Trójwymiarowa hodowla komórek na chipie w przepływowych mikrobioreaktorach

Witam, nazywam się Eric Gottwald i jestem naukowcem badawczym w Instytucie Interfejsów Biologicznych w Ware Institute of Technology. Dzisiaj chciałbym zaprezentować Państwu nasz chipowy perfuzyjny mikro-bioaktywny system. Zanim będziemy mogli wykorzystać chip w aplikacjach z kulturami komórkowymi, musimy przeprowadzić hydrolizę polimeru oraz odtłuścić obszar mikrostrukturalny.

Osiąga się to poprzez zanurzanie chipa w roztworach izopropanolu o różnych stężeniach, zaczynając od 100%. Chip jest zanurzany w każdym z roztworów przez zaledwie kilka sekund, a ostatnim etapem jest przemycie wodą. Następnie chip zostaje wysuszony, a na koniec należy pokryć go roztworem kolagenu typu I, aby ułatwić adhezję komórek do polimeru. Odbywa się to poprzez naniesienie kilku kropel roztworu kolagenu typu I na obszar mikrostrukturalny, po czym chip jest inkubowany w temperaturze 4 °C przez noc.

Po całonocnej inkubacji z roztworem kolagenu typu I, roztwór zostaje usunięty, a chip przemyto sterylnym PBS. Następnie usunięto PBS, dzięki czemu chip jest gotowy do inokulacji komórek. Teraz zaszczepimy chip komórkowy zawiesiną pojedynczych komórek, nakładając 150 µL zawiesiny komórkowej na obszar mikrostrukturalny. Po naniesieniu komórek chip inkubuje się przez trzy godziny w temperaturze 37 °C w inkubatorze.

Po trzygodzinnym okresie inkubacji chip zostaje wyjęty z inkubatora i jest gotowy do umieszczenia w ektorze. W tym celu ektor wyjmuje się z opakowania sterylnego; sterylność uzyskano poprzez naświetlanie folii przezroczystej promieniowaniem gamma. Wystarczy zatem otworzyć opakowanie i wyjąć ektor.

W następnym kroku włożymy górną część butelki do tego zbiornika z pożywką, aby móc rozmontować obudowę bioreaktora w celu włożenia chipa. Po otwarciu obudowy bioreaktora możemy teraz włożyć chip, umieszczając go w rowku obudowy bioreaktora, a następnie ponownie zmontować urządzenie. Na koniec należy podłączyć dwa filtry sterylizujące do zbiornika z pożywką oraz jeden sterylny port pobierania próbek.

W celu pomiaru rzeczywistego ciśnienia parcjalnego tlenu w zamkniętym obiegu, wstawimy dwa czujniki tlenu, montując je pomiędzy tymi dwoma złączami. Baktor jest teraz gotowy do napełnienia pożywką hodowlaną. System bactor jest gotowy do napełnienia pożywką do hodowli komórkowej, co osiąga się poprzez proste podłączenie zamkniętego obiegu do pompy perystaltycznej.

W ten sposób jednocześnie odpowietrzymy cały obieg bioreaktora. Jak widać tutaj w oknie Ector, medium wypływa z dołu, wznosi się i opuszcza bioreaktor od góry. Przed umieszczeniem systemu bioreaktora w inkubatorze sprawdzamy, czy pętla cyrkulacyjna została napełniona bez pęcherzyków powietrza.

Obecnie system jest całkowicie wypełniony pożywką do hodowli komórek i możemy przenieść bioreaktor do inkubatora. Teraz umieścimy bioreaktor w komorze inkubacyjnej. W tym celu bioreaktor zostaje najpierw podłączony do pompy rolkowej, tak jak widzieli Państwo chwilę wcześniej, a obecnie bioreaktor jest aktywnie perfundowany tą pożywką z butelki.

Aby utrzymać stężenie tlenu w otoczeniu, podłączamy zbiornik z medium do źródła gazu. Na koniec podłączymy dwa czujniki tlenu do obiegu, aby na bieżąco monitorować ciśnienie parcjalne tlenu w systemie. Układ jest teraz kompletny i może pracować przez cały zaplanowany czas trwania eksperymentu.

Jednym z najpotężniejszych narzędzi podczas analizy funkcji organotypowych komórek wewnątrz pojemników MicroCon jest skaningowy mikroskop laserowy, który widnieje tutaj. Skaningowy mikroskop laserowy daje nam możliwość nieinwazyjnego wglądu w każdy pojedynczy pojemnik MicroCon. Ponadto, ponieważ pojemniki MicroCon lub chip mogą być wykorzystywane w konwencjonalnych metodach barwienia immunocytochemicznego i immunofluorescencji, jesteśmy w stanie wykryć wszelkie rodzaje markerów oraz funkcji organotypowych wewnątrz mikropojemników.

Jak widać tutaj, w animacji tego chipa, dno oraz ścianki pojemnika MicroCon są całkowicie wypełnione komórkami. Mamy wiele żywych komórek i bardzo niewielką liczbę komórek martwych. Kolejny obraz pokazuje, że wewnątrz pojemnika MicroCon możemy wykryć wszelkie rodzaje funkcji organotypowych.

Na przykład w przypadku hepatocytów, produkcja albuminy lub ekspresja E-kadheryny w komórkach, co można tutaj wyraźnie zauważyć na nałożonych obrazach. Jądra komórkowe są barwione na niebiesko. E-kadheryna jest barwiona na zielono, a albumina jest wykazana lub barwiona na czerwono.

Jak można tutaj wyraźnie zauważyć, wszystkie funkcje organotypowe oczekiwane od hepatocytów są prawidłowo wyrażone w tego rodzaju kulturze 3D. Ponadto zbadaliśmy kolejny marker hepatocytów, którym była cytokeratyna 18, a ten obraz pokazuje, że cytokeratyna 18 jest również prawidłowo wyrażona w tego typu kulturach. Mamy nadzieję, że przekona to Państwa, iż tego rodzaju funkcje organotypowe mogą być przydatne również w przypadku innych kultur organotypowych.

Po zakończeniu eksperymentu Biore chip może zostać wykorzystany do izolacji wszystkich rodzajów komponentów komórkowych, na przykład całkowitego RNA. Jak widać tutaj, prezentujemy całkowite RNA, które zostało wyizolowane z systemu bioreaktora. To całkowite RNA może być następnie wykorzystane w dalszych analizach, takich jak na przykład realtime PCR lub, jak widać tutaj, analiza mikromacierzy.

Ponadto z układu można wyizolować nieuszkodzone komórki, które następnie można poddać konwencjonalnej analizie za pomocą cytometrii przepływowej. Jak widać tutaj, mamy nadzieję, że udało nam się wykazać, iż system ten może być przydatny w wszelkiego rodzaju zastosowaniach wymagających reakcji organotypowych, a także w takich aplikacjach, których do tej pory nie rozważaliśmy, na przykład w zastosowaniach związanych z komórkami macierzystymi.