacji polimerazy rekombinazy z wewnętrzną kontrolą pozytywną

Szybkie i dokładne wykrywanie patogenów roślin na miejscu, zwłaszcza patogenów przenoszonych przez glebę, jest kluczowe dla zapobiegania dalszej produkcji inokulum i rozprzestrzenianiu się chorób roślin na polu. Opracowana tutaj metoda wykorzystująca przenośny system detekcji PCR w czasie rzeczywistym umożliwia diagnostykę na miejscu w warunkach polowych.

Wykrywanie molekularne fitopatogenów przenoszonych przez glebę na miejscu za pomocą przenośnego systemu PCR w czasie rzeczywistym

Ilościowa analiza łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym w połączeniu z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR) jest szeroko stosowana do pomiaru poziomu infekcji wirusem RNA. W tym miejscu przedstawiamy bezpośredni test RT-qPCR, który nie wymaga etapu oczyszczania RNA, opracowany do oznaczania ilościowego kilku wirusów RNA, w tym wirusa dengi.

Pomiar RNA wirusa dengi w supernatancie hodowli zakażonych komórek za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym

Ten protokół przedstawia oparte na qRT-PCR podejście do określania liczby kopii genu nukleoproteiny (N) wirusa wścieklizny w różnych strukturach anatomicznych mózgu bydlęcego za pomocą transkrypcji in vitro.

Kwantyfikacja wirusa wścieklizny w różnych strukturach mózgu bydła

Immunoznakowanie nieprawidłowego białka prionowego za pomocą protokołów immunohistochemicznych wymaga specyficznych metod przygotowania próbki i przeciwciał anty-PrP. Niniejszy protokół opisuje kluczowe etapy demaskowania epitopów w celu zapewnienia prawidłowego znakowania immunologicznego PrP i zminimalizowania niespecyficznego barwienia tła. Podejście to uwzględnia również środki bezpieczeństwa biologicznego podczas prowadzenia badań immunohistochemicznych na tkankach zakażonych prionami.

Wykrywanie nieprawidłowego białka prionowego za pomocą immunohistochemii

Brakuje metody oceny powszechnie używanych obszarów w warunkach laboratoryjnych pod kątem zanieczyszczenia prionami i skutecznej dekontaminacji. Opisany tutaj protokół zawiera kluczowe podstawy do wdrożenia laboratoryjnego testu bezpieczeństwa prionów, który można łatwo modyfikować w celu spełnienia indywidualnych potrzeb określonych laboratoriów.

Test laboratoryjny bezpieczeństwa prionowego

Poznaj metodę RT-QuIC do wykrywania prionów CWD w materiale kałowym jeleniowatych. Ta technika umożliwia czułą i specyficzną detekcję prionów choroby chronicznego zmęczenia w próbkach kałowych.

Test konwersji wywołany wstrząsem w czasie rzeczywistym do wykrywania prionów CWD w materiale kałowym

Przeglądaj więcej filmów