Name: Oczyszczanie DNA wirusa w celu identyfikacji powiązanych białek wirusowych i komórkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Poznaj metodę oczyszczania DNA wirusa HSV-1 z zainfekowanych komórek MRC-5 w celu analizy proteomicznej białek związanych z genomem wirusowym. Technika ta pozwala identyfikować czynniki komórkowe zaangażowane w infekcję.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Hannah Fox za pomoc w przygotowaniu tego rękopisu. Prace te były wspierane przez grant NIH R01AI030612.

1. Hodowla komórkowa, infekcja wirusowa i znakowanie EdC (Rysunek 1)
Następujący protokół obejmuje pracę z wirusami. Prosimy o zapoznanie się z protokołami bezpieczeństwa biologicznego Twojej instytucji dotyczącymi bezpiecznego obchodzenia się z wirusami i innymi czynnikami biologicznymi. Protokół ten został zatwierdzony przez Institutional Review Board Uniwersytetu w Pittsburghu.
<ol>
	<li>Trypsynizować zlewającą się kolbę do hodowli tkankowej o długości 150 cm2 komórek MRC-5 i przenieść komórki na płytkę do hodowli tkankowej o długości 600 cm2 zawierającą 100 ml DMEM plus 10% FBS. Inkubować w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2 przez 3 - 4 dni do osiągnięcia zbiegu i fazy stacjonarnej. Zlewająca się miska o długości 600 cm2 zawiera ~7 x 107 komórek. Przygotować 1 tabliczkę dla każdego warunku i 1 tabliczkę dla każdej odpowiadającej jej kontroli ujemnej. 
	UWAGA: Komórki muszą osiągnąć fazę stacjonarną, aby zahamować replikację komórkowego DNA, aby zapewnić, że w kolejnych krokach znakowane i oczyszczane jest tylko vDNA. 
	UWAGA: Każda próbka wymaga uzupełniającej, nieznakowanej kontroli ujemnej przygotowanej przy użyciu tych samych warunków infekcji i punktu czasowego bez dodatku EdC. 
	UWAGA: Pomniejszona wersja tego eksperymentu powinna być przeprowadzana w tandemie, aby przetestować znakowanie DNA komórkowego poprzez obrazowanie przy użyciu porównywalnego wzrostu komórek, infekcji, warunków znakowania EdC i punktów czasowych (patrz Krok 2).</li>
	<li>Rozcieńczyć 7 x 108 PFU HSV-1 w 7 ml zimnego soli fizjologicznej buforowanej trisem (TBS). Usunąć podłoże wzrostowe i przechowywać w temperaturze 37 °C. Aby zainfekować, dodaj rozcieńczonego wirusa o pojemności 7 ml do komórek MRC-5 i kołysz się przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po adsorpcji usuń inokulum, przepłucz 50 ml TBS o temperaturze pokojowej i zastąp oryginalną pożywkę wzrostową. Inkubować w temperaturze 37 °C w obecności 5% CO2 . Etap ten należy przeprowadzić dla każdego warunku doświadczalnego i kontroli ujemnej. 
	UWAGA: Zwiększone znakowanie EdC można osiągnąć przy użyciu mutantów HSV-1 wadliwych pod względem ekspresji wirusowej dUTPazy (gen UL50) i/lub glikozylazy uracylowej (gen UL2). dUTPaza HSV-1 ma niską specyficzność substratową i może zmniejszać aktywację kilku analogów nukleozydów25,27.</li>
	<li>Oznacz genomy wirusów za pomocą EdC. Postępuj zgodnie ze wskazówkami, aby oznaczyć przychodzące genomy (1.3.1.), replikujące genomy (1.3.2.) lub widełki replikacyjne wirusa (1.3.3.). 
	UWAGA: Należy wykonać tylko Krok 1.3.1, 1.3.2 lub 1.3.3 w zależności od tego, czy w kolejnych krokach mają być analizowane odpowiednio genomy przychodzące, genomy replikowane czy widełki replikacyjne. 
	UWAGA: EdU lub f-ara EdU można zastąpić EdC. Toksyczność analogów nukleozydów powinna być monitorowana i minimalizowana.
	<ol>
		<li>Użyj wstępnie oznakowanych zapasów do przeprowadzenia infekcji w kroku 1.2 i przejdź do kroku 2 lub 3 w ciągu 4 godzin po infekcji (hpi), aby zbadać niezreplikowane vDNA (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1A). 
		UWAGA: Przygotuj wstępnie oznaczone zapasy wirusów, korzystając z wcześniej opisanego protocol25. Zapasy wirusów muszą zostać przepuszczone przez kolumnę G-25 w celu usunięcia pozostałości EdC.</li>
		<li>Znakowanie replikacji vDNA poprzez dodanie 5 - 25 μM EdC do pożywki do hodowli komórkowych zakażonych komórek przez 2 - 4 godziny (<silna klasa = "xfig">Figura 1B). Przed dodaniem rozcieńczyć EdC w 1 ml pożywki wzrostowej.</li>
		<li>Aby oznaczyć widełki replikacyjne wirusa, po rozpoczęciu replikacji vDNA (≥4 hpi), znakuj impulsowo replikację vDNA za pomocą 5 - 25 μM EdC przez 5-20 min. Aby gonić, przepłucz 3x pożywką chase zawierającą 25 - 100 μM 2'deoksycytydyny (deoksyC), a następnie inkubuj w obecności pożywki chase przez dodatkowe 20-40 minut (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C). 
		UWAGA: Przed użyciem należy zrównoważyć temperaturę impulsu i pożywki do 37 °C i 5% CO2 . 
		UWAGA: W przypadku eksperymentów z pogonią za impulsami ważne jest, aby wziąć pod uwagę czas potrzebny nukleozydom na wejście do komórki i fosforylację, zanim będą mogły zostać włączone do replikacji DNA. Trzeba to ustalić empirycznie. 
		UWAGA: Aby określić rozdzielczość eksperymentów z pościgiem impulsowym, należy obliczyć szybkość replikacji wirusa w zastosowanych warunkach eksperymentalnych. Można to określić za pomocą ilościowego PCR genomów wirusa podczas jednoetapowego przebiegu czasowego wzrostu26. 
		UWAGA: W celu obrazowania genomów wirusowych przejdź do Kroku 2, a w celu oczyszczenia genomów wirusa przejdź do Kroku 3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Obrazowanie DNA znakowanego EdC (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A)
UWAGA: Przydatne jest przeprowadzenie obrazowania w połączeniu z metodą oczyszczania genomu wirusa, aby sprawdzić, czy DNA komórkowe nie jest znakowane w eksperymentach. Obrazowanie może być również wykorzystywane do wizualizacji charakteru znakowanego vDNA i walidacji danych proteomicznych. Przykłady wzorców barwienia DNA komórkowego i wirusowego są pokazane na Rysunek 3.
<ol>
	<li>Przeprowadzić infekcje i znakowanie EdC, jak wskazano w kroku 1, z wyjątkiem stosowania zmniejszonych warunków na szkiełkach nakrywkowych w 12-dołkowym naczyniu do hodowli tkankowej zawierającym 1 ml pożywki wzrostowej.</li>
	<li>Napraw komórki za pomocą 1 ml 3,7% paraformaldehydu w 1x PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po utrwaleniu przepłukać komórki 2x 1 ml 3% BSA w PBS. 
	Uwaga: Paraformaldehyd może spowodować poważne lub trwałe obrażenia. Przestrzegaj środków ostrożności. 
	UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać stosowanie protokołu, a szkiełka nakrywkowe można przechowywać w temperaturze 4 °C w drugim praniu przez okres do 3 dni.</li>
	<li>Przepuszczalność komórek za pomocą 1 ml buforu do przepuszczalności [patrz tabela materiałów] przez 20 minut w temperaturze pokojowej podczas kołysania.</li>
	<li>Spłucz 1 ml 3% BSA, a następnie zablokuj 1 ml 3% BSA w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej podczas kołysania.</li>
	<li>Dodaj 1 ml koktajlu reakcji na kliknięcie [patrz tabela materiałów] do szkiełek nakrywkowych, aby kowalencyjnie skoniugować azydek Alexa Fluor 488 z DNA znakowanym EdC. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut podczas kołysania. Odessać i spłukać dwa razy 1 ml PBS.</li>
	<li>Wybarwić DNA komórkowe 1 ml rozcieńczenia Hoechst w stosunku 1:2 000 w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej podczas kołysania. Odessać i spłukać dwa razy 1 ml PBS.</li>
	<li>Barwienie przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi zgodnie ze standardowymi protokołami immunofluorescencji pośredniej25. 
	UWAGA: Znakowane vDNA kolokalizuje się z ICP8, ICP4 lub UL42, a znakowane DNA komórkowe kolokalizuje się z barwieniem Hoechsta.</li>
	<li>Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach podstawowych i komórkach obrazu za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. 
	UWAGA: Preparaty można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni.</li>
</ol>
3. Oczyszczanie vDNA i powiązanych białek
UWAGA: Kilka aspektów tego protokołu zostało zaadaptowanych z Leung et al.22 
UWAGA: Wszystkie i odczynniki należy przed użyciem schłodzić na lodzie, a wszystkie czynności należy wykonać na lodzie, chyba że wskazano inaczej.
<ol>
	<li>Zbierz jądra. 
	UWAGA: Przed izolacją jąder formaldehyd może być użyty do sieciowania białek z DNA. Bardziej rygorystyczne warunki prania mogą być następnie stosowane podczas oczyszczania DNA na kulkach pokrytych streptawidyną. Aby zapoznać się z warunkami sieciowania i mycia, patrz Sirbu i wsp.21.
	<ol>
		<li>Zastąp pożywkę wzrostową 20 ml buforem do ekstrakcji jąder (NEB) i inkubuj przez 20 minut w temperaturze 4 °C, od czasu do czasu kołysząc. Jądra staną się widoczne w mikroskopie.</li>
		<li>Zeskrobać jądra z płytki za pomocą skrobaka do komórek i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Wirować przez 10 minut przy 2 500 x g w temperaturze 4 °C w celu osadzania jąder, odrzucać supernatant. 
		UWAGA: Barwienie błękitem trypanowym może być stosowane do weryfikacji izolacji jąder od komórek.</li>
		<li>Delikatnie usunąć pastylkę jądrową w 10 ml PBS, przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i osadzać przez odwirowanie przez 10 minut w temperaturze 2 500 x g w temperaturze 4 °C. Całkowicie usunąć PBS. 
		UWAGA: Jądra mogą zostać zamrożone, a protokół może zostać wstrzymany w tym momencie. W tym celu należy delikatnie zawiesić granulat jądrowy w buforze zamrażającym o pojemności 500 μl i inkubować probówkę w łaźni etanolowej/suchego lodu. Zamrożone jądra przechowywać w temperaturze -80 °C. Przed użyciem rozmrozić jądra w temperaturze pokojowej, szybko przenieść do lodu, dodać 10 ml PBS, delikatnie rozdrobnić do wymieszania, osadzać przez odwirowanie przez odwirowanie w temperaturze 2 500 x g w temperaturze 4 °C i całkowicie usunąć PBS. Zamrażanie jąder może skutkować zmniejszoną wydajnością.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kowalencyjnie sprzężony azydek biotyny z vDNA znakowanym EdC.
	<ol>
		<li>Zawiesić ponownie osad jądrowy w 10 ml mieszance reakcyjnej na klik [patrz tabela materiałów], delikatnie pipetując 5 razy w górę i w dół za pomocą pipety 10 mL 
		UWAGA: Ważne jest, aby odczynniki wchodzące w skład mieszaniny reakcji kliknięcia były dodawane we wskazanej kolejności.</li>
		<li>Obracać przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Podczas obracania przygotuj i schłodź B1, B2 i B3 [patrz tabela materiałów].</li>
		<li>Jądra osadów przez odwirowanie przez 10 minut w temperaturze 2 500 x g w temperaturze 4 °C. Całkowicie usunąć mieszaninę reakcji kliknięcia i umyć osad przez delikatne ponowne zawieszenie w 10 ml PBS i odwirowanie przez 10 minut w temperaturze 2 500 x g w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Delikatnie zawiesić ponownie granulat jądrowy w 1 ml PBS i przenieść do probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml za pomocą końcówki pipety o dużym otworze. Jądra osadów przez wirowanie przez 10 minut w temperaturze 2 500 x g w temperaturze 4 °C. Całkowicie usunąć PBS i błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie. 
		UWAGA: W tym momencie protokół może zostać wstrzymany, a zamrożone jądra mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C. Rozmrażanie przez zamrożenie pomaga w późniejszej lizie, dlatego zaleca się błyskawiczne zamrożenie jąder nawet po przejściu do kroku 3.3 tego samego dnia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Liza jąder i fragmentacja DNA.
	<ol>
		<li>Rozmrozić jądra na lodzie i ponownie zawiesić w 500 μl buforu B1, pipetując w górę i w dół. Inkubować na lodzie przez 45 minut.</li>
		<li>Sonifikuj próbki 6 razy przez 30 s każda przy 40% amplitudzie za pomocą sondy mikrokońcówkowej 3 mm. Umieść próbki na lodzie na 30 s między impulsami. Po sonikacji próbki powinny być klarowne, nie mętne. 
		UWAGA: Warunki sonikacji powinny być zoptymalizowane dla poszczególnych sonikatorów. Szczegółowe instrukcje dotyczące optymalizacji warunków sonikacji można znaleźć w Leung et al.22.</li>
		<li>Resztki komórek osadu przez odwirowanie w temperaturze 14 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Rozmiar granulki powinien się znacznie zmniejszyć. Przefiltrować supernatant przez sitko do komórek 100 μM i zatrzymać przepływ.</li>
		<li>Dodać 500 μl buforu B2 do przefiltrowanego supernatantu. 900 μl tej próbki zostanie użyte w kroku 3.4.2.</li>
		<li>Pobrać podwielokrotność każdego warunku izolacji DNA (50 μl lub 1/20 objętości) i dodać 50 μl 2x roztwór wodorowęglanu SDS [patrz tabela materiałów]. Przejdź do protokołu izolacji DNA (krok 3.6).</li>
		<li>Pobrać podwielokrotność każdego warunku dla białka wejściowego (50 μl lub 1/20 objętości) i dodać 50 μl 2x bufor do próbki Laemmli, zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C. Użyć w kroku 3.5.6.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zwiąż biotynylowane DNA z kulkami pokrytymi streptawidyną.
	<ol>
		<li>Przygotuj kulki magnetyczne Streptawidyny T1, przenosząc 300 μl zawiesiny kulek do probówki do mikrofugi o pojemności 1,5 ml. Przygotuj jedną tubkę koralików na próbkę. Przemyj koraliki 3x za pomocą 1 ml buforu B2, wirując w celu ponownego zawieszenia, przykładając magnes do oddzielenia kulek i zasysając bufor do mycia. 
		UWAGA: Zoptymalizowane warunki wiązania skutkują maksymalizacją wydajności i minimalnym wiązaniem tła. Eksperymentalnie ustalono, że kulki magnetyczne Streptawidyny T1 mają znacznie większą zdolność wiązania niż kulki agarozowe, a także inne kulki Streptawidyny i mniej wiązania tła niż kulki Streptawidyny C1 (<silna klasa = "xfig">Figura 4A).</li>
		<li>Dodać 900 μl próbki z etapu 3.3.4. do umytych kulek i obracać przez noc w temperaturze 4 °C. 
		Uwaga: Nie wirować koralików po dodaniu do nich próbki. 
		UWAGA: Jeśli znaczne ilości DNA lub białka zostaną wyizolowane w nieznakowanej kontroli ujemnej, etap ten można skrócić z nocy do 4 godzin, aby zmniejszyć wiązanie tła.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyj kulki i wymyj vDNA i związane z nimi białka. 
	UWAGA: Zaleca się stosowanie końcówek filtrujących w pozostałych krokach.
	<ol>
		<li>Umieścić próbki w magnetycznym stojaku na probówki do mikrofugowania, usunąć supernatant, delikatnie zawiesić ponownie w 1 ml buforu B2, obracać w temperaturze 4 °C przez 5 minut.</li>
		<li>Powtórz krok 3.5.1 trzy razy.</li>
		<li>Umieścić próbki w magnetycznym stojaku na probówki do mikrofugowania, usunąć supernatant, delikatnie zawiesić ponownie w 1 ml buforu B3 i obracać w temperaturze 4 °C przez 5 minut.</li>
		<li>Przenieś 100 μl mieszaniny kulek (1/10 objętości) do nowej probówki w celu izolacji związanego DNA. Przyłóż tę rurkę do magnesu, usuń supernatant, ponownie zawieś kulki w 100 μl 1x roztworze wodorowęglanu SDS i przejdź do protokołu izolacji DNA (krok 3.6).</li>
		<li>Nanieść probówkę zawierającą pozostałą mieszaninę kulek o objętości 900 μl z kroku 3.5.3. na magnes, usunąć supernatant i ponownie zawiesić kulki w 50 μl 2x bufor do próbek Laemmli, aby wymyć kompleksy białkowe i DNA-białko.</li>
		<li>Próbki gotować w temperaturze 95 °C przez 15 minut, wirować, szybko wirować w mikrofugach i stosować magnes. Przenieść eluat do nowej probówki, błyskawicznie zamrozić i przechowywać w temperaturze -80 °C. 
		UWAGA: Użyj zaślepek, aby upewnić się, że rurki nie otwierają się podczas gotowania. 
		UWAGA: W tym momencie protokół może zostać wstrzymany, a próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez kilka tygodni.</li>
		<li>Analizuj próbki białek za pomocą barwienia Coomassie Blue, western blotting lub spektrometrii mas zgodnie ze standardowymi procedurami25. Reprezentatywne wyniki są pokazane w Rysunek 4 i <silna klasa="xfig">Rysunek 5. 
		UWAGA: Aby określić, czy wydajność białka jest wystarczająca do spektrometrii mas, 7,5 μl każdej próbki wykorzystuje się do analizy za pomocą barwienia Coomassie Blue i 7,5 μl do western blotting reprezentatywnego białka związanego z genomem wirusa (ICP4, ICP8 lub UL42). Ta sama objętość lizatów z kroku 3.3.6. są uruchamiane równolegle w celu kontroli poziomów białka wejściowego. Pozostała próbka (35 μl) jest następnie analizowana za pomocą spektrometrii mas, jak opisano wcześniej25.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja DNA
	<ol>
		<li>Inkubować próbki z etapów 3.3.5 i 3.5.4 w temperaturze 65 °C przez 4-16 godzin. W razie potrzeby usunąć próbkę z kulek magnetycznych.</li>
		<li>Ekstrahować próbki za pomocą 150 μl fenolu:chloroformu:alkoholu izoamylowego (PCI) i przenieść fazę wodną do nowej probówki.</li>
		<li>Ekstrahować pozostałą część PCI za pomocą 100 μl Tris-EDTA (TE) i dodać fazę wodną do nowej probówki.</li>
		<li>Ekstrahować próbki za pomocą 200 μl chloroformu: alkoholu izoamylowego (24:1).</li>
		<li>Oczyść fazę wodną za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z protokołem producenta. 
		UWAGA: Wskaźnik pH w buforze PB zmieni kolor na fioletowy po dodaniu do próbki. Dodać 10 μl 3M NaOAc pH 5,0, aby obniżyć pH próbki.</li>
		<li>Określ stężenie DNA za pomocą fluorometru. 
		UWAGA: Ten protokół zazwyczaj daje 100 - 400 ng DNA związanego z koralikami. Nie należy wykrywać DNA w eluacie kontroli ujemnej, do której nie dodano EdC w kroku 1.3.</li>
		<li>DNA może być przechowywane w probówce o niskiej zawartości wiązania DNA w temperaturze 4 lub -20 °C i może być wykorzystywane do PCR w czasie rzeczywistym lub wysokoprzepustowej analizy sekwencjonowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKnipe%2C+DM+%22Fields+virology%22">Fields virology</a>. , 6th, Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins Health. (2013).</li>
<li>Engel, E. A., Song, R., Koyuncu, O. O., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+biology+of+alpha+herpesviruses+with+MS-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Investigating the biology of alpha herpesviruses with MS-based proteomics.</a> Proteomics. 15, 1943-1956 (2015).</li>
<li>Wagner, L. M., DeLuca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+association+of+herpes+simplex+virus+ICP4+with+cellular+complexes+functioning+at+multiple+steps+in+PolII+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Temporal association of herpes simplex virus ICP4 with cellular complexes functioning at multiple steps in PolII transcription.</a> PloS One. 8, e78242(2013).</li>
<li>Taylor, T. J., Knipe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+of+herpes+simplex+virus+replication+compartments%3A+association+of+cellular+DNA+replication%2C+repair%2C+recombination%2C+and+chromatin+remodeling+proteins+with+ICP8%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Proteomics of herpes simplex virus replication compartments: association of cellular DNA replication, repair, recombination, and chromatin remodeling proteins with ICP8.</a> J Virol. 78, 5856-5866 (2004).</li>
<li>Fontaine-Rodriguez, E. C., Taylor, T. J., Olesky, M., Knipe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+of+herpes+simplex+virus+infected+cell+protein+27%3A+association+with+translation+initiation+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Proteomics of herpes simplex virus infected cell protein 27: association with translation initiation factors.</a> Virology. 330, 487-492 (2004).</li>
<li>Greco, T. M., Diner, B. A., Cristea, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Impact+of+Mass+Spectrometry-Based+Proteomics+on+Fundamental+Discoveries+in+Virology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Virol%22%5BJournal%5D)">The Impact of Mass Spectrometry-Based Proteomics on Fundamental Discoveries in Virology.</a> Annu Rev Virol. 1, 581-604 (2014).</li>
<li>Conwell, S. E., White, A. E., Harper, J. W., Knipe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+TRIM27+as+a+novel+degradation+target+of+herpes+simplex+virus+1+ICP0%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of TRIM27 as a novel degradation target of herpes simplex virus 1 ICP0.</a> J Virol. 89, 220-229 (2015).</li>
<li>Suk, H., Knipe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+the+herpes+simplex+virus+1+virion+protein+16+transactivator+protein+in+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of the herpes simplex virus 1 virion protein 16 transactivator protein in infected cells.</a> Proteomics. 15, 1957-1967 (2015).</li>
<li>Balasubramanian, N., Bai, P., Buchek, G., Korza, G., Weller, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+interaction+between+the+herpes+simplex+virus+type+1+exonuclease%2C+UL12%2C+and+the+DNA+double-strand+break-sensing+MRN+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Physical interaction between the herpes simplex virus type 1 exonuclease, UL12, and the DNA double-strand break-sensing MRN complex.</a> J Virol. 84, 12504-12514 (2010).</li>
<li>Sampath, P., Deluca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+ICP4%2C+TATA-binding+protein%2C+and+RNA+polymerase+II+to+herpes+simplex+virus+type+1+immediate-early%2C+early%2C+and+late+promoters+in+virus-infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Binding of ICP4, TATA-binding protein, and RNA polymerase II to herpes simplex virus type 1 immediate-early, early, and late promoters in virus-infected cells.</a> J Virol. 82, 2339-2349 (2008).</li>
<li>Amelio, A. L., McAnany, P. K., Bloom, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chromatin+insulator-like+element+in+the+herpes+simplex+virus+type+1+latency-associated+transcript+region+binds+CCCTC-binding+factor+and+displays+enhancer-blocking+and+silencing+activities%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A chromatin insulator-like element in the herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript region binds CCCTC-binding factor and displays enhancer-blocking and silencing activities.</a> J Virol. 80, 2358-2368 (2006).</li>
<li>Cliffe, A. R., Knipe, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+ICP0+promotes+both+histone+removal+and+acetylation+on+viral+DNA+during+lytic+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus ICP0 promotes both histone removal and acetylation on viral DNA during lytic infection.</a> J Virol. 82, 12030-12038 (2008).</li>
<li>Herrera, F. J., Triezenberg, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VP16-dependent+association+of+chromatin-modifying+coactivators+and+underrepresentation+of+histones+at+immediate-early+gene+promoters+during+herpes+simplex+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">VP16-dependent association of chromatin-modifying coactivators and underrepresentation of histones at immediate-early gene promoters during herpes simplex virus infection.</a> J Virol. 78, 9689-9696 (2004).</li>
<li>Kent, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((During+lytic+infection+herpes+simplex+virus+type+1+is+associated+with+histones+bearing+modifications+that+correlate+with+active+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">During lytic infection herpes simplex virus type 1 is associated with histones bearing modifications that correlate with active transcription.</a> J Virol. 78, 10178-10186 (2004).</li>
<li>Oh, J., Fraser, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+association+of+the+herpes+simplex+virus+genome+with+histone+proteins+during+a+lytic+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Temporal association of the herpes simplex virus genome with histone proteins during a lytic infection.</a> J Virol. 82, 3530-3537 (2008).</li>
<li>Catez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSV-1+genome+subnuclear+positioning+and+associations+with+host-cell+PML-NBs+and+centromeres+regulate+LAT+locus+transcription+during+latency+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">HSV-1 genome subnuclear positioning and associations with host-cell PML-NBs and centromeres regulate LAT locus transcription during latency in neurons.</a> PLoS Pathog. 8, e1002852(2012).</li>
<li>Everett, R. D., Murray, J., Orr, A., Preston, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+type+1+genomes+are+associated+with+ND10+nuclear+substructures+in+quiescently+infected+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus type 1 genomes are associated with ND10 nuclear substructures in quiescently infected human fibroblasts.</a> J Virol. 81, 10991-11004 (2007).</li>
<li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+minimum+herpes+simplex+virus+type+1+components+necessary+to+localize+transcriptionally+active+DNA+to+ND10%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Determination of minimum herpes simplex virus type 1 components necessary to localize transcriptionally active DNA to ND10.</a> J Virol. 77, 5821-5828 (2003).</li>
<li>Ishov, A. M., Maul, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+periphery+of+nuclear+domain+10+%28ND10%29+as+site+of+DNA+virus+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The periphery of nuclear domain 10 (ND10) as site of DNA virus deposition.</a> J Cell Biol. 134, 815-826 (1996).</li>
<li>Maroui, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latency+Entry+of+Herpes+Simplex+Virus+1+Is+Determined+by+the+Interaction+of+Its+Genome+with+the+Nuclear+Environment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Latency Entry of Herpes Simplex Virus 1 Is Determined by the Interaction of Its Genome with the Nuclear Environment.</a> PLoS Pathog. 12, e1005834(2016).</li>
<li>Sirbu, B. M., Couch, F. B., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+spatiotemporal+dynamics+of+proteins+at+replication+forks+and+in+assembled+chromatin+using+isolation+of+proteins+on+nascent+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Monitoring the spatiotemporal dynamics of proteins at replication forks and in assembled chromatin using isolation of proteins on nascent DNA.</a> Nat Protoc. 7, 594-605 (2012).</li>
<li>Leung, K. H., Abou El Hassan, M., Bremner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+efficient+method+to+purify+proteins+at+replication+forks+under+native+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">A rapid and efficient method to purify proteins at replication forks under native conditions.</a> BioTechniques. 55, 204-206 (2013).</li>
<li>Hobbs, W. E. 2nd, DeLuca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perturbation+of+cell+cycle+progression+and+cellular+gene+expression+as+a+function+of+herpes+simplex+virus+ICP0%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Perturbation of cell cycle progression and cellular gene expression as a function of herpes simplex virus ICP0.</a> J Virol. 73, 8245-8255 (1999).</li>
<li>Lomonte, P., Everett, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+type+1+immediate-early+protein+Vmw110+inhibits+progression+of+cells+through+mitosis+and+from+G%281%29+into+S+phase+of+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus type 1 immediate-early protein Vmw110 inhibits progression of cells through mitosis and from G(1) into S phase of the cell cycle.</a> J Virol. 73, 9456-9467 (1999).</li>
<li>Dembowski, J. A., DeLuca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+recruitment+of+nuclear+factors+to+productively+replicating+herpes+simplex+virus+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Selective recruitment of nuclear factors to productively replicating herpes simplex virus genomes.</a> PLoS Pathog. 11, e1004939(2015).</li>
<li>Dembowski, J. A., Dremel, S. E., DeLuca, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-Coupled+Recruitment+of+Viral+and+Cellular+Factors+to+Herpes+Simplex+Virus+Type+1+Replication+Forks+for+the+Maintenance+and+Expression+of+Viral+Genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Replication-Coupled Recruitment of Viral and Cellular Factors to Herpes Simplex Virus Type 1 Replication Forks for the Maintenance and Expression of Viral Genomes.</a> PLoS Pathog. 13, e1006166(2017).</li>
<li>Bjornberg, O., Nyman, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dUTPases+from+herpes+simplex+virus+type+1+and+mouse+mammary+tumour+virus+are+less+specific+than+the+Escherichia+coli+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">The dUTPases from herpes simplex virus type 1 and mouse mammary tumour virus are less specific than the Escherichia coli enzyme.</a> J Gen Virol. 77 (Pt 12), 3107-3111 (1996).</li>
<li>Chiou, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-+and+protein-scission+activities+of+ascorbate+in+the+presence+of+copper+ion+and+a+copper-peptide+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">DNA- and protein-scission activities of ascorbate in the presence of copper ion and a copper-peptide complex.</a> J Biochem. 94, 1259-1267 (1983).</li>
<li>Kennedy, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+consequences+of+copper+complexes+used+to+catalyze+bioorthogonal+click+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Cellular consequences of copper complexes used to catalyze bioorthogonal click reactions.</a> J Am Chem Soc. 133, 17993-18001 (2011).</li>
<li>Snel, B., Lehmann, G., Bork, P., Huynen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STRING%3A+a+web-server+to+retrieve+and+display+the+repeatedly+occurring+neighbourhood+of+a+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">STRING: a web-server to retrieve and display the repeatedly occurring neighbourhood of a gene.</a> Nucleic Acids Res. 28, 3442-3444 (2000).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten obejmuje wiele etapów, które, jeśli nie będą przestrzegane ostrożnie, mogą skutkować znacznym zmniejszeniem wydajności białka lub zanieczyszczeniem DNA komórkowego. Bardzo ważne jest, aby komórki stacjonarne były używane do wszystkich eksperymentów, aby zapewnić, że DNA komórkowe nie jest znakowane i oczyszczane. Można to potwierdzić przez brak komórkowych polimeraz DNA w próbce białka, ponieważ HSV-1 nie wykorzystuje komórkowej polimerazy DNA do syntezy genomu. Podczas etapów znakowania EdC i pobierania jąd...

Wirusy mają ograniczoną zdolność do wykonywania podstawowych funkcji i dlatego polegają na czynnikach gospodarza, aby ułatwić krytyczne aspekty infekcji, w tym ekspresję genów wirusa, replikację, naprawę, rekombinację i transport. Aktywność tych czynników gospodarza jest często wzmacniana przez białka kodowane przez wirusa. Ponadto wirusy muszą unikać wykrywania i zakłóceń przez odpowiedzi komórkowe na infekcję wirusową. W związku z tym interakcje wirusa z gospodarzem decydują o wyniku infekcji. Niezwykle ważne jest zrozumienie, w jaki sposób wirusy zmieniają środowisko komórkowe, aby dostosować maszynerię komórkową do ułatwienia procesów wirusowych. Szczególnie interesujące jest określenie, które czynniki i procesy oddziałują na genomy wirusów w całym cyklu zakaźnym.
Wirus opryszczki pospolitej typu 1 (HSV-1) to dwuniciowy wirus DNA, który infekuje znaczną część populacji ludzkiej. W ciągu pierwszej godziny od zakażenia genom wirusa dostaje się do jądra, gdzie następuje uporządkowana kaskada ekspresji genów wirusa w koordynacji z replikacją wirusowego DNA (vDNA) 1. W jądrze genomy podlegają regulacji epigenetycznej, ulegają naprawie i rekombinacji oraz są pakowane w kapsydy, tak że pierwsze wiriony potomne są wytwarzane w czasie krótszym niż sześć godzin. Kompleksowa ocena białek związanych z genomem wirusa w trakcie infekcji stworzy podstawy do zbadania szczegółów molekularnych procesów działających na genomy wirusowe i dostarczy informacji na temat czynników wirusowych i komórkowych zaangażowanych w różne etapy infekcji.
Poprzednie metody badania czynników gospodarza związanych z infekcją wirusową obejmowały oczyszczanie białek wirusowych z powinowactwem do analizy powiązanych białek komórkowych2,3,4,5,6,7,8,9. Te testy były kluczowe dla identyfikacji czynników komórkowych zaangażowanych w reakcje przeciwwirusowe gospodarza, jak również modyfikację chromatyny wirusa, ekspresję genów i naprawę DNA. Trudno jest jednak ustalić, czy interakcje zależą od związku z vDNA, a proteomika dostarcza jedynie wglądu w interakcje, które zachodzą w funkcji określonego czynnika wirusowego. Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) została wykorzystana do określenia, gdzie określone białka wirusowe i komórkowe wiążą się z genomami wirusów10,11,12,13,14,15 i fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) w połączeniu z immunocytochemią umożliwiły wizualizację czynników komórkowych, które kolokalizować z vDNA16,17,18,19,20. Testy te pozwalają na analizę przestrzenną i czasową. Jednak ograniczenia obejmują potrzebę wysoce specyficznych przeciwciał, ograniczoną czułość oraz potrzebę wcześniejszego wglądu w interakcje wirusa z gospodarzem. W związku z tym opracowaliśmy metodę opartą na iPOND (izolacja białek na powstającym DNA)21 i aniPOND (accelerated native iPOND)22 do selektywnego znakowania i oczyszczania vDNA z zakażonych komórek w celu bezstronnej identyfikacji białek związanych z genomem wirusa za pomocą spektrometrii mas. Projekt iPOND odegrał zasadniczą rolę w badaniu dynamiki widełek replikacji komórkowej.
W celu selektywnego oczyszczania genomów wirusowych z zakażonych komórek, replikujące vDNA jest znakowane nukleozydami modyfikowanymi etynylem, 5-etynylo-2'-deoksyurydyną (EdU) lub 5-etynylo-2'-deoksycytydyną (EdC) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1), a następnie kowalencyjną koniugację z azydkiem biotyny za pomocą chemii kliknięć, aby ułatwić jednoetapowe oczyszczanie genomów wirusowych i powiązanych białek na kulkach pokrytych streptawidyną (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). Co ważne, infekcje przeprowadzane są w komórkach stacjonarnych, które nie są zaangażowane w replikację DNA komórkowego w celu umożliwienia specyficznego znakowania vDNA. Ponadto zakażenie HSV-1 powoduje zatrzymanie cyklu komórkowego i hamuje replikację DNA komórkowego23,24. Wirus może być wstępnie znakowany przed infekcją w celu analizy białek związanych z przychodzącymi genomami wirusa (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A) lub znakowany podczas replikacji DNA w celu analizy białek związanych z nowo zsyntetyzowanym vDNA (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B)25. Co więcej, analiza pościgu impulsowego może być wykorzystana do zbadania natury białek związanych z widełkami replikacji wirusa (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C)26. Ponadto, zmodyfikowane etynylem vDNA może być kowalencyjnie sprzężone z fluoroforem w celu przestrzennego badania dynamiki białek (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2A i <silna klasa = "xfig" > Rysunek 3). Obrazowanie pozwala na bezpośrednią wizualizację vDNA i jest uzupełniającym podejściem do walidacji interakcji vDNA-białko i może być dostosowane do śledzenia genomów wirusa przez cały czas infekcji. Przewidujemy, że podejścia te mogą być dalej modyfikowane w celu zbadania dowolnego aspektu infekcji opryszczkowej, w tym latencji i reaktywacji, oraz w celu zbadania innych wirusów DNA. Co więcej, znakowanie za pomocą 5-etynylourydyny (UE) może pozwolić na analizę genomów wirusa RNA.

<table><tbody><tr><td>Komórki MRC-5</td><td>ATCC</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140-179</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże Dulbecco's Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>12800-082</td><td>Zastąpione 10% FBS, 2 mM L-glutamina, 12 mM&nbsp; (do wzrostu w kolbach) lub 30 mM (do wzrostu w szalkach) wodorowęglinian sodu</td></tr><tr><td>600 cm2 naczynie do hodowli tkankowych</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>166508</td><td></td></tr><tr><td>Tris Sól fizjologiczna buforowana (TBS), pH 7,4</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25,1 mM Tricine</td></tr><tr><td></td><td></td><td>HSV-1</td><td>Zapasy z mianami większymi niż 1x109 PFU/ml działają najlepiej</td></tr><tr><td>Sephadex G-25&nbsp; kolumna (kolumna odsalająca PD-10)</td><td>GE Healthcare</td><td>17085101</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-1</td><td></td></tr><tr><td>5&ostra;-etynylo-2&ostra;-deoksycytydyna (EdC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T511307</td><td>Rozpuść w DMSO, aby przygotować 40 mM bulionu, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>2&acute;-deoxycytydyna (deoksyC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3897</td><td>Rozpuścić w wodzie, aby przygotować 40 mM bulionu, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Bufor do ekstrakcji jądrowej (NEB)</td><td></td><td></td><td>Przygotuj świeży (20 mM Hepes pH 7,2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM sacharozy, 0,5% Igepal)</td></tr><tr><td>Skrobak do komórek</td><td>Bellco glass</td><td>7731-22000</td><td>Autoklaw przed użyciem</td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,2 (10x)</td><td></td><td></td><td>1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (przed użyciem rozcieńczyć do 1x w sterylnej wodzie)</td></tr><tr><td>Pięciowodny siarczan miedzi (II) (CuSO4-5H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C489</td><td>Przygotuj 100 mM zapasu i przechowuj w temperaturze 4 stopni; C przez okres do 1 miesiąca</td></tr><tr><td>(+) L-askorbinian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td>Świeżo przygotuj 100 mM bulionu i przechowuj na lodzie do czasu użycia</td></tr><tr><td>Azydek biotyny</td><td>Invitrogen</td><td>B10184</td><td>Przygotuj 10 mM bulionu w DMSO, podwielokrotność i przechowuj w temperaturze -20 &; C na okres do 1 roku&nbsp;</td></tr><tr><td>Click Reaction Mix</td><td></td><td></td><td>Przygotować bezpośrednio przed użyciem, dodając odczynniki we wskazanej kolejności (10 ml: 8,8 ml 1x PBS, 200 ml 100 mM CuSO4, 25 ml 10 mM azydu biotyny, 1 ml 100 mM askorbinianu sodu)&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Kompletny koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Roche</td><td>11697498001</td><td>Rozpuść w 1 ml wody, aby przygotować 50x bulion, można przechowywać w temperaturze 4 stopni; C przez okres do 1 tygodnia lub bezpośrednio dodać 1 tabletkę do 50 ml buforu</td></tr><tr><td>Bufor zamrażający</td><td></td><td></td><td>Przygotuj świeże (7 ml 100% glicerolu, 3 ml NEB, 200 &mu; L 50x inhibitor proteazy)</td></tr><tr><td>Bufor B1</td><td></td><td></td><td>Przygotuj świeży (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x inhibitor proteazy)</td></tr><tr><td>Bufor B2</td><td></td><td></td><td>Przygotuj świeży (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0,5% Igepal, 1x inhibitor proteazy)</td></tr><tr><td>Bufor B3</td><td></td><td></td><td>Przygotuj świeży (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x inhibitor proteazy)</td></tr><tr><td>Vibra Cell Ultra Sonic Processer wyposażony w sondę mikrokońcówkową 3 mm</td> Filtr siatkowy <td>Sonics</td><td>VCX 130</td><td></td></tr><tr><td>Falcon</td><td></td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Streptavidin T1</td><td>Life Technologies</td><td>65601</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Rotator Mini-Tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>260750F</td><td></td></tr><tr><td>2x Laemmli bufor</td><td></td><td></td> do próbek <td>Wymieszaj 400 mg SDS, 2 ml 100% glicerolu, 1,25 ml 1 M Tris (pH 6,8) i 10 mg błękitu bromofenolowego w 8 ml wody. Przechowywać w 4&nbsp; &deg; C przez okres do 6 miesięcy. Przed użyciem dodać 1 M DTT do końcowego stężenia 200 mM.</td></tr><tr><td>Zamki do probówki 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9679153</td><td></td></tr><tr><td>Standardowe odczynniki</td><td></td><td></td><td></td>do blottingu</tr><tr><td>western NOVEX Zestaw do barwienia na niebiesko koloidalne</td><td>Invitrogen</td><td>LC6025</td><td></td></tr><tr><td>12-dołkowe naczynie do hodowli tkankowych</td><td>Corning</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Autoklaw Fisher Scientific</td><td>12-545-100</td><td>przed użyciem</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-552-5</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldehyd</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>15710</td><td>Rozcieńczyć do 3,7% w 1x PBS przed użyciem</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1605</td><td>Przygotuj 3% w 1x PBS</td></tr><tr><td>Bufor permeabilizacyjny (0,5% Triton-X 100)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Przygotuj 0,5% Triton-X 100 w 1x PBS</td></tr><tr><td>Koktajl reakcji na kliknięcie - Zestaw do obrazowania Click-iT EdU Alexa Fluor 488</td><td>Sondy molekularne</td><td>C10337</td><td>Przygotuj zgodnie z protokołem producenta</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td>Przygotuj 10 mg / ml w wodzie, można przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C przez okres do 1 roku</td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało pierwszorzędowe anty-ICP8</td><td>Abcam</td><td>ab20194</td><td>Użyj rozcieńczenia 1:200 w 1x PBS</td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało pierwszorzędowe anty-UL42 (2H4)</td><td>Abcam</td><td>ab19311</td><td>Użyj rozcieńczenia 1:200 w 1x PBS</td></tr><tr><td>Goat anty-mysie przeciwciało drugorzędowe sprzężone 594</td><td>Life Technologies</td><td>a11005</td><td>Użyj rozcieńczenia 1:500 w 1x PBS</td></tr><tr><td>Immu-mount</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>9990402</td><td></td></tr><tr><td>2x SDS-roztwór wodorowęglanu</td><td></td><td></td><td>2% SDS, 200 mM NaHCO3</td></tr><tr><td>Fenol:chloroform:alkohol</td><td></td><td></td> izoamylowy <td>Wymieszać 25:24:1 co najmniej 1 dzień przed użyciem, przechowywać w temperaturze 4 stopni; C w ciemności</td></tr><tr><td>chloroform: alkohol</td><td></td><td></td> izoamylowy <td>Wymieszaj 24:1 co najmniej 1 dzień przed użyciem, przechowuj w temperaturze pokojowej w ciemności</td></tr><tr><td>10x Tris EDTA (TE), pH 8,0</td><td></td><td></td><td>100 mM Tris, 10 mM EDTA (rozcieńczyć do 1x przed użyciem)</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania Qiaquick PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>3 M octan sodu pH 5,2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0 Fluorometr</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania Qubit dsDNA HS</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do testów kubitowych</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny wyposażony w oprogramowanie</td><td></td><td></td><td></td>do</tr><tr>obrazowania <td></td><td></td><td></td><td>Mikrowirówka do probówek 1,5 ml</td></tr><tr><td>Wirówka stołowa do probówek 15 i 50 ml Komórka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> inkubator kultur Komora</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>bezpieczeństwa biologicznego</td></tr><tr><td>Bloki</td><td></td><td></td> grzewcze <td>65 &deg; C oraz 95 &deg; Z</td></tr></tbody></table>

oczyszczanie dna wirusa w celu identyfikacji powiązanych białek wirusowych i komórkowych

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

Celem tego protokołu jest wyizolowanie DNA wirusa opryszczki pospolitej typu 1 (HSV-1) z zainfekowanych komórek w celu identyfikacji powiązanych białek wirusowych i komórkowych za pomocą spektrometrii mas. Chociaż białka, które wchodzą w interakcje z genomami wirusów, odgrywają główną rolę w określaniu wyniku infekcji, kompleksowa analiza białek związanych z genomem wirusa nie była wcześniej możliwa. Tutaj demonstrujemy metodę, która umożliwia bezpośrednie oczyszczanie genomów HSV-1 z zakażonych komórek. Replikujące się DNA wirusa jest selektywnie znakowane zmodyfikowanymi nukleotydami, które zawierają alkinową grupę funkcyjną. Wyznakowane DNA jest następnie specyficznie i nieodwracalnie znakowane poprzez kowalencyjne przyłączenie azydku biotyny za pomocą katalizowanej miedzią(I) cykloaddycji azydku alkiny lub reakcji klikania. DNA znakowane biotyną jest oczyszczane na kulkach pokrytych streptawidyną, a powiązane białka są eluowane i identyfikowane za pomocą spektrometrii mas. Metoda ta umożliwia selektywne celowanie i izolację widełek replikacyjnych HSV-1 lub całych genomów ze złożonych środowisk biologicznych. Co więcej, adaptacja tego podejścia pozwoli na badanie różnych aspektów infekcji wirusem opryszczki, a także badanie genomów innych wirusów DNA.

Zastosowanie chemii klikalnej do oczyszczania DNA z komórek zostało po raz pierwszy zrealizowane za pomocą metody iPOND21. Celem iPOND jest oczyszczanie komórkowych widełek replikacyjnych w celu identyfikacji powiązanych z nimi białek. Zaadaptowaliśmy tę technikę do specyficznych badań interakcji białkowych z vDNA podczas infekcji. Modyfikacja tego podejścia w celu znakowania genomów wirusowych EdC (Rysunek 1), w połączeniu z synchroni...

Celem tego protokołu jest specyficzne oznaczanie i selektywne izolowanie wirusowego DNA z zakażonych komórek w celu scharakteryzowania białek związanych z genomem wirusa.

Oczyszczanie DNA wirusa w celu identyfikacji powiązanych białek wirusowych i komórkowych

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

Ogólnym celem tej metody jest oczyszczenie DNA wirusa opryszczki pospolitej typu 1 z zakażonych komórek w celu analizy proteomicznej białek związanych z genomem wirusa. Metoda ta dostarcza kluczowych informacji na temat udziału czynników komórkowych i zakażenia wirusem opryszczki. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją dostosować do bezpośredniego oczyszczania różnych populacji wirusowego DNA z zakażonych komórek, co pozwala na analizę wielu aspektów infekcji.Rozpocznij tę procedurę od hodowli pięciu komórek MRC, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie rozcieńczyć HSV-1 w zimnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej trisem lub TBS. W kolejnych krokach ważne jest, aby wyłączyć dmuchawę i kaptur do hodowli tkankowych, aby zapobiec wysychaniu komórek.Za pomocą pipety przenieś pożywkę wzrostową z komórek MRC 5 do sterylnej butelki, aby dodać ją z powrotem do komórek po zakażeniu. Zainfekuj komórki, dodając do nich siedem mililitrów rozcieńczonego wirusa. Kołysz komórkami co 10 minut przez godzinę w temperaturze pokojowej.Po wchłonięciu odessać innokulum, przepłukać komórki 50 mililitrami TBS o temperaturze pokojowej i zastąpić oryginalną pożywkę wzrostową. Następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w obecności 5% dwutlenku węgla. Po rozpoczęciu replikacji wirusowego DNA, około czterech godzin po zakażeniu, oznacz replikację wirusowego DNA.Aby to zrobić, rozcieńczyć EdC w jednym mililitrze pożywki wzrostowej i dodać ją do pożywki do hodowli komórkowych zakażonych komórek przez dwie do czterech godzin. Aby zebrać jądra, zastąp pożywkę wzrostową 20 mililitrami buforu do ekstrakcji jąder i inkubuj przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza z okazjonalnym kołysaniem. Po inkubacji zeskrobać jądra z płytki za pomocą skrobaka do komórek i przenieść je do 50-mililitrowej stożkowej rurki na lodzie.Wirować przez 10 minut w temperaturze 2 500 x g i czterech stopniach Celsjusza, aby uzyskać granulki jąder. Po odwirowaniu odrzucić sklarowany osad. Delikatnie usuń pastylkę jądrową w 10 mililitrach buforu fosforanowego, soli fizjologicznej lub PBS i przenieś ją do 50-mililitrowej stożkowej probówki.Następnie odwirować próbkę jak poprzednio. Po całkowitym usunięciu PBS ponownie zawiesić pastylkę jądrową w 10 mililitrach mieszanki reakcji klikającej, delikatnie pipetując pięć razy w górę iw dół za pomocą 10-mililitrowej pipety. Obracać próbkę przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie granulować jądra jak poprzednio.Całkowicie usuń mieszaninę szybkiej reakcji, a następnie umyj granulkę, delikatnie zawieszając ją ponownie w 10 mililitrach PBS i ponownie odwirowując. Teraz ostrożnie ponownie zawiesić pastylkę jądrową w jednym mililitrowym PBS i przenieść roztwór do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej. Po odwirowaniu całkowicie usunąć PBS i błyskawicznie zamrozić osad w ciekłym azocie.W tym momencie granulat może być przechowywany w temperaturze 80 stopni Celsjusza lub procedura może być kontynuowana. Aby lizować jądra i fragmentować DNA, ponownie zawiesić rozmrożone jądra w 500 mikrolitrach buforu B1, pipetując w górę iw dół. Inkubować zawiesinę na lodzie przez 45 minut.Następnie poddaj próbki działaniu sonikacji sześć razy przez 30 sekund każda przy amplitudzie 40%, używając trzymilimetrowej sondy mikrokońcówkowej. Umieścić próbki na lodzie na co najmniej 30 sekund między impulsami. Po sonikacji próbki powinny być klarowne, nie mętne.Osadzaj resztki komórek, wirując w temperaturze 14 000 x G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wielkość osadu powinna się znacznie zmniejszyć, przefiltrować supernatant przez sitko o wielkości komórek 100 mikronów i utrzymać przepływ. Następnie dodać 500 mikrolitrów buforu B2 do przefiltrowanego supernatantu.Aby związać biotynylowane DNA z kulkami pokrytymi streptawidyną, przygotuj kulki magnetyczne streptawidyny, przenosząc 300 mikrolitrów zawiesiny kulek do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej. Przygotuj jedną tubkę koralików na próbkę. Umyj kulki trzykrotnie mililitrem buforu B2, wirując w celu ponownego zawieszenia, przykładając do magnesu w celu oddzielenia kulek i zasysając bufor do mycia.Następnie dodaj 900 mikrolitrów próbki do umytych kulek. Pozostała część próbki zostanie wykorzystana do wejściowej izolacji DNA i białka. Obracaj zawieszenie przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnego dnia umieść próbki w magnetycznym stojaku na probówki do mikrofug i usuń supernatant. Delikatnie ponownie zawiesić kulki w jednym mililitrze buforu B2, a następnie obracać w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Ponownie usunąć supernatant za pomocą magnetycznego stojaka na probówki do mikrofugów.Tym razem delikatnie ponownie zawieś koraliki w jednym mililitrowym buforze B3 i obracaj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Po usunięciu supernatantu z mieszaniny kulek za pomocą magnesu, ponownie zawiesić kulki w 50 mikrolitrach 2x buforu do próbek Laemmli, aby nawiązywać do kompleksów białkowych DNA. Następnie gotuj próbki w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 15 minut.Zmieszaj mieszankę, a następnie szybko odwiruj próbki w mikrofudze. Nałóż próbki na magnes i przenieś przydział do nowej probówki. Na koniec błyskawicznie zamroź próbki i przechowuj je w temperaturze 80 stopni Celsjusza.Wykonaj analizę białka zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Znakowanie EdC prowadzono przez zero, 20, 40 lub 60 minut, a następnie oczyszczano z DNA wirusa i powiązanych białek. Wyluzowane białka poddano barwieniu coomassie blue i western blot przeciwciałem specyficznym dla białek wiążących wirusowe DNA, ICP4 i UL42.Strzałka wskazuje streptawidynę, która została usunięta z kulek podczas elucji, która jest obecna w każdych warunkach. Białka wyizolowane tą metodą poddawane są następnie spektrometrii mas. Wykres kołowy ilustruje liczbę białek w każdej kategorii funkcjonalnej, które okazały się być związane z typem wirusa opryszczki pospolitej w genomach po sześciu godzinach od zakażenia.Dokładniejsze przyjrzenie się interakcjom białko-białko między zidentyfikowanymi białkami przeprowadzono przy użyciu bazy danych sieci asocjacji funkcjonalnych białek łańcuchowych. Wyniki ujawniają podkompleksy białek, które funkcjonują razem w tym samym procesie biologicznym. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oczyścić DNA wirusa z zainfekowanych komórek w celu badania proteomicznego białek związanych z genomem wirusa.Tę technikę można wykonać w ciągu trzech do czterech dni. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o podjęciu środków ostrożności, aby zapobiec zanieczyszczeniu próbek DNAzą lub proteazą. Oprócz tej procedury można wykonać inne metody, takie jak immunofluorescencja, w celu zweryfikowania charakteru DNA wirusa znakowanego EdC.Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się wirusologią opryszczki do zbadania funkcji białek gospodarza i infekcji wirusowych.

purification-viral-dna-for-identification-associated-viral-cellular

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Genom wirusa grypy typu A składa się z ośmiu oddzielnych kompleksów RNA i białek, zwanych wirusowymi kompleksami rybonukleoproteinowymi (vRNP). Niniejsza praca opisuje oczyszczanie vRNP wirusa grypy A w gradiencie glicerolu oraz ich wizualizację za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Oczyszczanie i wizualizacja kompleksów rybonukleoprotein wirusa grypy A

Opisujemy proces izolacji wysokiej czystości DNA nukleokapsydu herpeswirusa z zainfekowanych komórek. Końcowe DNA odzyskane z roztworu charakteryzuje się wysokim stężeniem i czystością, co czyni je idealnym do sekwencjonowania wysokoprzepustowego, reakcji PCR o wysokiej wierności oraz transfekcji w celu otrzymania nowych rekombinantów wirusowych.

Przygotowanie viralnego DNA z nukleokapsydów

Tandemowa puryfikacja powinowactwa (TAP) jest skuteczną metodą identyfikacji białek wiążących. W ramach dowodu koncepcji metodologię tę zastosowano do dobrze scharakteryzowanego czynnika inicjacji translacji eIF4E w celu koprecypitacji czynników komórkowych gospodarza zaangażowanych w inicjację translacji. Metoda ta może być łatwo zaadaptowana do dowolnego białka komórkowego lub wirusowego.

Identyfikacja partnerów oddziaływań białkowych z wykorzystaniem tandemowej oczyszczania powinowactwa

Genomika pojedynczych wirusów (SVG) to metoda izolacji i amplifikacji genomów pojedynczych wirionów. Zawiesiny wirusowe mieszaniny różnych szczepów są sortowane za pomocą cytometrii przepływowej na preparat mikroskopowy z osobnymi studzienkami zawierającymi agarozę, co pozwala na przechwycenie wirionu i ograniczenie fragmentacji genomu podczas dalszej obróbki. Amplifikacja całego genomu jest przeprowadzana za pomocą wielokrotnej amplifikacji z wypieraniem (MDA), w wyniku czego otrzymuje się...

Izolacja i analiza genomu pojedynczych wirionów z wykorzystaniem metody „Single Virus Genomics”

Wirusy grypy replikują swój genom RNA w powiązaniu z chromatyną komórki gospodarza. W niniejszej pracy przedstawiamy metodę oczyszczania nienaruszonych kompleksów wirusowych rybonukleoprotein z chromatyny zainfekowanych komórek. Oczyszczone kompleksy wirusowe można analizować zarówno za pomocą techniki Western blot, jak i metody przedłużania starterów w celu oceny zawartości białek i RNA.

Oczyszczanie powinowactwem kompleksów rybonukleoprotein wirusa grypy z chromatyny zakażonych komórek

Korzystając z przykładu dróg oddechowych mukowiscydozy, manuskrypt przedstawia kompleksowy przepływ pracy obejmujący kombinację podejść metagenomicznych i metatranskryptomicznych w celu scharakteryzowania społeczności mikrobiologicznych i wirusowych w próbkach związanych ze zwierzętami.

Oczyszczanie nieczystości: sekwencjonowanie metagenomów i metatranskryptomów ze złożonych próbek związanych ze zwierzętami

Oferujemy nowatorską strategię izolowania przedziałów replikacyjnych wirusa (RC) od komórek ludzkich zakażonych adenowirusem (Ad). Podejście to reprezentuje system bezkomórkowy, który może pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów molekularnych regulujących replikację i ekspresję genomu wirusa, a także regulację interakcji wirus-gospodarz ustalonych w RC.

Izolacja frakcji subjądrowych wzbogaconych w przedziały replikacji wirusa z normalnych komórek ludzkich zakażonych adenowirusem

Tutaj prezentujemy nowe podejście do identyfikacji wirusów roślinnych za pomocą dwuniciowych genomów DNA. Stosujemy standardowe metody ekstrakcji DNA i RNA z zakażonych liści oraz przeprowadzamy sekwencjonowanie nowej generacji. Narzędzia bioinformatyczne łączą sekwencje w kontigi, identyfikują kontigi reprezentujące genomy wirusów i przypisują genomy do grup taksonomicznych.

Połączenie analizy DNA w surowej ekstrakcji wirionu z analizą RNA z zakażonych liści w celu odkrycia nowych genomów wirusów

Prezentowany tutaj jest protokół dla metody obrazowania fluorescencyjnego, multiplex immunofluorescencyjna metodawykrywania DNA, RNA i proteiny (MICDDRP), metoda zdolna do jednoczesnej fluorescencyjnej wizualizacji pojedynczych komórek białka wirusowego i kwasów nukleinowych o różnym typie i nici. Takie podejście można zastosować do różnych systemów.

Obrazowanie fluorescencyjne z multipleksem pojedynczych komórek w celu wizualizacji wirusowych kwasów nukleinowych i białek oraz monitorowania zakażeń HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika i grypy

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania epitopów neutralizacji na cząsteczkach wirusopodobnych wyświetlających antygen (VLP). Immunoprecypitację VLP pochodzących z ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV) przeprowadza się przy użyciu przeciwciał monoklonalnych specyficznych dla glikoprotein otoczkowych sprzężonych z kulkami magnetycznymi sprzężonymi z białkiem G. Przechwycone VLP są następnie poddawane analizie SDS-PAGE i Western blot przy użyciu przeciwciał specyficznych dla białka rdzenia...

Wykrywanie epitopów wrażliwych na neutralizację w antygenach wyświetlanych na szczepionkach opartych na cząsteczkach wirusopodobnych (VLP) za pomocą testu wychwytywania

Tutaj opisujemy nowo opracowany multipleksowy fluorescencyjny test immunologiczny, który wykorzystuje system cytometrii z podwójnym przepływem reporterowym do jednoczesnego wykrywania dwóch unikalnych epitopów białka kolca na nienaruszonych cząsteczkach wirusa SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2) zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej, które zostały wychwycone przez mikrosfery magnetyczne sprzężone z enzymem konwertującym angiotensynę.

Profilowanie epitopów białek powierzchniowych na cząsteczkach wirusa za pomocą strategii multipleksu dual-reporter

Poznaj metodę oczyszczania DNA wirusa HSV-1 z zainfekowanych komórek MRC-5 w celu analizy proteomicznej białek związanych z genomem wirusowym. Technika ta pozwala identyfikować czynniki komórkowe zaangażowane w infekcję.

Oczyszczanie DNA wirusa w celu identyfikacji powiązanych białek wirusowych i komórkowych

Przeglądaj więcej filmów