Opracowanie testu do oznaczania ilościowego wysokiej zawartości zmutowanego białka Sod1 w tworzeniu agregatów w żywych komórkach

Ogólnym celem tego eksperymentu jest opracowanie testu do badania wpływu małych cząsteczek na modulowanie agregacji nieprawidłowo sfałdowanych białek w sposób zależny od czasu i dawki. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące rozwoju testu komórkowego i jest stosowana w technikach przesiewowych o wysokiej zawartości. Główną zaletą tej techniki jest zapewnienie prostej metody wykrywania i ilościowego określania agregacji białek występującej w kilku zaburzeniach neurodegeneracyjnych.

Implikacje tej techniki rozciągają się na potencjalną terapię chorób neurodegeneracyjnych, takich jak ALS, ponieważ proponuje prostą metodę, która pozwala na opracowanie testu komórkowego i przeprowadzenie badań przesiewowych w kierunku moderatorów małych cząsteczek. Aby rozpocząć produkcję wirusa, przed transfekcją plazmidu należy rozszczepić limfocyty T HEK-293 przy 30 do 40% konfluencji w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli tkankowej i 10 mililitrach pożywki do hodowli komórkowej. Inkubuj płytkę hodowlaną w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc.

Następnego dnia przygotuj roztwór do transfekcji DNA z opakowaniem plazmidów wektora lentiwirusowego, 125 mikrolitrów jednego molowego chlorku wapnia i dodaj wodę destylowaną, aby dostosować objętość do 500 mikrolitrów. Delikatnie dodaj 500 mikrolitrów 0,05 molowego buforu HEPS i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie zastąp pożywkę z komórek T HEK-293 10 mililitrami, wstępnie podgrzaną, wolną od antybiotyków, świeżą pożywką hodowlaną zmieszaną z jednym mililitrem roztworu do transfekcji DNA.

Inkubować w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez noc. Następnego dnia zastąpić supernatent komórek świeżą pożywką hodowlaną i ponownie inkubować przez noc. Na koniec następnego dnia zbierz supernatent i przenieś do 15-mililitrowej probówki.

Aby usunąć martwe komórki i zanieczyszczenia, odwiruj probówkę o sile 500 g przez pięć minut. Aby jeszcze bardziej oczyścić supernatent, przepuść go przez filtr 0,45 mikrometra za pomocą 60-mililitrowej strzykawki. Następnie natychmiast dozować przefiltrowany supernatent do 300-mikrolitrowych porcji jednorazowego użytku.

Aby przygotować komórki do transdukcji, podziel je tak, aby zostały zakażone przy 60% konfluencji na sześciodołkowej płytce do hodowli tkankowej w dwóch mililitrach DMAM uzupełnionego 10% FBS. Inkubuj komórki w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza w temperaturze 5% dwutlenku węgla przez noc. Następnego dnia rozmrozić na lodzie jedną porcję zamrożonego lentiwirusa na każde użycie.

W międzyczasie ogrzej pożywkę do hodowli komórkowych zawierającą surowicę zgodną z linią komórkową będącą przedmiotem zainteresowania. Po całkowitym rozmrożeniu wirusa rozcieńczyć go w DMEM w nowych 1,5-mililitrowych mikroprobówkach wirówkowych. Następnie dostosuj objętość do jednego mililitra ze zmniejszoną pożywką surowicy.

Następnie dodać dwa mikrolitry polibrenu do jednego mililitra wirusa na pożywkę i dobrze wymieszać przez pipetowanie. Dodaj jeden mililitr tej mieszaniny do komórek i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Po inkubacji należy usunąć pożywkę zawierającą wirusa i zastąpić ją zwykłym DMEM uzupełnionym 10% FBS i zwrócić komórki do inkubatora.

Monitoruj wzrost komórek i zmieniaj pożywkę co dwa dni Gdy komórki osiągną zbieg, rozszerz każdą studzienkę sześciodołkowego naczynia na 10-centymetrową płytkę do hodowli tkankowej. Przenieś płytki do inkubatora. Na koniec zaoszczędź 1,5 razy 10 do 4 komórek na studzienkę i 50 mikrolitrów DMEM na 384 płytkach testowych.

Następnie sprawdź poziom ekspresji białka znakowanego YFP pod mikroskopem. Jeśli wyrażenie pokazuje stosunek sygnału do szumu równy lub większy niż trzy, przygotuj zapas komórek dla odpowiedniej linii komórek. W celu przeniesienia związku, na 384-dołkowej płytce polipropylenowej do przechowywania, dodać seryjne rozcieńczenia związków w standardowej serii rozcieńczeń od jednego do trzech.

Następnie, za pomocą płynnego urządzenia wyposażonego w 384-kapilarną głowicę, rozprowadź 0,25 mikrolitra inhibitorów proteasomu na pustych, płaskodennych czarnych 384-dołkowych płytkach testowych. Następnie wysiewaj 1,5 razy 10 do 4 komórek na tych płytkach. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez 24 godziny.

Przed obrazowaniem linii komórkowej poddanej działaniu inhibitorów proteasomu należy dodać 10 mikrolitrów wstępnie podgrzanego DMEM z roztworem barwiącym i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po barwieniu uruchom oprogramowanie do obsługi automatycznego mikroskopu, wybierając zakładkę mikroskopu. Najpierw należy wybrać zakładkę konfiguracja, a następnie wybrać obiektyw 20 razy w odpowiednim typie płyty.

Aby umożliwić prawidłowe ustawienie ostrości na różnych typach płyt, upewnij się, że rozmówca jest ustawiony na właściwą wartość obiektywu. Następnie wybierz ekspozycję pierwszą. Ustaw wysokość ostrości na zero mikrometrów, a następnie wybierz ostrość.

Po ustawieniu ostrości naświetl aparat jeden. Aby zoptymalizować płaszczyznę ekspozycji, dostosuj wysokość ostrości i kliknij opcję Weź wysokość. Zmień czasy naświetlania i moc lasera, aby uzyskać maksymalną intensywność pikseli około 3000 i zapisz parametry ekspozycji.

Wybierz kartę definicji eksperymentu, utwórz układ i układ podrzędny. Następnie przeciągnij i upuść odpowiednią ekspozycję układu, obraz referencyjny, plik kadrowania pochylenia i układ podrzędny. Następnie zapisz eksperyment.

Na koniec wybierz zakładkę automatycznego eksperymentu i uzyskaj obrazy. W przypadku obrazów dwukanałowych należy najpierw wybrać algorytm oprogramowania, aby podzielić na segmenty obiekty podstawowe, takie jak jądra, cytozol i agregaty. Najpierw rozprowadź 0,25 mikrolitra inhibitora proteasomu rozpuszczonego w 100% DMSO lub DMSO na 384-dołkowych płytkach z płaskim dnem.

Na tej samej płytce ręcznie wysiewaj 1,5 razy 10 do 4 komórek na dołek w 50 mikrolitrach DMEM. Następnie ustaw jednostkę kontroli środowiska systemu mikroskopu na 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Używaj mikroskopu w trybie fluorescencji szerokokątnej i jako ustawienia oprogramowania wybierz LWD 20-krotny obiektyw w trybie niekonfokalnym, cztery pola na studzienkę i interwał przechwytywania wynoszący jedną godzinę.

Następnie wybierz odpowiedni algorytm do segmentacji obiektu podstawowego, takiego jak cytozol i agregaty. W razie potrzeby dostosuj parametry progu tła i kontrastu. Badane linie komórkowe transdukowane za pomocą SOD-1 typu dzikiego i mutanta SOD-1 A4V pozostały zdrowe, wykazywały wysoki poziom ekspresji i długotrwałe szerokie znakowanie phi niezależnie od formy SOD.

Leczenie inhibitorem proteasomu ALLN przez 24 godziny sprzyjało akumulacji agregatów SOD-1 A4V YFP w komórkach HEK-293, ale nie w komórkach transdukowanych SOD-1 typu dzikiego YFP. Ponadto stwierdzono bardzo niski poziom agregacji w liniach komórkowych U2 OS i SH-SY5Y SOD-1 A4V YFP transdukowanych tymi samymi wektorami. Po wysianiu komórek w obecności lub bez ALLN monitorowano je pod kątem tworzenia się agregatów przez okres 50 godzin.

Formacja agregatów ALLN osiągnęła plateau po 24 godzinach i pozostała stabilna przez następne 12 godzin. Ponadto gęstość komórek znacznie zmniejszyła się po 28 godzinach w wyniku cytotoksycznego działania ALLN, podczas gdy liczba komórek wzrosła w kontroli negatywnej traktowanej DMSO. Komórki SOD-1 A4V YFP hodowane w obecności inhibitorów proteasomu przez 24 godziny barwiono roztworem Hoechsta.

Względną toksyczność dla trzech różnych inhibitorów proteasomu policzono poprzez pomiar liczby przylegających linii komórkowych pozostających w studni znakowanej barwnikiem Hoechst. Całkowita liczba komórek zmniejszyła się w odpowiedzi na zwiększoną dawkę inhibitorów proteazy. I odwrotnie, odsetek komórek wykazujących ekspresję agregatów SOD-1 A4V wzrastał wraz ze stężeniem inhibitora proteazy.

Podczas wykonywania tego procesu należy pamiętać, że jakość ogniw drastycznie wpłynie na wynik. Dlatego ważne jest, aby ustalić, czy komórki są wolne od mikroplazmy i są zdrowe na wszystkich etapach. Po tym procesie można zastosować inną metodę obrazowania, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące degradacji białka lub interakcji białka z innymi za pomocą rezonansowego transferu energii.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować narzędzia do testowania losu białka w wielu żywych komórkach za pomocą analizy obrazu o wysokiej zawartości. Tak więc ta metoda może zapewnić wgląd w agregację białek, tak jak zachodzi ona w prostych modelach komórkowych. Może być również stosowany do innych systemów, takich jak neurony różnicowane od indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych specyficznych dla pacjenta.