Name: Nakładająca się biblioteka peptydów do mapowania epitopów Qa-1 w białku (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Poznaj metodę mapowania epitopów Qa-1 w białkach przy użyciu nakładającej się biblioteki peptydów 15-merowych. Technika ta stymuluje komórki CD8 T zależne od Qa-1 i ma zastosowanie w badaniach regulacji odporności oraz terapii chorób autoimmunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Penelope Garcia za jej pomoc techniczną i przygotowanie tego rękopisu. Prace te były wspierane przez grant na innowacje badawcze (RIG) z Wydziału Medycyny Uniwersytetu Loma Linda (681205-2967) oraz grant pilotażowy z National Multiple Sclerosis Society (PP1685) dla XT.

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z Protokołem Opieki i Użytkowania Zwierząt zatwierdzonym przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Teksańskim w El Paso i Uniwersytecie Loma Linda.
1. Generowanie biblioteki OLP obejmującej całą długość białka
<ol>
	<li>Zaprojektuj bibliotekę OLP, w której wszystkie peptydy mają długość 15 merów, a sąsiednie peptydy nakładają się na siebie o 11 aminokwasów. 
	UWAGA: W badaniu MOG OLP sekwencję prekursora MOG [Mus musculus] pobrano z bazy danych białek NCBI pod tym linkiem: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_034944. Prekursor MOG (247 aminokwasów), który zawierał zarówno peptydy sygnałowe, jak i dojrzałe, został użyty, ponieważ większość zgłoszonych epitopów Qa-1 (HLA-E) znajdowała się w peptydach sygnałowych (np. Qdm1). Zaczynając od N-końca, sekwencje 15-merowych peptydów zostały zidentyfikowane w taki sposób, że dwa sąsiednie peptydy nałożyły się na siebie przez 11 aminokwasów (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). W związku z tym zidentyfikowano dokładnie 59 OLP w prekursorze 247 aminokwasów MOG. Jednak ostatni OLP może wynosić od 12 do 15 merów, w zależności od długości białka. Dodatkowo wybraliśmy bibliotekę 15-merową, ponieważ my i inni wykazaliśmy, że peptydy 15-merowe, po dodaniu do komórek dendrytycznych (DC) lub makrofagów, mogą być efektywnie przetwarzane na epitopy do rozpoznania przez limfocyty T CD8 +14,15.</li>
	<li>Kup każdy pojedynczy peptyd komercyjnie. 5 mg na peptyd powinno wystarczyć do badania przesiewowego. OLP i peptydy skrócone (krok 6.1) mogą być peptydami odsolonymi (czystość wynosi około 50 - 70%). Czystość optymalnego peptydu (krok 6.2), który zostanie wykorzystany do wytworzenia tetrameru i do przyszłych analiz biologicznych, powinna wynosić >90%. Rozpuść peptydy w sterylnych warunkach.</li>
	<li>Zrób 50 mg / ml pojedynczych zapasów peptydów w 100% DMSO. Na 5 mg każdego peptydu dodać 100 μl DMSO do każdej probówki, wymieszać i przechowywać peptydy w temperaturze -20 °C. Zapasy te zostaną wykorzystane do wytworzenia zapasu OLP_pool do wytwarzania linii limfocytów T CD8 + reaktywnych na OLP_pool. Ponadto zapasy te zostaną również wykorzystane do wytworzenia indywidualnych zapasów peptydów 10 mg / ml w celu określenia zdolności każdego pojedynczego peptydu do stymulowania odpowiedzi ograniczonej do Qa-1 w OLP_pool-reaktywnej linii komórek T CD8 +.</li>
	<li>Przygotuj OLP_pool bulionu, dodając równą objętość każdego peptydu do świeżej probówki. Ten OLP_pool zapas zawiera 100% DMSO. W badaniu MOG OLP było 59 OLPów12. Stąd stężenie każdego peptydu w OLP_pool wynosiło 847,46 μg/ml (50 mg/ml ÷ 59).</li>
	<li>Przygotować 10 mg / ml pojedynczych zapasów peptydowych przez rozcieńczenie (5x) 50 mg / ml zapasu w sterylnym H2O na 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery V (ten zapas zawiera 20% DMSO). Zrób te zapasy na płytce 96-dołkowej, ponieważ określenie odpowiedzi z ograniczeniami Qa-1 dla każdego pojedynczego peptydu zostanie przeprowadzone na płytce 96-dołkowej przy użyciu 8- lub 12-kanałowej pipety wielokanałowej. 
	UWAGA: Wszystkie peptydy, w tym OLP i peptydy skrócone, należy rozcieńczyć na 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery V lub na 96-dołkowym stojaku na próbki wypełnionym probówkami o pojemności 1 ml, ponieważ badanie przesiewowe biblioteki peptydów przeprowadza się na płytkach 96-dołkowych za pomocą pipety wielokanałowej. Jeśli trudno jest rozcieńczyć peptyd, dodaj kroplami 1 N NaOH, aby pomóc rozpuścić peptyd.</li>
</ol>
2. Gruntowanie komórek TK b-/- Db-/- CD8+ za pomocą OLP_pool-pulsacyjnych komórek Kb-/- Db-/- Ogniw dendrytycznych (DC).
UWAGA: Istnieją dwa główne allele Qa-1: jeden to Qa-1a, a drugi to Qa-1b. Ponieważ zwierzęta powszechnie wykorzystywane do badań akademickich, np. myszy C57BL/6 i Balb/c, są nosicielami Qa-1b, protokół ten opisuje procedurę mapowania epitopów Qa-1b w białku. Limfocyty T CD8 + stosowane w tym protokole są oczyszczane z myszy Kb / -Db / - (tło C57BL / 6), w których limfocyty T CD8 + są ograniczone głównie przez nieklasyczne cząsteczki MHC-Ib, w tym Qa-1.
<ol>
	<li>Wytwórz DC pochodzące ze szpiku kostnego, jak opisano wcześniej12.
	<ol>
		<li>Krótko mówiąc, hodowla zawiesin jednokomórkowych szpiku kostnego (1 x 106 komórek/ml) w pożywce RPMI-10 (RPMI 1640 uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą, 5,5 x 10-5 M 2-merkaptoetanolem, 1 mM pirogronianem sodu i 0,1 mM aminokwasem endogennym) zawierającymi 10 U/ml IL-4 i 100 U/mL GM-CSF w 6-dołkowej płytce (4 ml/dołek) w temperaturze 37 °C, 5 % emisji CO2 %.</li>
		<li>Dwa dni później ostrożnie usuń nieprzylegające komórki i dodaj świeże podłoże i cytokiny.</li>
		<li>Po hodowli komórek przez kolejne dwa dni, przenieś nieprzylegające komórki zawierające świeże pożywki i cytokiny na nową płytkę 6-dołkową.</li>
		<li>Hoduj komórki przez kolejne dwa dni i uzupełnij je świeżymi pożywkami i cytokinami zawierającymi LPS (0,1 μg/ml) w celu aktywacji DC.</li>
		<li>24 godziny później zbierz kontrolery domeny do eksperymentów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Napromieniuj DC 3000 radami.
	<ol>
		<li>Alternatywnie, potraktować DC (5 x 107 komórek/ml) mitomycyną C (50 μg/ml) w PBS w temperaturze 37 °C przez 20 min. Dodać RPMI-0 (RPMI 1640 bez surowicy), aby napełnić probówkę (~12 ml) i wirować komórki przez 10 minut w wirówce stołowej o stężeniu 300 x g. Odrzucić supernatanty i powtórzyć procedurę mycia jeszcze dwa razy. Te trzy płukania mają kluczowe znaczenie, ponieważ każda śladowa ilość mitomycyny C może hamować odpowiedź limfocytów T CD8 + podczas kohodowli komórek DC-T.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dostosuj stężenie DC do 5 x 106 komórek/ml w pożywce bez surowicy (pożywka bez surowicy AIM-V uzupełniona 5,5 x 10-5 M 2-merkaptoetanolem, 1 mM pirogronianem sodu i 0,1 mM aminokwasem endogennym).</li>
	<li>Dodaj OLP_pool roztwór podstawowy, który zawiera 100% DMSO, do DC tak, aby końcowe stężenie DMSO wynosiło 0,5% (200x). W badaniu MOG OLP stężenie każdego OLP w OLP_pool wynosiło 847,46 μg/ml; stąd końcowe stężenie każdego OLP w kulturze DC wynosiło 4,2 μg/ml (847,46 μg/ml ÷ 200). Jednak stężenie to można skalować do 100 μg/ml, o ile stężenie DMSO w hodowli komórkowej pozostaje mniejsze niż 1%.</li>
	<li>Inkubować DC w temperaturze pokojowej przez 3 godziny i delikatnie wstrząsać komórkami co 15 minut.</li>
	<li>Podczas tego okresu inkubacji oczyść limfocyty T CD8 + z pobranej śledziony lub węzłów chłonnych myszy Kb / -Db / - za pomocą komercyjnego zestawu do oczyszczania limfocytów T CD8 +, dostosuj stężenie komórek do 10 x 106 komórek / ml w pożywce bez surowicy zawierającej 50 U / ml interleukiny 2 (IL-2) i 100 U / ml IL-7.</li>
	<li>Teraz dodaj limfocyty T CD8 + do 48-dołkowej płytki jako 0,5 ml / dołek (po dodaniu 0,5 ml / studzienki OLP_pool-pulsacyjnych DC w kroku 2.8, końcowe stężenie limfocytów T CD8 + wyniesie 5 x 106 komórek / ml). 
	UWAGA: Limfocyty T CD8 + ze śledziony i węzłów chłonnych myszy można oczyścić za pomocą zestawu do izolacji CD8 Positive Isolation Kit, postępując zgodnie z instrukcją dostarczoną przez producenta. Uzyskane limfocyty T CD8 + są wolne od kulek.</li>
	<li>Zakręć OLP_pool-pulsacyjne DC (300 x g, 10 min) w temperaturze RT. Rozpuść OLP_pool-pulsacyjne DC do 2 x 106 komórek/ml w pożywce bez surowicy i dodaj 0,5 ml/studzienkę do 48-dołkowej płytki zawierającej limfocyty T CD8 + (końcowe stężenie OLP_pool-pulsacyjnych DC wynosi 1 x 106 komórek/ml, końcowe stężenie limfocytów T CD8 + wynosi 5 x 106 komórek / ml, końcowe stężenie IL-2 wynosi 25 U / ml, a końcowe stężenie IL-7 wynosi 50 U / ml). Hodować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>W dniu 4 usunąć i wyrzucić około 400 μl pożywki hodowlanej i dodać 500 μl świeżej pożywki bez surowicy zawierającej 100 U/ml IL-2 i 100U/ml IL-7 do każdej studzienki. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>W dniu 7 lub 8 ponownie stymuluj OLP_pool zagruntowane limfocyty T CD8 + za pomocą OLP_pool.</li>
</ol>
3. Restymulacja zaszczepionych limfocytów T CD8+ za pomocą makrofagów pulsujących z OLP_pool
<ol>
	<li>Cztery dni przed ponowną stymulacją limfocytów T CD8 + zagruntowanych OLP_pool przygotuj 2% (v/v) roztwór kulek poliakrylamidowych: przemyj 2 g kulek poliakryloamidu dwukrotnie w 20 ml wolnego od endotoksynH2Olub PBS. Granulki poliakryloamidu osadzać przez odwirowanie (400 x g) przez 5 minut i ponownie zawiesić w 100 ml PBS. Autoklaw z prędkością 15 lb/m przez 20 min. Przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wstrzyknąć myszom dootrzewnowo 1 ml / mysz sterylnego 2% roztworu kulek poliakrylamidu, aby przyciągnąć migrację monocytów / makrofagów do jamy otrzewnowej 16.</li>
	<li>Cztery dni później należy złożyć zwierzęta w ofierze z powodu przedawkowania CO2 .
	<ol>
		<li>W sterylnych warunkach wytnij mały otwór na środku brzucha, tak aby otwór był wystarczający do przejścia pipety transferowej o pojemności 5 ml. Napełnij pipetę transferową RPMI-0 i włóż pipetę do jamy brzusznej przez otwór.</li>
		<li>Przepłukać jamę brzuszną za pomocą pipetowania. Odpipetować jak najwięcej płynu z jamy brzusznej do sterylnej rurki (są to makrofagi otrzewnowe). Powtórz krok płukania 4 - 5 razy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Napromienij makrofagi otrzewnowej 3000 Radami.
	<ol>
		<li>Alternatywnie, należy potraktować makrofagi otrzewnowe mitomycyną C (postępować zgodnie z procedurą opisaną w kroku 2.2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dostosuj stężenie makrofagów otrzewnowej do 5 x 106 komórek/ml w pożywce bez surowicy. Dodaj OLP_pool bulionu (końcowe stężenie DMSO jest mniejsze niż 1%) i M-CSF (stężenie końcowe = 100 U/ml). 
	UWAGA: W tym badaniu MOG OLP użyliśmy 0,5% DMSO. W ten sposób MOG OLP_pool zapas rozcieńczono 200x (np. 1 μl MOG OLP_Pool zapasu dodano do 199 μl makrofagów otrzewnowych). Stąd końcowe stężenie każdego OLP wynosiło 4,2 μg/ml).</li>
	<li>Dodać 200 μl/basenik (1 x 106 komórek/basenik) do 48-dołkowej płytki do hodowli tkankowej i inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 4 godziny.</li>
	<li>Usunąć nieprzylegające komórki i kulki poliakryloamidu przez delikatne przemycie 200 μl/studzienkę wstępnie podgrzanego RPMI-0.</li>
	<li>Zbierz i połącz OLP_pool zagruntowane limfocyty T CD8 + z kroku 2.10. Dostosuj stężenie OLP_pool zagruntowanych limfocytów T CD8 + do 1 x 106 komórek/ml w pożywce bez surowicy zawierającej 25 U/ml IL-2 i 50 U/ml IL-7. Dodaj 1 ml / studzienkę do 48-dołkowej płytki, która zawiera makrofagi otrzewnowe z OLP_pool pulsacją.</li>
	<li>Cztery dni później uzupełnij pożywkę w 48-dołkowej płytce. Wyjąć i wyrzucić około 400 μl pożywki hodowlanej z 48-dołkowych płytek hodowlanych. Dodać 500 μl świeżej pożywki bez surowicy zawierającej 100 U/ml IL-2 i 100 U/ml IL-7 do każdej studzienki. Hodować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Trzy lub cztery dni później zbadaj limfocyty T CD8 + z OLP_pool restymulacją pod kątem specyficznej dla OLP_pool, ograniczonej odpowiedzi Qa-1 za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISPOT). Po tym czasie należy ponownie stymulować limfocyty T CD8 + co 7 - 10 dni. 
	UWAGA: Makrofagi są preferowane do ponownej stymulacji limfocytów T CD8 + zagruntowanych OLP_pool. Zauważyliśmy, że limfocyty T CD8 + restymulowane przez makrofagi rosły lepiej niż DC in vitro.</li>
</ol>
4. Określenie specyficznej dla OLP_pool, ograniczonej Qa-1 odpowiedzi w OLP_pool remiksowanej linii komórek T CD8+
UWAGA: Specyficzna dla OLP_pool, ograniczona Qa-1 odpowiedź w linii komórek T CD8+ z OLP_pool restymulowaną jest determinowana przez wydzielanie IFNγ po stymulacji przez OLP_pool w obecności C1R lub C1R. LimfocytyQa-1 b przy użyciu testu IFNγ ELISPOT. Ogniwa C1R można uzyskać komercyjnie. C1R. LimfocytyB Qa-1 mogą być generowane przez transdukcję komórek C1R za pomocą wektora lentiwirusowego Qa-1.
<ol>
	<li>Dodać 100 μl/basenik przeciwciała anty-IFN-γ rozcieńczonego w buforze powlekającym (PBS) do dołków płytki ELISPOT. Uszczelnić i inkubować płytkę w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Drugiego dnia odrzucić bufor powlekający zawierający przeciwciało anty-IFN-γ wychwytujące i dodać 200 μl/roztwór blokujący basenik (pożywka bez surowicy) i inkubować płytkę przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Napromieniować C1R i C1R. LimfocytyB Qa-1 z 9,600 Radami.
	<ol>
		<li>Alternatywnie traktuj C1R i C1R. LimfocytyB Qa-1 z mitomycyną C, jak opisano w kroku 2.2, z wyjątkiem tego, że czas leczenia będzie wynosił 30 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyreguluj C1R i C1R. LimfocytyB Qa-1 w podłożu bez surowicy do 4 x 106 komórek/ml.</li>
	<li>Odrzucić roztwór blokujący z płytki i dodać C1R i C1R. LimfocytyB Qa-1 w stężeniu 50 μl / dołek (200 000 komórek / dołek) i wymieszać.</li>
	<li>Dodaj 50 μl/dołek 100x rozcieńczonego bulionu OLP_pool (w podłożu bez serum) i odpowiednio wymieszaj. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 2 - 3 godziny.</li>
	<li>Dostosuj limfocyty T CD8 + z resymulacją OLP_pool do 1 - 2 x 106 komórek/ml w pożywce bez surowicy zawierającej 150 U/ml IL-7 i dodaj 50 μL/dołek (50 000 - 100 000 komórek/dołek) do płytki. Odwirować płytkę (58 x g) przez 5 minut.</li>
	<li>Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez noc.</li>
	<li>Odessać zawiesinę komórek. Umyj studzienki 2 razy wodą dejonizowaną (DI) (250 μL/studzienkę). Pozostaw studzienki do namoczenia przez 5 minut na każdym etapie mycia.</li>
	<li>Przemyć studzienki 3 razy buforem do płukania I (PBS zawierający 0,05% Tween20). Pozwól studzienkom moczyć się przez 1 minutę na każdym etapie mycia. Wyrzuć bufor do mycia.</li>
	<li>Dodać 100 μl przeciwciała wykrywającego rozcieńczonego w buforze rozcieńczającym (PBS zawierający 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS)).</li>
	<li>Inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.</li>
	<li>Odrzuć roztwór przeciwciała wykrywającego. Umyj studzienki 3 razy za pomocą 250 μl/studzienkę buforem do płukania I. Pozostaw studzienki do namoczenia przez 1 minutę na każdym etapie mycia.</li>
	<li>Dodać 100 μl/basenik koniugatu enzymatycznego (Streptawidyna-HRP) rozcieńczonego w buforze rozcieńczającym w rozcieńczeniu 1:100.</li>
	<li>Inkubować płytki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odrzuć sprzężony roztwór enzymu. Przemyj studzienki 4 razy za pomocą 250 μl/studzienkę buforem do płukania I. Pozostaw studzienki do namoczenia przez 1 minutę na każdym etapie mycia.</li>
	<li>Przemyć studzienki 2 razy 250 μl/studzienkę buforem do płukania II (PBS).</li>
	<li>Dodaj 100 μl roztworu substratu (wymieszaj 1 kroplę = 20 μl chromogenu AEC z 1 ml substratu AEC) do każdej studzienki. Monitoruj rozwój plamki przez 5 do 60 minut.</li>
	<li>Gdy zaczną pojawiać się pożądane rezultaty, zatrzymaj reakcję substratu, myjąc studzienki wodą destylowaną.</li>
	<li>Suszyć płytki na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 2 godziny lub przez noc, aż całkowicie wyschną. Wyjęcie plastikowej tacki spod talerzy ułatwi suszenie. Przechowuj płytki w szczelnie zamkniętej plastikowej torbie w ciemności, dopóki nie zostaną przeanalizowane.</li>
	<li>Ręczne liczenie plamek odbywa się za pomocą mikroskopu preparacyjnego lub czytnika płytek ELISPOT. Zobacz reprezentatywny wynik w Rysunek 2.</li>
</ol>
5. Oznaczanie poszczególnych peptydów w OLP_pool, które stymulują do ograniczonego wydzielania IFN-γ Qa-1 w linii komórek T CD8+ specyficznej dla OLP_pool
<ol>
	<li>Określ poszczególne peptydy, które stymulują OLP_pool-specyficzne, ograniczone przez Qa-1 wydzielanie IFN-γ w OLP_pool-specyficznej linii komórek T CD8 + za pomocą wyżej opisanego testu IFN-γ ELISPOT (końcowe stężenie każdego pojedynczego peptydu użytego do testu ELISOPT wynosi 10 μg/ml). Zobacz reprezentatywne wyniki w Rysunek 3. 
	UWAGA: Odpowiedź specyficzna dla OLP, ograniczona przez Qa-1 jest definiowana jako odpowiedź, która jest co najmniej trzykrotnie większa niż odpowiedź w obecności C1R. Komórki Qa-1b, ale bez OLP. W badaniu MOG OLP OLP68, OLP96 i OLP105 spełniały to kryterium. W związku z tym wszystkie trzy OLP potencjalnie zawierają epitopy Qa-112 (Rysunek 3). Jednak OLP105 konsekwentnie dawał najsilniejszą odpowiedź; W związku z tym przeprowadziliśmy szczegółową analizę OLP105 (<silna klasa="xfig">Rysunek 4 i <silna klasa="xfig">Rysunek 5)<klasa sup="xref">12.</li>
</ol>
6. Identyfikacja optymalnego epitopu Qa-1 w 15-merowym OLP, który stymuluje specyficzną dla epitopu, ograniczoną odpowiedź Qa-1 w linii limfocytów T CD8+ specyficznej dla OLP_pool
<ol>
	<li>Zsyntetyzuj C- i N-końcowo skrócone peptydy 15-merowego OLP, jak pokazano w <silna klasa = "xfig">Rysunek 4.</li>
	<li>Zbadaj wydzielanie IFN-γ w linii komórek T CD8 + specyficznej dla OLP, stymulując limfocyty T CD8 + każdym ze skróconych peptydów, a także rodzicielskim 15-merowym OLP w obecności C1R lub C1R. Limfocyty Qa-1b przy użyciu opisanego powyżej testu IFN-γ ELISPOT. Końcowe stężenie każdego pojedynczego peptydu użytego w teście ELISPOT wynosi 10 μg/ml. Peptyd definiuje się jako optymalny epitop Qa-1, jeśli peptyd: 1) konsekwentnie daje podobną lub silniejszą odpowiedź IFN-γ, w porównaniu z oryginalnym peptydem 15-merowym, w obecności C1R. LimfocytyB Qa-1; 2) mieści się w przedziale 8 - 10-merów (preferowany peptyd 9-merowy), które są długościami peptydów związanymi z cząsteczkami MHC-I15,17. Zobacz reprezentatywne wyniki w Rysunek 5.</li>
</ol>

<ol><li>Aldrich, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Tap-dependent+leader+peptide+recognized+by+alloreactive+T+cells+specific+for+a+class+Ib+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of a Tap-dependent leader peptide recognized by alloreactive T cells specific for a class Ib antigen.</a> Cell. 79 (4), 649-658 (1994).</li>
<li>Vance, R. E., Kraft, J. R., Altman, J. D., Jensen, P. E., Raulet, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+CD94%2FNKG2A+is+a+natural+killer+cell+receptor+for+the+nonclassical+major+histocompatibility+complex+%28MHC%29+class+I+molecule+Qa-1%28b%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Mouse CD94/NKG2A is a natural killer cell receptor for the nonclassical major histocompatibility complex (MHC) class I molecule Qa-1(b).</a> J Exp Med. 188 (10), 1841-1848 (1998).</li>
<li>Oliveira, C. C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20038604">The nonpolymorphic MHC Qa-1 mediates CD8+ T cell surveillance of antigen-processing defects.</a> J Exp Med. 207 (1), 207-221 (2010).</li>
<li>Nagarajan, N. A., Gonzalez, F., Shastri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonclassical+MHC+class+Ib-restricted+cytotoxic+T+cells+monitor+antigen+processing+in+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Nonclassical MHC class Ib-restricted cytotoxic T cells monitor antigen processing in the endoplasmic reticulum.</a> Nat Immunol. 13 (6), 579-586 (2012).</li>
<li>Hu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+regulatory+CD8+T+cells+in+Qa-1-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of regulatory CD8 T cells in Qa-1-deficient mice.</a> Nat Immunol. 5 (5), 516-523 (2004).</li>
<li>Tang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+immunity+by+a+novel+population+of+Qa-1-restricted+CD8alphaalpha%2BTCRalphabeta%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of immunity by a novel population of Qa-1-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells.</a> J Immunol. 177 (11), 7645-7655 (2006).</li>
<li>Leavenworth, J. W., Tang, X., Kim, H. J., Wang, X., Cantor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amelioration+of+arthritis+through+mobilization+of+peptide-specific+CD8%2B+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Amelioration of arthritis through mobilization of peptide-specific CD8+ regulatory T cells.</a> J Clin Invest. 123 (3), 1382-1389 (2013).</li>
<li>Wu, Y., Zheng, Z., Jiang, Y., Chess, L., Jiang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+specificity+of+T+cell+regulation+that+enables+self-nonself+discrimination+in+the+periphery%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The specificity of T cell regulation that enables self-nonself discrimination in the periphery.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 534-539 (2009).</li>
<li>Panoutsakopoulou, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+autoimmune+disease+after+vaccination+with+autoreactive+T+cells+that+express+Qa-1+peptide+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Suppression of autoimmune disease after vaccination with autoreactive T cells that express Qa-1 peptide complexes.</a> J Clin Invest. 113 (8), 1218-1224 (2004).</li>
<li>Tang, X., Maricic, I., Kumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-TCR+antibody+treatment+activates+a+novel+population+of+nonintestinal+CD8+alpha+alpha%2B+TCR+alpha+beta%2B+regulatory+T+cells+and+prevents+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Anti-TCR antibody treatment activates a novel population of nonintestinal CD8 alpha alpha+ TCR alpha beta+ regulatory T cells and prevents experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J Immunol. 178 (10), 6043-6050 (2007).</li>
<li>Holderried, T. A., Lang, P. A., Kim, H. J., Cantor, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+disruption+of+CD8%2B+Treg+activity+enhances+the+immune+response+to+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetic disruption of CD8+ Treg activity enhances the immune response to viral infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (52), 21089-21094 (2013).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Non-classical+Myelin+Epitopes+to+Treat+Experimental+Autoimmune+Encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Targeting Non-classical Myelin Epitopes to Treat Experimental Autoimmune Encephalomyelitis.</a> Sci Rep. 6, 36064(2016).</li>
<li>Lo, W. F., Dunn, C. D., Ong, H., Metcalf, E. S., Soloski, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+and+host+factors+involved+in+the+major+histocompatibility+complex+class+Ib-restricted+presentation+of+Salmonella+Hsp+60%3A+novel+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Bacterial and host factors involved in the major histocompatibility complex class Ib-restricted presentation of Salmonella Hsp 60: novel pathway.</a> Infect Immun. 72 (5), 2843-2849 (2004).</li>
<li>Xu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleocapsid+protein+of+Rift+Valley+fever+virus+is+a+potent+human+CD8%2B+T+cell+antigen+and+elicits+memory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The nucleocapsid protein of Rift Valley fever virus is a potent human CD8+ T cell antigen and elicits memory responses.</a> PLoS One. 8 (3), e59210(2013).</li>
<li>Schumacher, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+selection+by+MHC+class+I+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Peptide selection by MHC class I molecules.</a> Nature. 350 (6320), 703-706 (1991).</li>
<li>Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+and+characterization+of+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">The isolation and characterization of murine macrophages.</a> Curr Protoc Immunol. , Chapter 14, Unit 14, 11 (2008).</li>
<li>Guo, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+length+peptides+bind+to+HLA-Aw68+similarly+at+their+ends+but+bulge+out+in+the+middle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Different length peptides bind to HLA-Aw68 similarly at their ends but bulge out in the middle.</a> Nature. 360 (6402), 364-366 (1992).</li>
<li>Soloski, M. J., Metcalf, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+involvement+of+class+Ib+molecules+in+the+host+response+to+infection+with+Salmonella+and+its+relevance+to+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">The involvement of class Ib molecules in the host response to infection with Salmonella and its relevance to autoimmunity.</a> Microbes Infect. 3 (14-15), 1249-1259 (2001).</li>
<li>Smith, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+use+endocytic+pathway+for+cross-priming+class+Ib+MHC-restricted+CD8alphaalpha%2BTCRalphabeta%2B+T+cells+with+regulatory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells use endocytic pathway for cross-priming class Ib MHC-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells with regulatory properties.</a> J Immunol. 182 (11), 6959-6968 (2009).</li>
<li>Kalra, A., Mukherjee, P., Chauhan, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+fine+specificity+of+the+immune+response+to+a+Plasmodium+falciparum+rhoptry+neck+protein%2C+PfAARP%5BTitle%5D)+AND+%22Malar+J%22%5BJournal%5D)">Characterization of fine specificity of the immune response to a Plasmodium falciparum rhoptry neck protein, PfAARP.</a> Malar J. 15, 457(2016).</li>
<li>Kambayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nonclassical+MHC+class+I+molecule+Qa-1+forms+unstable+peptide+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The nonclassical MHC class I molecule Qa-1 forms unstable peptide complexes.</a> J Immunol. 172 (3), 1661-1669 (2004).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

W tym miejscu opisaliśmy protokół analizy epitopów Qa-1 w białku. W odniesieniu do tego protokołu, kilka innych strategii zostało również zgłoszonych wcześniej. Po pierwsze, do identyfikacji Qdm1 wykorzystano allogeniczne linie i klony limfocytów T CD8 +. Po drugie, przypuszczalny motyw wiązania Qa-1 z analizy Qdm został wykorzystany do identyfikacji HSP60p216-224 i epitopu TCRBV8.1 9,18. Po trzecie, do immunizacji zwierząt wyko...

Qa-1 należy do grupy nieklasycznych cząsteczek głównego kompleksu zgodności tkankowej 1b (MHC-Ib) u myszy. Jego ludzkim homologiem jest HLA-E. Wcześniejsze dowody wykazały, że cząsteczki Qa-1 pełnią ważne funkcje biologiczne. Po pierwsze, cząsteczki Qa-1 odgrywają ważną rolę w badaniu komórek pod kątem integralności strukturalnej i funkcjonalnej. W związku z tym cząsteczki Qa-1 rozwinęły kilka strategii monitorowania normalnej funkcji komórki. Jedna z takich strategii umożliwia cząsteczkom Qa-1 tworzenie kompleksów z przetworzonym peptydem liderowym (epitopem), tj. modyfikatorem determinantu Qa-1 (Qdm), który jest przetwarzany z klasycznych cząsteczek MHC-Ia w retikulum endoplazmatycznym1. Te kompleksy Qa-1/Qdm pojawiają się później na powierzchni komórki i wiążą się z hamującymi receptorami NKG2A na komórkach NK, aby zahamować aktywność zabijania NK2. Jeśli ekspresja cząsteczek MHC-Ia zostanie utracona, komórka (np. komórka złośliwa) staje się wrażliwa na zabijanie NK2. Druga strategia umożliwia cząsteczkom Qa-1 tworzenie nowych kompleksów Qa-1/epitopów na powierzchni komórki, która ma niedobór TAP (transporter związany z przetwarzaniem antygenu)3 i/lub ERAAP (aminopeptydaza retikulum endoplazmatycznego związana z przetwarzaniem antygenu)4 (oba niedobory często występują w komórkach złośliwych). Komórka, która wyraża te nowe kompleksy Qa-1 / epitop, może być następnie rozpoznana i wyeliminowana przez specyficzne dla epitopu limfocyty T CD8 + ograniczone do Qa-1. Po drugie, cząsteczki Qa-1 indukują regulację immunologiczną5. W związku z tym wykazano, że kompleksy Qa-1/epitopy stymulują limfocyty T regulatorowe CD8 + (Treg), które są ważne dla zapobiegania uszkodzeniom tkanek własnych za pośrednictwem układu odpornościowego6,7,8,9,10. Po trzecie, wykazano, że limfocyty Treg CD8 + z ograniczeniami Qa-1 ograniczają odpowiedź immunologiczną na infekcję wirusową11.
Dlatego specyficzne zwiększanie specyficznych dla epitopów limfocytów T CD8+ z ograniczeniami Qa-1 jest potencjalnie obiecującą strategią eliminacji nieprawidłowych komórek, wzmocnienia regulacji immunologicznej i kontroli wielkości odpowiedzi immunologicznej wywołanej przez wirusa. Chociaż nie ustalono, czy augmentacja limfocytów T CD8 + CD8 + specyficznych dla epitopu Qa-1 może wzmocnić nadzór immunologiczny i ograniczyć odpowiedzi immunologiczne wywołane wirusem, nasze laboratoria i inne wyraźnie wykazały, że immunizacja epitopami Qa-1 może zwiększyć funkcję komórek Treg CD8 + z ograniczeniami Qa-1 specyficznych dla patogennych autoimmunologicznych limfocytów T CD4 +, prowadząc do skutecznej kontroli CD4 + Choroby autoimmunologiczne zależne od limfocytów T w różnych modelach zwierzęcych, takich jak eksperymentalne alergiczne zapalenie mózgu i rdzenia kręgowego (zwierzęcy model ludzkiego stwardnienia rozsianego)6,10, kolagenowe zapalenie stawów (zwierzęcy model ludzkiego reumatoidalnego zapalenia stawów)7, oraz cukrzyca nieotyła (zwierzęcy model ludzkiej cukrzycy typu 1)8. Ponadto odkryliśmy, że immunizacja specyficznym tkankowo epitopem Qa-1 prowadzi do specyficznej kontroli stanu zapalnego o podłożu immunologicznym w tej tkance poprzez augmentację komórek Treg CD8 + sup12. Powyższe sukcesy badań przedklinicznych wskazują na potrzebę pełnej oceny immunizacji epitopami Qa-1 w leczeniu chorób immunologicznych specyficznych tkankowo oraz potencjalnie w terapii innych chorób związanych z niedoborami TAP i ERAAP.
W związku z tym, istnieje zapotrzebowanie na technologię, która może niezawodnie i szybko analizować epitopy Qa-1 w białku. W związku z tym opisano ograniczoną liczbę biologicznie ważnych epitopów Qa-1. Większość z tych epitopów Qa-1 została zidentyfikowana przypadkowo podczas badania odpowiedzi limfocytów T CD8 + na bakterie13, komórki z niedoborem TAP3, komórki z niedoborem ERAAP4, oraz komórki, które powodują EAE6,9. W związku z tym pożądana jest technika wysokoprzepustowa do identyfikacji biologicznie ważnych epitopów Qa-1 w określonym białku. Poniżej opisujemy strategię biblioteki nakładających się peptydów (OLP), która mapuje funkcjonalne epitopy Qa-1 w białku przy użyciu linii komórek T CD8 + z repryksem Qa-1 specyficznych dla puli OLP (OLP_pool) białka.

<table><tbody><tr><td>Białko do analizy</td><td>NIE</td><td></td> DOTYCZY <td>Nie dotyczy Sekwencję białka można uzyskać z NCBI</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat#: D2650 SIGMA</td><td>DMSO należy sterylnie i poddać badaniu na hodowli komórkowej.</td></tr><tr><td>Myszy Kb-/-Db-/-</td><td>Laboratorium Lackson</td><td>Stock#: 019995</td><td>Użyliśmy myszy Taconic H2-KbH2-Db myszy z podwójnym nokautem (Cat#: 4215-F i 4215-M), które jednak nie są już dostępne.</td></tr><tr><td>AIM V Serum Free Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#:</td> 2-merkaptoetanol 12055091 <td></td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 21985023</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 11360070</td><td></td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 11140076</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads CD8 Zestaw do izolacji</td> <td>dodatniejThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: 11333D</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Gel P-100</td><td>Bio-Rad</td><td>Kat#: 150-4171</td><td></td></tr><tr><td>Foshate Balanced Solution (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat#: Pipeta 20012027</td><td></td></tr><tr><td>Trasfer</td><td>Globe Scientific</td><td>Mfg#: Mysi 137238</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>PeproTech</td><td>Kat#: 315-02</td><td></td></tr><tr><td>48-dołkowe płytki do hodowli tkankowych</td><td>USA</td><td>Scientific Cat#: CC7682-7548</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar TC-treated Multiple Well Plates, 96-dołkowe, dno w kształcie litery V</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat#: Z372129 Sigma</td><td></td></tr><tr><td>1ml głęboka 06-dołkowa płytka PP, sterylna</td><td>USA Scientific</td><td>Pozycja#: 1896-1110</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana mysia IL-2</td><td>PeproTech</td><td>Cat#: 212-12</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana mysz IL-7</td><td>PeproTech</td><td>Cat#L: 217-17</td><td></td></tr><tr><td>Wychwytywanie przeciwciała anty-IFN-&gamma;</td><td>BD Biosciences</td><td>Kat#: 551881</td><td></td></tr><tr><td>Płytka ELISPOT</td><td>Sigma-Aldrich Kot</td><td>#: S2EM004M99</td><td></td></tr><tr><td>C1R</td><td>ATCC</td><td>Kat#: ATCC CRL-1993</td><td></td></tr><tr><td>C1R. Qa-1b</td><td></td><td></td><td>Wykonane na zamówienie (dostęp do GenBank #: NM_010398.3)</td></tr><tr><td>Qa-1 wektor lentiwirusowy</td><td>GeneCopoeia</td><td>Produkt#: Mm02955</td><td></td></tr><tr><td>Wykrywanie przeciwciała anty-IFN-&gamma</td><td>BD Biosciences</td><td>Kot #: 551881</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Kot#: P9416</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-HRP</td><td>BD Biosciences</td><td>Kot#: BD557630</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże AEC</td><td>BD Biosciences</td><td>Cat#: 551951</td><td></td></tr><tr><td>ImmunoSpot Analyzer</td><td>ImmunoSpot</td><td></td><td>Każdy analizator immunoSpot powinien działać w tym celu.</td></tr></tbody></table>

nakładająca się biblioteka peptydów do mapowania epitopów qa-1 w białku

Overlapping Peptide Library to Map Qa-1 Epitopes in a Protein

Qa-1 (HLA-E u człowieka) należy do grupy nieklasycznych cząsteczek głównego kompleksu zgodności tkankowej 1b (MHC-Ib). Najnowsze dane sugerują, że cząsteczki Qa-1 odgrywają ważną rolę w badaniu komórek pod kątem integralności strukturalnej i funkcjonalnej, indukowaniu regulacji immunologicznej i ograniczaniu odpowiedzi immunologicznej na infekcje wirusowe. Dodatkowo, funkcjonalna augmentacja limfocytów T CD8 + z ograniczeniami Qa-1 poprzez immunizację epitopów wykazała efekty terapeutyczne w kilku zwierzęcych modelach chorób autoimmunologicznych, np. eksperymentalnym alergicznym zapaleniu mózgu i rdzenia kręgowego, zapaleniu stawów wywołanym kolagenem i cukrzycy nieotyłej. Dlatego istnieje pilna potrzeba opracowania metody, która może skutecznie i szybko zidentyfikować funkcjonalne epitopy Qa-1 w białku. W tym miejscu opisujemy protokół, który wykorzystuje linie komórek T CD8 + z ograniczeniami Qa-1 specyficzne dla biblioteki nakładających się peptydów (OLP) do oznaczania epitopów Qa-1 w białku. Ta biblioteka OLP zawiera 15-merowe nakładające się peptydy, które pokrywają całą długość białka, a sąsiednie peptydy nakładają się na siebie o 11 aminokwasów. Korzystając z tego protokołu, niedawno zidentyfikowaliśmy 9-merowy epitop Qa-1 w glikoproteinie oligodendrocytów mielinowych (MOG). Wykazano, że ten nowo zmapowany epitop MOG Qa-1 indukuje specyficzne dla epitopu, ograniczone do Qa-1 limfocyty T CD8 +, które wzmacniają regulację immunologiczną specyficzną dla mieliny. Dlatego protokół ten jest przydatny do przyszłych badań nad nowymi celami i funkcjami limfocytów T CD8 + z ograniczeniami Qa-1.

Projekt biblioteki OLP obejmującej pełną długość białka
Zaczynając od N-końca białka, każdy peptyd składa się z 15 aminokwasów (15-mer). Zatem pierwszy peptyd obejmuje pozycje od 1 do 15. N-koniec drugiego peptydu nakłada się na C-koniec pierwszego peptydu o 11 aminokwasów. W związku z tym drugi peptyd obejmuje pozycje od 5 do 19. Pozostałe peptydy należy zaprojektować aż do końca C-końca białka (Rysunek 1</str...

Qa-1 (HLA-E u człowieka) należy do grupy nieklasycznych cząsteczek głównego kompleksu zgodności tkankowej 1b. Wykazano, że immunizacja epitopami wiążącymi Qa-1 zwiększa tkankową regulację immunologiczną i łagodzi kilka chorób autoimmunologicznych. W niniejszym artykule opisujemy nakładającą się strategię biblioteki peptydów do identyfikacji epitopów Qa-1 w białku.

Nakładająca się biblioteka peptydów do mapowania epitopów Qa-1 w białku

Qa-1 (HLA-E in human) belongs to a group of non-classical major histocompatibility complex 1b (MHC-Ib) molecules. Recent data suggest that Qa-1 molecules ...

Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja epitopów Qa-1 w białkach. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu regulacji immunologicznej i immunoterapii. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że zmapowane peptydy są znane z tego, że stymulują limfocyty T CD8 ograniczone przez Qa-1, a procedura jest łatwa do wykonania.Implikacje tej techniki rozciągają się na projekty terapeutyczne dla chorób o podłożu immunologicznym, takich jak stwardnienie rozsiane. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat regulacji immunologicznej za pośrednictwem Qa-1 u zwierząt, może być również zastosowana do regulacji immunologicznej za pośrednictwem HLA-E u ludzi. Aby rozpocząć procedurę, zaprojektuj bibliotekę 15-merowych peptydów, w których sąsiednie peptydy nakładają się na siebie w 11 aminokwasach.Otrzymać i rozpuścić peptydy w sterylnych warunkach. Dla każdego peptydu połącz pięć miligramów peptydu ze 100 mikrolitrami dimetylosulfotlenku. Połącz 10 mikrolitrów każdego zapasu peptydów w czystej 1-mililitrowej probówce kriogenicznej, aby przygotować zapas puli OLP.Następnie załaduj 20 mikrolitrów każdego bulionu peptydowego do 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V i rozcieńcz każdy bulion 80 mikrolitrami sterylnej wody. Przechowuj zarówno pozostałe 50 miligramów na mililitr peptydów, jak i płytkę z zapasami peptydów 10 miligramów na mililitr w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Następnie dodaj 10 mikrolitrów roztworu podstawowego puli OLP do 15-mililitrowej probówki zawierającej dwa mililitry napromieniowanych komórek dendrytycznych w podłożu wolnym od surowicy, rozcieńczając w ten sposób DMSO dwustukrotnie.Przechowuj pozostały zapas puli OLP w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Inkubować DC w puli OLP w temperaturze pokojowej przez trzy godziny. Delikatnie potrząsaj komórkami ręcznie co 15 minut.Podczas inkubacji użyj zestawu do oczyszczania komórek T CD8 + z pobranej śledziony myszy lub węzłów chłonnych. Przygotuj pięć mililitrów roztworu z 10 milionami limfocytów T na mililitr pożywki bez surowicy z 50 jednostkami na mililitr interleukiny 2 i 100 jednostkami na mililitr interleukiny 7. Oczyszczone limfocyty T CD8 powinny być wolne od kulek lub nietknięte.Umieść 0,5 mililitra roztworu komórek T w każdym z 10 dołków 48-dołkowej płytki. Po zakończeniu inkubacji roztworu prądu stałego z pulą OLP dodać 10 mililitrów pożywki bez surowicy do DC. Odwirować komórki w temperaturze 300 razy G przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Następnie rozpuść komórki w pięciu mililitrach pożywki bez surowicy. Dodaj 0,5 mililitra zawiesiny komórek do każdego z 10 dołków. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w atmosferze 5% dwutlenku węgla przez cztery dni.Następnie usuń 400 mikrolitrów pożywki hodowlanej z każdej studzienki. Dodać 500 mikrolitrów świeżej pożywki bez surowicy zawierającej po 100 jednostek na mililitr IL-2 i IL-7 do każdej studzienki. Inkubuj komórki przez kolejne dwa do trzech dni przed ponowną stymulacją komórek zagruntowanych w puli OLP.Przed ponowną stymulacją należy uzyskać i napromienić makrofagi otrzewnowe myszy. Dostosuj stężenie makrofagów do pięciu milionów komórek na mililitr pożywki bez surowicy. Połącz 10 mikrolitrów zapasu z puli OLP z dwoma mililitrami napromieniowanych makrofagów otrzewnowych, aby uzyskać końcowe stężenie DMSO 0,5% objętości.Uzupełnij ten roztwór o 100 jednostek na mililitr mysiego czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów. Napełnij 48-dołkową płytkę 200 mikrolitrami roztworu makrofagów z puli OLP w każdym dołku. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery godziny.Następnie delikatnie umyj każdą studzienkę 200 mikrolitrami wstępnie podgrzanego podłoża RPMI-0. Roztwór makrofagów będzie zawierał dużo kulek. Przed dodaniem limfocytów T CD8 zagruntowanych pulą OLP należy sprawdzić płytkę pod mikroskopem, aby upewnić się, że wszystkie studzienki są wolne od kulek.Następnie zbierz i połącz komórki T CD8 + zagruntowane w puli OLP, które są gotowe do ponownej stymulacji. Dostosuj stężenie limfocytów T do miliona komórek na mililitr w pożywce bez surowicy zawierającej 25 jednostek na mililitr IL-2 i 50 jednostek na mililitr IL-7. Dodaj jeden mililitr zbiorczego roztworu limfocytów T do każdej studzienki zawierającej makrofagi pulsujące w puli OLP.Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w atmosferze 5% dwutlenku węgla przez cztery dni. Następnie usuń około 400 mikrolitrów pożywki z każdej studzienki. Dodać do każdej studzienki 500 mikrolitrów świeżej pożywki bez surowicy zawierającej po 100 jednostek na mililitr IL-2 i IL-7.Wznów inkubację w tych samych warunkach. Po trzech do czterech dniach zbadaj ponownie stymulowane komórki pod kątem ograniczonej odpowiedzi Qa-1 specyficznej dla puli OLP za pomocą testu immunologicznego sprzężonego z enzymem interferon-gamma. Odświeżaj pożywkę z limfocytów T CD8 + co trzy do czterech dni, czekając na wyniki.Wykonaj test ELISPOT z rozcieńczonymi zapasami peptydów, aby określić, które peptydy wytwarzają specyficzne dla puli OLP ograniczone wydzielanie interferonu gamma Qa-1. Na koniec oceń skróconą serię peptydów za pomocą ELISPOT, aby zidentyfikować optymalny epitop Qa-1. Test interferon-gamma ELISPOT wykazał znaczny wzrost liczby komórek tworzących plamki, gdy komórki T CD8 + stymulowane przez łączoną nakładającą się bibliotekę peptydów MOG połączono z C1R.Komórki Qa-1b. Sugerowało to, że limfocyty T reagowały na peptydy wiążące Qa-1 i że MOG_pool zawierały jeden lub więcej epitopów wiążących Qa-1. Przeprowadzono kolejny test w celu zbadania poszczególnych peptydów w basenie.Trzy peptydy wykazały odpowiedzi, które były co najmniej trzy razy większe niż odpowiedź w obecności C1R. Komórki Qa-1b bez peptydów. Spośród nich wybrano peptyd o największej odpowiedzi do dalszej oceny.Oceniono bibliotekę skróconych peptydów opartych na 15-merowym peptydzie będącym przedmiotem zainteresowania w celu zidentyfikowania optymalnego epitopu Qa-1. Epitop powinien mieć od ośmiu do 10 merów, przy czym preferowane jest dziewięć merów. Co więcej, optymalny epitop wykazywałby podobną lub silniejszą odpowiedź interferon-gamma niż peptyd 15-merowy.Dziewięciomerowy N-końcowo skrócony peptyd najlepiej spełnia te kryteria, co czyni go optymalnym epitopem Qa-1. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się regulacją immunologiczną do odkrycia nowych epitopów Qa-1 do badania regulacji immunologicznej w innych tkankach, takich jak trzustka. Nie zapominaj, że praca z promieniowaniem może być bardzo niebezpieczna.Naukowcy powinni ściśle przestrzegać polityki uczelni i być odpowiednio przeszkoleni.

overlapping-peptide-library-to-map-qa-1-epitopes-in-a-protein

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje technikę, która wykorzystuje technologię mikromacierzy peptydowych do profilowania specyficzności przeciwciał rozpoznających modyfikacje potranslacyjne (PTM) na peptydach histonowych. Szkiełko mikromacierzy zawierające unieruchomione peptydy histonowe sprzężone z fluoroforem ze znanymi kombinacjami PTM poddaje się działaniu docelowych przeciwciał specyficznych dla PTM. Proces ten pomaga zidentyfikować swoistość przeciwciała dla celu i jego potencjalną reaktywność krzyżową z...

Technologia mikromacierzy peptydowych do profilowania swoistości przeciwciał

Opisano techniki analizowania mechanizmów leżących u podstaw wydzielania HIV-1 Nef w egzosomach. Specyficzne krótkie peptydy pochodzące z transfekcji Nef i białka wykorzystano do określenia struktury, funkcji i partnerów wiążących region modyfikacji wydzielania Nef. Procedury te mają ogólne znaczenie w wielu badaniach mechanistycznych.

Identyfikacja motywów funkcjonalnych i ich partnerów wiążących w oparciu o peptydy

Testy biochemiczne z rekombinowanymi ludzkimi cząsteczkami MHC II mogą dostarczyć szybkich, ilościowych wglądów w identyfikację, delecję lub projektowanie epitopów immunogennych. Tutaj opisany jest test wiązania peptyd-MHC II skalowany do płytek 384-dołkowych. Ten opłacalny format powinien okazać się przydatny w dziedzinie deimmunizacji białek oraz projektowania i opracowywania szczepionek.

Wysokoprzepustowy test wiązania MHC II do analizy ilościowej epitopów peptydowych

Badanie przesiewowe macierzy peptydowej to wysokoprzepustowy test do identyfikacji miejsc interakcji białko-białko. Pozwala to na mapowanie wielu interakcji białka docelowego i może służyć jako metoda identyfikacji miejsc dla inhibitorów, które celują w białko. Tutaj opisujemy protokół badania przesiewowego i analizy macierzy peptydowych.

Identyfikacja miejsc interakcji białko-białko za pomocą macierzy peptydowych

Tutaj autorzy prezentują prosty i skuteczny protokół definiowania liniowego epitopu antygenowego za pomocą oczyszczonego przeciwciała monoklonalnego i skanowania peptydowego poprzez hybrydyzację kropkowo-plamową. Zidentyfikowany epitop może być następnie wykorzystany w zastosowaniach terapeutycznych i diagnostycznych.

Wspomagana skanowaniem peptydowym identyfikacja liniowego epitopu limfocytów B rozpoznanego przez przeciwciało monoklonalne

Biblioteki wyświetlania bakterii w biopanowaniu to sprawdzona technika odkrywania odczynników powinowactwa peptydowego, solidna alternatywa dla przeciwciał. Półautomatyczna metoda sortowania usprawniła biopanoramowanie w celu zmniejszenia występowania wyników fałszywie dodatnich. Poniżej ilustrujemy proces myślowy i techniki stosowane w ocenie kandydatów i minimalizacji dalszej analizy.

Półautomatyczne biopanowanie bakteryjnych bibliotek wyświetlających w celu odkrywania odczynników powinowactwa peptydowego i analizy otrzymanych izolatów

Niezgodności w sekwencjach ludzkiego antygenu leukocytarnego (HLA) między parami dawców i biorców narządów są główną przyczyną odrzucenia przeszczepu narządów za pośrednictwem przeciwciał. W tym miejscu przedstawiamy zastosowanie niestandardowych macierzy antygenowych, które są oparte na sekwencjach HLA poszczególnych dawców, do badania alloprzeciwciał HLA przeciwko dawcom u biorców narządów.

Spersonalizowane macierze peptydowe do wykrywania alloprzeciwciał HLA w przeszczepach narządów

Tutaj prezentujemy narzędzie proteogenomiczne PoGo i protokoły do szybkiej, ilościowej, potranslacyjnej modyfikacji i umożliwionego mapowania wariantów peptydów zidentyfikowanych za pomocą spektrometrii mas na genomy referencyjne. To narzędzie jest przydatne do integracji i wizualizacji proteogenomicznych i osobistych badań proteomicznych w połączeniu z ortogonalnymi danymi genomicznymi.

Szybka i ilościowa metoda modyfikacji potranslacyjnej i wariantów umożliwiła mapowanie peptydów do genomów

To badanie miało na celu przedstawienie strategii identyfikacji interakcji lek-peptyd. Strategia obejmuje biopanowanie krótkich peptydów rozpoznających leki w oparciu o bioczujnik mikrowagi kwarcowej (QCM), a następnie analizę bioinformatyczną w celu ilościowej oceny uzyskanych informacji w celu rozpoznania leku i adnotacji miejsc wiązania leku na białkach.

Oparta na biosensorach strategia wysokoprzepustowej analizy biopanningowej i bioinformatycznej do globalnej walidacji interakcji lek-białko

Tutaj prezentujemy protokół oczyszczania kompleksów peptydowych MHC klasy I i klasy II z linii komórkowych myszy i ludzi, dostarczając wysokiej jakości danych immunopeptydomowych. Protokół koncentruje się na przygotowaniu próbki przy użyciu dostępnych na rynku przeciwciał.

Immunopeptydomika: izolacja mysich i ludzkich peptydów związanych z MHC klasy I i II do analizy spektrometrii mas

Przedstawiamy protokół umożliwiający wychwytywanie i identyfikację specyficznych dla choroby interakcji białko-białko z komórek i tkanek rodzimych za pomocą sond chemicznych i spektrometrii mas. Uzyskane zbiory danych interakcji są analizowane za pomocą dedykowanej platformy internetowej, aby ujawnić dynamiczne dysfunkcje sieci oraz zmiany w ścieżkach związane z chorobą.

Mapowanie dysfunkcyjnych interakcji białko-białko w chorobach

Poznaj metodę mapowania epitopów Qa-1 w białkach przy użyciu nakładającej się biblioteki peptydów 15-merowych. Technika ta stymuluje komórki CD8 T zależne od Qa-1 i ma zastosowanie w badaniach regulacji odporności oraz terapii chorób autoimmunologicznych.

Nakładająca się biblioteka peptydów do mapowania epitopów Qa-1 w białku

Przeglądaj więcej filmów