Oczyszczanie DNA wirusa w celu identyfikacji powiązanych białek wirusowych i komórkowych
31 sierpnia 2017
Celem tego protokołu jest specyficzne oznaczanie i selektywne izolowanie wirusowego DNA z zakażonych komórek w celu scharakteryzowania białek związanych z genomem wirusa.
Ogólnym celem tej metody jest oczyszczenie DNA wirusa opryszczki pospolitej typu 1 z zakażonych komórek w celu analizy proteomicznej białek związanych z genomem wirusa. Metoda ta dostarcza kluczowych informacji na temat udziału czynników komórkowych i zakażenia wirusem opryszczki. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją dostosować do bezpośredniego oczyszczania różnych populacji wirusowego DNA z zakażonych komórek, co pozwala na analizę wielu aspektów infekcji.
Rozpocznij tę procedurę od hodowli pięciu komórek MRC, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie rozcieńczyć HSV-1 w zimnym roztworze soli fizjologicznej buforowanej trisem lub TBS. W kolejnych krokach ważne jest, aby wyłączyć dmuchawę i kaptur do hodowli tkankowych, aby zapobiec wysychaniu komórek.
Za pomocą pipety przenieś pożywkę wzrostową z komórek MRC 5 do sterylnej butelki, aby dodać ją z powrotem do komórek po zakażeniu. Zainfekuj komórki, dodając do nich siedem mililitrów rozcieńczonego wirusa. Kołysz komórkami co 10 minut przez godzinę w temperaturze pokojowej.
Po wchłonięciu odessać innokulum, przepłukać komórki 50 mililitrami TBS o temperaturze pokojowej i zastąpić oryginalną pożywkę wzrostową. Następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w obecności 5% dwutlenku węgla. Po rozpoczęciu replikacji wirusowego DNA, około czterech godzin po zakażeniu, oznacz replikację wirusowego DNA.
Aby to zrobić, rozcieńczyć EdC w jednym mililitrze pożywki wzrostowej i dodać ją do pożywki do hodowli komórkowych zakażonych komórek przez dwie do czterech godzin. Aby zebrać jądra, zastąp pożywkę wzrostową 20 mililitrami buforu do ekstrakcji jąder i inkubuj przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza z okazjonalnym kołysaniem. Po inkubacji zeskrobać jądra z płytki za pomocą skrobaka do komórek i przenieść je do 50-mililitrowej stożkowej rurki na lodzie.
Wirować przez 10 minut w temperaturze 2 500 x g i czterech stopniach Celsjusza, aby uzyskać granulki jąder. Po odwirowaniu odrzucić sklarowany osad. Delikatnie usuń pastylkę jądrową w 10 mililitrach buforu fosforanowego, soli fizjologicznej lub PBS i przenieś ją do 50-mililitrowej stożkowej probówki.
Następnie odwirować próbkę jak poprzednio. Po całkowitym usunięciu PBS ponownie zawiesić pastylkę jądrową w 10 mililitrach mieszanki reakcji klikającej, delikatnie pipetując pięć razy w górę iw dół za pomocą 10-mililitrowej pipety. Obracać próbkę przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie granulować jądra jak poprzednio.
Całkowicie usuń mieszaninę szybkiej reakcji, a następnie umyj granulkę, delikatnie zawieszając ją ponownie w 10 mililitrach PBS i ponownie odwirowując. Teraz ostrożnie ponownie zawiesić pastylkę jądrową w jednym mililitrowym PBS i przenieść roztwór do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej. Po odwirowaniu całkowicie usunąć PBS i błyskawicznie zamrozić osad w ciekłym azocie.
W tym momencie granulat może być przechowywany w temperaturze 80 stopni Celsjusza lub procedura może być kontynuowana. Aby lizować jądra i fragmentować DNA, ponownie zawiesić rozmrożone jądra w 500 mikrolitrach buforu B1, pipetując w górę iw dół. Inkubować zawiesinę na lodzie przez 45 minut.
Następnie poddaj próbki działaniu sonikacji sześć razy przez 30 sekund każda przy amplitudzie 40%, używając trzymilimetrowej sondy mikrokońcówkowej. Umieścić próbki na lodzie na co najmniej 30 sekund między impulsami. Po sonikacji próbki powinny być klarowne, nie mętne.
Osadzaj resztki komórek, wirując w temperaturze 14 000 x G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wielkość osadu powinna się znacznie zmniejszyć, przefiltrować supernatant przez sitko o wielkości komórek 100 mikronów i utrzymać przepływ. Następnie dodać 500 mikrolitrów buforu B2 do przefiltrowanego supernatantu.
Aby związać biotynylowane DNA z kulkami pokrytymi streptawidyną, przygotuj kulki magnetyczne streptawidyny, przenosząc 300 mikrolitrów zawiesiny kulek do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej. Przygotuj jedną tubkę koralików na próbkę. Umyj kulki trzykrotnie mililitrem buforu B2, wirując w celu ponownego zawieszenia, przykładając do magnesu w celu oddzielenia kulek i zasysając bufor do mycia.
Następnie dodaj 900 mikrolitrów próbki do umytych kulek. Pozostała część próbki zostanie wykorzystana do wejściowej izolacji DNA i białka. Obracaj zawieszenie przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Następnego dnia umieść próbki w magnetycznym stojaku na probówki do mikrofug i usuń supernatant. Delikatnie ponownie zawiesić kulki w jednym mililitrze buforu B2, a następnie obracać w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Ponownie usunąć supernatant za pomocą magnetycznego stojaka na probówki do mikrofugów.
Tym razem delikatnie ponownie zawieś koraliki w jednym mililitrowym buforze B3 i obracaj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Po usunięciu supernatantu z mieszaniny kulek za pomocą magnesu, ponownie zawiesić kulki w 50 mikrolitrach 2x buforu do próbek Laemmli, aby nawiązywać do kompleksów białkowych DNA. Następnie gotuj próbki w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 15 minut.
Zmieszaj mieszankę, a następnie szybko odwiruj próbki w mikrofudze. Nałóż próbki na magnes i przenieś przydział do nowej probówki. Na koniec błyskawicznie zamroź próbki i przechowuj je w temperaturze 80 stopni Celsjusza.
Wykonaj analizę białka zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Znakowanie EdC prowadzono przez zero, 20, 40 lub 60 minut, a następnie oczyszczano z DNA wirusa i powiązanych białek. Wyluzowane białka poddano barwieniu coomassie blue i western blot przeciwciałem specyficznym dla białek wiążących wirusowe DNA, ICP4 i UL42.
Strzałka wskazuje streptawidynę, która została usunięta z kulek podczas elucji, która jest obecna w każdych warunkach. Białka wyizolowane tą metodą poddawane są następnie spektrometrii mas. Wykres kołowy ilustruje liczbę białek w każdej kategorii funkcjonalnej, które okazały się być związane z typem wirusa opryszczki pospolitej w genomach po sześciu godzinach od zakażenia.
Dokładniejsze przyjrzenie się interakcjom białko-białko między zidentyfikowanymi białkami przeprowadzono przy użyciu bazy danych sieci asocjacji funkcjonalnych białek łańcuchowych. Wyniki ujawniają podkompleksy białek, które funkcjonują razem w tym samym procesie biologicznym. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oczyścić DNA wirusa z zainfekowanych komórek w celu badania proteomicznego białek związanych z genomem wirusa.
Tę technikę można wykonać w ciągu trzech do czterech dni. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o podjęciu środków ostrożności, aby zapobiec zanieczyszczeniu próbek DNAzą lub proteazą. Oprócz tej procedury można wykonać inne metody, takie jak immunofluorescencja, w celu zweryfikowania charakteru DNA wirusa znakowanego EdC.
Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się wirusologią opryszczki do zbadania funkcji białek gospodarza i infekcji wirusowych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Celem niniejszego protokołu jest oczyszczenie DNA wirusa opryszczki typu 1 (Herpes Simplex virus type one) z zainfekowanych komórek w celu przeprowadzenia analizy proteomicznej białek związanych z genomem wirusa. Pozwala to na uzyskanie wiedzy na temat roli czynników komórkowych w infekcji wirusem opryszczki.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Wirusologia
- Proteomika
- Biologia komórki
Wstęp
- Wirus opryszczki prostego typu 1 (HSV-1) jest powszechnym patogenem wirusowym.
- Zrozumienie białek związanych z genomem wirusa jest kluczowe dla rozwoju terapii.
- Czynniki komórkowe odgrywają istotną rolę w dynamice infekcji wirusowej.
- Obecne metody izolacji wirusowego DNA mogą zostać udoskonalone pod kątem swoistości i wydajności.
Cel badania
- Izolacja DNA wirusowego z zainfekowanych komórek.
- Analiza białek związanych z genomem wirusowym.
- Adaptacja metody do różnych populacji DNA wirusowego.
Zastosowane metody
- Hodowla komórek MRC 5.
- Rozcieńczanie HSV-1 w zimnym soli buforowej z TRIS (TBS).
- Wyłączenie nadmuchu w dygestorium do hodowli komórkowych w celu zapobiegania wysychaniu komórek.
- Postępowanie zgodnie ze szczegółowym protokołem dla etapów oczyszczania.
Główne wyniki
- Skuteczne oczyszczanie DNA HSV-1 z zainfekowanych komórek.
- Identyfikacja białek związanych z genomem wirusa.
- Wnioski dotyczące interakcji między czynnikami komórkowymi a infekcją wirusową.
- Adaptacyjność metody do różnych populacji wirusowego DNA.
Wnioski
- Metoda ta skutecznie izoluje DNA wirusowe do analiz proteomicznych.
- Umożliwia ona lepsze zrozumienie mechanizmów infekcji wirusowych.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować identyfikację celów terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Bezpośrednie oczyszczanie DNA HSV-1 z zainfekowanych komórek umożliwia kompleksową identyfikację białek wirusowych i gospodarza związanych z replikującymi się genomami wirusa. Możliwość ta usprawnia mechanistyczną redukcję ryzyka oraz walidację celów na styku wirologii i proteomiki, zwiększając pewność prognostyczną w fazie wczesnego odkrywania. Adaptowalność tej metody do innych wirusów DNA sprawia, że stanowi ona wielokrotnie wykorzystywalną platformę do badań interakcji wirus-gospodarz w obrębie całego portfolio.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie kompleksów białkowych w widełkach replikacji wirusowej w celu uzyskania wglądu w mechanizmy ich działania.
- Wspiera walidację funkcjonalną celów poprzez mapowanie powiązań białek gospodarza i wirusa z wirusowym DNA.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez ujawnienie czynników komórkowych krytycznych dla wyników infekcji.
- Stanowi podstawę do zwiększenia pewności predykcyjnej w wyborze celów przeciwwirusowych.
Przesiew i opracowanie testu
- Przygotowuje zwalidowane kompleksy wirusowego DNA i białek do dalszych analiz z wykorzystaniem spektrometrii mas.
- Standaryzuje izolację DNA specyficznego dla replikacji w celu uzyskania powtarzalnych wyników badań proteomicznych.
- Generuje ilościowe dane dotyczące asocjacji białek, które służą do opracowania strategii screeningu związków.
- Umożliwia skalowalną adaptację do różnych populacji wirusów lub etapów infekcji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Powiązana wyniki proteomiczne z istotnymi dla przebiegu choroby interakcjami wirus-gospodarz w celu odkrycia biomarkerów translacyjnych.
- Wspiera ciągłość procesu od etapu odkryć po przedkliniczną walidację mechanizmów przeciwwirusowych.
- Zmniejsza ryzyko związane z decyzjami o dalszym rozwoju poprzez wyjaśnienie czynników zależności gospodarza w procesie infekcji.
- Zapewnia kontekst mechanistyczny dla wyboru i walidacji modeli przedklinicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje etapy wczesnego odkrywania i identyfikacji związków wiodących, umożliwiając bezpośrednią analizę kompleksów białek wirusowo-gospodarz oraz wspierając późniejsze badania przesiewowe i badania translacyjne.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących oddziaływań między genomem a białkami wirusowymi oraz mapowanie szlaków sygnałowych.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki proteomiczne do opracowywania testów.
- Analityka: Umożliwia identyfikację i kategoryzację powiązanych białek w oparciu o spektrometrię mas.
- Badania translacyjne: Łączy dane o białkach wirusowo-gospodarz z mechanizmami istotnymi dla przebiegu choroby i strategiami poszukiwania biomarkerów.
- Zastosowania w przedsiębiorstwach: Możliwość adaptacji do innych wirusów DNA oraz modeli infekcji w celu uzyskania szerokiego wpływu na badania i rozwój (R&D).
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad infekcjami wirusowymi.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje oczyszczanie kompleksów wirusowego DNA i białek w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz zwiększa efektywność kapitałową w procesie odkrywania leków przeciwwirusowych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów wirusowych i czynników zależności gospodarza z uwzględnieniem ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu wirusologii, proteomiki oraz analizy spektrometrii mas.
- Wymaga dostępu do hodowli komórkowych, odczynników do chemii klik (click chemistry) oraz zaawansowanej aparatury analitycznej.
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja międzyzespołowa w celu zapobiegania kontaminacji i zapewnienia powtarzalności.
- Metoda jest możliwa do adaptacji dla różnych wirusów DNA i modeli zakażeń po optymalizacji protokołu.
- Wymaga ostrożnego obchodzenia się z próbkami, aby uniknąć kontaminacji DNazą i proteazami, zgodnie z uwagami w protokole.
