Name: Przygotowanie pierwotnych komórek ostrej białaczki limfoblastycznej w różnych fazach cyklu komórkowego przez elutriację odśrodkową (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: Poznaj metodę elutriacji odśrodkowej do izolacji pierwotnych komórek ostrej białaczki limfoblastycznej w różnych fazach cyklu komórkowego. Ta technika umożliwia badanie zależnych od fazy odpowiedzi na leki przeciwnowotworowe bez chemicznych perturbacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez NIH CA109821 (do TCC). Dziękujemy firmie Beckman-Coulter za hojne przekazanie funduszy na pokrycie kosztów publikacji oraz za pomoc techniczną w konfiguracji i eksploatacji systemu elutriacji. Dziękujemy dr Fredowi Falkenburgowi za dostarczenie początkowych pierwotnych kultur WSZYSTKICH.

UWAGA: Ten protokół został zoptymalizowany dla pierwotnych komórek B-ALL o średnicy od około 8 μm (faza G1) do 13 μm (fazy G2/M). W związku z tym określone prędkości wirówki i natężenia przepływu pompy mogą nie mieć zastosowania do ogniw o różnych zakresach wielkości. Niemniej jednak odpowiednie parametry elutriacji można oszacować za pomocą równania szybkości sedymentacji. Komórki są hodowane w określonym podłożu wolnym od surowicy, zgodnie z opisem16 o optymalnej gęstości 1 - 3 x 106 komórek/ml. Z wyjątkiem zbierania frakcji, które przeprowadza się w temperaturze 4 °C przy użyciu probówek chłodzonych lodem, wszystkie etapy przeprowadza się w temperaturze pokojowej, a wirówkę ustawia się na 20 °C, maksymalnie 24 °C.
1. Przygotowanie buforu elucyjnego i materiałów
<ol>
	<li>W celu zmniejszenia zlepiania się komórek należy przygotować bufor elutriacyjny ze zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) z czerwienią fenolową uzupełnioną 2% płodową surowicą bydlęcą (FBS), w celu ochrony komórek przed stresem mechanicznym podczas procesu elutriacji, oraz 1,6 g/l soli dipotasowej kwasu 2-naftol-6,8-disulfonowego (NDA), która sprawia, że zewnętrzna część komórki jest naładowana ujemnie i zmniejsza zlepianie.
	<ol>
		<li>Dodaj 1,6 g NDA do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
		<li>W sterylnych warunkach dodać 35 ml HBSS z butelki o pojemności 1 l do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej NDA. Obracaj rurką, aż NDA się rozpuści.</li>
		<li>Za pomocą filtra 0,2 μm przenieś rozpuszczoną NDA do nowej sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Następnie dodaj NDA do pozostałego 1 litra HBSS.</li>
		<li>Na koniec dodać 21 ml FBS do HBSS, aby uzyskać końcowe stężenie 2% (v/v). 
		UWAGA: Bufor elutriacyjny może być przygotowany i przechowywany w temperaturze 4 °C do daty ważności na HBSS lub do momentu wystąpienia istotnej zmiany pH, na co wskazuje żółknięcie barwnika wskaźnikowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznacz stożkowe probówki o pojemności 50 ml do zbierania frakcji tak, aby były probówki oznaczone jako mycie 1 i 2 (W1 i W2), frakcje 1 - 20 (F1 - F20) i STOP.
	<ol>
		<li>Wstępnie schłodź te rurki na lodzie przed zebraniem frakcji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Montaż systemu elutriacji
<ol>
	<li>Najpierw zainstaluj zespół stroboskopowy w wirówce tak, aby przewód zasilający był wyprowadzony z komory przez port po lewej stronie. Upewnij się, że lampa błyskowa stroboskopowa lamp znajduje się z przodu komory, tak aby zrównała się z viewokienko, gdy wirówka jest zamknięta.
	<ol>
		<li>Zamocuj zespół na miejscu, najpierw dokręcając dwie z krzyżakowym w dwóch otworach w górnej części każdego wspornika, a następnie dokręcając skrzydełkowane w dolnej części każdego wspornika.</li>
		<li>Podłącz przewód zasilający do portu zasilania stroboskopu z tyłu wirówki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Następnie ustaw wirnik prosto w dół na piaście napędu wirówki i zabezpiecz kluczem imbusowym z rękojeścią T. 
	UWAGA: Jeśli wirówka nie jest potrzebna do celów innych niż elutriacja, zespół stroboskopowy i wirnik można przechowywać w wirówce między cyklami.</li>
	<li>Po zabezpieczeniu wirnika umieść w wirniku zespół szybkozłączki zawierający komorę elutriacyjną, przeciwwagę, zespół uszczelnienia obrotowego i płytę montażową.
	<ol>
		<li>Dociśnij równomiernie jedną ręką komorę elutriacyjną, a drugą ręką przeciwwagę, aż w wirniku zatrzasną się w otworach w płycie montażowej.</li>
		<li>Na koniec przymocuj kotwiący, umieszczając kołek po jednej stronie w otworze w zespole obrotowego uszczelnienia i zabezpieczając otwór oczkowy po drugiej stronie jedną ze z krzyżakowym (wymienionych w 2.1.1) na wsporniku po lewej stronie komory.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Następnie zmontuj system przepływu za pomocą pompy o zmiennej prędkości i rurki, aby przepompować bufor do komory elutriacyjnej i zebrać bufor wypływający z komory elutriacyjnej.
	<ol>
		<li>Przełóż rurkę wejściową o rozmiarze 16 wychodzącą z pompy o zmiennej prędkości przez port w lewym górnym rogu komory wirówki, tak aby weszła do komory.</li>
		<li>Przymocuj złączkę do wolnego końca rurki wejściowej i włóż złączkę do otworu wejściowego z boku zespołu obrotowego uszczelnienia.</li>
		<li>Przełóż rurkę wyjściową rozmiaru 16 przez port i przymocuj ją do rurki przesyłowej w górnej części zespołu obrotowego uszczelnienia. 
		UWAGA: System przepływu może również pozostać zmontowany między przebiegami elutriacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Na koniec włącz wirówkę i ustaw specyfikacje niezbędne do eksperymentu.
	<ol>
		<li>Zmień identyfikator wirnika.</li>
		<li>Jeśli wirówka wymaga wprowadzenia czasu, ustaw na 2 godziny, co jest więcej niż wystarczające do zakończenia cyklu elutriacji.</li>
		<li>Ustaw temperaturę na 20 °C z maksymalną temperaturą 24 °C.</li>
		<li>Ustaw przyspieszenie na maksimum i opóźnienie na wolne.</li>
		<li>Na koniec ustaw prędkość na 867 x g.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Gruntowanie systemu elutriacji
<ol>
	<li>Najpierw, aby wysterylizować system elutriacji, umieść rurkę zbiornika w plastikowej butelce o pojemności 500 ml zawierającej 5% wybielacza i umieść rurkę wyjściową w pustej plastikowej butelce na odpady o pojemności 1 l.
	<ol>
		<li>Włącz pompę i ustaw prędkość na 25 ml/min i pozwól, aby 5% wybielacz przepłynął przez cały system elutriacji, aż zostanie wypompowany z rurki wyjściowej do butelki na odpady.</li>
		<li>Włącz wirówkę i pozwól jej osiągnąć maksymalną wyznaczoną prędkość (867 x g), aby uwolnić pęcherzyki i przeciwciśnienie.</li>
		<li>Zatrzymaj wirówkę. Gdy wirnik przestanie się obracać, otwórz pokrywę i sprawdź, czy komora nie ma wycieków.</li>
		<li>Jeśli nie ma wycieków, pozwól roztworowi wybielacza przepływać przez system przez co najmniej 5 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Następnie przepłukać system wodą autoklawowaną, ponieważ wybielacz może prowadzić do tworzenia się osadów z buforu elutriacyjnego, które mogą prowadzić do zlepiania się komórek, a także powodować ich uszkodzenie.
	<ol>
		<li>Umieść rurkę zbiornika w 1 litrowej butelce z autoklawowaną wodą i pozwól jej przepłukać przez co najmniej 10 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po przepłukaniu wodą wprowadzić do układu bufor elutriacyjny. Użyj szklanej butelki o pojemności 150 ml, która została poddana autoklawie, aby utworzyć zbiornik na bufor elucyjny i komórki.
	<ol>
		<li>Dodać 100 ml buforu elucyjnego do butelki i przesunąć rurkę zbiornika do szklanej butelki tak, aby probówka znalazła się na samym dnie.</li>
		<li>Uruchom wirówkę i pozwól, aby bufor przepłynął przez system, aby wypłukać wodę.</li>
		<li>Gdy butelka zbiornika jest prawie pusta, a woda zostanie całkowicie wypłukana z systemu, przenieś rurkę wyjściową z butelki na odpady do zbiornika, tak aby bufor był zawracany przez system.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Na koniec wyreguluj viewokienko tak, aby komora elutriacyjna była widoczna z aktualną prędkością.
	<ol>
		<li>Naciśnij przycisk zasilania lampy stroboskopowej na zewnątrz wirówki, aby lampa się włączyła. Przekręć pokrętło elutriacji również na zewnątrz wirówki maksymalnie w lewo.</li>
		<li>Patrząc przez okno podglądu, powoli przekręć pokrętło w prawo, aż komora elutriacyjna pojawi się w polu widzenia, a światło stroboskopowe zdąży się z obrotem wirnika. 
		UWAGA: System elutriacji można pozostawić w tym stanie, dopóki komórki nie zostaną przygotowane.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przygotowanie próbki komórki
<ol>
	<li>Policz komórki i podnieś od 300 do 400 milionów w pożywce wzrostowej do kilku stożkowych probówek o pojemności 50 ml. Wiruj komórki w temperaturze 1210 x g przez 3 minuty.</li>
	<li>Odessać pożywkę wzrostową i ponownie zawiesić komórki w 25 ml buforu elucyjnego, delikatnie pipetując w górę iw dół.</li>
	<li>Aby zmniejszyć zlepianie się komórek, przepuść komórki dwukrotnie przez igłę o rozmiarze 25.
	<ol>
		<li>Za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml narysuj komórki, a następnie przymocuj igłę o rozmiarze 25 i przełóż komórki na wewnętrzną ściankę sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Powtarzaj tę czynność, aż wszystkie 25 ml przejdzie przez igłę.</li>
		<li>Zaopatrz się w nową igłę i strzykawkę i powtórz powyższy proces raz. 
		Uwaga: Igły strzykawkowe należy umieszczać w pojemnikach na ostre przedmioty. 
		UWAGA: Bardzo ważne jest, aby komórki były przepychane przez igłę bezpośrednio przed wprowadzeniem ich do systemu elutriacji, aby ograniczyć zlepianie się komórek do minimum.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Wprowadzenie próbki komórki do systemu elutriacji i pobieranie frakcji
<ol>
	<li>Wprowadzić próbkę komórkową do systemu elutriacji, wlewając próbkę komórki do zbiornika zbiornika, przez który przechodzi pozostały bufor elutriacyjny.
	<ol>
		<li>Pozwól komórkom wejść do systemu i osiągnąć równowagę w komorze elutriacyjnej. 
		UWAGA: Proces ten zajmie około 5 minut, a postęp można śledzić, obserwując komórki, gdy wchodzą do komory przez okno podglądu. Aby upewnić się, że wszystkie komórki znajdują się w komorze, weź kroplę eluentu, umieść ją na szklanym szkiełku i obejrzyj pod mikroskopem. Jeśli próbka jest wolna od nienaruszonych komórek, potwierdza to ich zatrzymanie w komorze.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozpocznij zbieranie frakcji, gdy wszystkie komórki wejdą do komory, a w najszerszej części komory pojawi się wyraźna granica, w której komórki są w równowadze.
	<ol>
		<li>Zacznij od przeniesienia rurki wyjściowej do stożkowej rurki o pojemności 50 ml oznaczonej W1. Zebrać 50 ml buforu elutriacyjnego dla tej frakcji, upewniając się, że masz oko na zbiornik zbiornika i w razie potrzeby uzupełnij buforem elutriacyjnym. 
		UWAGA: Aby upewnić się, że wszystkie ogniwa weszły do systemu, poczekaj, aż zbiornik stanie się prawie pusty przed ponownym napełnieniem zbiornika po raz pierwszy. Po pierwszym napełnieniu nie trzeba będzie czekać, aż zbiornik stanie się prawie pusty. Nigdy NIE WOLNO dopuścić do opróżnienia zbiornika, ponieważ spowoduje to powstanie pęcherzyków i ciśnienia wstecznego w systemie.</li>
		<li>Po zebraniu 50 ml dla W1 jednocześnie zmień prędkość na 821 x g i przesuń probówkę wyjściową do stożkowej rurki oznaczonej W2 i zbierz 50 ml więcej z tą prędkością.</li>
		<li>Kontynuuj zmianę prędkości i zbieranie frakcji, jak wskazano w Tabeli 1. Upewnij się, że w zbiorniku zbiornika znajdują się media i przez cały czas utrzymuj stożkowe rurki na lodzie. Na koniec wyreguluj viewokienko, powoli obracając pokrętło w prawo wraz ze spadkiem prędkości.</li>
		<li>Po zebraniu wszystkich 20 frakcji zatrzymaj wirówkę i zbierz 50 ml do stożkowej probówki oznaczonej STOP.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Płukanie systemu elutriacji
<ol>
	<li>Po całkowitym zatrzymaniu wirówki należy przepłukać system, umieszczając rurkę zbiornika w butelce o pojemności 1 l z autoklawowaną wodą, a rurkę wyjściową z powrotem do pojemnika na odpady.
	<ol>
		<li>Zwiększ prędkość pompy do 50 ml/min i pozwól wodzie przepływać przez system, aż do jej wyczerpania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyłącz pompę, wyjmij wąż wejściowy i wyjściowy z zestawu szybkozłączki i wyciągnij kołek z kotwiącego.
	<ol>
		<li>Zdejmij szybkozłączkę z wirnika. 
		UWAGA: W zależności od tego, do czego będzie używana wirówka, system elutriacji można teraz pozostawić bez zmian. W przeciwnym razie cały zespół można zdemontować w odwrotnej kolejności, jak opisano powyżej. Komorę elutriacyjną można wyjąć z szybkozłączki i oczyścić między przebiegami za pomocą ultradźwiękowej łaźni wodnej. Usuwa to zanieczyszczenia i zanieczyszczenia ze ściany komory, co może negatywnie wpłynąć na późniejsze przebiegi.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Analiza frakcji i zbieranie pul G1 lub G2/M.
Uwaga: Aby zademonstrować skuteczność elutriacji, każda frakcja jest analizowana pod kątem liczby komórek, średnicy komórki i zawartości DNA, a następnie tworzone są pule komórek w fazach G1 lub G2/M do analiz immunoblot, jak opisano w Reprezentatywnych wynikach. W tej sekcji protokołu opisano sposób tworzenia tych pul i przygotowywania ich do użytku eksperymentalnego.
<ol>
	<li>Wirować każdą frakcję w temperaturze 2000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odessać z buforu elucyjnego.</li>
	<li>Połącz ze sobą frakcje, aby uzyskać zarówno pulę faz G1, jak i pulę faz G2/M.
	<ol>
		<li>W przypadku puli faz G1 ponownie zawiesić frakcje, które zostały zebrane w zakresie prędkości od 788 x g do 661 x g (F1 - F5) w łącznej objętości 1 ml roztworu soli fizjologicznej buforu fosforanowego (PBS) i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Dla puli faz G2/M należy ponownie zawiesić frakcje, które zostały zebrane w zakresie prędkości 387 x g i 333 x g (F17 - F20).</li>
		<li>Odwirować komórki o gramaturze 2000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odessać PBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w 10 ml pożywki wzrostowej i pobrać liczbę komórek.</li>
	<li>Z każdej puli należy pobrać podwielokrotność do analizy pod kątem zawartości DNA za pomocą barwienia jodkiem propidyny i analizy cytometrycznej przepływowej15. 
	UWAGA: Pozostałą część każdej puli można wykorzystać do dalszych eksperymentów.</li>
</ol>

<ol><li>Beach, D., Piper, M., Shall, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+newly-initiated+DNA+from+the+early+S+phase+of+the+synchronous+eukaryote%2C+Physarum+polycephalum%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+cell+res%22%5BJournal%5D)">Isolation of newly-initiated DNA from the early S phase of the synchronous eukaryote, Physarum polycephalum.</a> Exp cell res. 129, 211-221 (1980).</li>
<li>Sevcikova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Completion+of+cell+division+is+associated+with+maximum+telomerase+activity+in+naturally+synchronized+cultures+of+the+green+alga+Desmodesmus+quadricauda%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Completion of cell division is associated with maximum telomerase activity in naturally synchronized cultures of the green alga Desmodesmus quadricauda.</a> FEBS letters. 587, 743-748 (2013).</li>
<li>Rosner, M., Schipany, K., Hengstschlager, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merging+high-quality+biochemical+fractionation+with+a+refined+flow+cytometry+approach+to+monitor+nucleocytoplasmic+protein+expression+throughout+the+unperturbed+mammalian+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+protoc%22%5BJournal%5D)">Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle.</a> Nat protoc. 8, 602-626 (2013).</li>
<li>Banfalvi, G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21755438">Overview of cell synchronization.</a> Meth mol biol. 761, 1-23 (2011).</li>
<li>Langan, T. J., Rodgers, K. R., Chou, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+of+Mammalian+Cell+Cultures+by+Serum+Deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+mol+biol%22%5BJournal%5D)">Synchronization of Mammalian Cell Cultures by Serum Deprivation.</a> Meth mol biol. 1524, 97-105 (2017).</li>
<li>Dulla, K., Margalef, A. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21755441">Large-Scale Mitotic Cell Synchronization.</a> Meth mol biol. 1524, 65-74 (2017).</li>
<li>Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+control+in+the+early+embryonic+development+of+aquatic+animal+species%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+biochem+physiol+Toxicol%2Cpharmacol+CBP%22%5BJournal%5D)">Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species.</a> Comp biochem physiol Toxicol,pharmacol CBP. 178, 8-15 (2015).</li>
<li>Banfalvi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+synchronization+of+animal+cells+and+nuclei+by+centrifugal+elutriation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+protoc%22%5BJournal%5D)">Cell cycle synchronization of animal cells and nuclei by centrifugal elutriation.</a> Nat protoc. 3, 663-673 (2008).</li>
<li>Grosse, J., Meier, K., Bauer, T. J., Eilles, C., Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+separation+by+countercurrent+centrifugal+elutriation%3A+recent+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Prep+biochem%2Cbiotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell separation by countercurrent centrifugal elutriation: recent developments.</a> Prep biochem,biotechnol. 42, 217-233 (2012).</li>
<li>Smith, J., Manukyan, A., Hua, H., Dungrawala, H., Schneider, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronization+of+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+mol%22%5BJournal%5D)">Synchronization of Yeast.</a> Meth mol. 1524, 215-242 (2017).</li>
<li>Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+anti-mitotic+drugs+kill+cancer+cells%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+cell+sci%22%5BJournal%5D)">How do anti-mitotic drugs kill cancer cells?</a> J cell sci. 122, 2579-2585 (2009).</li>
<li>Manchado, E., Guillamot, M., Malumbres, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Killing+cells+by+targeting+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+death+diff%22%5BJournal%5D)">Killing cells by targeting mitosis.</a> Cell death diff. 19, 369-377 (2012).</li>
<li>Komlodi-Pasztor, E., Sackett, D., Wilkerson, J., Fojo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitosis+is+not+a+key+target+of+microtubule+agents+in+patient+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Clinic+oncol%22%5BJournal%5D)">Mitosis is not a key target of microtubule agents in patient tumors.</a> Nature reviews. Clinic oncol. 8, 244-250 (2011).</li>
<li>Furst, R., Vollmar, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+perspective+on+old+drugs%3A+non-mitotic+actions+of+tubulin-binding+drugs+play+a+major+role+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Die+Pharmazie%22%5BJournal%5D)">A new perspective on old drugs: non-mitotic actions of tubulin-binding drugs play a major role in cancer treatment.</a> Die Pharmazie. 68, 478-483 (2013).</li>
<li>Kothari, A., Hittelman, W. N., Chambers, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Cycle-Dependent+Mechanisms+Underlie+Vincristine-Induced+Death+of+Primary+Acute+Lymphoblastic+Leukemia+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+res%22%5BJournal%5D)">Cell Cycle-Dependent Mechanisms Underlie Vincristine-Induced Death of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells.</a> Cancer res. 76, 3553-3561 (2016).</li>
<li>Nijmeijer, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+primary+human+lymphoblastic+leukemia+cells+in+the+absence+of+serum+or+hematopoietic+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+hematol%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of primary human lymphoblastic leukemia cells in the absence of serum or hematopoietic growth factors.</a> Exp hematol. 37, 376-385 (2009).</li>
<li>Knudsen, E. S., Wang, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+mechanisms+for+the+inhibition+of+E2F+binding+to+RB+by+cyclin-dependent+kinase-mediated+RB+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Dual mechanisms for the inhibition of E2F binding to RB by cyclin-dependent kinase-mediated RB phosphorylation.</a> Mol Cell Bio. 17, 5771-5783 (1997).</li>
<li>Malumbres, M., Barbacid, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cyclin-dependent+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+biochem+sci%22%5BJournal%5D)">Mammalian cyclin-dependent kinases.</a> Trends biochem sci. 30, 630-641 (2005).</li>
<li>Liang, H., Hittelman, W., Nagarajan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitous+expression+and+cell+cycle+regulation+of+the+protein+kinase+PIM-1%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+biochem+biophys%22%5BJournal%5D)">Ubiquitous expression and cell cycle regulation of the protein kinase PIM-1.</a> Arch biochem biophys. 330, 259-265 (1996).</li>
<li>Sen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+gene+encoding+a+tRNA+synthetase-like+protein+is+enhanced+in+tumorigenic+human+myeloid+leukemia+cells+and+is+cell+cycle+stage-+and+differentiation-dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Expression of a gene encoding a tRNA synthetase-like protein is enhanced in tumorigenic human myeloid leukemia cells and is cell cycle stage- and differentiation-dependent.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 94, 6164-6169 (1997).</li>
<li>Ly, T., Endo, A., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+the+response+to+cell+cycle+arrests+in+human+myeloid+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of the response to cell cycle arrests in human myeloid leukemia cells.</a> eLife. 4, (2015).</li>
</ol>

Anisha Kothari pracuje obecnie na Wydziale Biologii Komórkowej i Molekularnej w Dziecięcym Szpitalu Badawczym św. Judy.

Opisaliśmy metodę otrzymywania pierwotnych komórek ALL w różnych fazach cyklu komórkowego za pomocą CCE. W optymalnych warunkach można łatwo uzyskać zasadniczo czystą populację komórek w fazie G1 i wysoce wzbogaconą populację komórek w fazach G2/M z doskonałą wydajnością, a w razie potrzeby można również uzyskać komórki wysoce wzbogacone w fazie S. Przedstawione tutaj wyniki uzyskano przy użyciu jednej pierwotnej hodowli ALL (w szczególności ALL-5) i zasadniczo identyczne wyniki uzyskano przy użyciu niezależnej hodowli, ...

Hodowane komórki zazwyczaj rosną asynchronicznie, a pojedyncze komórki są obecne w różnych fazach cyklu komórkowego. Niektóre organizmy wykazują naturalnie synchroniczne cykle komórkowe lub mogą być synchronizowane przez określone bodźce fizjologiczne. Na przykład jądra w gigantycznych plazmodiach śluzowca Physarum polycephalum dzielą się w wysoce synchroniczny sposób1, a komórki zielonych alg Desmodesmus quadricauda mogą być synchronizowane przez naprzemienne okresy światła i ciemności2. Chociaż takie organizmy oferują unikalne cechy eksperymentalne, nieodpowiednio modelują złożoność komórek ssaków. Zdolność do sztucznej synchronizacji populacji komórek ssaków ma kluczowe znaczenie dla pogłębienia naszej wiedzy na temat regulacji cyklu komórkowego i molekularnych podstaw punktów kontrolnych cyklu komórkowego. Typowe metody obejmują deprywację surowicy, blokowanie i uwalnianie substancji chemicznych lub wykorzystywanie cech fizycznych3,4. Wycofanie surowicy często powoduje, że komórki przechodzą w stan spoczynku, a ponowne dodanie surowicy sprzyja powrotnemu wejściu cyklu komórkowego w fazę G15. Inhibitory chemiczne obejmują czynniki takie jak nadmiar tymidyny lub hydroksymocznika, które blokują komórki na granicy G1/S, lub inhibitory mikrotubul, które zazwyczaj zatrzymują komórki w fazie M3,4. Podejścia, które wykorzystują cechy fizyczne, obejmują mitotyczne wytrząsanie, które może być wykorzystane do wzbogacenia komórek mitotycznych, ponieważ są one mniej przylegające niż komórki interfazowe6. Jednak wszystkie te techniki mają potencjalne wady. Na przykład nie wszystkie typy komórek zachowują żywotność przy braku surowicy lub obecności inhibitorów chemicznych, a wydajność komórek po mitotycznym wstrząsaniu jest ograniczona bez wcześniejszej synchronizacji z inhibitorami mitotycznymi.
Z wyjątkiem wczesnych cykli komórek embrionalnych, gdzie komórki stopniowo zmniejszają swój rozmiar w miarę podziału7, większość komórek przechodzących przez cykl przechodzi fazy wzrostu i staje się większa. Właściwość ta jest wykorzystywana w technice przeciwprądowej elutriacji odśrodkowej (CCE), która może być używana do rozdzielania komórek różniących się wielkością, a tym samym fazą cyklu komórkowego8,9. Podczas CCE komórki znajdują się pod wpływem dwóch przeciwstawnych sił: siły odśrodkowej, która odpycha komórki od osi obrotu, oraz prędkości płynu (przeciwprądu), która popycha komórki w kierunku osi obrotu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Komórki w komorze elutriacyjnej osiągają pozycję równowagi, w której siły te są równe. Kluczowymi czynnikami decydującymi o położeniu równowagi są średnica i gęstość komórki. Wraz ze wzrostem natężenia przepływu roztworu buforowego, a siła oporu przeciwprądowego przeważa nad siłą odśrodkową, ustanawiana jest nowa równowaga, powodująca zmianę położenia komórek wewnątrz komory. Wszystkie komórki są przesuwane w kierunku wyjścia z komory, w wyniku czego mniejsze komórki opuszczają komorę jako pierwsze, podczas gdy większe komórki pozostają w komorze, dopóki natężenie przeciwprądu nie wzrośnie wystarczająco, aby ułatwić ich wyjście. Komórki wydostające się z komory elutriacyjnej wraz z kolejnymi wzrostami szybkości przepływu przeciwprądowego mogą być zbierane w określonych frakcjach, a każda frakcja zawiera komórki o sekwencyjnie rosnących rozmiarach. Zamiast przeprowadzać elutriację ze stopniowym wzrostem natężenia przeciwprądu, sekwencyjne zmniejszanie siły odśrodkowej poprzez zmniejszanie prędkości wirowania przyniesie ten sam wynik. Proces elutriacji wymaga optymalizacji w zależności od typu komórki, zastosowanego bufora elutriacyjnego i zastosowanej aparatury. Szybkość sedymentacji komórek w tych warunkach najlepiej opisuje prawo Stokesa: SV = [d2(ρp-ρ m)/18η].ω2r, gdzie SV = prędkość sedymentacji; d = średnica cząstki; ρp = gęstość cząstki; ρm = gęstość bufora; η = lepkość buforu; ω = prędkość kątowa wirnika; i r = promieniowe położenie cząstki. Tak więc SV jest proporcjonalny do średnicy i gęstości komórki, a ponieważ średnica jest podniesiona do drugiej potęgi, przyczynia się bardziej niż gęstość, która jest na ogół stała przez cały cykl komórkowy.
Ważną zaletą CCE jest to, że komórki nie są poddawane ciężkim warunkom chemicznej obróbki lub deprywacji żywieniowej i mogą być odzyskiwane z doskonałą wydajnością, zasadniczo bez zakłóceń. Wymogiem jest, aby komórki, o których mowa, uległy znacznemu zwiększeniu średnicy, o co najmniej 30%, w miarę przechodzenia przez cykl komórkowy. Główną wadą jest koszt specjalistycznej wirówki, wirnika i akcesoriów. Niemniej jednak zdolność do przygotowania komórek wzbogaconych w określone fazy cyklu komórkowego przez CCE znacznie ułatwiła badania cyklu komórkowego w organizmach od drożdży po komórki ssaków9,10. Co więcej, ostatnie postępy rozszerzają zastosowania na oddzielanie komórek od zdrowej tkanki do tkanki nowotworowej, rozdzielanie różnych typów komórek w heterogenicznych mieszaninach oraz do produkcji określonych typów komórek do immunoterapii9.
Naszym głównym zainteresowaniem było zrozumienie mechanizmu działania środków celujących w mikrotubule (MTA), takich jak alkaloidy barwinka i taksany. Uważano, że leki te działają wyłącznie na mitozę, blokując funkcję mikrotubul wrzeciona11,12, ale ostatnie dowody sugerują, że mogą one również celować w mikrotubule międzyfazowe13,14. Niedawno informowaliśmy, że pierwotne komórki ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL) ulegają śmierci w fazie G1 lub w fazie M, gdy są leczone winkrystyną i innymi MTA w sposób zależny od cyklu komórkowego15. Zdolność do rozdzielenia WSZYSTKICH komórek na różne fazy cyklu komórkowego za pomocą CCE odegrała zasadniczą rolę w dojściu do tego wniosku. W tym artykule opisujemy szczegóły techniczne i oferujemy praktyczne wskazówki dotyczące zastosowania CCE do przygotowania pierwotnych komórek ALL w różnych fazach cyklu komórkowego.

<table><tbody><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanksa</td><td>Lonza</td><td>10-508Q</td><td>Butelka 1 L</td></tr><tr><td>Płod Plus Serum bydlęce</td><td>Atlas Biologicals</td><td>FP-0500-A</td><td>Butelka 500 ml</td></tr><tr><td>Kwas 2-naptol-6,8-disulfonowy Sól dipotasowa</td><td>Acros Organics</td><td>212-672-4</td><td>100 g proszek</td></tr><tr><td>50 ml probówki</td><td>Denville Scientifics</td><td>C1062-P</td><td>500/opakowanie</td></tr><tr><td>Membrana PES 0,22 &mikro; m jednostka filtrująca</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td>250 sztuk w opakowaniu</td></tr><tr><td>Avanti J-26S XPI z Elut. Non-IVD - 50/60 Hz, 200/208/240V</td><td>Wirówka Beckman Coulter</td><td>B14544</td><td>kompatybilna z systemem elutriacji</td></tr><tr><td>Zestaw wirnika elutriatora JE 5.0</td> Zestaw wirnika <td>Beckman Coulter</td><td>356900</td>, <td>który zawiera wirnik, klucz imbusowy z rękojeścią T, zespół szybkozłączki (bez komory elutriacyjnej), kotwiący i zestaw stroboskopowy</td></tr><tr><td>Komora, standardowa, 4 ml, "A"</td> <td>Beckman Coulter</td><td>356943</td><td>Standardowa komora elutriacyjna&nbsp;</td></tr><tr><td>Głowica pompy Masterflex L/S Easy-Load</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07518-10</td><td></td></tr><tr><td>Napęd o zmiennej prędkości Masterflex L/S</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07528-10</td><td></td></tr><tr><td>Silikonowa rurka do pompy Masterflex BioPharm utwardzana platyną, L/S 16</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-96420-16</td><td></td></tr><tr><td>25 G x 1,5 Igła Precision Glide</td><td>BD</td><td>305127</td><td>sterylne, jednorazowe igły</td></tr><tr><td>10 ml Luer-Lok strzykawka</td><td>BD</td><td>309604</td><td>sterylne, jednorazowe strzykawki</td></tr><tr><td>Vi-Cell XR</td><td>Beckman Coulter</td><td>383556</td><td></td></tr><tr><td>bufor do barwienia PI/RNazy</td><td>BD Pharmingen</td><td>550825</td><td>jodek propidyny/RNaza barwiący</td></tr><tr><td>bufor cyklina B1 (GNS1) mysie przeciwciało monoklonalne IgG</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-245</td><td></td></tr><tr><td>cyklina D1 (DCS-6) mysie przeciwciało monoklonalne IgG</td><td>Święty Mikołaj Cruz Biotechnology</td><td>sc-20044</td><td></td></tr><tr><td>P-Rb (S807/811) (D20B12) Przeciwciało monoklonalne królika XPR</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>8516s</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH (14C10) królicze przeciwciało monoklonalne</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>2118s</td><td></td></tr><tr><td>Kozioł anty-mysi koniugat IgG (H+L)-HRP</td><td>BioRad</td><td>170-6516</td><td></td></tr><tr><td>Kozioł anty-królik IgG (H+L)-HRP koniugat</td><td>BioRad</td><td>170-6515</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie pierwotnych komórek ostrej białaczki limfoblastycznej w różnych fazach cyklu komórkowego przez elutriację odśrodkową

Preparation of Primary Acute Lymphoblastic Leukemia Cells in Different Cell Cycle Phases by Centrifugal Elutriation

Zdolność do synchronizacji komórek była kluczowa dla naszego zrozumienia regulacji cyklu komórkowego. Powszechnie stosowane techniki obejmują deprywację surowicy; substancje chemiczne, które zatrzymują komórki w różnych fazach cyklu komórkowego; lub zastosowanie mitotycznego wstrząsu, który wykorzystuje ich zmniejszone przyleganie. Jednak wszystkie te rzeczy mają wady. Na przykład głód surowicy działa dobrze dla normalnych komórek, ale gorzej dla komórek nowotworowych z upośledzonymi punktami kontrolnymi cyklu komórkowego z powodu aktywacji onkogenu lub utraty supresorów guza. Podobnie, populacje komórek poddane działaniu substancji chemicznej mogą być siedliskiem uszkodzeń wywołanych przez leki i wykazywać zmiany związane ze stresem. Techniką, która pozwala obejść te problemy, jest przeciwprądowa elutriacja odśrodkowa (CCE), w której komórki są poddawane dwóm przeciwstawnym siłom, sile odśrodkowej i prędkości płynu, co skutkuje oddzieleniem komórek na podstawie wielkości i gęstości. Ponieważ komórki przechodzące przez cykl zazwyczaj się powiększają, CCE można wykorzystać do rozdzielenia komórek na różne fazy cyklu komórkowego. Tutaj stosujemy tę technikę do pierwotnych komórek ostrej białaczki limfoblastycznej. W optymalnych warunkach można uzyskać zasadniczo czystą populację komórek w fazie G1 i wysoce wzbogaconą populację komórek w fazach G2/M z doskonałą wydajnością. Te populacje komórek idealnie nadają się do badania zależnych od cyklu komórkowego mechanizmów działania leków przeciwnowotworowych oraz do innych zastosowań. Pokazujemy również, w jaki sposób modyfikacje standardowej procedury mogą prowadzić do nieoptymalnej wydajności i omawiamy ograniczenia tej techniki. Przedstawiona szczegółowa metodologia powinna ułatwić zastosowanie i zbadanie tej techniki w odniesieniu do innych typów komórek.

Pierwotne komórki ALL (3 - 4 x 108) poddano elutriacji odśrodkowej, zbierając je w dwóch frakcjach płukania oraz dwudziestu frakcjach głównych, zgodnie z opisanym protokołem. Tabela 1 przedstawia reprezentatywne dane, w których ukazano całkowitą liczbę komórek w każdej frakcji oraz odpowiadającą im prędkość rotora. Całkowita wydajność wynosiła zazwyczaj ponad 80%. Pomiar średnicy komórek w poszczególnych frakcjach potwierdził, że średnica komórek zwiększała się wraz z postępem ...

Ten protokół opisuje użycie elutriacji odśrodkowej do rozdzielania komórek pierwotnej ostrej białaczki limfoblastycznej na różne fazy cyklu komórkowego.

Przygotowanie pierwotnych komórek ostrej białaczki limfoblastycznej w różnych fazach cyklu komórkowego przez elutriację odśrodkową

The ability to synchronize cells has been central to advancing our understanding of cell cycle regulation. Common techniques employed include serum ...

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie komórek w różnych fazach cyklu komórkowego za pomocą elutriacji odśrodkowej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie terapii nowotworów. Ponieważ izolacja komórek w oddzielnych fazach pozwala na badanie zależnych od fazy skutków związków przeciwnowotworowych.Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na rozdzielenie komórek na określone fazy za pomocą właściwości fizycznych, a nie zaburzeń chemicznych. Aby rozpocząć eksperyment, zainstaluj zespół stroboskopowy w wirówce tak, aby przewód zasilający był wyprowadzony z komory przez port po lewej stronie. Wyreguluj lampę błyskową stroboskopową tak, aby zrównała się z viewokienko, gdy wirówka jest zamknięta.Zamocuj zespół na miejscu, dokręcając dwie z krzyżakowym w górnej części każdego wspornika. A następnie dokręcając skrzydełkowane w dolnej części wspornika. Podłącz przewód zasilający do portu zasilania stroboskopu, znajdującego się z tyłu wirówki.Następnie ustaw wirniki prosto w dół na piaście napędu wirówki i mocno zabezpiecz ją kluczem imbusowym z rękojeścią T. Następnie umieść zespół zawierający komorę elutriacyjną, przeciwwagę, zespół uszczelnienia

preparation-primary-acute-lymphoblastic-leukemia-cells-different-cell

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Ten film opisuje metodę przestrzennego rozdzielania trzech subpopulacji komórek białaczkowych: zawieszonych komórek białaczkowych swobodnie unoszących się w pożywce, jasnych komórek białaczkowych przylegających do powierzchni monowarstwy komórek mezenchymalnych zrębu oraz komórek białaczkowych ciemnych fazowo, które wyemigrowały pod monowarstwę mezenchymalnych komórek zrębu z kohodowli 2D.

Żniwa subpopulacji białaczkowej: metoda przestrzennego oddzielania subpopulacji komórek białaczkowych od kokultury 2D

Ten film opisuje technikę izolowania komórek przewlekłej białaczki limfocytowej (CLL) od krwi obwodowej. Dzięki temu protokołowi wyizolujemy komórki PBL z próbki krwi ludzkiego pacjenta w celu późniejszego wydajnego generowania frakcji jądrowych i cytoplazmatycznych.

Wirowanie w gradiencie gęstości: metoda izolowania komórek PBL z krwi obwodowej

Ten film opisuje przygotowanie frakcji subkomórkowych z komórek białaczkowych, co jest metodą generowania frakcji komórkowych i jądrowych z komórek białaczkowych. Frakcje jądrowe i cytoplazmatyczne można wykorzystać do dalszej analizy.

Przygotowanie frakcji subkomórkowych z komórek białaczkowych: metoda generowania frakcji komórkowych i jądrowych z komórek białaczkowych

Chromosomy mogą być izolowane z żywych komórek, takich jak limfocyty czy fibroblasty skóry, oraz z organizmów, w tym ludzi i myszy. Te preparaty chromosomowe mogą być dalej wykorzystywane do rutynowych prążków G i procedur cytogenetyki molekularnej, takich jak fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH), porównawcza hybrydyzacja genomowa (CGH) i kariotypowanie spektralne (SKY).

Przygotowanie chromosomów z hodowanych komórek

Obecny raport podsumowuje protokół, który może być wykorzystany do modelowania wpływu niszy mikrośrodowiska szpiku kostnego na komórki białaczkowe, kładąc nacisk na wzbogacenie najbardziej chemoodpornej subpopulacji.

Modelowanie białaczki opornej na chemioterapię in vitro

Neutrofile to najliczniejszy rodzaj białych krwinek. Opisano tutaj izolację neutrofili z krwi ludzkiej metodą separacji w gradinie gęstości i różnicowanie ludzkich komórek promielocytowych (HL60) wzdłuż szlaku granulocytarnego; w celu zbadania ich roli we wrażliwości komórek chłoniaka na leki przeciwchłoniakowe.

Izolacja i analiza neutrofili w celu określenia ich roli we wrażliwości komórek chłoniaka na środki terapeutyczne

Prosta metoda lizy czerwonych krwinek do tworzenia B-LCL została opracowana z wysoką efektywnością nieśmiertelności, wymagając niewielkiej ilości krwi i oszczędzając czas od inicjacji do krioprezerwacji.

Prosta metoda lizy krwinek czerwonych w celu ustalenia linii komórkowych limfoblastoidów B

Przewlekła białaczka limfocytowa (CLL) jest najczęstszą białaczką w zachodnim świecie. Czynniki transkrypcyjne NFAT są ważnymi regulatorami rozwoju i aktywacji w wielu typach komórek. W tym miejscu przedstawiamy protokół stosowania immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) w ludzkich komórkach PBL w celu identyfikacji nowych genów docelowych NFAT2.

Test immunoprecypitacji chromatyny w celu identyfikacji nowych genów docelowych NFAT2 w przewlekłej białaczce limfocytowej

Ten protokół umożliwia optymalizację i późniejsze efektywne generowanie frakcji jądrowych i cytoplazmatycznych z pierwotnych komórek przewlekłej białaczki limfocytowej. Próbki te są wykorzystywane do określenia lokalizacji białek, a także zmian w transporcie białek, które zachodzą między przedziałami jądrowymi i cytoplazmatycznymi po stymulacji komórek i leczeniu farmakologicznym.

Subkomórkowe frakcjonowanie pierwotnych komórek przewlekłej białaczki limfocytowej w celu monitorowania transportu białek jądrowych/cytoplazmatycznych

Protokół ten opisuje ksenoprzeszczep in ovo komórek ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL) pochodzących od pacjenta, który występuje 4 dni po wstrzyknięciu.

In Ovo Ksenografacja komórek ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL) (PDX-ALL)

Protokół ma na celu opisanie mysiego modelu generującego nawroty ostrej białaczki limfoblastycznej, oparty na dynamice odpowiedzi na chemioterapię indukcyjną.

Model myszy nawrotu białaczki do indukcyjnej chemioterapii ostrej białaczki limfoblastycznej

Poznaj metodę elutriacji odśrodkowej do izolacji pierwotnych komórek ostrej białaczki limfoblastycznej w różnych fazach cyklu komórkowego. Ta technika umożliwia badanie zależnych od fazy odpowiedzi na leki przeciwnowotworowe bez chemicznych perturbacji.

Przygotowanie pierwotnych komórek ostrej białaczki limfoblastycznej w różnych fazach cyklu komórkowego przez elutriację odśrodkową (Wideo) | JoVE Journal

Przygotowanie pierwotnych komórek ostrej białaczki limfoblastycznej w różnych fazach cyklu komórkowego przez elutriację odśrodkową

Przeglądaj więcej filmów