Name: Trójwymiarowa hodowla komórkowa oparta na chipach w perfuzjonych mikrobioreaktorach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-05-21T20:23:00.000+00:00
Duration: 12 min 39 s
Description: Poznaj trójwymiarową hodowlę komórkową w perfuzjonych mikrobioreaktorach opartych na chipach. System umożliwia uprawę do 10 milionów komórek w kontrolowanych warunkach sterylnej zamkniętej pętli cyrkulacyjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Pragniemy podziękować Mechthild Herschbach oraz Anke Dech za doskonałą pomoc techniczną.

Niniejszy artykuł opisuje zastosowanie platformy opartej na chipie (rys. 1) do trójwymiarowej hodowli linii komórkowych, a także komórek pierwotnych. Ponieważ wiele komórek wykazuje funkcje organotypowe wyłącznie w środowisku 3D, opracowaliśmy polimerowy chip, który stanowi rusztowanie, do którego komórki mogą przylegać we wszystkich kierunkach przestrzennych i który może zostać zamontowany w obudowie bioreaktora w celu kontroli przepływu cieczy, ciśnienia tlenu itp. W zależności od projektu eksperymentalnego powierzchnię polimeru można modyfikować za pomocą różnych technik, np. naświetlania UV, PECVD, szczepienia γ lub konwencjonalnej chemii mokrej.
<img src="/files/ftp_upload/old/564_2008_9_19_6/564_Figure-01.png" alt="Schemat mikrowytwarzania z strukturami 3D i obrazami SEM do analizy materiałowej." width="546" height="386" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="564_Figure-01.png">
Rycina 01

1. Odpowietrzanie i hydrofilizacja chipa
Przed użyciem chip musi zostać odgazowany i zhydrofilizowany. W tym celu przeprowadza się serię kąpieli alkoholowych. Przygotowuje się roztwory izopropanolu o stężeniach 100%, 70%, 50% i 30% w wodzie traktowanej DMPC, a następnie chip zanurza się w każdym z tych stężeń, zaczynając od roztworu 100%, na czas do 30 s. Ostatnim etapem serii jest zanurzenie w czystej wodzie traktowanej Dimetylopirokarbonianem (DMPC). Od tego momentu kluczowe jest utrzymywanie chipu w stanie zwilżonym.
2. Powlekanie kolagenem I
Po serii kąpieli w alkoholach chip jest zazwyczaj powlekany roztworem kolagenu I pochodzącym z ogona szczura. Z roztworu stokowego kolagenu o stężeniu 2 mg/ml w 0,2% kwasie octowym pobiera się alikwot odpowiadający 30 μg białka kolagenu i rozcieńcza go wodą traktowaną DMPC do końcowej objętości 150 μl. W rezultacie powierzchnia chipu zostaje pokryta warstwą kolagenu o gęstości 10 μg kolagenu I na cm2 powierzchni.
3. Inokulacja komórek raka wątrobowokomórkowego
Komórki raka hepatokomórkowego linii Hep G2 poddaje się trypsynizacji i zliczaniu. W przypadku eksperymentów krótkoterminowych (od 1 do 6 dni) w każdym chipie oraz w odpowiadających im kontrolnych szalkach Petriego o średnicy 6 cm wysiewa się 5*106 komórek. Aby zaszczepić chip, 5*106 komórek resuspenduje się w 150 μl pożywki hodowlanej i nanosi na obszar mikrostrukturalny chipa (ryc. 2). Następnie chip umieszcza się w inkubatorze na 2-3 godziny. W czasie inkubacji komórki sedymentują do mikropojemników i przylegają do rusztowania powleczonego kolagenem I.
<img src="/files/ftp_upload/old/564_2008_9_19_7/564_Figure-02.png" alt="Równowaga statyczna; ΣFx=0; układ doświadczalny; szkiełko mikroskopowe z próbką w szalce Petriego." width="300" height="225" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="564_Figure-02.png">
Rycina 2
4. Włożenie chipa do obudowy bioreaktora
Po okresie inkubacji chip zostaje wyjęty z inkubatora i zamontowany w obudowie bioreaktora. W tym celu, w komorze z laminarnym przepływem powietrza, wstępnie zmontowany bioreaktor zostaje wyjęty z jałowego opakowania i rozłożony w stopniu umożliwiającym włożenie chipa. Chip jest ostrożnie przenoszony za pomocą jałowej pęsety i umieszczany w rowku zawierającym uszczelkę, która uszczelnia chip, co prowadzi do utworzenia komory górnej i dolnej w bioreaktorze. Następnie bioreaktor zostaje ponownie złożony i przeniesiony do inkubatora, gdzie zostaje podłączony do pompy, zasilania gazem oraz analizatora tlenu.
5. Napełnianie układu
Zaraz po podłączeniu bioreaktora do zbiornika z pożywką, pompy i zasilania gazem, zamknięta pętla cyrkulacyjna zostaje wypełniona pożywką. Odbywa się to poprzez odpowiednie ustawienie złączy trójdrożnych w taki sposób, aby uzyskano superfuzję, definiowaną jako przepływ pożywki nad górną powierzchnią chipa. Prowadzi to do usunięcia zamkniętego powietrza z obiegu bioreaktora bez konieczności usuwania komórek z rusztowania. Po całkowitym wypełnieniu układu pożywką, złącza trójdrożne przełącza się tak, aby uzyskać perfuzję, definiowaną jako przepływ od dołu chipa przez tkankę. W konfiguracji perfuzyjnej przepływ jest dostosowany do potrzeb komórek, co w przypadku hepatocytów zazwyczaj mieści się w zakresie 60-500 μl/min.
6. Pobieranie próbek
W trakcie eksperymentu można pobierać próbki pożywki. W tym celu strzykawki podłącza się do sterylnych portów znajdujących się na górnej części zbiornika z pożywką. Po pobraniu próbek porty sterylizuje się 70% izopropanolem.
7. Izolacja nienaruszonych komórek z chipa do dalszych zastosowań
Po zakończeniu eksperymentu bioreaktory zostają odłączone od zasilania gazem oraz pompy perystaltycznej, przeniesione do komory z laminarnym przepływem powietrza i rozmontowane zgodnie z wcześniejszym opisem. Za pomocą sterylnej pęsety chip zostaje wyjęty z obudowy bioreaktora, umieszczony w szalce Petri o średnicy 3,5 cm i przepłukany PBS. Następnie chip inkubuje się z trypsyną/EDTA (0,25%/0,53mM) przez 5-15 min w inkubatorze, aby odłączyć komórki od obszaru mikrostrukturalnego. Zebrana zawiesina komórkowa jest wirowana przez 5 min przy 600 g. Komórki można następnie wykorzystać w konwencjonalnych zastosowaniach analitycznych, np. do izolacji całkowitego RNA lub białek. Rutynowo izolujemy całkowite RNA (zestaw PARIS, Ambion Inc., Austin, Texas, USA) do analizy mikromacierzy i RT-PCR w czasie rzeczywistym. Ekspresję białek analizuje się za pomocą skaningowego mikroskopu laserowego po barwieniu immunohistochemicznym komórek wewnątrz chipu, ale można ją również badać innymi metodami, np. za pomocą cytometrii przepływowej.

<ol><li>Berry, M. N., Friend, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+preparation+of+isolated+rat+liver+parenchymal+cells%3A+A+biochemical+and+fine+structural+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: A biochemical and fine structural study.</a> J. Cell Biol. 53, 506-520 (1969).</li>
<li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+rat+liver+cells.+3.+Enzymatic+requirements+for+tissue+dispersion%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Preparation of rat liver cells. 3. Enzymatic requirements for tissue dispersion.</a> Exp. Cell Res. 82, 391-398 (1973).</li>
<li>Giselbrecht, S., Gietzelt, T., Gottwald, E., Trautmann, C., Truckenmueller, R., Weibezahn, K. F., Welle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+tissue+culture+substrates+produced+by+microthermoforming+of+pre-processed+polymer+films%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdev%22%5BJournal%5D)">3D tissue culture substrates produced by microthermoforming of pre-processed polymer films.</a> Biomed. Microdev. 8, 191-199 (2006).</li>
<li>Welle, A., Gottwald, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UV-based+patterning+of+polymeric+substrates+for+cell+culture+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdev%22%5BJournal%5D)">UV-based patterning of polymeric substrates for cell culture applications.</a> Biomed. Microdev. 4, 33-41 (2002).</li>
<li>Gottwald, E., Giselbrecht, S., Augspurger, C., Lahni, B., Dambrowsky, N., Truckenmueller, R., Piotter, V., Gietzelt, T., Wendt, O., Pfleging, W., Welle, A., Rolletschek, A., Wobus, A. M., Weibezahn, K. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chip-based+platform+for+the+in+vitro+generation+of+tissues+in+three-dimensional+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A chip-based platform for the in vitro generation of tissues in three-dimensional organization.</a> Lab Chip. 7, 777-785 (2007).</li>
<li>Eschbach, E., Chatterjee, S. S., Noldner, M., Gottwald, E., Dertinger, H., Weibezahn, K. -F., Knedlitschek, G., G, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microstructured+scaffolds+for+liver+tissue+with+high+density%3A+Morphological+and+biochemical+characterization+of+tissue+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Microstructured scaffolds for liver tissue with high density: Morphological and biochemical characterization of tissue aggregates.</a> J. Cell. Biochem. 95, 243-255 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opracowaliśmy platformę opartą na chipach do trójwymiarowej hodowli komórek w aktywnie perfundowanych mikrobioreaktorach. Chipy mogą być wytwarzane z polimerów niebiodegradowalnych, jak i biodegradowalnych, przy użyciu technik mikro wtryskiwania, hot embossingu oraz mikro termoformowania 3. W zależności od projektu eksperymentu powierzchnia polimeru może zostać zmodyfikowana za pomocą naświetlania promieniowaniem UV 4. W urządzeniach tych można z powodzeniem hodować linie komórkowe hepatocytów, a ta...

<table><tbody><tr><td>Komórki</td><td>Inne</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen I z ogona szczura</td><td>Odczynnik</td><td>Roche Group</td><td>11 179 179 001</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw PARIS</td><td>Odczynnik</td><td>Ambion</td><td>AM1921</td><td></td></tr><tr><td>Syto16</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>S7578</td><td></td></tr><tr><td>anty-cytokeratyna 18</td><td>Przeciwciało</td><td>Abcam</td><td>ab668</td><td>Przeciwciało pierwotne, mysie monoklonalne, stosowane w rozcieńczeniu 1/100 w PBS</td></tr><tr><td>Anty-E-kadheryna</td><td>Przeciwciało</td><td>Abcam</td><td>ab1416</td><td>Przeciwciało pierwotne, mysie monoklonalne, stosowane w rozcieńczeniu 1/50 w PBS.</td></tr><tr><td>Kozie anty-albuminy</td><td>Odczynnik</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>E80-129</td><td>Przeciwciało pierwotne, kozie anty-ludzka albumina, stosowane w rozcieńczeniu 1/200 w PBS</td></tr><tr><td>Królicze anty-mysie IgG1</td><td>Przeciwciało</td><td>Invitrogen</td><td>A11059</td><td>Przeciwciało wtórne, koniugowane z Alexa Flour 488, stosowane w rozcieńczeniu 1/100 w PBS + 0.5 % BSA</td></tr><tr><td>Cy3 anty-kozie IgG</td><td>Odczynnik</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-165-003</td><td>Cy3 AffiniPure osioł a-kozie IgG Ab, stosowane w rozcieńczeniu 1/700 w PBS + 0.5% BSA</td></tr></tbody></table>

trójwymiarowa hodowla komórek na chipie w przepływowych mikrobioreaktorach

Chip-based Three-dimensional Cell Culture in Perfused Micro-bioreactors

Opracowaliśmy system hodowli komórkowej na chipie do trójwymiarowej uprawy komórek. Chip jest zazwyczaj produkowany z polimerów niebiodegradowalnych, np. poliwęglanu lub polimetakrylanu metylu, metodą mikro-wtryskowego formowania, mikro-tłoczenia na gorąco lub mikro-termoformowania. Może on być jednak również wykonany z polimerów biodegradowalnych. Jego całkowite wymiary wynoszą 0,7–1 x 20 x 20 x 0,7–1 mm (wys. x szer. x dł.). Główne cechy stosowanych chipów to albo siatka do 1156 sześciennych mikro-pojemników (cf-chip), z których każdy ma rozmiar 120-300 x 300 x 300 μm (wys. x szer. x dł.), albo wgłębienia okrągłe o średnicy 300 μm i głębokości 300 μm (r-chip). Rusztowanie może pomieścić 10 mln komórek w konfiguracji trójwymiarowej. W celu optymalnego dostarczania składników odżywczych i gazów chip jest umieszczany w obudowie bioreaktora. Bioreaktor stanowi część zamkniętego, sterylnego obiegu, który w najprostszej konfiguracji składa się dodatkowo z pompy perystaltycznej oraz zbiornika z pożywką z dopływem gazu. Bioreaktor może pracować w trybie perfuzji, superfuzji lub trybie mieszanym. Z powodzeniem hodowaliśmy linie komórkowe, a także komórki pierwotne przez okresy kilku tygodni. W przypadku pierwotnych hepatocytów szczura wykazaliśmy zachowanie funkcji organotypowych przez ponad 2 tygodnie. W przypadku linii komórkowych raka wątrobowokomórkowego wykazaliśmy indukcję genów specyficznych dla wątroby, które w standardowej hodowli monowarstwowej nie są lub są w niewielkim stopniu ekspresowane. System ten może być również użyteczny jako system hodowli komórek macierzystych, ponieważ pierwsze eksperymenty z różnicowaniem linii komórek macierzystych okazały się obiecujące.

Opisujemy platformę opartą na chipie do trójwymiarowej hodowli komórek w mikrobioreaktorach. Jeden chip może pomieścić do 10 Mio. komórek, które mogą być hodowane w precyzyjnie określonych warunkach pod kątem przepływu cieczy, ciśnienia tlenu itp. w sterylnym, zamkniętym obiegu.

Trójwymiarowa hodowla komórek na chipie w przepływowych mikrobioreaktorach

Opracowaliśmy system hodowli komórkowej oparty na chipie do trójwymiarowej hodowli komórek. Chip jest zazwyczaj produkowany z...

Witam, nazywam się Eric Gottwald i jestem naukowcem badawczym w Instytucie Interfejsów Biologicznych w Ware Institute of Technology. Dzisiaj chciałbym zaprezentować Państwu nasz chipowy perfuzyjny mikro-bioaktywny system. Zanim będziemy mogli wykorzystać chip w aplikacjach z kulturami komórkowymi, musimy przeprowadzić hydrolizę polimeru oraz odtłuścić obszar mikrostrukturalny.Osiąga się to poprzez zanurzanie chipa w roztworach izopropanolu o różnych stężeniach, zaczynając od 100%. Chip jest zanurzany w każdym z roztworów przez zaledwie kilka sekund, a ostatnim etapem jest przemycie wodą. Następnie chip zostaje wysuszony, a na koniec należy pokryć go roztworem kolagenu typu I, aby ułatwić adhezję komórek do polimeru. Odbywa się to poprzez naniesienie kilku kropel roztworu kolagenu typu I na obszar mikrostrukturalny, po czym chip jest inkubowany w temperaturze 4 °C przez noc.Po całonocnej inkubacji z roztworem kolagenu typu I, roztwór zostaje usunięty, a chip przemyto sterylnym PBS. Następnie usunięto PBS, dzięki czemu chip jest gotowy do inokulacji komórek. Teraz zaszczepimy chip komórkowy zawiesiną pojedynczych komórek, nakładając 150 µL zawiesiny komórkowej na obszar mikrostruktur

chip-based-three-dimensional-cell-culture-perfused-micro

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Trójwymiarowa hodowla komórek oparta na chipach w przepływowych mikrobioreaktorach

W przeszłości wiele systemów hodowli in vitro – głównie hodowle monowarstwowe – często obarczonych było wadą polegającą na tym, że zróżnicowane komórki pierwotne miały stosunkowo krótki czas życia i ulegały dedyferencjacji podczas hodowli. W konsekwencji większość ich funkcji swoistych dla danego organu była szybko utracona. Aby zatem odtworzyć lepsze warunki dla tych komórek in vitro, wprowadzono modyfikacje i adaptacje do konwencjonalnych hodowli monowarstwowych.

Wywiad: Bioreaktory i rusztowania 3D z modyfikowaną powierzchnią w badaniach nad komórkami macierzystymi

W niniejszym protokole prezentujemy proces wytwarzania macierzy mikroaktuatorów z pionowo przesuniętymi słupkami, na której opiera się ta technologia, oraz sposób, w jaki technologia bazowa ta może zostać zmodyfikowana w celu prowadzenia wysokoprzepustowych dynamicznych mechanicznie hodweli komórkowych w dwu- i trójwymiarowych paradygmatach hodowli.

Mikrofabrykowane platformy do mechanicznie dynamicznej hodowli komórek

W tym protokole przedstawiono produkcję, konfigurację i podstawowe działanie mikroprzepływowego bioreaktora pikolitrowego (PLBR) do analizy pojedynczych komórek mikroorganizmów prokariotycznych. Mikroorganizmy istotne z przemysłowego punktu widzenia zostały przeanalizowane jako dowód zasadności, co pozwoliło na wgląd w tempo wzrostu, morfologię i niejednorodność fenotypową w określonych okresach czasu, co jest prawie niemożliwe przy użyciu konwencjonalnych metod.

Mikroprzepływowy bioreaktor pikoliterowy do analizy mikrobiologicznej pojedynczych komórek: produkcja, konfiguracja systemu i obsługa

Tutaj prezentujemy protokół kohodowli komórek pierwotnych, modeli tkanek i biopsji dziurkowania w mikroprzepływowym chipie wielonarządowym przez okres do 28 dni. Ludzkie mikronaczyniowe komórki śródbłonka skóry, agregaty wątroby i biopsje skóry z powodzeniem połączono we wspólnym krążeniu pożywki.

Wielonarządowy chip - platforma mikroprzepływowa do długoterminowej kokultury wielotkankowej

Opisujemy metodę konstruowania urządzeń do hodowli 3D i eksperymentowania z komórkami i organoidami wielokomórkowymi. Urządzenie to umożliwia analizę odpowiedzi komórkowych na sygnały rozpuszczalne w mikrośrodowiskach 3D ze zdefiniowanymi gradientami chemoatraktantu. Organoidy są lepsze niż pojedyncze komórki w wykrywaniu słabych hałaśliwych sygnałów.

Analiza 3D wielokomórkowych odpowiedzi na gradienty chemoatraktantu

Ten protokół demonstruje metody umożliwiające rozszerzoną hodowlę in vitro ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX). Jeden etap zwiększa ogólną żywotność wielokomórkowych kultur klastrowych w hydrożelach 3D, poprzez proste usuwanie niezdolnych do życia pojedynczych komórek. Drugi krok demonstruje najlepsze praktyki dotyczące hodowli PDX w perfuzjowanej platformie mikroprzepływowej.

Zwiększona żywotność kultur hydrożelowych ex vivo 3D ksenoprzeszczepów pobranych od pacjentów w perfuzjonej platformie mikroprzepływowej

Prezentujemy system mikroprzepływowy do wysokoprzepustowych badań nad złożonymi maszynami życia, który składa się z 1500 jednostek hodowlanych, szeregu ulepszonych pomp perystaltycznych i modułu mieszania na miejscu. Chip mikroprzepływowy pozwala na analizę wysoce złożonych i dynamicznych warunków mikrośrodowiskowych in vivo.

Generowanie dynamicznych warunków środowiskowych za pomocą wysokowydajnego urządzenia mikroprzepływowego

Ten artykuł przedstawia metodę budowy i obsługi taniego, wielokanałowego systemu hodowli komórek perfuzyjnych do pomiaru dynamiki wydzielania i szybkości wchłaniania substancji rozpuszczonych w procesach komórkowych. System może również wystawiać komórki na działanie dynamicznych profili bodźców.

Wielostrumieniowy bioreaktor perfuzyjny zintegrowany z frakcjonowaniem wylotowym w celu dynamicznej hodowli komórek

Ten protokół przedstawia konfigurację i działanie nowo opracowanego, wydrukowanego w 3D bioreaktora do hodowli ex vivo naczyń krwionośnych w trakcie perfuzji. System został zaprojektowany tak, aby mógł być łatwo przyjęty przez innych użytkowników, praktyczny, niedrogi i możliwy do dostosowania do różnych zastosowań eksperymentalnych, takich jak podstawowa biologia i badania farmakologiczne.

Ex vivo Kultura perfuzyjna dużych naczyń krwionośnych w bioreaktorze wydrukowanym w 3D

Nasz szczegółowy protokół opisuje tworzenie i używanie zaawansowanego modelu jelita na chipie, który symuluje ludzką błonę śluzową jelit ze strukturami 3D i różnymi typami komórek, umożliwiając dogłębną analizę odpowiedzi immunologicznych i funkcji komórkowych w odpowiedzi na kolonizację mikrobiologiczną.

Immunokompetentny model jelita na chipie do analizy odpowiedzi immunologicznej błony śluzowej jelit

Tutaj prezentujemy protokoły, które szczegółowo opisują instrukcje dotyczące wdrażania hodowli komórkowych 3D przy użyciu matryc kolagenowych i kolagenowo-agarozowych w systemie mikrofizjologicznym. Protokoły te wspierają kogenerację kanalików proksymalnych nerek i sferoidów raka nerkowokomórkowego, symulując warunki in vivo i umożliwiając zaawansowane badania interakcji komórek raka nerki.

Kohodowla mikroprzepływowa zdrowych nerek i nabłonka guza w celu modelowania progresji raka nerki

Poznaj trójwymiarową hodowlę komórkową w perfuzjonych mikrobioreaktorach opartych na chipach. System umożliwia uprawę do 10 milionów komórek w kontrolowanych warunkach sterylnej zamkniętej pętli cyrkulacyjnej.

Trójwymiarowa hodowla komórek na chipie w przepływowych mikrobioreaktorach

Przeglądaj więcej filmów