Przygotowanie pierwotnych komórek ostrej białaczki limfoblastycznej w różnych fazach cyklu komórkowego przez elutriację odśrodkową

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie komórek w różnych fazach cyklu komórkowego za pomocą elutriacji odśrodkowej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie terapii nowotworów. Ponieważ izolacja komórek w oddzielnych fazach pozwala na badanie zależnych od fazy skutków związków przeciwnowotworowych.

Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na rozdzielenie komórek na określone fazy za pomocą właściwości fizycznych, a nie zaburzeń chemicznych. Aby rozpocząć eksperyment, zainstaluj zespół stroboskopowy w wirówce tak, aby przewód zasilający był wyprowadzony z komory przez port po lewej stronie. Wyreguluj lampę błyskową stroboskopową tak, aby zrównała się z viewokienko, gdy wirówka jest zamknięta.

Zamocuj zespół na miejscu, dokręcając dwie z krzyżakowym w górnej części każdego wspornika. A następnie dokręcając skrzydełkowane w dolnej części wspornika. Podłącz przewód zasilający do portu zasilania stroboskopu, znajdującego się z tyłu wirówki.

Następnie ustaw wirniki prosto w dół na piaście napędu wirówki i mocno zabezpiecz ją kluczem imbusowym z rękojeścią T. Następnie umieść zespół zawierający komorę elutriacyjną, przeciwwagę, zespół uszczelnienia obrotowego i płytę montażową na wirniku. Dociśnij równomiernie, kładąc jedną rękę na komorze elutriacyjnej, a drugą na przeciwwadze, aż na wirniku zatrzasną się na swoim miejscu.

Umieść kołek znajdujący się na jednym końcu w otworze w zespole obrotowego uszczelnienia. I zabezpiecz otwór na oko na drugim końcu jedną ze z krzyżakowym, przymocowaną do wspornika, aby podłączyć kotwiący. Aby zmontować układ przepływowy, pompować bufor do i z komory elutriacyjnej, podłącz rurkę o rozmiarze 16 do pompy o zmiennej prędkości.

Przełóż jeden wolny koniec tej rurki przez port w lewym górnym rogu komory wirówki, tak aby wszedł do komory. Przymocuj złączkę do wolnego końca tej rurki, a następnie włóż złączkę do otworu wejściowego zespołu obrotowego uszczelnienia. Na koniec włóż rurkę wyjściową przez port, aby przymocować ją do rurki przesyłowej w górnej części zespołu obrotowego uszczelnienia.

Po zmontowaniu systemu elutriacji wysterylizuj go, umieszczając drugi wolny koniec rurki wejściowej w butelce o pojemności 500 mililitrów, wypełnionej 5% wybielaczem. I umieszczenie rurki wyjściowej w pustej litrowej butelce na odpady. Następnie włącz pompę i pozwól wybielaczowi przepłynąć przez cały system elutriacji, aż zostanie wypompowany do butelki na odpady.

Teraz włącz wirówkę i pozwól jej osiągnąć maksymalną wyznaczoną prędkość, aby uwolnić pęcherzyki i ciśnienie wsteczne. Po osiągnięciu ustawionej prędkości zatrzymaj wirówkę. Po całkowitym zatrzymaniu wirnika otwórz pokrywę i sprawdź, czy w komorze nie ma wycieków.

Następnie, w podobny sposób, jak opisano wcześniej, przepuszczaj sterylną wodę przez system przez 10 minut. Po przepłukaniu wodą zastąp zbiornik na wodę sterylną szklaną butelką wypełnioną 100 mililitrami buforu elucyjnego. Umieść rurkę wejściową w tej butelce, tak aby znajdowała się na samym dole.

Uruchom wirówkę i pozwól buforowi przepłynąć przez system. Po tym, jak butelka zbiornika jest prawie pusta, a woda zostanie całkowicie wypłukana z systemu, przenieś rurkę wyjściową z butelki na odpady do zbiornika, tak aby bufor był w sposób ciągły zawracany przez system. Na koniec włącz lampę stroboskopową i przekręć pokrętło elutriacji w skrajną lewą stronę.

Teraz wyreguluj viewokienko, powoli obracając pokrętło w prawo, tak aby komora elutriacyjna była wyraźnie widoczna, a światło stroboskopowe było zsynchronizowane z prędkością wirnika. Przygotuj próbkę komórki zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Dodać zawieszone komórki do butelki zbiornika zawierającej bufor elucyjny do recyklingu.

Pozwól komórkom wejść do systemu i osiągnąć równowagę w komorze elutriacyjnej. Aby upewnić się, że wszystkie komórki są zatrzymane w komorze, weź kroplę eluentu na szklane szkiełko i obejrzyj ją pod mikroskopem. Jeśli próbka jest pozbawiona nienaruszonych komórek, potwierdza to retencję w komorze.

Gdy wszystkie komórki wejdą do komory i widoczna jest wyraźna granica w najbielszej części komory, zawierająca komórki i równowagę, zacznij zbierać frakcje. Przenieś rurkę wyjściową do wstępnie schłodzonej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów, oznaczonej W1. Zbierz 50 mililitrów buforu elutryacyjnego w tej probówce i przechowuj na lodzie. Wkrótce po zebraniu frakcji W1 zmniejsz prędkość wirówki do 821 G. I przenieś rurkę wyjściową do stożkowej probówki, oznaczonej W2, i zbierz 50 mililitrów więcej przy tej prędkości.

Kontynuuj zmianę prędkości i zbieranie ułamków. Upewnij się, że w zbiorniku zbiornika znajduje się podłoże i zawsze przechowuj zebrane frakcje na lodzie. Po zebraniu wszystkich frakcji zatrzymaj wirówkę i zbierz 50 mililitrów w stożkowej probówce, oznaczonej jako stop.

Komórki osadkowe zebrane w każdej z frakcji i przy użyciu dalszej analizy, takiej jak cytometria przepływowa lub western blot, w zależności od potrzeb. Pokazany jest wykres liniowy przedstawiający średnią średnicę komórek w kolejnych frakcjach elutriacji. Należy zauważyć, że im większa średnica komórki, tym wyższa liczba frakcji, przy której eluuje.

Wyniki analizy sortowania komórek aktywowanych fluorescencyjnie pokazują zawartość DNA komórek w każdej z 20 frakcji elutriacji. Wczesne frakcje, od F1 do F5, zawierają prawie wyłącznie komórki o zawartości DNA 2N reprezentujące komórki w fazie G1. Mieszaninę komórek w fazach G1 i S zaobserwowano we frakcjach pośrednich, od F6 do F9. A komórki z zawartością 4N DNA, reprezentujące komórki od G2 do M, obserwowano począwszy od F10.

Pokazane tutaj są wyniki western blot z sondowania poziomów białek związanych z cyklem komórkowym w połączonych frakcjach komórek w fazie G1 i fazie G2 do M. Pula od G2 do M miała wyższe poziomy fosfo-Rb i cykliny B w porównaniu z pulą G1, zgodnie z oczekiwaniami. Sygnał cykliny D 1 był słaby, ale mimo to był wykrywalny w puli G1 i niewykrywalny w puli G2 do M.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby nie spieszyć się i upewnić się, że system elutriacji jest prawidłowo zmontowany, a wszystkie materiały i roztwory są przygotowane. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak analiza cyklu komórkowego, testy żywotności komórek i immunobloty, w celu zbadania, w jaki sposób związki terapeutyczne mogą działać w sposób zależny od fazy cyklu komórkowego.