Name: Ocena przepuszczalności bariery krew-mózg przez dożylną infuzję albuminy znakowanej FITC w mysim modelu choroby neurodegeneracyjnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Poznaj metodę oceny przepuszczalności bariery krew-mózg w mysim modelu choroby neurodegeneracyjnej przy użyciu albuminy znakowanej FITC. Szybka technika dożylnej infuzji umożliwia badanie uszkodzeń bariery i ich związku z neurodegeneracją.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez "Fondazione Neuromed" i finansowana przez włoskie Ministerstwo Zdrowia "Ricerca Corrente" dla V.M.

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez IRCCS Neuromed Animal Care Review Board oraz przez "Istituto Superiore di Sanità" (numer zezwolenia: 1163/2015- PR) i były zgodne z wytycznymi Dyrektywy UE 2010/63/UE dotyczącej eksperymentów na zwierzętach.
1. Przygotowanie roztworu albuminy FITC do wstrzyknięcia do żyły szyjnej
UWAGA: Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone na 11-tygodniowych myszach HD R6/2 oraz na rodzeństwie z miotu typu dzikiego (WT) dopasowanego pod względem wieku i płci.
<ol>
	<li>Rozpuścić albuminę FITC-w proszku (patrz tabela materiałów) w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS) w stężeniu 10 mg/ml. 
	UWAGA: Aby uzyskać optymalne wyniki, należy je przygotować na świeżo dla każdej reakcji etykietowania.</li>
</ol>
2. Przygotowanie sprzętu do użycia podczas operacji
<ol>
	<li>Rozłóż wcześniej autoklawowane narzędzia chirurgiczne (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Wyczyść stół chirurgiczny alkoholem (70% roztwór etanolu). Przygotować pole operacyjne (45 cm x 45 cm) za pomocą sterylnego jednorazowego ręcznika chirurgicznego i ustawić operacyjny mikroskop stereoskopowy.</li>
</ol>
3. Zabieg chirurgiczny infuzji albuminy FITC do żyły szyjnej
<ol>
	<li>Zapisz masę ciała myszy do znieczulenia.</li>
	<li>Znieczulić mysz wstrzyknięciem dootrzewnowym (i.p) odpowiedniej dawki roztworu ketaminy (100 mg/kg) - ksylazyny (10 mg/kg).</li>
	<li>Monitoruj sedację zwierząt za pomocą delikatnego odruchu wycofania się z palca u nogi, jak wykazano w Walantus i wsp.11,12.</li>
	<li>Umieść znieczuloną mysz w pozycji leżącej na plecach i przymocuj cztery nogi i ogon do stołu chirurgicznego za pomocą taśmy klejącej.</li>
	<li>Po zabezpieczeniu myszy należy ostrożnie ogolić odpowiedni margines chirurgiczny na szyi za pomocą elektrycznej maszynki do golenia (patrz Tabela Materiałów) i zdezynfekować ją roztworem jodu powidonu i 70% etanolem.</li>
	<li>Osusz odsłoniętą ogoloną powierzchnię bawełnianymi wacikami.</li>
	<li>Delikatnie podciągnij ogoloną skórę i wykonaj skalpelem podłużne nacięcie o długości 1,5 cm w linii środkowej obojczyka, zaczynając w połowie klatki piersiowej i sięgając tuż poniżej szyi.</li>
	<li>Ostrożnie rozciągnij tkankę łączną za pomocą kleszczy pod obserwacją mikroskopową (5-krotne powiększenie), aby odsłonić żyłę szyjną zewnętrzną.</li>
	<li>Zapewnić wystarczającą ilość miejsca po prawej i lewej stronie żyły szyjnej, aby ułatwić wprowadzenie igły 301/2 G do infuzji roztworu albuminy FITC.</li>
	<li>Wstrzyknąć zwierzęciu dożylnie (prawa żyła szyjna) powoli (przez 3 minuty) 100 μl 10 ml/kg albuminy FITC za pomocą igły 301/2 G.</li>
	<li>Po 15 minutach poddaj mysz eutanazji przez dekapitację, szybko usuń mózg z czaszki, jak opisano wcześniej13 i zanurz go na 15 minut w co najmniej 10-krotnie większej objętości samego mózgu po wstępnie schłodzonym izopentanie.</li>
	<li>Przenieść zamrożony izopentan mózg do wstępnie schłodzonej probówki i przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 °C do czasu przeprowadzenia sekcji histologicznej.</li>
</ol>
4. Histologiczne wycinki mózgu nasączone albuminą FITC
<ol>
	<li>Osadź zamrożony mózg w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) (patrz Tabela materiałów) przed sekcją kriostatu.</li>
	<li>Seryjnie pociąć mózg na odcinki o grubości 20 μm za pomocą kriostatu (patrz Tabela materiałów) i zamontować je na szkiełkach mikroskopowych.</li>
	<li>Przeprowadzić współbarwienie FITC-albumina/laminina przy użyciu specyficznego przeciwciała anty-lamininy (patrz Tabela Materiałów), jak opisano wcześniej6.
	<ol>
		<li>Krótko mówiąc, inkubować skrawki z pierwszorzędowym przeciwciałem anty-lamininą (pAb 1:1000) przez noc i postępować z odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z Cy3.</li>
		<li>Szkiełka nakrywkowe z podłożem montażowym zawierającym 4',6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI) (pik absorpcji = 360 nm; pik emisji = 460 nm (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Pozostaw szkiełko do wyschnięcia na noc w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
		<li>Obserwuj barwienie fluorescencyjne pod mikroskopem fluorescencyjnym (patrz tabela materiałów) przy 20-krotnym powiększeniu, wyposażonym zarówno w filtry FITC (pik absorpcji = 495 nm; pik emisji = 525 nm), jak i Cy3 (pik absorpcji = 550 nm; pik emisji = 570 nm).
		<ol>
			<li>Aby obejrzeć próbki bezpośrednio po barwieniu, należy zabezpieczyć szkiełko nakrywkowe w rogach za pomocą lakieru do paznokci i zbadać je pod mikroskopem, jak powyżej (ppkt 4.3.3).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Ustawianie mikroskopu fluorescencyjnego i akwizycja kolorowych obrazów
<ol>
	<li>Ustaw mikroskop fluorescencyjny w następujący sposób.
	<ol>
		<li>Włącz lampę fluorescencyjną na około 10 minut przed użyciem. Włącz mikroskop, podłączony komputer i aparat cyfrowy. Uruchom oprogramowanie do analizy obrazu (patrz Spis materiałów).</li>
		<li>Użyj odpowiedniego celu, aby uzyskać optymalne zbieranie sygnału i rozdzielczość przestrzenną, a następnie wybierz odpowiednie filtry.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Akwizycja obrazów kolorowych
	<ol>
		<li>Wybierz polecenie [na żywo] w oprogramowaniu do analizy obrazu (patrz Tabela materiałów) i ustaw optymalne parametry oświetlenia dla każdego filtra.</li>
		<li>Wybierz polecenie [zablokuj], aby pobrać jednokanałowy kolorowy obraz i dodać pasek skali ("Edycja>Skala nagrywania")</li>
		<li>Zapisz każdy obraz w formacie ".tiff".</li>
		<li>Scal kanały w jeden obraz, wybierając opcję "Plik>Scal kanał" i zapisz go w folderze</li>
		<li>w formacie TIFF".</li>
		<li>Uzyskaj co najmniej cztery dwudziestoczterobitowe kolorowe obrazy (2200 μm x 3400 μm) na wycinek mózgu (6 sekcji na szkiełko).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Ocena wynaczynienia albuminy FITC
<ol>
	<li>Przeanalizuj intensywność fluorescencji dla każdego pojedynczego kanału, korzystając z ogólnodostępnego ImageJ14,15.</li>
	<li>Znormalizuj całkowitą intensywność sygnału fluorescencyjnego albuminy FITC przez całkowitą intensywność fluorescencji CY3-Lamininy na każdy obraz i zgłoś wynaczynioną albuminę na zewnątrz naczyń jako intensywność zielonej fluorescencji.</li>
</ol>

<ol><li>Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Handb+Clin+Neurol%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier.</a> Handb Clin Neurol. 133, 39-59 (2016).</li>
<li>Serlin, Y., Shelef, I., Knyazer, B., Friedman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+physiology+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Anatomy and physiology of the blood-brain barrier.</a> Semin Cell Dev Biol. 38, 2-6 (2015).</li>
<li>Moretti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+dysfunction+in+disorders+of+the+developing+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier dysfunction in disorders of the developing brain.</a> Front Neurosci. 9, 40(2015).</li>
<li>Zhao, Z., Nelson, A. R., Betsholtz, C., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+Dysfunction+of+the+Blood-Brain+Barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Establishment and Dysfunction of the Blood-Brain Barrier.</a> Cell. 163 (5), 1064-1078 (2015).</li>
<li>Drouin-Ouellet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrovascular+and+blood-brain+barrier+impairments+in+Huntington%27s+disease%3A+Potential+implications+for+its+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cerebrovascular and blood-brain barrier impairments in Huntington's disease: Potential implications for its pathophysiology.</a> Ann Neurol. 78 (2), 160-177 (2015).</li>
<li>Di Pardo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairment+of+blood-brain+barrier+is+an+early+event+in+R6%2F2+mouse+model+of+Huntington+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Impairment of blood-brain barrier is an early event in R6/2 mouse model of Huntington Disease.</a> Sci Rep. 7, 41316(2017).</li>
<li>Lecler, A., Fournier, L., Diard-Detoeuf, C., Balvay, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-Brain+Barrier+Leakage+in+Early+Alzheimer+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Blood-Brain Barrier Leakage in Early Alzheimer Disease.</a> Radiology. 282 (3), 923-925 (2017).</li>
<li>van de Haar, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-Brain+Barrier+Leakage+in+Patients+with+Early+Alzheimer+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Blood-Brain Barrier Leakage in Patients with Early Alzheimer Disease.</a> Radiology. 282 (2), 615(2017).</li>
<li>Fernandez-Lopez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+permeability+is+increased+after+acute+adult+stroke+but+not+neonatal+stroke+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier permeability is increased after acute adult stroke but not neonatal stroke in the rat.</a> J Neurosci. 32 (28), 9588-9600 (2012).</li>
<li>Yang, Y., Rosenberg, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+breakdown+in+acute+and+chronic+cerebrovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier breakdown in acute and chronic cerebrovascular disease.</a> Stroke. 42 (11), 3323-3328 (2011).</li>
<li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> J Vis Exp. (6), e239(2007).</li>
<li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+pancreatic+islets+into+the+kidney+capsule+of+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice.</a> J Vis Exp. (9), e404(2007).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li>
<li>McCloy, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+inhibition+of+Cdk1+in+G+2+phase+overrides+the+SAC+and+decouples+mitotic+events%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Partial inhibition of Cdk1 in G 2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events.</a> Cell Cycle. 13 (9), 1400-1412 (2014).</li>
<li>Burgess, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+human+Greatwall+results+in+G2+arrest+and+multiple+mitotic+defects+due+to+deregulation+of+the+cyclin+B-Cdc2%2FPP2A+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Loss of human Greatwall results in G2 arrest and multiple mitotic defects due to deregulation of the cyclin B-Cdc2/PP2A balance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (28), 12564-12569 (2010).</li>
<li>Krueger, M., Hartig, W., Reichenbach, A., Bechmann, I., Michalski, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+breakdown+after+embolic+stroke+in+rats+occurs+without+ultrastructural+evidence+for+disrupting+tight+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier breakdown after embolic stroke in rats occurs without ultrastructural evidence for disrupting tight junctions.</a> PLoS One. 8 (2), e56419(2013).</li>
<li>Hirano, A., Kawanami, T., Llena, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+the+blood-brain+barrier+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of the blood-brain barrier in disease.</a> Microsc Res Tech. 27 (6), 543-556 (1994).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów

Technika, którą tutaj opisujemy, jest przede wszystkim przydatna do wykrywania wycieku z grupy krew-mózg w warunkach choroby mózgu. Dysfunkcja bariery krew-mózg zyskuje na popularności jako powszechna cecha różnych zaburzeń neurologicznych4. Wcześniej używaliśmy tego podejścia do opisania wczesnego zaburzenia integralności BBB w mysim modelu rzadkiej choroby neurodegeneracyjnej, takiej jak HD6.
Metoda ta wykorzystuje względną prostotę i skuteczno...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/56389/assessment-blood-brain-barrier-permeability-intravenous-infusion-fitc">Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease</a>. One of the author&#39;s names was corrected from:
Maglione Vittorio
to:
Vittorio Maglione

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/56389/assessment-blood-brain-barrier-permeability-intravenous-infusion-fitc">Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease</a>. One of the author's names was corrected.

Erratum: Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease

Homeostaza w obrębie ośrodkowego układu nerwowego (OUN) jest warunkiem wstępnym prawidłowej komunikacji i funkcjonowania komórek nerwowych. Miąższ OUN jest szczelnie odizolowany od obwodu przez śródbłonkową barierę krew-mózg (BBB), która stanowi interfejs między obwodowym krwiobiegiem a mózgiem i odgrywa kluczową rolę w wzajemnym oddziaływaniu między tymi dwoma okręgami1,2. BBB jest złożoną i dynamiczną trójwymiarową strukturą składającą się głównie z wyspecjalizowanych komórek śródbłonka mikronaczyń (EC) połączonych ze sobą międzykomórkowymi kompleksami połączeniowymi - ścisłymi połączeniami (TJ) - i otoczonych perycytami, zakończeniami neuronów i wyrostkami stopy astrocytów1,2.
W warunkach fizjologicznych, ekstremalnie niska przepuszczalność nienaruszonego BBB zapewnia ścisłą regulację transportu składników odżywczych i innych cząsteczek do i z mózgu, a także zapewnia CNS unikalną ochronę przed zmianami zachodzącymi w składzie krwi, które mogą wpływać na aktywność neuronalną oraz przed potencjalnymi uszkodzeniami obwodowymi1, 2,3.
Od dawna wiadomo, że zakłócenie integralności BBB i jego zwiększonej przepuszczalności stanowi kluczową cechę dla wielu zaburzeń neurologicznych i neurodegeneracyjnych4 w tym Choroby Huntingtona (HD)5,6, jednak nadal nie jest jasne, czy taka dysfunkcja jest zjawiskiem sprawczym, czy zdarzeniem propagacyjnym w przebiegu choroby. Czas załamania BBB również pozostaje nieuchwytny, jednak pojawiające się dowody naszej grupy i innych wskazują, że zaburzona integralność BBB nie stanowi późnego zdarzenia w progresji choroby, ale raczej wczesny krok6,7,8, co może mieć długoterminowe konsekwencje.
Mając to na uwadze, ważne jest, aby przedwcześnie ujawnić rozpad BBB w neurodegeneracji, aby opracować strategie przydatne do przewidywania postępu choroby i uszkodzenia mózgu oraz do opracowania alternatywnych i bardziej ukierunkowanych interwencji, które są w stanie skutecznie złagodzić kliniczne konsekwencje takiego zakłócenia. Wiarygodne obrazowanie upośledzenia bariery krew-mózg ma zatem ogromne znaczenie zarówno w badaniach eksperymentalnych, jak i klinicznym leczeniu chorób mózgu.
W tym artykule opisujemy udaną i prostą procedurę oceny przepuszczalności BBB w mysim modelu HD przy użyciu izotiocyjanianu fluorescenianu o wysokiej masie cząsteczkowej (albuminy FITC). Wynaczynienie albuminy FITC, która normalnie nie może przekroczyć bariery, do miąższu mózgu mierzono jako wskaźnik przecieku BBB. Technikę tę można łatwo dostosować do szczurów i innych stanów patologicznych charakteryzujących się upośledzeniem naczyń mózgowych9,10.

<table><tbody><tr><td>Koncyjanian izotiocyjanianu albuminy i fluoresciny</td><td>SIGMA</td><td>A9771-100MG</td><td></td></tr><tr><td>pAb anty-Laminin</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB300-144</td><td></td></tr><tr><td>CY3 anty-królik wyprodukowany z kozy</td><td>MILLIPORE</td><td>AP132</td><td></td></tr><tr><td>SUPERFROST PLUS</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe 24 X 50 mm</td><td>Thermo Scientific (DIAPATH)</td><td>61050</td><td></td></tr><tr><td>Związek Kilik Optimal Temperature (OCT)</td><td>Bio Optica</td><td>05-9801</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Media montażowe</td><td>VECTOR</td><td>H-1500</td><td>Media montażowe z DAPI</td></tr><tr><td>iNSu/Light Insulina Jednorazowa strzykawka</td><td>RAYS Zdrowie i </td><td>Bezpieczeństwo INS1ML26G13</td><td></td></tr><tr><td>30G 1/2 "</td><td>BD Microlance</td><td>304000</td><td>Igła do jednorazowej strzykawki z insuliną</td></tr><tr><td>Uchwyt skalpela</td><td>FST</td> <td>91003-12</td><td></td></tr><tr><td>#22 Jednorazowe ostrza skalpela</td><td>FST</td><td>10022-00</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do cienkiej tęczówki 10,5 cm</td><td>F.S.T.</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #5745 45&deg; 0,10 x 0,06 mm</td><td>FST</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Graefe 10 cm</td><td>F.S.T.</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #5 0,1 X 0,06 mm</td><td>FST</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Łatka medyczna</td><td>Medicalis</td><td>34788</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna jednorazowa zasłona na ręcznik</td> Mikroskop stereoskopowy <td>Dispotech</td><td>TVO50VE</td><td></td></tr> Oświetlacz optyczny <tr><td></td><td>NIKON</td><td>SMZ 745 T</td><td></td></tr><tr><td>Oświetlacz optyczny LED (C-FLED2)</td><td>NIKON</td><td>1003167</td><td>Oświetlacz optyczny do stereoskopowego mikroskopu</td></tr><tr><td>Eclipse Ni-U</td><td>Nikon</td><td>932162</td><td>Mikroskop epifluorescencyjny</td></tr><tr><td>Mikroskop Aparat cyfrowy</td><td>Nikon</td><td>DS-Ri2</td><td>Kamera mikroskopowa</td></tr><tr><td>Intenslight</td><td>Nikon</td><td>C-HGFI</td><td>Lampa mikroskopowa</td></tr><tr><td>NIS-Elements 64-bit</td><td>Nikon</td><td>AR 4.40.00</td><td>Oprogramowanie analityczne</td></tr><tr><td>Elektryczna maszynka do golenia</td><td>Gemei</td><td>GM-3007</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena przepuszczalności bariery krew-mózg przez dożylną infuzję albuminy znakowanej fitc w mysim modelu choroby neurodegeneracyjnej

Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease

Naruszenie integralności bariery krew-mózg (BBB) jest powszechną cechą różnych chorób neurologicznych i neurodegeneracyjnych. Chociaż wzajemne oddziaływanie między zaburzoną homeostazą BBB a patogenezą zaburzeń mózgu wymaga dalszych badań, opracowanie i walidacja wiarygodnej procedury dokładnego wykrywania zmian BBB może mieć kluczowe znaczenie i stanowić użyteczne narzędzie do potencjalnego przewidywania postępu choroby i opracowywania ukierunkowanych strategii terapeutycznych.
Tutaj prezentujemy łatwą i efektywną procedurę oceny przecieku BBB w stanie neurodegeneracyjnym, takim jak ten występujący w przedklinicznym mysim modelu choroby Huntingtona, w którym defekty przepuszczalności BBB są wyraźnie wykrywalne przedwcześnie w chorobie. W szczególności albumina o wysokiej masie cząsteczkowej izotiocyjanianu fluoresceiny znakowana (FITC), która jest w stanie przekroczyć barierę krew-mózg tylko wtedy, gdy ta ostatnia jest upośledzona, jest ostro podawana do żyły szyjnej myszy, a następnie określa się jej rozmieszczenie w obszarach naczyniowych lub miąższowych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
Nagromadzenie zielonej albuminy fluorescencyjnej w miąższu mózgu funkcjonuje jako wskaźnik nieprawidłowej przepuszczalności BBB, a po określeniu ilościowym za pomocą oprogramowania do przetwarzania Image J, jest zgłaszane jako intensywność zielonej fluorescencji.

Prawidłowe wlewanie albuminy FITC do żyły szyjnej prowadzi do przenikania zielonego fluorescencyjnego znacznika z krwiobiegu do miąższu mózgu w przypadku uszkodzenia bariery krew-mózg (BBB)6. W warunkach fizjologicznych dystrybucja wlewanej fluorescencyjnej albuminy jest ograniczona do wnętrza naczyń krwionośnych mózgu, a w otaczającym obszarze okołonaczyniowym i/lub w miąższu mózgu nie wykrywa się żadnego sygnału (Rysunek 1A, mikrogra...

W tym badaniu prezentujemy łatwą i efektywną procedurę oceny uszkodzenia bariery krew-mózg w stanach neurodegeneracyjnych. Aby osiągnąć nasz cel, wstrzyknęliśmy albuminę o wysokiej masie cząsteczkowej izotiocyjanianu fluoresceiny znakowanej (FITC) do żyły szyjnej myszy i oceniliśmy jej wyciek do miąższu mózgu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Ocena przepuszczalności bariery krew-mózg przez dożylną infuzję albuminy znakowanej FITC w mysim modelu choroby neurodegeneracyjnej

Disruption of blood-brain barrier (BBB) integrity is a common feature for different neurological and neurodegenerative diseases. Although the interplay ...

Ogólnym celem tej procedury jest ocena przepuszczalności bariery mózg-krew w mysim modelu choroby zwyrodnieniowej poprzez doszkłowe wstrzyknięcie albuminy znakowanej FITC. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w badaniu homeostazy mózgu. Może to być szczególnie przydatne do zbadania ewentualnego związku między uszkodzeniem bariery krew-mózg a neurodegeneracją.Główną zaletą tej techniki jest to, że jest szybka i łatwa do wykonania i może być stosowana również do większych modeli zwierzęcych i innych warunków neuropatologicznych. Zabieg chirurgiczny polegający na dożynkowym wstrzyknięciu FITC-białka zademonstruje Luca Capocci. Salvatore Castaldo zademonstruje histologiczne sekcje mózgu.Enrico Amico zademonstruje procedurę pozyskiwania mikrofotografii. Rozpocznij od przygotowania roztworu albuminy FITC, rozpuszczając proszek albuminy FITC w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem w ilości 10 miligramów na mililitr. Rozłóż autoklawowane narzędzia chirurgiczne.Wyczyść stół chirurgiczny 70% etanolem i umieść sterylną jednorazową serwetkę chirurgiczną. Następnie ustaw działający mikroskop stereoskopowy. Po znieczuleniu myszy za pomocą dootrzewnowego wstrzyknię

assessment-blood-brain-barrier-permeability-intravenous-infusion-fitc

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film opisuje test przepuszczalności do oceny przepuszczalności bariery krew-mózg in vitro przy użyciu cząsteczek fluoresceiny sodu.

Test przepuszczalności naśladującej barierę krew-mózg: Test in vitro do oceny przepuszczalności naśladownictwa BBB dla cząsteczek znacznikowych

Ten film demonstruje procedurę oceny przerwania bariery krew-mózg w mysim modelu EAE. Barwniki fluorescencyjne o różnych rozmiarach są wstrzykiwane po ortopie i krążą w naczyniach krwionośnych mózgu. Mniejszy barwnik przecieka przez szczeliny do tkanki mózgowej, podczas gdy większy barwnik dostaje się tylko wtedy, gdy zakłócenie jest poważne, co koreluje z zakresem uszkodzenia bariery.

Określanie przerwania bariery krew-mózg za pomocą barwników fluorescencyjnych w mysim modelu EAE

Ten film demonstruje metodę badania przenikania przez model bariery krew-mózg (BBB) in vitro przy użyciu astrocytów i komórek śródbłonka na wkładce membranowej, z wolnym FITC i ferrytyną obciążoną FITC. FITC-ferrytyna wiązała się z receptorami na komórkach śródbłonka i przenikała przez barierę błonową do dolnej komory, podczas gdy wolna FITC wykazywała ograniczoną przenikalność i pozostawała w górnej komorze.

Badanie przenikania FITC i FITC-ferrytyny przez model bariery krew-mózg in vitro

Opisano i zweryfikowano metodę tworzenia modelu in vitro bariery krew-mózg opartej na wspólnej hodowli komórek mikronaczyniowych śródbłonka i astrocytów mózgu szczura. System ten okazał się przydatnym narzędziem do badania wpływu nanoformulacji na przenikanie przez barierę cząsteczek fluorescencyjnych.

In vitro Przenikanie ferrytyn obciążonych FITC przez barierę krew-mózg szczura: model do badania dostarczania nanoformułowanych cząsteczek

Tutaj prezentujemy test przepuszczalności naczyń krwionośnych mózgu myszy za pomocą dootrzewnowego wstrzykiwania znaczników fluorescencyjnych, a następnie perfuzji, który ma zastosowanie do zwierzęcych modeli dysfunkcji bariery krew-mózg. Jedna półmózg służy do ilościowej oceny przepuszczalności, a druga do wizualizacji znacznika/barwienia immunologicznego. Zabieg trwa 5 - 6 godzin dla 10 myszy.

Test przepuszczalności bariery krew-mózg in vivo u myszy przy użyciu znaczników znakowanych fluorescencyjnie

Ogólnym celem tej procedury jest dostarczenie wysoce powtarzalnej techniki oceny in vivo naruszenia bariery krew-mózg w szczurzych modelach udaru niedokrwiennego.

Ocena in vivo przerwania bariery krew-mózg w szczurzym modelu udaru niedokrwiennego

Tutaj prezentujemy protokoły do badania upośledzenia jednostki nerwowo-naczyniowej podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia in vivo. W szczególności zajmujemy się tym, jak określić przepuszczalność bariery krew-mózg i aktywność żelatynazy zaangażowaną w migrację leukocytów przez limity gleju.

Wizualizacja upośledzenia barier śródbłonkowych i glejowych jednostki nerwowo-naczyniowej podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia mięśniowego in vivo

Ukierunkowanie leków na nowotwory ośrodkowego układu nerwowego jest dużym wyzwaniem. W tym miejscu opisujemy protokół wytwarzania in vitro naśladującego barierę nowotworową krew-mózg przy użyciu komórek mysich i / lub ludzkich oraz omawiamy ich znaczenie dla przewidywalności celowania w nowotwór ośrodkowego układu nerwowego in vivo.

Przewidywanie dostarczania ładunków in vivo przy użyciu bariery krew-mózg w naczyniu

Ten protokół opisuje nowatorską technikę pomiaru trzech najważniejszych parametrów niedokrwiennego uszkodzenia mózgu na tym samym zestawie próbek mózgu gryzoni. Wykorzystanie tylko jednej próbki mózgu jest bardzo korzystne pod względem kosztów etycznych i ekonomicznych.

Pomiar obrzęku mózgu po udarze, strefy zawału i uszkodzenia bariery krew-mózg w jednym zestawie próbek mózgu gryzoni

Opracowano metodę wizualizacji wynaczynienia barwnika z powodu uszkodzenia bariery krew-mózg (BBB) poprzez podanie myszom dwóch barwników fluorescencyjnych w różnych punktach czasowych. Zastosowanie glicerolu jako krioprotektantu ułatwiło immunohistochemię na tej samej próbce.

Ocena przełamania bariery krew-mózg w mysim modelu łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu

Protokół ten przedstawia wiarygodną metodę oceny integralności bariery krew-mózg (BBB) w modelu dorosłego danio pręgowanego (Danio rerio) przy użyciu oceny Evana opartej na niebieskim barwniku, umożliwiając zarówno jakościową, jak i ilościową analizę zaburzeń nerwowo-naczyniowych.

Wizualizacja strażnika: oparta na niebieskim barwniku ocena przepuszczalności bariery krew-mózg przez Evana u dorosłych danio pręgowanych

Poznaj metodę oceny przepuszczalności bariery krew-mózg w mysim modelu choroby neurodegeneracyjnej przy użyciu albuminy znakowanej FITC. Szybka technika dożylnej infuzji umożliwia badanie uszkodzeń bariery i ich związku z neurodegeneracją.

Ocena przepuszczalności bariery krew-mózg przez dożylną infuzję albuminy znakowanej FITC w mysim modelu choroby neurodegeneracyjnej (Wideo) | JoVE Journal

Ocena przepuszczalności bariery krew-mózg przez dożylną infuzję albuminy znakowanej FITC w mysim modelu choroby neurodegeneracyjnej

Przeglądaj więcej filmów