Nakładająca się biblioteka peptydów do mapowania epitopów Qa-1 w białku
20 grudnia 2017
Qa-1 (HLA-E u człowieka) należy do grupy nieklasycznych cząsteczek głównego kompleksu zgodności tkankowej 1b. Wykazano, że immunizacja epitopami wiążącymi Qa-1 zwiększa tkankową regulację immunologiczną i łagodzi kilka chorób autoimmunologicznych. W niniejszym artykule opisujemy nakładającą się strategię biblioteki peptydów do identyfikacji epitopów Qa-1 w białku.
Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja epitopów Qa-1 w białkach. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu regulacji immunologicznej i immunoterapii. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że zmapowane peptydy są znane z tego, że stymulują limfocyty T CD8 ograniczone przez Qa-1, a procedura jest łatwa do wykonania.
Implikacje tej techniki rozciągają się na projekty terapeutyczne dla chorób o podłożu immunologicznym, takich jak stwardnienie rozsiane. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat regulacji immunologicznej za pośrednictwem Qa-1 u zwierząt, może być również zastosowana do regulacji immunologicznej za pośrednictwem HLA-E u ludzi. Aby rozpocząć procedurę, zaprojektuj bibliotekę 15-merowych peptydów, w których sąsiednie peptydy nakładają się na siebie w 11 aminokwasach.
Otrzymać i rozpuścić peptydy w sterylnych warunkach. Dla każdego peptydu połącz pięć miligramów peptydu ze 100 mikrolitrami dimetylosulfotlenku. Połącz 10 mikrolitrów każdego zapasu peptydów w czystej 1-mililitrowej probówce kriogenicznej, aby przygotować zapas puli OLP.
Następnie załaduj 20 mikrolitrów każdego bulionu peptydowego do 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V i rozcieńcz każdy bulion 80 mikrolitrami sterylnej wody. Przechowuj zarówno pozostałe 50 miligramów na mililitr peptydów, jak i płytkę z zapasami peptydów 10 miligramów na mililitr w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Następnie dodaj 10 mikrolitrów roztworu podstawowego puli OLP do 15-mililitrowej probówki zawierającej dwa mililitry napromieniowanych komórek dendrytycznych w podłożu wolnym od surowicy, rozcieńczając w ten sposób DMSO dwustukrotnie.
Przechowuj pozostały zapas puli OLP w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Inkubować DC w puli OLP w temperaturze pokojowej przez trzy godziny. Delikatnie potrząsaj komórkami ręcznie co 15 minut.
Podczas inkubacji użyj zestawu do oczyszczania komórek T CD8 + z pobranej śledziony myszy lub węzłów chłonnych. Przygotuj pięć mililitrów roztworu z 10 milionami limfocytów T na mililitr pożywki bez surowicy z 50 jednostkami na mililitr interleukiny 2 i 100 jednostkami na mililitr interleukiny 7. Oczyszczone limfocyty T CD8 powinny być wolne od kulek lub nietknięte.
Umieść 0,5 mililitra roztworu komórek T w każdym z 10 dołków 48-dołkowej płytki. Po zakończeniu inkubacji roztworu prądu stałego z pulą OLP dodać 10 mililitrów pożywki bez surowicy do DC. Odwirować komórki w temperaturze 300 razy G przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
Następnie rozpuść komórki w pięciu mililitrach pożywki bez surowicy. Dodaj 0,5 mililitra zawiesiny komórek do każdego z 10 dołków. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w atmosferze 5% dwutlenku węgla przez cztery dni.
Następnie usuń 400 mikrolitrów pożywki hodowlanej z każdej studzienki. Dodać 500 mikrolitrów świeżej pożywki bez surowicy zawierającej po 100 jednostek na mililitr IL-2 i IL-7 do każdej studzienki. Inkubuj komórki przez kolejne dwa do trzech dni przed ponowną stymulacją komórek zagruntowanych w puli OLP.
Przed ponowną stymulacją należy uzyskać i napromienić makrofagi otrzewnowe myszy. Dostosuj stężenie makrofagów do pięciu milionów komórek na mililitr pożywki bez surowicy. Połącz 10 mikrolitrów zapasu z puli OLP z dwoma mililitrami napromieniowanych makrofagów otrzewnowych, aby uzyskać końcowe stężenie DMSO 0,5% objętości.
Uzupełnij ten roztwór o 100 jednostek na mililitr mysiego czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów. Napełnij 48-dołkową płytkę 200 mikrolitrami roztworu makrofagów z puli OLP w każdym dołku. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery godziny.
Następnie delikatnie umyj każdą studzienkę 200 mikrolitrami wstępnie podgrzanego podłoża RPMI-0. Roztwór makrofagów będzie zawierał dużo kulek. Przed dodaniem limfocytów T CD8 zagruntowanych pulą OLP należy sprawdzić płytkę pod mikroskopem, aby upewnić się, że wszystkie studzienki są wolne od kulek.
Następnie zbierz i połącz komórki T CD8 + zagruntowane w puli OLP, które są gotowe do ponownej stymulacji. Dostosuj stężenie limfocytów T do miliona komórek na mililitr w pożywce bez surowicy zawierającej 25 jednostek na mililitr IL-2 i 50 jednostek na mililitr IL-7. Dodaj jeden mililitr zbiorczego roztworu limfocytów T do każdej studzienki zawierającej makrofagi pulsujące w puli OLP.
Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w atmosferze 5% dwutlenku węgla przez cztery dni. Następnie usuń około 400 mikrolitrów pożywki z każdej studzienki. Dodać do każdej studzienki 500 mikrolitrów świeżej pożywki bez surowicy zawierającej po 100 jednostek na mililitr IL-2 i IL-7.
Wznów inkubację w tych samych warunkach. Po trzech do czterech dniach zbadaj ponownie stymulowane komórki pod kątem ograniczonej odpowiedzi Qa-1 specyficznej dla puli OLP za pomocą testu immunologicznego sprzężonego z enzymem interferon-gamma. Odświeżaj pożywkę z limfocytów T CD8 + co trzy do czterech dni, czekając na wyniki.
Wykonaj test ELISPOT z rozcieńczonymi zapasami peptydów, aby określić, które peptydy wytwarzają specyficzne dla puli OLP ograniczone wydzielanie interferonu gamma Qa-1. Na koniec oceń skróconą serię peptydów za pomocą ELISPOT, aby zidentyfikować optymalny epitop Qa-1. Test interferon-gamma ELISPOT wykazał znaczny wzrost liczby komórek tworzących plamki, gdy komórki T CD8 + stymulowane przez łączoną nakładającą się bibliotekę peptydów MOG połączono z C1R.
Komórki Qa-1b. Sugerowało to, że limfocyty T reagowały na peptydy wiążące Qa-1 i że MOG_pool zawierały jeden lub więcej epitopów wiążących Qa-1. Przeprowadzono kolejny test w celu zbadania poszczególnych peptydów w basenie.
Trzy peptydy wykazały odpowiedzi, które były co najmniej trzy razy większe niż odpowiedź w obecności C1R. Komórki Qa-1b bez peptydów. Spośród nich wybrano peptyd o największej odpowiedzi do dalszej oceny.
Oceniono bibliotekę skróconych peptydów opartych na 15-merowym peptydzie będącym przedmiotem zainteresowania w celu zidentyfikowania optymalnego epitopu Qa-1. Epitop powinien mieć od ośmiu do 10 merów, przy czym preferowane jest dziewięć merów. Co więcej, optymalny epitop wykazywałby podobną lub silniejszą odpowiedź interferon-gamma niż peptyd 15-merowy.
Dziewięciomerowy N-końcowo skrócony peptyd najlepiej spełnia te kryteria, co czyni go optymalnym epitopem Qa-1. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się regulacją immunologiczną do odkrycia nowych epitopów Qa-1 do badania regulacji immunologicznej w innych tkankach, takich jak trzustka. Nie zapominaj, że praca z promieniowaniem może być bardzo niebezpieczna.
Naukowcy powinni ściśle przestrzegać polityki uczelni i być odpowiednio przeszkoleni.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym artykule omówiono metodę identyfikacji epitopów Qa-1 w białkach, co ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia regulacji odpornościowej. Technika ta polega na zaprojektowaniu biblioteki nakładających się peptydów, które mogą stymulować komórki CD8 T ograniczone przez Qa-1.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia
- Autoimmunizacja
- Projektowanie terapeutyczne
Wprowadzenie
- Qa-1 jest nieklasyczną cząsteczką głównego układu zgodności tkankowej.
- Immunizacja epitopami wiążącymi Qa-1 może poprawić regulację odpornościową.
- Metoda ta znajduje potencjalne zastosowanie w leczeniu chorób autoimmunologicznych.
- Może być ona stosowana zarówno w modelach zwierzęcych, jak i w regulacji odporności u ludzi.
Cel badania
- Identyfikacja epitopów Qa-1 w białkach.
- Pogłębienie wiedzy na temat regulacji odpornościowej i immunoterapii.
- Opracowanie strategii terapeutycznych dla chorób o podłożu immunologicznym.
Zastosowane Metody
- Projektowanie biblioteki peptydów 15-merowych.
- Zapewnienie nakładania się sąsiednich peptydów o 11 aminokwasów.
- Mapowanie peptydów stymulujących limfocyty T CD8 z ograniczeniem Qa-1.
- Zastosowanie metody zarówno w badaniach na zwierzętach, jak i u ludzi.
Główne wyniki
- Technika ta jest prosta i skuteczna.
- Zmapowane peptydy skutecznie stymulują komórki CD8 T ograniczone przez Qa-1.
- Zdobyta wiedza może pomóc w opracowaniu projektów terapeutycznych dla chorób takich jak stwardnienie rozsiane.
- Potencjał do szerszych zastosowań w regulacji odporności.
Wnioski
- Metoda ta dostarcza cennych informacji na temat regulacji immunologicznej pośredniczonej przez Qa-1.
- Daje ona nadzieję na opracowanie terapii chorób autoimmunologicznych.
- Dalsze badania mogą rozszerzyć zakres jej zastosowań w immunoterapii.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Identyfikacja funkcjonalnych epitopów Qa-1 umożliwia mechanistyczną minimalizację ryzyka w odniesieniu do celów regulacji immunologicznej w programach badawczych nad chorobami autoimmunologicznymi. Podejście to wspomaga walidację celu poprzez powiązanie sekwencji peptydowych z aktywacją komórek T CD8+ ograniczoną przez Qa-1, co zapewnia pewność prognostyczną dla immunomodulacji specyficznej dla epitopu. Metoda ta przyspiesza identyfikację wiodących cząsteczek w procesach opracowywania immunoterapii poprzez szybkie mapowanie regionów immunogennych w białkach istotnych dla danej choroby, takich jak glikoproteina mielinowa oligodendrocytów.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez mapowanie epitopów wiążących się z cząsteczką Qa-1, które indukują odpowiedzi regulacyjnych limfocytów T CD8+.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje biblioteki nakładających się peptydów do systematycznego skanowania sekwencji białek w celu znalezienia regionów immunogennych z funkcjonalną walidacją za pomocą metody IFN-γ ELISPOT.
- Wartość naukowa: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez potwierdzenie swoistej dla epitopów regulacji immunologicznej w modelach chorób, takich jak eksperymentalne alergiczne zapalenie mózgu i rdzenia.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe odczyty IFN-γ w celu uszeregowania kandydatów peptydowych według siły stymulującej w stosunku do kontroli.
- Wartość operacyjna: Ustanawia powtarzalny schemat przesiewowy z wykorzystaniem napromieniowanych komórek dendrytycznych i makrofagów do prezentacji peptydów komórkom T CD8+.
- Wartość naukowa: Umożliwia analizę trunkacji w celu zdefiniowania minimalnych epitopów (8–10 mer) o optymalnej aktywności dla dalszych zastosowań.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Mapuje epitopy w antygenach istotnych dla przebiegu choroby (np. MOG), aby badać regulację odpornościową w tkankach takich jak trzustka i OUN.
- Wartość operacyjna: Zapewnia platformę możliwą do przeniesienia z mysiego układu Qa-1 na ludzkie systemy HLA-E w celu międzygatunkowej walidacji celu.
- Wartość naukowa: Wspiera wybór modeli przedklinicznych poprzez identyfikację epitopów wzmacniających specyficzną dla mieliny regulację odpornościową.
Integracja rurociągów i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w etap wczesnego odkrywania leków w celu wsparcia identyfikacji związków wiodących, w szczególności w przypadku terapii immunomodulujących ukierunkowanych na szlaki autoimmunizacyjne.
- Biologia odkrywcza: Testowanie hipotez dotyczących regulacji odporności poprzez powiązanie regionów białkowych z aktywacją limfocytów T ograniczoną przez Qa-1.
- Przesiewanie: Dostarczanie gotowych do analizy pul peptydowych oraz poszczególnych peptydów o potwierdzonym działaniu immunostymulującym.
- Analityka: Wykorzystanie metody ELISPOT do ilościowego oznaczania komórek tworzących plamki, co umożliwia priorytetyzację epitopów w oparciu o dane.
- Badania translacyjne: Powiązanie mapowania epitopów z efektami funkcjonalnymi w modelach chorób autoimmunologicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanowienie powtarzalnego schematu mapowania epitopów, który można zastosować do wielu antygenów istotnych w przebiegu chorób.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w wyborze celu poprzez walidację funkcjonalnych epitopów sterujących regulacją odpornościową.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje proces odkrywania epitopów poprzez projektowanie nakładających się peptydów i kontrolowaną stymulację komórkową.
- Wartość strategiczna: Redukuje ryzyko biologiczne w rozwoju immunoterapii dzięki wczesnemu potwierdzeniu mechanizmu działania.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia dostosowanie do ryzyka rozwój kandydatów opartych na epitopach z wykazanymi efektami immunomodulującymi.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu immunologii, pracy z peptydami oraz sterylnych technik hodowli komórek.
- Zależne od dostępu do linii komórek T CD8+ ograniczonych przez Qa-1 oraz komórek prezentujących antygen (komórek dendrytycznych, makrofagów).
- Wymaga standaryzowanych odczynników, w tym IL-2, IL-7 i M-CSF do hodowli komórek T oraz różnicowania makrofagów.
- Wiąże się z kwestiami bezpieczeństwa biologicznego przy pracy z komórkami naświetlanymi i zapasami peptydów w DMSO.
- Opiera się na infrastrukturze ELISPOT w celu czułej detekcji sekrecji IFN-γ jako odczytu funkcjonalnego.
Najczęściej zadawane pytania (FAQ) dot. Biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
0:56
Overlapping Peptide (OLP) Library Generation and T Cell Priming with OLP Pool-pulsed Dendritic Cells (DCs) Protocol
3:43
Re-stimulation of OLP Pool-primed CD8+ T Cells Using Macrophages Pulsed with the OLP Pool
6:19
Results: Identification of a 9-mer Qa-1 Epitope in Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein (MOG)
7:32
Conclusion
