Analiza cyklu komórkowego

Cykl komórkowy odnosi się do zestawu procesów komórkowych i biochemicznych zachodzących w komórce, prowadzących do jej podziału. Komórka przechodzi przez różne etapy cyklu, a czas potrzebny na zakończenie tego procesu jest prawie stały dla danego typu komórki. Każde odchylenie od tego czasu wskazuje na nieprawidłowy podział komórek. Dlatego analiza cyklu komórkowego staje się bardzo przydatnym narzędziem dla biologów zainteresowanych badaniem mechanizmów podziału komórek, co docelowo pomoże w leczeniu pacjentów z chorobami takimi jak rak, w których cykl komórkowy jest zaburzony.

W tym filmie omówiono zasadę i uogólniony protokół analizy cyklu komórkowego. Na koniec pokażemy kilka zastosowań tej powszechnie używanej metody.

Dowiedzmy się, czym jest analiza cyklu komórkowego i jak działa ten test.

Zasadniczo analiza cyklu komórkowego populacji mieszanej mówi nam, ile komórek znajduje się w każdej z różnych faz. Najczęściej odbywa się to poprzez ocenę zawartości DNA w komórce. Możesz pomyśleć: dlaczego zawartość DNA? Aby to zrozumieć, przyjrzyjmy się pokrótce, co dzieje się z chromosomalnym DNA, gdy komórka przechodzi przez cykl.

Podczas fazy G1 zawartość DNA w komórce nie zmienia się. W fazie S zachodzi replikacja DNA, a pod koniec tej fazy zawartość DNA ulega podwojeniu. W fazie G2 komórki sprawdzają, czy nie ma błędów w duplikacji DNA, a na koniec – pod koniec etapu M – to DNA zostaje równo podzielone na dwie komórki potomne. Dlatego znakowanie DNA może pomóc naukowcowi określić etap cyklu komórkowego.

Jednym z ważnych czynników branych pod uwagę przy tym oznaczaniu jest wybór barwnika wiążącego DNA. Bromodeoksyurydyna lub BrdU jest analogiem kwasu nukleinowego i strukturalnie naśladuje tymidynę. Dzięki temu BrdU może włączyć się do rosnącej nici podczas replikacji DNA. Dlatego ten barwnik oznacza komórki tylko w fazie S. Po inkorporacji BrdU nici DNA są rozdzielane, a BrdU jest wykrywany za pomocą fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał.

Inne związki, takie jak jodek propidyny lub PI, który jest z natury fluorescencyjny, interkalują między dwuniciowymi kwasami nukleinowymi, a zatem barwią komórki na wszystkich etapach. Jednak ilość barwienia PI jest proporcjonalna do ilości DNA.

Chociaż wybór barwnika zależy od eksperymentu, naukowcy często stosują procedury podwójnego barwienia. Cząsteczki takie jak PI, które proporcjonalnie wiążą się ze wszystkimi komórkami, mogą łatwo różnicować komórki G1 od komórek fazy G2 lub M. Jednak komórki fazy S są nadal w fazie przejściowej. Dlatego dodanie cząsteczek takich jak BrdU, które znakują tylko komórki fazy S, zwiększa specyficzność wykrywania etapów cyklu komórkowego. Na koniec komórki są analizowane za pomocą cytometrii przepływowej w celu zliczenia komórek na różnych etapach cyklu komórkowego.

Teraz, gdy rozumiesz zasady barwienia cyklu komórkowego, omówmy procedurę z użyciem BrdU i PI.

Ustaw szalki do hodowli komórkowych: jedną na potrzeby eksperymentu, a dodatkowe trzy jako kontrole. Przy około 60% konfluencji, BrdU rozpuszczony w pożywkach hodowlanych dodaje się do żywych komórek, a następnie następuje inkubacja. Na tym etapie BrdU jest włączony do replikującego się DNA.

Po inkubacji komórki są odwirowywane i ponownie zawieszane w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami lub PBS. Następnie komórki są utrwalane przez dodawanie zawiesiny komórkowej kroplami do lodowatego 70% etanolu, delikatnie wirując. To zatrzymuje podział komórek i zapobiega zbrylaniu.

Utrwalone komórki są ponownie odwirowywane i ponownie zawieszane w PBS. Następnie kroplami do komórek dodaje się stężony roztwór kwasu zawierający detergent, taki jak Triton-X. Detergent przenika do komórek, umożliwiając wnikanie związków nieprzepuszczalnych dla błony, a kwas obniża pH i denaturuje DNA, odsłaniając BrdU. Komórki są następnie odwirowywane, supernatant jest odrzucany, a osad jest ponownie zawieszany w roztworze alkalicznym w celu przywrócenia pH.

Na koniec komórki przemywa się PBS i inkubuje z przeciwciałem BrdU sprzężonym ze znacznikiem fluorescencyjnym w temperaturze pokojowej. Po tym etapie próbki należy chronić przed światłem, aby uniknąć fotowybielania.

Podczas podwójnego barwienia komórki są inkubowane z PI i RNazą. RNaza jest niezbędna do usunięcia podwójnych nici RNA-RNA lub RNA-DNA, które również wiążą się z PI i mogą dawać fałszywie dodatnie wyniki. Komórki są następnie przepuszczane przez sitko komórkowe w celu wytworzenia zawiesiny pojedynczej komórki, która jest niezbędna do analizy cytometrycznej przepływowej.

Teraz, gdy znasz już protokół barwienia, przyjrzyjmy się, jak analizować uzyskane dane.

Krótko mówiąc, w cytometrii przepływowej wiązka laserowa świeci na wąski strumień zawiesiny pojedynczej komórki, a emisja na określonych długościach fal z barwników w każdej komórce jest wykrywana jako pojedyncze zdarzenie na wykresie punktowym.

W tym przypadku wykres punktowy komórek barwionych PI pokazuje dwa odrębne klastry, z których jeden ma prawie dwukrotnie większą ilość PI niż drugi. Po optymalizacji detektora PI zestawy te pojawiają się jako dwa piki w analizie histogramu. Szczyt przy większej intensywności PI reprezentuje komórki G2 / M, a ten o niższej intensywności reprezentuje komórki G1. Obszary pod tymi pikami reprezentują liczbę komórek w odpowiednich fazach.

Podobnie, zdarzenia BrdU-FITC mogą być wyświetlane w analizie histogramu w skali logarytmicznej. Ten wykres pokazuje, że komórki BrdU dodatnie są wyraźnie jaśniejsze niż komórki niebarwione, a ponieważ tylko ułamek populacji znajduje się w fazie S, można zaobserwować większy pik niebarwionych komórek BrdU.

Wykres punktowy komórek zabarwionych BrdU i PI może być wyświetlany z PI na liniowej osi X i BrdU na logarytmicznej osi Y, co pokazuje wzór podkowy przechodzący od G1, S do G2. Proporcję komórek w obszarach bramkowanych można określić i wyświetlić na wykresie słupkowym.

Teraz, gdy przeszliśmy przez podstawowy protokół analizy cyklu komórkowego, przyjrzyjmy się, jak można go wykorzystać w różnych konfiguracjach eksperymentalnych.

A. Łącząc manipulacje genetyczne z analizą cyklu komórkowego, naukowcy badają rolę określonych białek w progresji cyklu komórkowego. W tym badaniu naukowcy uzyskali nadekspresję białka zwanego p27 w fibroblastach embrionalnych myszy. Wyniki pokazują, że nadekspresja doprowadziła do zmniejszenia liczby komórek w fazie S, co wskazuje, że białko to odgrywa kluczową rolę w regulacji cyklu komórkowego.

Korzystając z analizy cyklu komórkowego, naukowcy mogą porównać kinetykę progresji. W tym miejscu porównano kinetykę progresji między dwiema liniami komórkowymi raka jelita grubego i linią komórkową raka piersi. Wyniki wykazały, że komórki raka piersi postępowały przez cykl komórkowy w wolniejszym tempie w porównaniu z liniami komórkowymi jelita grubego, biorąc pod uwagę wyższy odsetek komórek raka piersi w G1 w czasie.

Wreszcie, w przypadku analizy cyklu komórkowego in vivo, BrdU można wstrzyknąć gryzoniom, a docelową populację komórek wyizolować do analizy cyklu komórkowego. W tym badaniu wyizolowano hematopoetyczne komórki macierzyste lub HSC myszy, którym wstrzyknięto BrdU do analizy cytometrii przepływowej. Zebrane dane ujawniły rozkład HSC na różnych etapach cyklu komórkowego z przewagą w fazie G1 i S.

Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat analizy cyklu komórkowego. Zapoznaliśmy się z zasadami stojącymi za tym procesem, szczegółowo opisaliśmy protokół krok po kroku i sprawdziliśmy, w jaki sposób ten typ analizy jest używany w różnych warunkach eksperymentalnych. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!