Trójwymiarowa hodowla komórkowa oparta na chipach w perfuzjonych mikrobioreaktorach

Cześć, nazywam się Eric Gottwald i jestem naukowcem w Instytucie Interfejsów Biologicznych w Ware Institute of Technology. A dzisiaj chciałbym przedstawić Wam nasz perfuzyjny system mikrobioaktywny na bazie chipów. Zanim będziemy mogli użyć chipa w zastosowaniach związanych z hodowlą komórkową, musimy zhydrolizować polimer i obniżyć wartość znamionową obszaru mikrostrukturalnego.

Osiąga się to po prostu zanurzając chip w różnych stężeniach izopropanolu, zaczynając od 100%Zanurzam chip tylko na kilka sekund w każdym stężeniu, a ostatnim krokiem jest tylko woda. Następnie chip jest suszony, a na koniec musimy pokryć chip kolagenem, jednym z roztworów ułatwiających przyleganie komórek do polimeru. Odbywa się to poprzez kapanie zaledwie kilku kropli kolagenu, jednego roztworu na obszar mikrostrukturalny i w tym stanie chip jest inkubowany w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc.

Po całonocnej inkubacji z roztworem kolagenu jeden roztwór jest usuwany, a chip jest myty sterylnym PBS Następnie również PBS jest usuwany, a chip jest teraz gotowy do zaszczepienia komórek. Teraz zaszczepimy statek komórkowy zawiesiną pojedynczych komórek, a odbywa się to poprzez umieszczenie 150 mikrolitrów zawiesiny komórkowej na obszarze mikrostrukturalnym. Po osadzeniu komórek chip inkubuje się przez trzy godziny w temperaturze 37 stopni w inkubatorze.

Po trzygodzinnym okresie inkubacji chip jest wyjmowany z inkubatora i jest teraz gotowy do włożenia do ectora. W tym celu ektor wyjmuje się ze sterylnego opakowania, a sterylność uzyskuje się poprzez napromieniowanie promieniowaniem gamma tej przezroczystej folii. Musimy więc tylko otworzyć opakowanie i wyjąć ector.

To, co zrobimy dalej, to włożymy górną część butelki do tego zbiornika pożywki, abyśmy mogli zdemontować obudowę bioreaktora w celu włożenia chipa. Po otwarciu obudowy bioreaktora możemy teraz włożyć chip, co osiąga się po prostu umieszczając chip w rowku obudowy bioreaktora, a bactor można teraz ponownie zmontować. To, co musimy w końcu zrobić, to podłączyć sterylne filtry do zbiornika pożywki i jednego portu do pobierania sterylnych próbek.

W celu pomiaru rzeczywistego napięcia tlenu w zamkniętej pętli cyrkulacyjnej włożymy dwie sondy tlenu, po prostu montując je między tymi dwoma złączami. Bactor jest teraz gotowy do napełnienia pożywką hodowlaną. System bactor jest teraz gotowy do napełnienia pożywką do hodowli komórkowych, a osiąga się to po prostu poprzez podłączenie zamkniętej pętli cyrkulacyjnej do pompy rolkowej.

W ten sposób jednocześnie obniżymy wartość całego obiegu bactora. Jak widać tutaj w oknie Ectora, można zobaczyć, jak medium wychodzące z dołu wznosi się i wznosi, pozostawiając bactor na górze. Zanim umieścimy system Bactor w inkubatorze, sprawdzamy, czy pętla cyrkulacyjna jest wypełniona bez pęcherzyków powietrza.

Teraz system jest całkowicie wypełniony pożywką do hodowli komórkowych i możemy przenieść bioreaktor do inkubatora. Teraz umieścimy birektora w komorze inkubacyjnej. I w tym celu najpierw bi rector jest podłączony do pompy rolkowej, jak już widzieliście krótko wcześniej, a teraz ector jest aktywnie perfektowany przez to medium z butelki.

Aby utrzymać stężenie tlenu w otoczeniu, podłączamy zbiornik medium do źródła gazu. I na koniec podłączymy dwa czujniki tlenu do krążenia, aby monitorować online ciśnienie tlenu w systemie. Teraz konfiguracja jest zakończona i może być uruchamiana tak długo, jak długo eksperyment został zaprojektowany.

Jednym z najpotężniejszych narzędzi podczas analizy funkcji organotypowych komórek znajdujących się wewnątrz pojemników MicroCon jest laserowy mikroskop skaningowy, który można zobaczyć tutaj. Laserowy mikroskop skaningowy daje nam możliwość zajrzenia do każdego pojedynczego pojemnika MicroCon bez zniszczenia. A ponieważ pojemniki MicroCon lub chip mogą być używane do konwencjonalnych metod immunofluorescencji barwienia immunologicznego, jesteśmy w stanie wykryć wszystkie rodzaje markerów i funkcji organotypowych wewnątrz mikropojemników.

Jak widać na animacji tego chipa, dno jest całkowicie wypełnione komórkami, a także ściankami pojemnika MicroCon. Mamy mnóstwo komórek, które są całkiem żywe, i mamy bardzo, bardzo mało martwych komórek. Na następnym zdjęciu widać, że wewnątrz pojemnika MicroCon możemy wykryć wszelkiego rodzaju funkcje organotypowe.

Na przykład w przypadku hepatocytów, produkcja albuminy lub E może usłyszeć ekspresję w komórkach, co można ładnie zobaczyć tutaj w nakładce. Jądro było zabarwione na niebiesko. Eko w tym przypadku jest zabarwiony na zielono, a albumina jest wyrażona lub zabarwiona na czerwono.

I jak tu ładnie widać, wszystkie funkcje organotypowe, których oczekujesz od hepatocytów, są ładnie wyrażone w tego rodzaju kulturze 3D. Co więcej, przyjrzeliśmy się innemu markerowi hepatocytów, a była to cytokeratyna 18, a to zdjęcie pokazuje, że cytokeratyna 18 jest również ładnie wyrażana w tego rodzaju kulturach. Miejmy nadzieję, że przekona Cię to, że tego rodzaju funkcje organotypowe mogą być przydatne również dla innych kultur organotypowych.

Po zakończeniu eksperymentu Biore chip może być używany do izolacji wszelkiego rodzaju składników komórkowych, takich jak na przykład całkowite RNA. Jak widać tutaj, tutaj pokazujemy pobranie całkowitego RNA, które zostało wyizolowane z systemu bioreaktora. Ten całkowity RNA może być następnie wykorzystany do dalszych zastosowań, takich jak na przykład PCR w czasie rzeczywistym lub, jak widać tutaj, analiza mikromacierzy.

Co więcej, nienaruszone komórki mogą być izolowane z systemu, a następnie wykorzystywane do konwencjonalnej analizy cytometrii przepływowej. Jak można tu zauważyć, mam nadzieję, że uda nam się pokazać Państwu, że system może być przydatny we wszystkich rodzajach zastosowań, w których wymagane są reakcje organotypowe, oraz że system może być przydatny we wszystkich tych zastosowaniach, których do tej pory nie braliśmy pod uwagę, takich jak na przykład zastosowania komórek macierzystych.