Name: Opracowanie testu do oznaczania ilościowego wysokiej zawartości zmutowanego białka Sod1 w tworzeniu agregatów w żywych komórkach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-04T12:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Poznaj metodę ilościowego oznaczania agregacji białka SOD1 w komórkach HEK-293 przy użyciu obrazowania konfokalnego. Technika umożliwia badanie wpływu małych cząsteczek na agregację białek w chorobach neurodegeneracyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta grantem ufundowanym przez rząd koreański (MSIP) (NRF-2014K1A4A7A01074642) oraz program wsparcia indywidualnych naukowców National Research Foundation of Korea (NRF) (NRF-2013M3A9B5076486/NRF-2015R1D1A1A09057239).

1. Produkcja lentiwirusa
UWAGA: Produkcja i manipulacja wektorami lentiwirusowymi została przeprowadzona zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health (NIH) dotyczącymi badań z wykorzystaniem rekombinowanego DNA. Plazmid kodujący zmutowany SOD1 typu dzikiego i A4V oznaczony wzmocnionym YFP (SOD1WT-YFP i SOD1A4V-YFP) opisano w Kim i wsp. 11 Oba produkty fuzji genów zostały amplifikowane przy użyciu pary starterów PCR 5′-ATCGTCTAGACACCATGGCGACGAAGGTCGTGTGC-3′′ i 5′-TAGCGG CCGCTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3′′ i wstawione do plazmidu CMV pTRIP-delta U319 przy użyciu miejsc restrykcyjnych XhoI i BsrGI. We wcześniejszych eksperymentach komórki HEK-293T dzielono w stosunku 1:4 do 1:6 co dwa dni. Unikanie więcej niż 20 przejść i utrzymywanie komórek przy konfluencji mniejszej niż 60% pomaga zapewnić dobrą wydajność transfekcji.
<ol>
	<li>W dniu 1 rozdrobnić komórki HEK-293T przy 30-40% zbiegu na płytce do hodowli tkankowej o średnicy 10 cm (3 x 106 komórek / naczynie) w 10 ml pożywki do hodowli komórkowej (DMEM o wysokiej zawartości glukozy z 10% FBS i 4 mM L-glutaminy) w celu produkcji wirusa.</li>
	<li>Płytkę do hodowli tkankowej o średnicy 10 cm należy przechowywać przez noc w inkubatorze CO2 (37 °C, 5% CO2 ).</li>
	<li>W dniu 2 przygotuj roztwór do transfekcji DNA zawierający 10 μg wektorów lentiwirusowych (pTRIP-delta U3 CMV - SOD1WT-YFP lub -SOD1A4V-YFP) wraz z plazmidami pakującymi lentiwirusa (5 μg pVSVg; 10 μg pCMV-dR8.71) (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A)20. Dodać 125 μl z 1 M CaCl2 i dostosować objętość do 500 μl za pomocą wody destylowanej. Delikatnie dodaj 500 μl 0,05 M HEPES do mieszaniny i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zastąp pożywkę komórkową HEK-293T 10 ml wstępnie podgrzaną świeżą pożywką hodowlaną, bez antybiotyków, zmieszaną z 1 ml roztworu do transfekcji DNA i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
	<li>W dniu 3 zastąpić supernatant komórek świeżą pożywką hodowlaną.</li>
	<li>W dniu 4 zebrać supernatant do probówki o pojemności 15 ml i wirować przez 5 minut przy 500 x g, aby usunąć martwe komórki i zanieczyszczenia. Dalej oczyść supernatant, przepuszczając go przez filtr 0,45 μm za pomocą dużej strzykawki o pojemności 60 ml. Natychmiast rozlać do jednorazowych porcji (300 μl) i przechowywać w temperaturze -80 °C. Aby utrzymać maksymalną aktywność produktu, unikaj cyklu zamrażania i rozmrażania.</li>
</ol>
2. Transdukcja lentiwirusowa
<ol>
	<li>Podziel linię komórkową, która ma być zakażona przy 60% zbieganiu (komórki HEK-293 i SH-SY5Y; 5 x 105 komórek na dołek i U2OS; 1 x 105 komórek na dołek) na 6-dołkowej płytce do hodowli tkankowej w 2 ml pożywki DMEM uzupełnionej 10% FBS.</li>
	<li>Przechowywać przez noc 6-dołkową płytkę do hodowli tkankowej w inkubatorze o temperaturze 37 °C w temperaturze 5% CO2 . </li>
	<li>Wyjąć zamrożonego lentiwirusa z zamrażarki w temperaturze -80 °C i rozmrozić porcję na lodzie przed każdym użyciem; nie zamrażać ponownie.</li>
	<li>Podczas rozmrażania wirusa należy ogrzać pożywkę do hodowli komórkowej zawierającą surowicę zgodną z linią komórkową będącą przedmiotem zainteresowania. Po całkowitym rozmrożeniu wirusa przygotuj szereg rozcieńczeń (1:3, 1:10, 1:30 i 1:100) w DMEM w świeżej probówce do mikrofuge o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Zwiększyć objętość w probówkach do 1 ml za pomocą zredukowanej pożywki surowicy.</li>
	<li>Dodać 2 μl polibrenu (w zapasie 4 μg/μl) do 1 ml wirusa/pożywki. Dobrze wymieszać pipetując i dodać 1 ml mieszaniny do komórek. Inkubować komórki z wirusem przez 24 godziny.</li>
	<li>Usuń nośnik wirusa i zastąp go zwykłym nośnikiem DMEM uzupełnionym 10% FBS. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
	<li>Monitoruj wzrost komórek i zmieniaj pożywkę hodowlaną co dwa dni. Przy zbieganiu rozszerz 6-dołkową półkę na płytkę do hodowli tkankowej o średnicy 10 cm.</li>
	<li>Gdy komórki zostaną wystarczająco rozprężone, wysiewaj 1,5 x 104 komórki na basenik w 50 μl pożywki DMEM na 384-dołkowych płytkach testowych, aby sprawdzić poziom ekspresji białka znakowanego YFP za pomocą mikroskopii. Jeśli ekspresja komórki białkowej znakowanej YFP wykazuje stosunek sygnału do szumu ≥3, przygotuj zapas komórek dla odpowiedniej linii komórkowej.</li>
</ol>
3. Zależny od czasu wpływ inhibitora proteasomu na agregację białek
UWAGA: Wykonaj akwizycję obrazu za pomocą automatycznego mikroskopu (zobacz Materiały).
<ol>
	<li>Dozuj 0,25 μl DMSO lub inhibitora proteasomu rozpuszczonego w 100% DMSO (ALLN, 2 mM) na 384-dołkowe płytki o płaskim dnie.</li>
	<li>Ręcznie wysiewać 1,5 x 104 komórek na studzienkę w 50 μl pożywki DMEM na tej samej płytce testowej. Końcowe stężenie inhibitora proteasomu (ALLN) powinno wynosić 10 μM.</li>
	<li>Ustawić jednostkę kontroli środowiska systemu mikroskopu na 37 °C i 5% CO2 . Zrzut ekranu z eksperymentalną konfiguracją jest pokazany w Rysunek 3.</li>
	<li>Mikroskop należy obsługiwać w trybie fluorescencji szerokokątnej, korzystając z oprogramowania z następującymi ustawieniami: obiektyw LWD 20X, tryb niekonfokalny, 4 pola/studzienkę, z godzinnym interwałem rejestrowania. Na końcu każdego uruchomienia przechwycone obrazy są automatycznie przesyłane na serwer.</li>
</ol>
4. Obrazowanie poklatkowe dla ekspresji YFP w żywych komórkach i analiza obrazu (pojedynczy kanał)
UWAGA: Poniższe kroki opisują zastosowanie oprogramowania (np. Columbus).
<ol>
	<li>Wybierz odpowiedni algorytm do segmentacji obiektów podstawowych (cytozolu i agregatów). W razie potrzeby dostosuj próg tła i parametry kontrastu (Rysunek 4).</li>
	<li>Policz komórki za pomocą funkcji "znajdź komórki" z indywidualnym progiem 0,1 dla kanału intensywności YFP. Określ wartości zagregowane za pomocą algorytmu "znajdź plamki" ze względną intensywnością plamki YFP >0,2 i współczynnikiem podziału 1,0.</li>
</ol>
5. Wpływ inhibitorów proteasomu na agregację białek na żywych komórkach barwionych na ich jądra (dwa kanały)
UWAGA: Wykonaj akwizycję obrazu za pomocą automatycznego mikroskopu. Określ zakres stężeń inhibitorów proteasomu (ALLN, epoksomycyna i MG132) w oparciu o oczekiwaną wartość IC50, aby zapewnić optymalne dopasowanie krzywej.
<ol>
	<li>Przygotować seryjne rozcieńczenia związków na 384-dołkowej płytce polipropylenowej do przechowywania według standardowej serii rozcieńczeń 1:3. Upewnij się, że dobrze wymieszałeś rozcieńczenia związków, aby upewnić się, że stężenia związków są dokładne.</li>
	<li>Dozować 0,25 μl inhibitorów proteasomu na puste, płaskie, czarne 384-dołkowe płytki testowe. Używamy maszyny do obsługi cieczy wyposażonej w głowicę kapilarną 384 zdolną do przenoszenia objętości.</li>
	<li>Wysiew 1,5 x 104 komórki na studzienkę w 50 μl pożywki DMEM na płytkach testowych. Inkubować płytki do oznaczania w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 24 godziny.</li>
	<li>Dodać 10 μl pożywki DMEM (wstępnie podgrzanej w temperaturze 37 °C) z roztworem barwiącym (Hoechst 33342 przy zapasie 10 mg/ml) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Uruchom oprogramowanie operacyjne mikroskopu. Zrzut ekranu przedstawiający konfigurację eksperymentalną jest pokazany w Rysunek 6. Wybierz zakładkę "Konfiguracja" i wybierz obiektyw 20X oraz odpowiedni typ płytki. Upewnij się, że "kołnierz" jest ustawiony na odpowiednią wartość na obiektywie, co pozwala na prawidłowe ustawienie ostrości przy różnych typach płytek.</li>
	<li>Wybierz zakładkę "Mikroskop". Zdefiniuj ekspozycję 1 jako YFP (laser 488), a ekspozycję 2 jako Hoechst (laser 405). Aktywuj filtr dla obu ekspozycji i przypisz ekspozycję 1 do kamery 1 i ekspozycję 2 do kamery 2. Ustaw czasy naświetlania na ~800 ms dla ekspozycji 1 i ~40 ms dla ekspozycji 2.</li>
	<li>Wybierz ekspozycję 1. Ustaw wysokość ostrości na 0 μm. Wybierz "Ostrość". Po ustawieniu ostrości naświetl aparat 1. Dostosuj wysokość ostrości, aby zoptymalizować płaszczyznę ekspozycji i kliknij "Weź wysokość". Zmień czasy naświetlania i moc lasera, aby uzyskać maksymalną intensywność pikseli ~3,000. Zapisz parametry ekspozycji. Powtórz te czynności dla ekspozycji 2.</li>
	<li>Wybierz kartę "Definicja eksperymentu". Utwórz układ i układ podrzędny. Przeciągnij i upuść odpowiedni układ, ekspozycję, obraz referencyjny, plik pochylenia i podukład. Zapisz eksperyment.</li>
	<li>Wybierz zakładkę "Automatyczny eksperyment" i uzyskaj obrazy. Na końcu każdego uruchomienia przechwycone obrazy są automatycznie przesyłane na serwer.</li>
</ol>
6. Analiza obrazu dwóch kanałów
<ol>
	<li>Wybierz algorytm oprogramowania do segmentacji obiektów podstawowych (jąder, cytozolu i agregatów) (<silna klasa="xfig">Rysunek 7).</li>
	<li>Wybierz metodę, która dokładnie segmentuje jądra poprzez oględziny segmentowanych obiektów. Obiekty barwione metodą Hoechsta w kanale 1 (Ch1) zostaną użyte do określenia liczby komórek. Barwienie YFP ze zmutowanego SOD1-A4V w kanale 2 (Ch2) zostanie wykorzystane do określenia ilości agregatów.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą algorytmu "znajdź jądra" jako obszary barwienia Hoechsta >20 μm2, ze współczynnikiem podziału 7,0, indywidualnym progiem 0,40 i kontrastem >0,10.</li>
	<li>Utwórz tabelę danych i określ EC50 dla każdego ze związków, korzystając z równania "Regresja nieliniowa" w oprogramowaniu do tworzenia wykresów.</li>
</ol>

<ol><li>Schulte, J., Sepp, K. J., Wu, C., Hong, P., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+chemical+and+rnai+screens+for+suppressors+of+neurotoxicity+in+a+huntington%27s+disease+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">High-content chemical and rnai screens for suppressors of neurotoxicity in a huntington's disease model.</a> PLoS ONE. 6 (8), e23841(2011).</li>
<li>Honarnejad, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+implementation+of+a+high-throughput+compound+screening+assay+for+targeting+disrupted+ER+calcium+homeostasis+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Development and implementation of a high-throughput compound screening assay for targeting disrupted ER calcium homeostasis in Alzheimer's disease.</a> PLoS ONE. 8 (11), 1-12 (2013).</li>
<li>Burkhardt, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cellular+model+for+sporadic+ALS+using+patient-derived+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A cellular model for sporadic ALS using patient-derived induced pluripotent stem cells.</a> Mol Cell Neurosci. 56, 355-364 (2013).</li>
<li>Mattiazzi, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Content+Screening+for+Quantitative+Cell+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">High-Content Screening for Quantitative Cell Biology.</a> Trends Cell Biol. 26 (8), 598-611 (2016).</li>
<li>Kato, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyotrophic+lateral+sclerosis+models+and+human+neuropathology%3A+Similarities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Amyotrophic lateral sclerosis models and human neuropathology: Similarities and differences.</a> Acta Neuropathologica. 115 (1), 97-114 (2008).</li>
<li>Strong, M. J., Kesavapany, S., Pant, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathobiology+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%3A+a+proteinopathy%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+neuropathol+exp+neurol%22%5BJournal%5D)">The pathobiology of amyotrophic lateral sclerosis: a proteinopathy?</a> J neuropathol exp neurol. 64 (8), 649-664 (2005).</li>
<li>Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Charcot+to+Lou+Gehrig%3A+deciphering+selective+motor+neuron+death+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS.</a> Nat rev Neurosci. 2 (11), 806-819 (2001).</li>
<li>Bruijn, L. I., Miller, T. M., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+Mechanisms+Involved+in+Motor+Neuron+Degeneration+in+Als%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Unraveling the Mechanisms Involved in Motor Neuron Degeneration in Als.</a> Annu Rev Neurosci. 27 (1), 723-749 (2004).</li>
<li>Vassall, K. a, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+stability+and+increased+formation+of+soluble+aggregates+by+immature+superoxide+dismutase+do+not+account+for+disease+severity+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Decreased stability and increased formation of soluble aggregates by immature superoxide dismutase do not account for disease severity in ALS.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (6), 2210-2215 (2011).</li>
<li>Hwang, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonamyloid+aggregates+arising+from+mature+copper%2Fzinc+superoxide+dismutases+resemble+those+observed+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonamyloid aggregates arising from mature copper/zinc superoxide dismutases resemble those observed in amyotrophic lateral sclerosis.</a> J Biol Chem. 285 (53), 41701-41711 (2010).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimerization%2C+Oligomerization%2C+and+Aggregation+of+Human+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis+Copper%2FZinc+Superoxide+Dismutase+1+Protein+Mutant+Forms+in+Live+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Dimerization, Oligomerization, and Aggregation of Human Amyotrophic Lateral Sclerosis Copper/Zinc Superoxide Dismutase 1 Protein Mutant Forms in Live Cells.</a> J Biol Chem. 289 (21), 15094-15103 (2014).</li>
<li>Shaw, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergent-insoluble+aggregates+associated+with+amyotrophic+lateral+sclerosis+in+transgenic+mice+contain+primarily+full-length%2C+unmodified+superoxide+dismutase-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Detergent-insoluble aggregates associated with amyotrophic lateral sclerosis in transgenic mice contain primarily full-length, unmodified superoxide dismutase-1.</a> J Biol Chem. 283 (13), 8340-8350 (2008).</li>
<li>Banci, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOD1+and+amyotrophic+lateral+sclerosis%3A+Mutations+and+oligomerization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">SOD1 and amyotrophic lateral sclerosis: Mutations and oligomerization.</a> PLoS ONE. 3 (2), 1-8 (2008).</li>
<li>Johnston, J. a, Dalton, M. J., Gurney, M. E., Kopito, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+high+molecular+weight+complexes+of+mutant+Cu%2C+Zn-superoxide+dismutase+in+a+mouse+model+for+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Formation of high molecular weight complexes of mutant Cu, Zn-superoxide dismutase in a mouse model for familial amyotrophic lateral sclerosis.</a> Proc Natl Acad Sci. 97 (23), 12571-12576 (2000).</li>
<li>Niwa, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disulfide+bond+mediates+aggregation%2C+toxicity%2C+and+ubiquitylation+of+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis-linked+mutant+SOD1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Disulfide bond mediates aggregation, toxicity, and ubiquitylation of familial amyotrophic lateral sclerosis-linked mutant SOD1.</a> J Biol Chem. 282 (38), 28087-28095 (2007).</li>
<li>Juneja, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognosis+in+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis%3A+progression+and+survival+in+patients+with+glu100gly+and+ala4val+mutations+in+Cu%2CZn+superoxide+dismutase%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Prognosis in familial amyotrophic lateral sclerosis: progression and survival in patients with glu100gly and ala4val mutations in Cu,Zn superoxide dismutase.</a> Neurology. 48 (1), 55-57 (1997).</li>
<li>Kaur, S. J., McKeown, S. R., Rashid, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+SOD1+mediated+pathogenesis+of+Amyotrophic+Lateral+Sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Mutant SOD1 mediated pathogenesis of Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> Gene. 577 (2), 109-118 (2016).</li>
<li>de Bruyns, A., Geiling, B., Dankort, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Modular+Lentiviral+Vectors+for+Effective+Gene+Expression+and+Knockdown%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Construction of Modular Lentiviral Vectors for Effective Gene Expression and Knockdown.</a> Methods Mol Biol. 1448, 3-21 (2016).</li>
<li>Sirven, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Transgene+Expression+in+Cord+Blood+CD34%2B-Derived+Hematopoietic+Cells%2C+Including+Developing+T+Cells+and+NOD%2FSCID+Mouse+Repopulating+Cells%2C+Following+Transduction+with+Modified+TRIP+Lentiviral+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Enhanced Transgene Expression in Cord Blood CD34+-Derived Hematopoietic Cells, Including Developing T Cells and NOD/SCID Mouse Repopulating Cells, Following Transduction with Modified TRIP Lentiviral Vectors.</a> Mol Ther. 3 (4), 438-448 (2001).</li>
<li>Wu, C., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-titre+retroviral+vector+system+for+efficient+gene+delivery+into+human+and+mouse+cells+of+haematopoietic+and+lymphocytic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22J+gen+virol%22%5BJournal%5D)">High-titre retroviral vector system for efficient gene delivery into human and mouse cells of haematopoietic and lymphocytic lineages.</a> J gen virol. 91 (Pt 8), 1909-1918 (2010).</li>
<li>Irshad, H., Veillard, A., Roux, L., Racoceanu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+nuclei+detection%2C+segmentation%2C+and+classification+in+digital+histopathology%3A+A+review-current+status+and+future+potential%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Methods for nuclei detection, segmentation, and classification in digital histopathology: A review-current status and future potential.</a> IEEE Rev Biomed Eng. 7, 97-114 (2014).</li>
<li>Purschke, M., Rubio, N., Held, K. D., Redmond, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototoxicity+of+Hoechst+33342+in+time-lapse+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol+Sci%22%5BJournal%5D)">Phototoxicity of Hoechst 33342 in time-lapse fluorescence microscopy.</a> Photochem Photobiol Sci. 9 (12), 1634-1639 (2010).</li>
<li>Jaskova, K., Pavlovicova, M., Jurkovicova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+transporters+and+their+role+in+the+development+of+neuronal+disease+and+neuronal+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+physiol+biophys%22%5BJournal%5D)">Calcium transporters and their role in the development of neuronal disease and neuronal damage.</a> Gen physiol biophys. 31 (4), 375-382 (2012).</li>
<li>Kieran, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+with+arimoclomol%2C+a+coinducer+of+heat+shock+proteins%2C+delays+disease+progression+in+ALS+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Treatment with arimoclomol, a coinducer of heat shock proteins, delays disease progression in ALS mice.</a> Nat Med. 10 (4), 402-405 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Istnieją dwa główne podejścia do generowania stabilnych linii komórkowych. Pierwszy trwa kilka tygodni i wymaga przejściowej transfekcji i selekcji oporności genomowych zintegrowanych wektorów plazmidowego DNA. Drugi zajmuje kilka godzin dzięki zastosowaniu lentiwirusa, dzięki czemu protokół ten jest podatny na skuteczną ekspresję białka docelowego w wielu liniach komórkowych przy ograniczonym wysiłku. Wektor19 TRIP-CMV był trwałym wektorem do użycia, o zachowanej wydajności transdukcji i stabilne...

Agregacja białek to proces biologiczny, w którym nieprawidłowo sfałdowane białka grupują się i mogą działać jako czynniki sprawcze w chorobach neurodegeneracyjnych (amyloidoza). Scharakteryzowanie agregacji białek ma zasadnicze znaczenie dla zrozumienia roli agregatów w dysfunkcji komórkowej, a także dla ułatwienia odkrycia nowych czynników, które wpływają na początek patologii. Wizualizacja białek znakowanych fluorescencyjnie w żywych komórkach jest potężną metodą, która może pomóc w opracowaniu testów mających zastosowanie do badań przesiewowych o wysokiej zawartości (HCS)1,2,3,4.
Stwardnienie zanikowe boczne (ALS) jest uważane za chorobę proteopatyczną spowodowaną obecnością nieprawidłowo sfałdowanych białek z tendencją do agregacji i akumulacji w neuronach ruchowych zarówno w rodzinnym ALS (fALS), jak i sporadycznym ALS (sALS)5,6. Podzbiór ~ 20% przypadków fALS jest związany z dominującymi mutacjami w genie kodującym cytozolowy enzym przeciwutleniający dysmutazę ponadtlenkową miedzi i typu 1 (SOD1)7,8. Zaproponowano kilka potencjalnych przyczyn tej dysfunkcji o podłożu genetycznym, w tym zmiany w strukturze i funkcji wariantów SOD1, takie jak nieprawidłowa stabilność, zwiększona szybkość rozwijania i skłonność do agregacji9,10. Warto zauważyć, że jedyną zweryfikowaną i potencjalnie toksyczną właściwością wspólną zarówno dla wariantów SOD1 związanych z ALS, jak i SOD1 typu dzikiego (WT) jest zwiększona skłonność do tworzenia przedziałowych agregatów białkowych lub inkluzji białkowych11,12. Nieprawidłowo sfałdowany mutant SOD1 jest trwale poliubikwitynowany i degradowany przez układ ubikwityna-proteasom. W rezultacie, niski poziom hamowania aktywności proteasomu prowadzi do akumulacji zmutowanych agregatów SOD113,14, które tworzą amorficzne struktury złożone z rozpuszczalnych składników, które mogą wymieniać się z rozpuszczalnym mutantem SOD1 w cytozolu15. W szczególności mutacja SOD1 A4V (alanina w kodonie 4 zmieniona w walinę) jest najczęstszą mutacją powodującą ALS i prowadzi do szybkiej neurodegeneracji ze średnim czasem przeżycia krótszym niż 2 lata po wystąpieniu choroby16. Biochemicznie SOD1 A4V ma zwiększoną tendencję do monomeryzacji, agregacji i tworzenia porów amyloidowych; Jego porowate agregaty są podobne do porów amyloidowych innych zmutowanych form związanych z chorobą, takich jak α-synukleina i białko β-amyloidowe17. Aby zbadać dynamikę akumulacji agregatów SOD1, należy jeszcze opracować metody monitorowania rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych form agregatów SOD1.
Wcześniej wykazaliśmy, używając obrazowania żywych komórek i komórek HEK-293 przejściowo transfekowanych fluorescencyjnym białkiem SOD1, że mutacje związane z ALS upośledzają dimeryzację i agregację SOD111. Chociaż systemy ekspresji przejściowej mogą dostarczyć użytecznych informacji na temat biologicznych skutków krótkotrwałej nadekspresji genów, metody zapewniające stabilną integrację pożądanych genów mogą być preferowane do opracowywania testów. W związku z tym wektory lentiwirusowe oferują zdolność do nadawania długotrwałej i regulowanej ekspresji genów komórkom ssaków 18. W tym badaniu skupiliśmy się na generowaniu stabilnych linii komórkowych transdukowanych rekombinowanym lentiwirusem zawierającym WT i zmutowanym SOD1 znakowanym żółtym białkiem fluorescencyjnym (YFP). Korzystając z mikroskopii obrazowania żywych komórek i automatycznej kwantyfikacji agregacji SOD1, wyzwalaliśmy i określiliśmy ilościowo zdarzenia agregacji SOD1 po zahamowaniu proteasomu.

<table><tbody><tr><td>ALLN (C20H37N3O4)</td><td>Millipore</td><td>208719</td><td></td></tr><tr><td>MG132 (C26H41N3O5)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2211</td><td></td></tr><tr><td>Epoksomycyna (C 28H50N4O7)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3652</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H-3570</td><td></td></tr><tr><td>Opera</td><td>Perkin Elmer</td><td>OP-QEHS-01</td><td></td></tr><tr><td>Opera EvoShell software</td><td>Perkin Elmer</td><td>Ver 1.8.1</td><td></td></tr><tr><td>Operetka</td><td>Perkin Elmer</td><td>OPRT1288</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania Harmony</td><td>Perkin Elmer</td><td>Ver 3.0.0</td><td></td></tr><tr><td>Columbus Oprogramowanie do analizy obrazu</td><td>Perkin Elmer</td><td>Ver 2.3.2</td><td></td></tr><tr><td>CyBi Hummingwell obsługa cieczy</td><td>CyBio AG</td><td>OL 3387 3 0110</td><td></td></tr></tbody></table>

opracowanie testu do oznaczania ilościowego wysokiej zawartości zmutowanego białka sod1 w tworzeniu agregatów w żywych komórkach

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Stwardnienie zanikowe boczne (ALS) jest śmiertelną chorobą neurodegeneracyjną, która może być spowodowana przez dziedziczne mutacje w genie kodującym dysmutazę ponadtlenkową miedzi i 1 (SOD1). Niestabilność strukturalna SOD1 i wykrywanie inkluzji SOD1-dodatnich u pacjentów z rodzinnym ALS potwierdza potencjalną przyczynową rolę nieprawidłowo sfałdowanego i/lub zagregowanego SOD1 w patologii ALS. W tym badaniu opisujemy rozwój testu komórkowego zaprojektowanego do ilościowego określenia dynamiki agregacji SOD1 w żywych komórkach za pomocą podejść przesiewowych o wysokiej zawartości. Korzystając z wektorów lentiwirusowych, wygenerowaliśmy stabilne linie komórkowe eksprymujące typ dziki i zmutowany A4V SOD1 oznaczony żółtym białkiem fluorescencyjnym i stwierdziliśmy, że oba białka ulegały ekspresji w cytozolu bez żadnych oznak agregacji. Co ciekawe, tylko SOD1 A4V stabilnie eksprymowany w HEK-293, ale nie w liniach komórkowych U2OS lub SH-SY5Y, tworzył agregaty po leczeniu inhibitorem proteasomu. Pokazujemy, że możliwe jest ilościowe określenie agregacji na podstawie analizy dawka-odpowiedź różnych inhibitorów proteasomu oraz śledzenie kinetyki tworzenia agregatów za pomocą mikroskopii poklatkowej. Nasze podejście wprowadza możliwość ilościowego określenia wpływu mutacji ALS na rolę SOD1 w tworzeniu agregatów, a także badań przesiewowych w kierunku małych cząsteczek, które zapobiegają agregacji SOD1 A4V.

Tworzenie stabilnej linii komórkowej z użyciem lentiwirusa: Ogólna strategia monitorowania agregatów białka SOD1 przedstawiona jest na Rysunku 1. W pierwszym kroku przygotowano lentiwirusowy wektor ekspresyjny do stabilnej dostawy genu SOD1 do linii komórkowych (Krok 1). Przygotowano dwa wektory lentiwirusowe kodujące SOD1 WT oraz SOD1 A4V z etykietą YFP (odpowiednio SOD1WT-YFP i SOD1A4V-YFP) wraz z plazmidami pakującymi i otoczkowymi (<stron...

Opisujemy metodę ilościowego określania agregacji nieprawidłowo sfałdowanych białek. Nasz protokół szczegółowo opisuje indukowane lentiwirusem stabilne generowanie linii komórkowych, automatyczne obrazowanie konfokalne i analizę obrazu agregatów białkowych. Jako przykładowe zastosowanie, zbadaliśmy wpływ małych cząsteczek na promowanie agregacji SOD1 w sposób zależny od czasu i dawki.

Opracowanie testu do oznaczania ilościowego wysokiej zawartości zmutowanego białka Sod1 w tworzeniu agregatów w żywych komórkach

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest opracowanie testu do badania wpływu małych cząsteczek na modulowanie agregacji nieprawidłowo sfałdowanych białek w sposób zależny od czasu i dawki. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące rozwoju testu komórkowego i jest stosowana w technikach przesiewowych o wysokiej zawartości. Główną zaletą tej techniki jest zapewnienie prostej metody wykrywania i ilościowego określania agregacji białek występującej w kilku zaburzeniach neurodegeneracyjnych.Implikacje tej techniki rozciągają się na potencjalną terapię chorób neurodegeneracyjnych, takich jak ALS, ponieważ proponuje prostą metodę, która pozwala na opracowanie testu komórkowego i przeprowadzenie badań przesiewowych w kierunku moderatorów małych cząsteczek. Aby rozpocząć produkcję wirusa, przed transfekcją plazmidu należy rozszczepić limfocyty T HEK-293 przy 30 do 40% konfluencji w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli tkankowej i 10 mililitrach pożywki do hodowli komórkowej. Inkubuj płytkę hodowlaną w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc.Następnego dnia przygotuj roztwór do transfekcji DNA z opakowaniem plazmidów wektora lentiwiru

assay-development-for-high-content-quantification-sod1-mutant-protein

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W tym filmie demonstrujemy komórkowy test agregacji białek za pomocą inhibitorów proteasomów, które blokują aktywność proteasomu, zapobiegając nieprawidłowo sfałdowanym, zmutowanym białkom, połączonym z fluorescencyjnym znacznikiem, przed degradacją proteasomalną zależną od ubikwityny, prowadzącą do ich akumulacji w cytoplazmie komórki. Agregaty białkowe są następnie wizualizowane i oznaczane ilościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Test tworzenia agregatów białkowych: metoda wykrywania i ilościowego określania agregacji białek w hodowanych komórkach po indukcji przez inhibitor proteasomu

Ten film opisuje test degradacji dla nieprawidłowo sfałdowanych białek za pomocą leczenia cykloheksymidem wraz z frakcjonowaniem detergentem. Metoda ta pomaga w badaniu dynamiki nieprawidłowo sfałdowanych białek i odkrywaniu dogłębnych mechanizmów obrotu białkami.

Test degradacji białek podatnych na nieprawidłowe fałdowanie: technika monitorowania nieprawidłowo sfałdowanej degradacji białek przy użyciu obróbki cykloheksymidem i frakcjonowania detergentem

Ten film demonstruje obrazowanie i kwantyfikację agregatów białkowych w genetycznie zmodyfikowanych mózgach Drosophila. Mózgi są naprawiane, myte i traktowane środkiem zapobiegającym blaknięciu przed zamontowaniem. Obrazy są rejestrowane za pomocą mikroskopu konfokalnego i oznaczane ilościowo w celu obserwacji transmisji zmutowanych agregatów białkowych.

Obrazowanie i kwantyfikacja agregatów białkowych w genetycznie zmodyfikowanych mózgach Drosophila

Ten raport opisuje protokoły pomiaru szybkości degradacji nieprawidłowo sfałdowanych białek za pomocą testów western blot lub opartych na fluorescencji. Metody te mogą być stosowane do analizy innych nieprawidłowo sfałdowanych białek oraz do wysokoprzepustowych badań przesiewowych.

Testy degradacji nieprawidłowo sfałdowanych białek w komórkach

Opracowaliśmy prosty i elastyczny przepływ pracy do ekstrakcji danych ilościowych z badań biologicznych komórek opartych na obrazowaniu fluorescencyjnym agregacji białek i przepływu autofagicznego w ośrodkowym układzie nerwowym modeli neurodegeneracji Drosophila.

Ilościowa biologia komórki neurodegeneracji u Drosophila poprzez bezstronną analizę białek znakowanych fluorescencyjnie za pomocą ImageJ

Starzenie się komórek jest kluczowym czynnikiem w rozwoju przewlekłych patologii związanych z wiekiem. Identyfikacja środków terapeutycznych ukierunkowanych na komórki starcze daje nadzieję na wydłużenie procesu starzenia się w dobrym zdrowiu. W tym miejscu przedstawiamy nowatorski test do badań przesiewowych w celu identyfikacji senoterapeutyków na podstawie pomiaru aktywności związanej ze starzeniem β-galaktozydazy w pojedynczych komórkach.

Test przesiewowy oparty na SA-β-galaktozydazie do identyfikacji leków senoterapeutycznych

Pomiary zaangażowania docelowego leku są kluczowe dla skutecznego rozwoju leków i walidacji sond chemicznych. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół pomiaru zaangażowania leku w cel za pomocą obrazowania o wysokiej zawartości w kompatybilnej z mikropłytką adaptacji komórkowego testu przesunięcia termicznego (CETSA).

Wykorzystanie obrazowania o wysokiej zawartości do ilościowego określenia zaangażowania celu w przylegających komórkach

Tutaj opisaliśmy metodę obrazowania o wysokiej zawartości do ilościowego określenia transportu mutantów rodopsyny związanych z barwnikowym zwyrodnieniem siatkówki. Do ilościowego określenia białka rodopsyny na powierzchni komórki lub w całej komórce wykorzystano analizę punktacji na wielu długościach fali.

Test transportu rodopsyny za pomocą analizy obrazowania o wysokiej zawartości

Wprowadzamy tutaj procedurę pomiaru oligomerów białkowych i agregacji w lizacie komórkowym i żywych komórkach za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji.

Wykrywanie agregacji białek za pomocą spektroskopii korelacji fluorescencji

Tutaj prezentowana jest metoda analizy kinetyki agregacji białek u nicieni Caenorhabditis elegans. Zwierzęta z populacji zsynchronizowanej pod względem wieku są obrazowane w różnych punktach czasowych, a następnie następuje półautomatyczne zliczanie inkluzji w CellProfiler i dopasowywanie do modelu matematycznego w AmyloFit.

Monitorowanie kinetyki agregacji białek in vivo przy użyciu automatycznego zliczania inkluzji u Caenorhabditis elegans

Fizjologiczny model in vivo α-synukleiny jest niezbędny do zbadania i zrozumienia patogenezy choroby Parkinsona. Opisujemy metodę monitorowania cytotoksyczności i tworzenia agregatów α-synukleiny przy użyciu humanizowanego modelu drożdży.

Metoda badania toksyczności i agregacji α-synukleiny przy użyciu humanizowanego modelu drożdży

Poznaj metodę ilościowego oznaczania agregacji białka SOD1 w komórkach HEK-293 przy użyciu obrazowania konfokalnego. Technika umożliwia badanie wpływu małych cząsteczek na agregację białek w chorobach neurodegeneracyjnych.

Opracowanie testu do oznaczania ilościowego wysokiej zawartości zmutowanego białka Sod1 w tworzeniu agregatów w żywych komórkach (Wideo) | JoVE Journal

Opracowanie testu do oznaczania ilościowego wysokiej zawartości zmutowanego białka Sod1 w tworzeniu agregatów w żywych komórkach

Przeglądaj więcej filmów