Name: Ultracienkie porowane elastyczne hydrożele jako biomimetyczna błona podstawna do hodowli dwukomórkowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Poznaj metodę tworzenia ultracienkich porowanych hydrożeli PEG z tlenkiem cynku jako biomimetycznej błony podstawnej do hodowli dwukomórkowej. Technika umożliwia badanie interakji komórkowych w inżynierii tkankowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować Prof. Paulowi Van Tasselowi i Prof. Chinedum Osuji za ich wnikliwe rozmowy i ekspertyzę materiałoznawstwa. Finansowanie tych prac zostało zapewnione przez Dubinsky New Initiative Award oraz National Institutes of Health NIBIB BRPR01 EB16629-01A1.

Proszę przeczytać Kartę Charakterystyki Substancji Niebezpiecznej (MSDS) wszystkich materiałów przed użyciem i stosować środki ostrożności przez cały czas.
1. Synteza igieł z tlenku
<ol>
	<li>Przygotować 250 ml 0,04 M roztworu Zn(NO3)2*6H2O, dodając 2,9749 g azotanu do 250 ml wody.</li>
	<li>Przygotować 150 ml 1 M NaOH, dodając 6 g NaOH do 150 ml wody.</li>
	<li>Ustawić kąpiel w oleju mineralnym na płycie grzejnej z mieszadłem i zanurzyć kolbę okrągłodenną o pojemności 500 ml w łaźni olejowej o temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 250 ml Zn(NO3)2*6H2Odo kolby i rozpocząć mieszanie reakcji.</li>
	<li>Dodać 150 ml roztworu NaOH (na krótko utworzy się biały osad, a następnie zniknie, gdy oba roztwory będą się mieszać). Mieszać przez 2 godziny bez przykrycia.</li>
	<li>Podgrzać kolbę do temperatury 55-60 °C i kontynuować mieszanie przez 24 godziny.</li>
	<li>Wyłącz ogień i mieszając, pozwól roztworowi ostygnąć do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Przefiltrować roztwór na lejku Büchnera o wielkości porów 11 μm i pozostawić do wyschnięcia na noc bez przykrycia. Gdy bibuła filtracyjna nie jest już mokra od wylanego roztworu, a nad otworami lejka utworzy się biały proszek, cząstki są całkowicie wysuszone.</li>
	<li>Zebrać igły ZnO i przygotować się do skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM), aby potwierdzić morfologię przypominającą igłę. Krótko mówiąc, zamontuj taśmę węglową na króćcu szpilki i użyj metalowej szpatułki, aby rozsmarować igły ZnO na taśmie węglowej. Napyl warstwę irydu o grubości 8 mm o gęstości 22,4 g/cm3 i uzyskaj obrazy przy napięciu 10 kV.</li>
</ol>
2. Dodanie protektorowej warstwy na szkiełkach mikroskopowych w celu wywołanego HCl uwalniania PEG
<ol>
	<li>Przygotować roztwór octanu, rozpuszczając 1,756 g octanu w 200 ml metanolu.</li>
	<li>Wyczyść zwykłe szkiełka mikroskopowe 3" x 1" z 70% etanolem i jednorazową chusteczką. Pozostaw do wyschnięcia na powietrzu na 10 minut.</li>
	<li>Umieść szklaną szalkę Petriego o średnicy 150 mm na płycie grzejnej i rozgrzej do 150 - 160 °C.</li>
	<li>Za pomocą szklanej pipety z gruszką pipetującą przytrzymaj szkiełka pęsetą i pokryj szkiełka, nakładając 5 kropli octanu, tworząc cienką warstwę rozproszoną na szkiełku. Pozwolić, aby nadmiar roztworu spłynął z powrotem do roztworu podstawowego.</li>
	<li>Umieścić szkiełko na wstępnie nagrzanej szalce Petriego (150 - 160 °C) stroną pokrytą octanem skierowaną do góry. Pozostaw na płycie grzejnej na 15 minut.</li>
	<li>Wyjmij szkiełko pęsetą i pozwól mu ostygnąć do temperatury pokojowej. Slajd będzie wyglądał na pokryty białymi smugami.</li>
	<li>Usuń nadmiar, który pozostał na szkiełkach, za pomocą jednorazowej chusteczki, aby usunąć widoczne białe smugi. Powierzchnia powinna być jednolita.</li>
	<li>Przygotowane szkiełka należy wystawić na działanie promieniowania UV w kapturze bezpieczeństwa biologicznego przez co najmniej 1 godzinę, aby zapewnić sterylność. 
	Uwaga: Światło UV jest szkodliwe dla oczu i odsłoniętej skóry. Unikaj bezpośredniego kontaktu z oczami lub skórą i wyłączaj zasilanie elektryczne, gdy nie używasz.</li>
</ol>
3. Przygotowanie izolatorów silikonowych
<ol>
	<li>Pokrój arkusz silikonu na kwadraty mniejsze niż 1" x 1" (izolatory muszą być w stanie zmieścić się w naczyniu 6-dołkowym).</li>
	<li>Przebić otwory 8 - 12 mm w środku kwadratów za pomocą stempla biopsyjnego.</li>
	<li>Autoklaw izolatorów silikonowych przez 20 min w temperaturze 121,0 °C i 1,12 kg/cm.</li>
</ol>
4. Przygotowanie roztworu PEG i synteza żelu PEG
Uwaga: Funkcjonalizacja i polimeryzacja PEG była wcześniej szeroko badana i szczegółowo opisana przez nasze laboratorium i inne. 8,10,11,13,14,15,16,17
<ol>
	<li>Połącz peptyd adhezyjny komórek RGD z akryloilo-PEG-NHS w 50 mM wodorowęglanie sodu (pH 8,5) w stosunku molowym 1:1, aby umożliwić funkcjonalizację końca aminowego peptydu z ugrupowaniem akrylowym, reakcją biochemiczną, która została wcześniej scharakteryzowana jako dająca ponad 85% wydajności. 17</li>
	<li>Przygotować fotoinicjator, mieszając 2,2-dimetoksy-2-fenyloacetofenon z 1-winylo-2-pirolidonem w stężeniu 300 mg/ml.</li>
	<li>W oddzielnych probówkach o pojemności 1,5 ml odważyć: 20 mg igieł ZnO, 12,5 mg PEG-DA i 2,5 mg PEG-RGD.</li>
	<li>Zawiesić 20 mg igieł ZnO w 270 μl 10% roztworu FBS/PBS; wirować do wymieszania (około 15 s).</li>
	<li>Krótko (<1 s) odwirować roztwór w mini wirówce stołowej, aby doprowadzić wszelkie agregaty ZnO do podstawy probówki.</li>
	<li>Zebrać 250 μl z górnej części roztworu ZnO, aby upewnić się, że agregaty pozostały na dnie probówki. Połącz z PEG-DA i PEG-RGD, aby stworzyć rozwiązanie PEG o pojemności około 2,5 mM RGD. Wir do wymieszania (około 15 s).</li>
	<li>Dodać 2 μl fotoinicjatora acetofenonu/n-winylopirolidonu i krótko mieszać (około 5 s).</li>
	<li>Dodać 20 μl roztworu polimeru wzdłuż środka szkiełek pokrytych ZnO.</li>
	<li>Powoli opuść drugi szkiełko na górę, z powłoką ZnO skierowaną w dół (roztwór PEG powinien znajdować się między dwiema warstwami pokrytymi ZnO). Staraj się nie dopuścić do tworzenia się pęcherzyków powietrza. Przesuwaj szkiełka na boki wzdłuż głównej osi, aby umożliwić ucieczkę pęcherzyków i rozprowadzić roztwór na cienką warstwę. Pokryć większą część szkiełka roztworem polimeru. Utwórz lekki zwis z górnym suwakiem, aby zapewnić możliwość rozłożenia prowadnic w późniejszych krokach.</li>
	<li>Sieciować szkiełka pod lampą UV 365 nm (około 10 mW/cm2) przez 15 minut.</li>
</ol>
5. Uwolnienie żeli PEG ze szkiełek
<ol>
	<li>Dociśnij wystającą prowadnicę i ręcznie rozsuń obie prowadnice w wolnym tempie, aby uniknąć pęknięcia prowadnic. Pozostaw żele do wyschnięcia na co najmniej 5 minut lub na noc.</li>
	<li>Umieścić szkiełko na sterylnej szklanej szalce Petriego o średnicy 25 mm i delikatnie wylać 1 M roztwór HCl na szkiełko, używając tylko tyle, aby przykryć szkiełko (około 10 - 20 ml). Delikatnie kołysz szalką Petriego; żel powinien zacząć odnosić się od szkiełka, gdy HCl rozpuści protektorową powłokę cynkową i igły. Gdy żel zostanie usunięty ze szkiełka, wlać HCl z powrotem do roztworu podstawowego.</li>
	<li>Spłucz żel, delikatnie wlewając około 25 ml 1x PBS do szalki Petriego, aż szkiełko podstawowe i żel zostaną zanurzone. Ostrożnie przelej PBS do pojemnika na odpady.</li>
	<li>Delikatnie wlej około 25 ml 1x PBS do szalki Petriego, aż żel zacznie unosić się w roztworze.</li>
	<li>Za pomocą pęsety ostrożnie wsuń silikonowy izolator pod żel i unieś na niego żel.</li>
	<li>Przenieś izolator i żel do 6-dołkowego naczynia wypełnionego sterylnym 1x PBS.</li>
	<li>Powtarzaj ten proces, aż wszystkie żele zostaną usunięte ze szkiełek i nasączą się w PBS. Przygotowane żele należy wystawić na działanie promieniowania UV w kapturze bezpieczeństwa biologicznego przez co najmniej 1 godzinę, aby zapewnić sterylność.</li>
</ol>
6. Dwuwarstwowe komórki rozsiewające
<ol>
	<li>Przygotuj komórki A549 do wysiewu. Krótko przepłukać kolbę o długości 75cm2 5 ml 1x PBS, dodać 3 ml 0,25% trypsyny-EDTA i odstawić na 2 - 3 minuty w temperaturze 37 °C.
	<ol>
		<li>Mechanicznie wymieszać kolbę, wygasić reakcję za pomocą 3 ml zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Modified Eagle Medium z 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliny-streptomycyny i zebrać do 15-mililitrowej kolby stożkowej. Spłucz dodatkowymi 4 ml kompletnego zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Modified Eagle i zbierz do tego samego stożka. Wiruj komórki przy 475 x g przez 6 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podczas gdy komórki wirują, dodaj małą kroplę kompletnego zmodyfikowanego podłoża Dulbecco's Modified Eagle Medium do każdego dołka na 6-dołkowej płytce. Za pomocą pęsety przenieś izolatory silikonowe z żelami do nowej płytki 6-dołkowej, tak aby żel spoczywał na kropli pożywki. Teraz, gdy żele są rozprowadzone cienką warstwą, sprawdź, czy nie ma widocznych dla oka dużych otworów. Należy to zrobić bezpośrednio przed wysiewem komórek, aby uniknąć wysuszenia i pękania żeli.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco's Eagle Medium z 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliną-streptomycyną w stężeniu 6 x 105 komórek/ml. Dodaj zawiesinę komórkową kroplami do środka żelu, starając się utrzymać menisk w wyciętym obszarze membrany silikonowej. Pozwól komórkom przylegać przez 4 godziny.</li>
	<li>Po 4 godzinach dodać 0,5 ml zmodyfikowanego kompletnego podłoża Dulbecco Eagle Complete Medium do studzienki i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, aby zapewnić pełną przyczepność.</li>
	<li>Następnego dnia przygotuj HUVEC do wysiewu komórek.
	<ol>
		<li>Wypłucz kolbę o średnicy 75cm2 5 ml 1X PBS, dodaj 3 ml 0,25% trypsyny-EDTA i pozostaw na 2 - 3 minuty w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Mechanicznie wymieszać kolbę, wygasić reakcję 3 ml pożywki M199 z 20% płodową surowicą bydlęcą, 1% penicyliną-streptomycyną i 1% suplementem wzrostowym i zebrać do 15 ml stożkowego roztworu.</li>
		<li>Przepłukać 4 ml kompletnej pożywki M199 i zebrać do tego samego stożkowego podłoża. Wiruj komórki przy 475 x g przez 6 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podczas gdy komórki wirują w dół, dodaj małą kroplę kompletnego podłoża 199 do każdej studzienki na nowej 6-dołkowej płytce. Umieść nowy izolator silikonowy w studzience z kroplą pożywki w środku silikonu.</li>
	<li>Za pomocą pęsety ostrożnie odwróć silikonowy izolator podtrzymujący żel PEG z komórkami A549 na izolator w nowej płytce 6-dołkowej.</li>
	<li>Ponownie zawiesić HUVEC w stężeniu 6 x 105 komórek/ml i dodać zawiesinę komórkową do środka odwróconego żelu kroplami, starając się utrzymać menisk na żelu w wyciętym obszarze membrany silikonowej. Pozwól komórkom przylegać przez 2 godziny.</li>
	<li>Po 2 godzinach delikatnie dodać 2 ml kompletnej pożywki M199 do każdego dołka.</li>
</ol>
7. Immunofluorescencja
<ol>
	<li>Ostrożnie usuń pożywkę z żeli za pomocą ręcznej pipety i dodaj około 500 μl 4% paraformaldehydu (PFA) do środka żelu, w którym znajdują się komórki. Odstawić na 30 minut w temperaturze pokojowej. 
	Uwaga: PFA jest toksyczną substancją chemiczną; Nosić ochronę i upewnić się, że obchodzenie się z nią odbywa się w komorze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	<li>Ostrożnie usuń PFA i dodaj około 500 μl 2% BSA w PBS do każdego żelu. Odstawić na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ostrożnie usuń BSA. Przygotować przeciwciała pierwszorzędowe w rozcieńczeniu 1:100 w 2% BSA w PBS i dodać 500 μl do każdego żelu. Odstawić na 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Delikatnie spłucz 500 μl 1x PBS.
	<ol>
		<li>Powtórz ten sam proces z przeciwciałami drugorzędowymi. Należy stosować następujące przeciwciała: 1) klon 16B1 przeciwko ludzkiej CD144 (VE-kadherynie); 2) anty-ludzki klon CD324 (E-kadheryna) 6714; 3) anty-ludzki klon CD31 (PECAM-1) C-20; 4) anty-A549; 5) anty-mysie FITC; 6) anty-koza Alexa Fluor 647. Aby uwidocznić F-aktynę, dodaj 500 μl falloidyny (10 μg/ml w PBS) przez 20 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ostrożnie usuń przeciwciała wtórne lub falloidynę i dodaj 500 μl DAPI (0,1 μg/ml) przez 20 min. Ostrożnie usuń roztwór DAPI i delikatnie dodaj 1,5 ml 1x PBS do każdej studzienki, aby żele były w zawiesinie.
	<ol>
		<li>Za pomocą pęsety i izolatorów silikonowych przenieś jeden żel na szklane szkiełko. Zrób to dla każdego żelu bezpośrednio przed obrazowaniem i zastąp żele roztworem PBS po obrazowaniu.</li>
		<li>Alternatywnie zamontuj żele za pomocą medium montażowego DAPI. Dobrze uszczelnij próbki lakierem do paznokci, uzyskaj obrazy w ciągu 2 dni, aby zapobiec wysuszeniu i pękaniu żelu. Zapoznaj się z Tabelą 1, aby zapoznać się z rozwiązywaniem problemów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Domogatskaya, A., Rodin, S., Tryggvason, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+diversity+of+laminins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional diversity of laminins.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 523-553 (2012).</li>
<li>Howat, W. J., Holmes, J. A., Holgate, S. T., Lackie, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+pores+in+human+bronchial+epithelium%3A+a+conduit+for+infiltrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Basement membrane pores in human bronchial epithelium: a conduit for infiltrating cells.</a> Am J Pathol. 158, 673-680 (2001).</li>
<li>Lauridsen, H. M., Pober, J. S., Gonzalez, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+composite+model+of+the+human+postcapillary+venule+for+investigation+of+microvascular+leukocyte+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">A composite model of the human postcapillary venule for investigation of microvascular leukocyte recruitment.</a> FASEB J. 28, 1166-1180 (2014).</li>
<li>Mul, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+migration+of+neutrophils+across+monolayers+of+endothelial+and+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Sequential migration of neutrophils across monolayers of endothelial and epithelial cells.</a> J Leukoc Biol. 68, 529-537 (2000).</li>
<li>Hermanns, M. I., Unger, R. E., Kehe, K., Peters, K., Kirkpatrick, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+epithelial+cell+lines+in+coculture+with+human+pulmonary+microvascular+endothelial+cells%3A+development+of+an+alveolo-capillary+barrier+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Lung epithelial cell lines in coculture with human pulmonary microvascular endothelial cells: development of an alveolo-capillary barrier in vitro.</a> Lab Invest. 84, 736-752 (2004).</li>
<li>Birkness, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+tissue+culture+bilayer+model+to+examine+early+events+in+Mycobacterium+tuberculosis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">An in vitro tissue culture bilayer model to examine early events in Mycobacterium tuberculosis infection.</a> Infect Immun. 67, 653-658 (1999).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+alveolar+epithelial+cells+attenuate+pulmonary+microvascular+endothelial+cell+permeability+under+septic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human alveolar epithelial cells attenuate pulmonary microvascular endothelial cell permeability under septic conditions.</a> PLoS One. 8, 55311(2013).</li>
<li>Pellowe, A. S., Gonzalez, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+biomimicry+for+the+creation+of+investigational+and+therapeutic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Nanomed+Nanobiotechnol%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix biomimicry for the creation of investigational and therapeutic devices.</a> Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 8, 5-22 (2016).</li>
<li>Peyton, S. R., Raub, C. B., Keschrumrus, V. P., Putnam, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+poly%28ethylene+glycol%29+hydrogels+to+investigate+the+impact+of+ECM+chemistry+and+mechanics+on+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The use of poly(ethylene glycol) hydrogels to investigate the impact of ECM chemistry and mechanics on smooth muscle cells.</a> Biomaterials. 27, 4881-4893 (2006).</li>
<li>West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-patterned+hydrogels%3A+Customized+cell+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Protein-patterned hydrogels: Customized cell microenvironments.</a> Nat Mater. 10, 727-729 (2011).</li>
<li>DeLong, S. A., Gobin, A. S., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+immobilization+of+RGDS+on+hydrogel+surfaces+to+direct+cell+alignment+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Covalent immobilization of RGDS on hydrogel surfaces to direct cell alignment and migration.</a> J Control Release. 109, 139-148 (2005).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li>
<li>Taite, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+hydrogel+substrates%3A+probing+leukocyte+receptor-ligand+interactions+in+parallel+plate+flow+chamber+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Bioactive hydrogel substrates: probing leukocyte receptor-ligand interactions in parallel plate flow chamber studies.</a> Ann Biomed Eng. 34, 1705-1711 (2006).</li>
<li>Lauridsen, H. M., Walker, B. J., Gonzalez, A. L. <a target="_blank" href="http://www.worldscientific.com/doi/abs/10.1142/S2339547814500113">Chemically- and mechanically-tunable porated polyethylene glycol gels for leukocyte integrin independent and dependent chemotaxis.</a> Technology. 02, 133-143 (2014).</li>
<li>DeLong, S. A., Moon, J. J., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalently+immobilized+gradients+of+bFGF+on+hydrogel+scaffolds+for+directed+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Covalently immobilized gradients of bFGF on hydrogel scaffolds for directed cell migration.</a> Biomaterials. 26, 3227-3234 (2005).</li>
<li>Lauridsen, H. M., Gonzalez, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic%2C+ultrathin+and+elastic+hydrogels+regulate+human+neutrophil+extravasation+across+endothelial-pericyte+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+one%22%5BJournal%5D)">Biomimetic, ultrathin and elastic hydrogels regulate human neutrophil extravasation across endothelial-pericyte bilayers.</a> PLOS one. 12, 0171386-0171405 (2017).</li>
<li>Peters, E. B., Christoforou, N., Leong, K. W., Truskey, G. A., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28Ethylene+Glycol+Hydrogel+Scaffolds+Containing+Cell-Adhesive+and+Protease-Sensitive+Peptides+Support+Microvessel+Formation+by+Endothelial+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Poly(Ethylene Glycol Hydrogel Scaffolds Containing Cell-Adhesive and Protease-Sensitive Peptides Support Microvessel Formation by Endothelial Progenitor Cells.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 9, 38-54 (2016).</li>
<li>Schwartz, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+strategy+for+mimicking+the+extracellular+matrix+provides+new+insight+about+tumor+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">A synthetic strategy for mimicking the extracellular matrix provides new insight about tumor cell migration.</a> Integr Biol (Camb). 2, 32-40 (2010).</li>
<li>Booth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acellular+normal+and+fibrotic+human+lung+matrices+as+a+culture+system+for+in+vitro+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation.</a> Am J Respir Crit Care Med. 186, 866-876 (2012).</li>
<li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membranes%3A+structure%2C+assembly+and+role+in+tumour+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Basement membranes: structure, assembly and role in tumour angiogenesis.</a> Nat Rev Cancer. 3, 422-433 (2003).</li>
<li>Roudsari, L. C., Keffs, S. E., Witt, A. S., Gill, B. J., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+Poly%28ethylene+glycol%29-based+Tumor+Angiogenesis+Model+to+Study+the+Influence+of+Vascular+Cells+on+Lung+Tumor+Cell+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A 3D Poly(ethylene glycol)-based Tumor Angiogenesis Model to Study the Influence of Vascular Cells on Lung Tumor Cell Behavior.</a> Scientific Reports. 6, 1-15 (2016).</li>
<li>Bermudez, L. E., Sangari, F. J., Kolonoski, P., Petrofsky, M., Goodman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficiency+of+the+translocation+of+Mycobacterium+tuberculosis+across+a+bilayer+of+epithelial+and+endothelial+cells+as+a+model+of+the+alveolar+wall+is+a+consequence+of+transport+within+mononuclear+phagocytes+and+invasion+of+alveolar+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">The efficiency of the translocation of Mycobacterium tuberculosis across a bilayer of epithelial and endothelial cells as a model of the alveolar wall is a consequence of transport within mononuclear phagocytes and invasion of alveolar epithelial cells.</a> Infect Immun. 70, 140-146 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany tutaj protokół pozwolił nam stworzyć przestrajalny hydrożel PEG, który służy jako biomimetyczne rusztowanie BM. W szczególności, poprzez różnicę mas cząsteczkowych PEG, strategii koniugacji peptydów oraz struktur lub stężeń mikrokrystalicznych tlenku, można odpowiednio modyfikować moduł sprężystości, właściwości biochemiczne i porowatą strukturę hydrożeli. Ultracienkie rusztowanie PEG charakteryzuje się większą gęstością porów i mniejszą średnicą porów, co jest bardziej naśladujące cechy występujące w błonach pod...

Matryce zewnątrzkomórkowe (ECM) tworzą rusztowania białkowe, które wspierają przyłączanie komórek i służą jako bariery między różnymi typami komórek i są niezbędnym składnikiem złożonych tkanek i narządów. W przeciwieństwie do śródmiąższowej tkanki łącznej, błona podstawna (BM) jest wyspecjalizowanym typem ECM, który działa jak bariera dzieląca przedziały tkankowe od siebie. BM mają grubość około 100 μm, dzięki czemu umożliwiają bezpośrednią i pośrednią komunikację między komórkami po obu stronach. Dwa typowe przykłady BM to naczyniowe BM, znajdujące się w ścianie mikronaczyniowej między perycytami a komórkami śródbłonka, oraz BM dróg oddechowych, które znajdują się między komórkami śródbłonka i nabłonka. BM odgrywają ważną rolę w regulacji funkcji komórek, takich jak polaryzacja i migracja komórek, w zdrowiu i chorobie. 1 Skład, sztywność, architektura i porowatość BM różnią się w zależności od układu narządów, aby ułatwić różne funkcje fizjologiczne. Na przykład pory BM mają kluczowe znaczenie dla utrzymania komunikacji między komórkami, dyfuzji rozpuszczalnych cząsteczek oraz migracji komórek odpornościowych podczas stanu zapalnego lub bakterii podczas infekcji. W drogach oddechowych pory rozciągają się na całej grubości BM, a ich średnice wahają się od 0,75 do 3,86 μm.2
Cienka natura BM zapewnia, że chociaż typy komórek są fizycznie oddzielone od siebie, komunikacja międzykomórkowa za pośrednictwem sygnalizacji parakrynnej i kontaktowej jest zachowana. W związku z tym, aby badać choroby ludzkie in vitro, naukowcy oparli się na porowatych, przepuszczalnych wkładkach nośnych do hodowli dwuwarstw komórkowych. 3 Te modele były kluczowe dla zrozumienia komunikacji komórkowej, która odgrywa rolę w zdrowiu i chorobie. 3,4,5,6,7 Przepuszczalne wkładki nośne spełniają podstawowe wymagania dotyczące zrozumienia, w jaki sposób sygnalizacja komórka-komórka reguluje procesy fizjologiczne, takie jak rekrutacja leukocytów i infiltracja bakteryjna; jednak wkładki mają znaczne ograniczenia i nie naśladują ludzkiego BM. Przepuszczalne wkładki nośne nie mają zarówno mechanicznej, jak i biochemicznej przestrajalności, a uproszczona porowata struktura nie naśladuje struktury włóknistej, która tworzy nieregularne pory typowe dla BM. W związku z tym rośnie zapotrzebowanie na przestrajalne systemy, które mogą odtworzyć natywne właściwości BM, które wpływają na procesy komórkowe.
Podłoża na bazie polimerów są idealnymi kandydatami do rozwoju biomimetycznych BM do badania dwuwarstw komórkowych w kontekście, który bardziej naśladuje środowisko in vivo. 8,9,10,11,12 Polimery są mechanicznie przestrajalne i mogą być chemicznie modyfikowane w celu włączenia biomimetycznych fragmentów peptydów.11,12,13 Bioobojętny polimer glikolu polietylenowego (PEG) może być używany do budowy biomimetycznych BM, a ostatnie prace szczegółowo opisały syntezę mechanicznie przestrajalnych żeli PEG z kwasem argininowo-glicynowo-asparaginowym (RGD) z porowatymi sieciami, które wspierają wzrost komórek i chemotaksję komórek zapalnych. 14 Chociaż opublikowane podłoża oparte na PEG dostarczyły bardziej realistycznego modelu ludzkiego ECM niż przepuszczalne podpory, wiele z tych modeli jest niezwykle grubych, z głębokością około 775 μm, co ogranicza zdolność do tworzenia kultur dwuwarstwowych z kontaktami komórka-komórka. 14
Tutaj prezentujemy protokół tworzenia naśladownictwa BM opartego na polimerze PEG, który pokonuje wiele ograniczeń obecnych technologii hodowli dwuwarstwowych komórek. Opracowaliśmy metodę szablonów, która włącza tlenek, szeroko stosowany materiał do produkcji mikrokrystalicznej, do polimeru podczas syntezy i sieciowania, który jest następnie i selektywnie usuwany z powstałego polimeru luzem. Proces ten generuje losową porowatą sieć, naśladując krętą i wzajemnie połączoną sieć porów ludzkich BM. Ponadto porowatość można zmienić poprzez zmianę wielkości i kształtu mikrokryształów tlenku poprzez modyfikację stechiometrii reakcji podczas produkcji igły. Opracowana tutaj technika tworzy ultracienki hydrożel, który naśladuje grubość ludzkiego BM. Wreszcie, mechanika, porowatość i skład biochemiczny tych konstruktów podobnych do BM mogą być łatwo zmienione w celu wytworzenia mikrośrodowiska, które jest najbardziej podobne do tego obserwowanego in vivo.

<table><tbody><tr><td>1M Hydrożel chlorkowy (HCl)</td><td>EMD</td><td>HX0603-75 2,5L</td><td>Sterylny. Stosować w dygestorium z ochroną oczu i rękawicami.</td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Gibco</td><td>14040-133 500 mL</td><td>Brak</td></tr><tr><td>Azotan sześciowodny (Zn(NO3)2&bull; 6H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>228737-500g</td><td>Stosować w okularach ochronnych i rękawicach.</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH)</td><td>Macron Chemicals</td><td>278408-500g</td><td>Stosować z ochroną oczu i rękawicami.</td></tr><tr><td>Octan dwuwodny ((CH3O2)2Zn2+&bull; 2H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC45180010 1 kg</td><td>Stosować z ochroną oczu i rękawicami.</td></tr><tr><td>Metanol (CH3OH)</td><td>J.T. Baker</td><td>9070-05 4L</td><td>Stosować w dygestorium z ochroną oczu i rękawicami.</td></tr><tr><td>VWR Life Science Seradigm Premium Grade FBS</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td>Sterylny filtr. 5 ml FBS w 45 ml PBS</td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>CVS&nbsp;</td><td>PLD-B280B</td><td>Brak</td></tr><tr><td>Kolba okrągłodenna</td><td>ChemGlass</td><td></td><td>N/A</td></tr><tr><td>Termometr</td><td></td><td></td><td>Nie</td></tr> dotyczy <tr><td>Mieszadło</td><td></td><td></td><td>Nie</td></tr> dotyczy <tr><td>Zwykłe, wstępnie oczyszczone szkiełka mikroskopowe o grubości 3 "x1" x1 "mm Thermo</td><td>Scientific</td><td>420-004T</td><td>Spryskaj etanolem i pozostaw do wyschnięcia przed użyciem.</td></tr><tr><td>Szklane pipety</td><td></td><td></td> Pasteura <td>Nie dotyczy</td></tr><tr><td>1 ml gruszki</td><td></td><td></td><td></td>gumowe</tr> Nie dotyczy <tr><td>Plastikowe szalki</td><td></td><td></td> Petriego 100 mm <td>Nie</td></tr> dotyczy <tr><td>Kleszcze</td><td></td><td></td> sterylne <td>Nie dotyczy</td></tr><tr><td>Izolatory silikonowe</td><td></td><td></td> o <td>grubości 0,8 mm</td></tr><tr><td>Stemple</td><td></td><td></td> z polidimetylosiloksanu (PDMS) <td>Nie dotyczy</td></tr><tr><td>Butelki szklane</td><td></td><td></td><td>Nie dotyczy</td></tr><tr><td>Płytki 6-dołkowe</td><td>Cellstar</td><td>657 160</td><td>Nie dotyczy</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna</td><td>Whatman</td><td>8519</td><td>Nie dotyczy</td></tr><tr><td>Mieszadło z płytką grzejną</td><td>VWR Dya-Dual</td><td>12620-970</td><td>Stosować z ochroną oczu i rękawicami.</td></tr><tr><td>2,2-dimetoksy-2-fenyloacetofenon (C6H5COC(OCH3)2C6H5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>24650-42-8</td><td>Stosować z osłoną oczu i rękawicami.</td></tr><tr><td>1-winylo-2-pirolidon (C6H9NO)</td><td>Aldrich</td><td></td><td>Stosować z ochroną oczu i rękawicami.</td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy 10 000 (H(OCH2CH2)10,000OH)</td><td>Fluka</td><td>81280-1kg</td><td>Stosować z ochroną oczu i rękawicami.</td></tr><tr><td>Koszulka RGDS</td><td>Life Tein</td><td>180190</td><td>Stosować z ochroną oczu i rękawicami.</td></tr><tr><td>Długofalowa lampa UV Blak-Ray</td><td>UVP</td><td>Model B 100AP</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Lampy Eppendorf</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td>N/A</td></tr></tbody></table>

ultracienkie porowane elastyczne hydrożele jako biomimetyczna błona podstawna do hodowli dwukomórkowej

Ultrathin Porated Elastic Hydrogels As a Biomimetic Basement Membrane for Dual Cell Culture

Błona podstawowa jest kluczowym składnikiem dwuwarstw komórkowych, które mogą różnić się sztywnością, składem, architekturą i porowatością. Badania in vitro dwuwarstw śródbłonkowo-nabłonkowych tradycyjnie opierały się na przepuszczalnych modelach podporowych, które umożliwiają hodowlę dwuwarstwową, ale przepuszczalne nośniki mają ograniczoną zdolność do replikowania różnorodności ludzkich błon podstawnych. Natomiast modele hydrożelowe, które wymagają syntezy chemicznej, są wysoce przestrajalne i pozwalają na modyfikację zarówno sztywności materiału, jak i składu biochemicznego poprzez włączenie peptydów biomimetycznych lub białek. Jednak tradycyjne modele hydrożelowe mają ograniczoną funkcjonalność, ponieważ brakuje im porów do kontaktów komórka-komórka i funkcjonalnych badań migracji in vitro. Dodatkowo, ze względu na grubość tradycyjnych hydrożeli, wprowadzenie porów obejmujących całą grubość hydrożeli było wyzwaniem. W niniejszym badaniu używamy hydrożeli z poli(glikolu etylenowego) (PEG) i nowatorskiej metody szablonowania tlenku, aby wyeliminować wcześniejsze wady hydrożeli biomimetycznych. W rezultacie prezentujemy ultracienki, przypominający błonę podstawną hydrożel, który umożliwia hodowlę konfluentnych dwuwarstw komórkowych na konfigurowalnym rusztowaniu o zmiennej architekturze porów, właściwościach mechanicznych i składzie biochemicznym.

Hydrożele PEG-RGD utworzono poprzez umieszczenie roztworu polimeru pomiędzy dwiema poświęcalnymi warstwami tlenku cynku i stworzenie szablonów porów z igieł tlenku cynku. Poświęcalne komponenty tlenku cynku usunięto następnie kwasem solnym, co pozwoliło na otrzymanie ultracienkich hydrożeli PEG z ciągłymi porami (Rycyna 1). Morfologię igieł tlenku cynku potwierdzono za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM), a ich średnia długość i szerokość wynios...

Obecne modele hodowli dwuwarstwowych nie pozwalają na funkcjonalne badania in vitro, które naśladują mikrośrodowiska in vivo. Wykorzystując glikol polietylenowy i metodę szablonowania tlenku, protokół ten opisuje rozwój ultracienkiej biomimetycznej błony podstawnej o regulowanej sztywności, porowatości i składzie biochemicznym, która ściśle naśladuje matryce zewnątrzkomórkowe in vivo.

Ultracienkie porowane elastyczne hydrożele jako biomimetyczna błona podstawna do hodowli dwukomórkowej

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies ...

Ogólnym celem tego protokołu jest opisanie metody szablonowania glikolu polietylenowego i tlenku w celu stworzenia porowatej, ultracienkiej, biomimetycznej błony podstawnej, która obsługuje hodowlę dwukomórkową i ma regulowane właściwości mechaniczne i chemiczne. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy tworzyć hydrożele, które są ultracienkie, porowate, strojone mechanicznie i biochemicznie. Umożliwiają one wspomaganie hodowli jedno- lub dwukomórkowej.Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie inżynierii tkankowej, w tym w jaki sposób podwójne hodowle komórkowe reagują i wchodzą w interakcje z mikrośrodowiskami, które naśladują ludzkie błony podstawne. Implikacje tej techniki rozciągają się na szeroką gamę systemów biologicznych i tkanek, ostatecznie umożliwiając więcej badań biomimetycznych ze zwiększoną translacją na choroby ludzkie. Dodaj 250 mililitrów azotanu do kolby i zacznij mieszać reakcję.Następnie dodaj 150 mililitrów roztworu wodorotlenku sodu. Na krótko utworzy się biały osad, a następnie zniknie, gdy oba roztwory będą się nadal mieszać. Mieszaj mieszaninę przez dwie godziny bez przykrycia.Podgrzej kolbę do 55 do 60 stopni Celsjusza i kont

ultrathin-porated-elastic-hydrogels-as-biomimetic-basement-membrane

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W niniejszym protokole prezentujemy proces wytwarzania macierzy mikroaktuatorów z pionowo przesuniętymi słupkami, na której opiera się ta technologia, oraz sposób, w jaki technologia bazowa ta może zostać zmodyfikowana w celu prowadzenia wysokoprzepustowych dynamicznych mechanicznie hodweli komórkowych w dwu- i trójwymiarowych paradygmatach hodowli.

Mikrofabrykowane platformy do mechanicznie dynamicznej hodowli komórek

Opisano proste techniki szybkiego wytwarzania mikrofabrykowanych systemów kultur neuronalnych z wykorzystaniem cyfrowego urządzenia z mikrolustrami do litografii z dynamiczną projekcją maski na standardowych podłożach do hodowli komórkowej. Systemy hodowlane te mogą lepiej odzwierciedlać naturalną architekturę biologiczną, a opisane techniki można dostosować do licznych zastosowań.

Wytwarzanie mikrowzorowanych hydrożeli dla systemów kultur neuronalnych z wykorzystaniem fotolitografii z dynamiczną projekcją maski

Niniejszy protokół koncentruje się na wykorzystaniu naturalnej zdolności komórek macierzystych do reagowania na sygnały z otaczającej je macierzy zewnątrzkomórkowej i indukowania ich różnicowania w wiele fenotypów. Niniejszy artykuł metodologiczny rozszerza nasz opis i charakterystykę modelu wykorzystującego dwuwarstwowy hydrożel, składający się z PEG-fibryny i kolagenu, do jednoczesnego współróżnicowania mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej1.

Projektowanie dwuwarstwowego hydrożelu w celu kontrolowania różnicowania ASC

Opisujemy wytwarzanie arkuszy hydrożelowych z mikrowzorzystymi elementami za pomocą prostego procesu, który może być składany i manipulowany w formie wolnostojącej. Korzystając z tych modułowych arkuszy hydrożelowych, można wygenerować prosty system hodowli komórkowych 3D w skali makro z kontrolowanym mikrośrodowiskiem komórkowym.

Budowa modułowych arkuszy hydrożelowych dla mikrowzorzystej architektury komórkowej 3D w skali makro

Ten artykuł przedstawia proste podejście do dostarczania nieciągłych gradientowych naprężeń statycznych na koncentrycznym hydrożelu wypełnionym komórkami w celu regulacji wyrównania komórek w inżynierii tkankowej.

Gradient Strain Chip do stymulowania zachowań komórkowych w hydrożelu z komórkami

Inżynieria i analiza tkanek nośnych z heterogenicznymi populacjami komórek nadal stanowią wyzwanie. W tym miejscu opisujemy metodę tworzenia dwuwarstwowych krążków hydrożelu alginianowego jako platformy do wspólnej hodowli różnych populacji komórek w ramach jednego konstruktu.

Warstwowe konstrukty alginianowe: platforma do wspólnej hodowli heterogenicznych populacji komórek

To jest metoda tworzenia trójwymiarowego rusztowania do hodowli komórkowych z zewnątrzkomórkowej macierzy płucnej. Nienaruszone płuca są przetwarzane na hydrożele, które mogą wspierać wzrost komórek w trzech wymiarach.

Przestrajalne hydrożele z macierzy zewnątrzkomórkowej płuc do hodowli komórek 3D

Rekombinowane hydrożele modyfikowane białkami są korzystne dla hodowli komórkowych 3D, ponieważ pozwalają na pełne dostrojenie szkieletu polimerowego, a tym samym mikrośrodowiska komórki. W tym miejscu opisujemy proces oczyszczania rekombinowanego białka podobnego do elastyny i jego zastosowanie w enkapsulacji komórek hydrożelowych 3D.

Produkcja elastynopodobnych hydrożeli białkowych do enkapsulacji i barwienia immunologicznego komórek w 3D

Wkładki do hodowli tkankowych z plastikowymi membranami są złotym standardem w laboratoriach hodowli komórkowych jako przepuszczalne nośniki do tworzenia warstw komórkowych i modeli tkanek barierowych. W niniejszym artykule przedstawiamy prostą metodę zastąpienia plastikowej membrany bardziej biologicznie istotną membraną wykonaną z rekombinowanego funkcjonalizowanego białka pajęczej nici.

Nanowłóknista błona podstawna naśladująca wykonana z rekombinowanej, funkcjonalizowanej nici pajęczej w niestandardowych wkładkach do hodowli tkankowych

Hodowla prawidłowych komórek w kontekście trójwymiarowym stanowi alternatywną metodę badania wczesnych zdarzeń niezbędnych do transformacji komórkowej i tumorigenezji. Metoda ta jest wykorzystywana do hodowli prawidłowych komórek jajnika i jajowodów w celu zbadania wczesnych etapów powstawania raka jajnika.

Hydrożele alginianowe do trójwymiarowej hodowli organów jajników i jajowodów

Poznaj metodę tworzenia ultracienkich porowanych hydrożeli PEG z tlenkiem cynku jako biomimetycznej błony podstawnej do hodowli dwukomórkowej. Technika umożliwia badanie interakji komórkowych w inżynierii tkankowej.

Ultracienkie porowane elastyczne hydrożele jako biomimetyczna błona podstawna do hodowli dwukomórkowej

Przeglądaj więcej filmów