DOI: 10.3791/56401-v
Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.
Qa-1 (HLA-E u człowieka) należy do grupy nieklasycznych cząsteczek głównego kompleksu zgodności tkankowej 1b. Wykazano, że immunizacja epitopami wiążącymi Qa-1 zwiększa tkankową regulację immunologiczną i łagodzi kilka chorób autoimmunologicznych. W niniejszym artykule opisujemy nakładającą się strategię biblioteki peptydów do identyfikacji epitopów Qa-1 w białku.
Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja epitopów Qa-1 w białkach. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu regulacji immunologicznej i immunoterapii. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że zmapowane peptydy są znane z tego, że stymulują limfocyty T CD8 ograniczone przez Qa-1, a procedura jest łatwa do wykonania.
Implikacje tej techniki rozciągają się na projekty terapeutyczne dla chorób o podłożu immunologicznym, takich jak stwardnienie rozsiane. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat regulacji immunologicznej za pośrednictwem Qa-1 u zwierząt, może być również zastosowana do regulacji immunologicznej za pośrednictwem HLA-E u ludzi. Aby rozpocząć procedurę, zaprojektuj bibliotekę 15-merowych peptydów, w których sąsiednie peptydy nakładają się na siebie w 11 aminokwasach.
Otrzymać i rozpuścić peptydy w sterylnych warunkach. Dla każdego peptydu połącz pięć miligramów peptydu ze 100 mikrolitrami dimetylosulfotlenku. Połącz 10 mikrolitrów każdego zapasu peptydów w czystej 1-mililitrowej probówce kriogenicznej, aby przygotować zapas puli OLP.
Następnie załaduj 20 mikrolitrów każdego bulionu peptydowego do 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V i rozcieńcz każdy bulion 80 mikrolitrami sterylnej wody. Przechowuj zarówno pozostałe 50 miligramów na mililitr peptydów, jak i płytkę z zapasami peptydów 10 miligramów na mililitr w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Następnie dodaj 10 mikrolitrów roztworu podstawowego puli OLP do 15-mililitrowej probówki zawierającej dwa mililitry napromieniowanych komórek dendrytycznych w podłożu wolnym od surowicy, rozcieńczając w ten sposób DMSO dwustukrotnie.
Przechowuj pozostały zapas puli OLP w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Inkubować DC w puli OLP w temperaturze pokojowej przez trzy godziny. Delikatnie potrząsaj komórkami ręcznie co 15 minut.
Podczas inkubacji użyj zestawu do oczyszczania komórek T CD8 + z pobranej śledziony myszy lub węzłów chłonnych. Przygotuj pięć mililitrów roztworu z 10 milionami limfocytów T na mililitr pożywki bez surowicy z 50 jednostkami na mililitr interleukiny 2 i 100 jednostkami na mililitr interleukiny 7. Oczyszczone limfocyty T CD8 powinny być wolne od kulek lub nietknięte.
Umieść 0,5 mililitra roztworu komórek T w każdym z 10 dołków 48-dołkowej płytki. Po zakończeniu inkubacji roztworu prądu stałego z pulą OLP dodać 10 mililitrów pożywki bez surowicy do DC. Odwirować komórki w temperaturze 300 razy G przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
Następnie rozpuść komórki w pięciu mililitrach pożywki bez surowicy. Dodaj 0,5 mililitra zawiesiny komórek do każdego z 10 dołków. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w atmosferze 5% dwutlenku węgla przez cztery dni.
Następnie usuń 400 mikrolitrów pożywki hodowlanej z każdej studzienki. Dodać 500 mikrolitrów świeżej pożywki bez surowicy zawierającej po 100 jednostek na mililitr IL-2 i IL-7 do każdej studzienki. Inkubuj komórki przez kolejne dwa do trzech dni przed ponowną stymulacją komórek zagruntowanych w puli OLP.
Przed ponowną stymulacją należy uzyskać i napromienić makrofagi otrzewnowe myszy. Dostosuj stężenie makrofagów do pięciu milionów komórek na mililitr pożywki bez surowicy. Połącz 10 mikrolitrów zapasu z puli OLP z dwoma mililitrami napromieniowanych makrofagów otrzewnowych, aby uzyskać końcowe stężenie DMSO 0,5% objętości.
Uzupełnij ten roztwór o 100 jednostek na mililitr mysiego czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów. Napełnij 48-dołkową płytkę 200 mikrolitrami roztworu makrofagów z puli OLP w każdym dołku. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery godziny.
Następnie delikatnie umyj każdą studzienkę 200 mikrolitrami wstępnie podgrzanego podłoża RPMI-0. Roztwór makrofagów będzie zawierał dużo kulek. Przed dodaniem limfocytów T CD8 zagruntowanych pulą OLP należy sprawdzić płytkę pod mikroskopem, aby upewnić się, że wszystkie studzienki są wolne od kulek.
Następnie zbierz i połącz komórki T CD8 + zagruntowane w puli OLP, które są gotowe do ponownej stymulacji. Dostosuj stężenie limfocytów T do miliona komórek na mililitr w pożywce bez surowicy zawierającej 25 jednostek na mililitr IL-2 i 50 jednostek na mililitr IL-7. Dodaj jeden mililitr zbiorczego roztworu limfocytów T do każdej studzienki zawierającej makrofagi pulsujące w puli OLP.
Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w atmosferze 5% dwutlenku węgla przez cztery dni. Następnie usuń około 400 mikrolitrów pożywki z każdej studzienki. Dodać do każdej studzienki 500 mikrolitrów świeżej pożywki bez surowicy zawierającej po 100 jednostek na mililitr IL-2 i IL-7.
Wznów inkubację w tych samych warunkach. Po trzech do czterech dniach zbadaj ponownie stymulowane komórki pod kątem ograniczonej odpowiedzi Qa-1 specyficznej dla puli OLP za pomocą testu immunologicznego sprzężonego z enzymem interferon-gamma. Odświeżaj pożywkę z limfocytów T CD8 + co trzy do czterech dni, czekając na wyniki.
Wykonaj test ELISPOT z rozcieńczonymi zapasami peptydów, aby określić, które peptydy wytwarzają specyficzne dla puli OLP ograniczone wydzielanie interferonu gamma Qa-1. Na koniec oceń skróconą serię peptydów za pomocą ELISPOT, aby zidentyfikować optymalny epitop Qa-1. Test interferon-gamma ELISPOT wykazał znaczny wzrost liczby komórek tworzących plamki, gdy komórki T CD8 + stymulowane przez łączoną nakładającą się bibliotekę peptydów MOG połączono z C1R.
Komórki Qa-1b. Sugerowało to, że limfocyty T reagowały na peptydy wiążące Qa-1 i że MOG_pool zawierały jeden lub więcej epitopów wiążących Qa-1. Przeprowadzono kolejny test w celu zbadania poszczególnych peptydów w basenie.
Trzy peptydy wykazały odpowiedzi, które były co najmniej trzy razy większe niż odpowiedź w obecności C1R. Komórki Qa-1b bez peptydów. Spośród nich wybrano peptyd o największej odpowiedzi do dalszej oceny.
Oceniono bibliotekę skróconych peptydów opartych na 15-merowym peptydzie będącym przedmiotem zainteresowania w celu zidentyfikowania optymalnego epitopu Qa-1. Epitop powinien mieć od ośmiu do 10 merów, przy czym preferowane jest dziewięć merów. Co więcej, optymalny epitop wykazywałby podobną lub silniejszą odpowiedź interferon-gamma niż peptyd 15-merowy.
Dziewięciomerowy N-końcowo skrócony peptyd najlepiej spełnia te kryteria, co czyni go optymalnym epitopem Qa-1. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się regulacją immunologiczną do odkrycia nowych epitopów Qa-1 do badania regulacji immunologicznej w innych tkankach, takich jak trzustka. Nie zapominaj, że praca z promieniowaniem może być bardzo niebezpieczna.
Naukowcy powinni ściśle przestrzegać polityki uczelni i być odpowiednio przeszkoleni.
