Name: Nadekspresja i oczyszczanie ludzkiej cis-prenylotransferazy w Escherichia coli (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Poznaj metodę nadekspresji i oczyszczania ludzkiej cis-prenylotransferazy w Escherichia coli w warunkach niedenaturujących. Protokół umożliwia badanie aktywności enzymatycznej DHDDS i mechanizmów syntezy izoprenoidów związanych z retinitis pigmentosa.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Centrum Doskonałości Badawczej (I-CORE) w Biologii Strukturalnej Komórki Izraelskiej Fundacji Naukowej (1775/12) oraz granty Izraelskiej Fundacji Naukowej 1721/16 i 2338/16 (Y.H.) oraz 825/14 (D.K.). Wsparcie Fundacji Fields Estate dla D.K. jest bardzo cenne. Praca ta została wykonana przez Ilana Edriego i Michała Goldenberga w częściowym spełnieniu wymagań pracy doktorskiej na Wydziale Lekarskim Uniwersytetu w Tel Awiwie.

1 . Klonowanie cis-PT w celu nadekspresji u E. coli
<ol>
	<li>Uzyskaj wektor ekspresyjny pET-32b, przeznaczony do klonowania i ekspresji wysokiego poziomu sekwencji białkowych połączonych z białkiem 109aa tioredoksyny (TRX) 17 i zoptymalizowaną pod kątem kodonu E. coli <klasa sup="xref">18 sekwencją kodującą pełnej długości cis-PT.</li>
	<li>Zadbaj o to, aby przed sekwencją cis-PT znajdowało się miejsce cięcia proteazy TEV (proteazy wirusa wytrawiania tytoniu) (ENLYFQ/G, gdzie "/" oznacza punkt rozszczepienia) 9, a następnie krótki elastyczny łącznik (SGSGSG, w celu zwiększenia dostępności miejsca cięcia) przed sekwencją cis-PT (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A). Dodaj również odpowiednie miejsca ograniczeń 5' i 3' do klonowania.</li>
	<li>Sklonuj zsyntetyzowany konstrukt DNA do wektora pET-32b przy użyciu standardowych technik ligacji 10.</li>
</ol>
2 . Nadekspresja ludzkich DHDDS w E. coli
<ol>
	<li>Przekształć kompetentne komórki E. coli T7 z ekspresją za pomocą konstruktu DHDDS TRX-fusion zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Przekształcone komórki należy pokryć płytką zgodnie z instrukcjami producenta na LB-agar w warunkach selektywnych ampicyliny (200 mg/l).</li>
	<li>Zaszczepić wybrane kolonie w 100 ml pożywki LB w kulturach starterowych kolb o pojemności 250 ml z ampicyliną w ilości 100 mg/l i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C ze stałym wstrząsaniem przy 200 obr./min.</li>
	<li>Zaszczepić 80 ml kultury w dwóch 5-litrowych kolbach (40 ml na kolbę), z których każda zawiera 1,5 l pożywki 2x YT (16 g/l tryptonu, 10 g/l ekstraktu drożdżowego, 5 g/l NaCl) ze 100 mg/l ampicyliny.</li>
	<li>Inkubować kulturę w temperaturze 37 °C, stale wytrząsając przy 180 obr./min, aż do osiągnięcia OD600nm = 0,5.</li>
	<li>Obniżyć temperaturę do 16 °C i indukować komórki, dodając 0,5 mM izopropylu β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG). Kontynuuj inkubację w tych samych warunkach przez 16-20 godzin w celu ekspresji białka.</li>
	<li>Zebrać komórki przez odwirowanie (10 000 x g przez 10 min). 
	Uwaga: W tym miejscu można wstrzymać protokół; osad komórek należy przechowywać w temperaturze -80°C do czasu oczyszczenia.</li>
</ol>
3 . Oczyszczanie ludzkich DHDDS
<ol>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w buforze A (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 10 mM β-merkaptoetanolu), 1 μg/ml DNazy I i mieszaninie inhibitorów proteazy.</li>
	<li>Homogenizować komórki za pomocą homogenizatora szklano-teflonowego.</li>
	<li>Zakłócić działanie komórek za pomocą mikrofluidyzatora lub jego odpowiednika przy ciśnieniu 12 000 - 15 000 psi 11.</li>
	<li>Odwirować lizat komórkowy przy 40 000 x g przez 45 minut w temperaturze 4 °C. Odzyskać supernatant zawierający frakcję rozpuszczalną.</li>
	<li>Załadować supernatant do chromatografii o sile 5 - 10 ml chromatografii powinowactwa do immobilizowanych metali kobaltowych (Co2+-IMAC) 12 kolumnę 10 mM imidazolu, a następnie dokładnie przemyć buforem A i 10 mM imidazolem w celu zmniejszenia niespecyficznego wiązania białka.</li>
	<li>Eluować nadekspresję białek buforem A uzupełnionym 250 mM imidazolem.</li>
	<li>Usunąć imidazol za pomocą 53 ml preparatywnej kolumny odsalającej zrównoważonej buforem A.</li>
	<li>Dodaj proteazę TEV znakowaną 6xHis (1 mg proteazy TEV na 50 mg białka) do eluowanych białek, aby usunąć ich znakowane 6xHisem białko fuzyjne TRX w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Załaduj rozszczepione białka do kolumny Co2 + -IMAC, zrównoważonej buforem A uzupełnionym 5 mM imidazolem, aby usunąć rozszczepione 6x znakowane Hisem białko fuzyjne TRX i proteazę TEV.</li>
	<li>Zebrać przepływ i zagęścić do 3 - 4 ml za pomocą filtra odśrodkowego o masie cząsteczkowej 30 kDa.</li>
	<li>Załadować skoncentrowane białko do kolumny chromatograficznej superdex-200 z wykluczeniem wielkości, zrównoważonej buforem A w celu ostatecznego oczyszczenia. Białko eluuje się w postaci dimeru (~76 kDa).</li>
	<li>Wybierz odpowiednie frakcje, porównując profil elucji z krzywą kalibracyjną kolumny.</li>
	<li>Oceń czystość preparatu za pomocą SDS-PAGE.</li>
	<li>Określić stężenie białka potrzebne do dalszych eksperymentów i błyskawicznego zamrożenia podwielokrotności oczyszczonych, skoncentrowanych białek w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia.</li>
</ol>
4 . Analityczna chromatografia wykluczająca wielkość (SEC)
<ol>
	<li>Aby zapewnić zdolność białka do wytrzymania cykli zamrażania i rozmrażania, należy rozmrozić porcję zamrożonych białek i odwirować przy 21 000 x g przez 10 minut w celu usunięcia nierozpuszczalnych agregatów. Zebrać supernatant.</li>
	<li>Załaduj białka do kolumny analitycznej superdex-200 wstępnie zrównoważonej z 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,02% Triton X-100, 10 mM β-merkaptoetanolem, używając ultra-sprawnego systemu chromatografii cieczowej 13,14.</li>
	<li>Monitorować fluorescencję tryptofanu (λex = 280 nm, λem = 350 nm) w celu wykrycia elucji elucji białek. Upewnij się, że masz ważną krzywą kalibracyjną do oceny masy cząsteczkowej - takie krzywe są dostępne u producentów kolumn SEC.</li>
</ol>
5 . Kinetyka enzymów - Aktywność zależna od czasu 15,16,17
<ol>
	<li>Aby zapewnić aktywność oczyszczonego białka, należy zmieszać 5 μM oczyszczonego DHDDS z 10 μM FPP i 50 μM 14C-IPP, aby zainicjować reakcję w buforze A z 0,5 mM MgCl2 w temperaturze 22 - 30 °C. 
	Uwaga: Dokładne warunki reakcji mogą się różnić w przypadku preparatów cis-PT innych niż DHDDS. Co więcej, aktywność DHDDS zależy również od temperatury i [Mg2+]. 
	Uwaga: 14C-IPP jest radioaktywny i powinien być używany zgodnie z lokalnymi przepisami bezpieczeństwa radiacyjnego.</li>
	<li>Pobrać 15 μl próbek z reakcji po 0, 2, 4 i 6 godzinach, po natychmiastowym wygaszeniu reakcji przez dodanie 15 μl buforu A uzupełnionego 20 mM EDTA (do końcowego stężenia 10 mM EDTA).</li>
	<li>Dodać 1 mlH2nasyconego O-butanolem 1-butanolu i dokładnie odwirować, aby wyekstrahować produkty reakcji. 
	Uwaga: W tym miejscu protokół można zatrzymać, a próbki można zachować do późniejszego odczytu.</li>
	<li>Dodać koktajl scyntylacyjny do próbek i za pomocą licznika scyntylacyjnego oznaczyć ilościowo produkty reakcji w fazie butanolowej obejmujące 14C wraz z radioaktywnością 15 μl mieszaniny reakcyjnej, co odpowiada promieniotwórczości całkowitej.</li>
	<li>Odejmij odczyty tła zmierzone przy użyciu próbek 0 h od każdego punktu czasowego i oblicz procent wykorzystanych 14C-IPP.</li>
	<li>Obliczyć inkorporację netto 14C-IPP w każdym punkcie czasowym, obliczając procent wykorzystany z całkowitych 14stężeń C-IPP i wykreślić wyniki w funkcji czasu. Oczekuje się, że z czasem nastąpi wzrost liczby 14C-IPP netto.</li>
</ol>

<ol><li>Grabinska, K. A., Park, E. J., Sessa, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cis-Prenyltransferase%3A+New+Insights+into+Protein+Glycosylation%2C+Rubber+Synthesis%2C+and+Human+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">cis-Prenyltransferase: New Insights into Protein Glycosylation, Rubber Synthesis, and Human Diseases.</a> J Biol Chem. 291 (35), 18582-18590 (2016).</li>
<li>Ogura, K., Koyama, T., Sagami, H. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/chapter/10.1007/978-1-4615-5901-6_3">Polyprenyl diphosphate synthases.</a> Subcell Biochem. 28, 57-87 (1997).</li>
<li>Ogura, K., Koyama, T. Enzymatic Aspects of Isoprenoid Chain Elongation. Chem Rev. 98 (4), 1263-1276 (1998).</li>
<li>Imperiali, B., O'Connor, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+N-linked+glycosylation+on+glycopeptide+and+glycoprotein+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Effect of N-linked glycosylation on glycopeptide and glycoprotein structure.</a> Curr Opin Chem Biol. 3 (6), 643-649 (1999).</li>
<li>Bukhtiyarov, Y. E., Shabalin, Y. A., Kulaev, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubilization+and+characterization+of+dehydrodolichyl+diphosphate+synthase+from+the+yeast+Saccharomyces+carlsbergensis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Solubilization and characterization of dehydrodolichyl diphosphate synthase from the yeast Saccharomyces carlsbergensis.</a> J Biochem. 113 (6), 721-728 (1993).</li>
<li>Adair, W. L., Cafmeyer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+cis-prenyltransferase+required+for+dolichyl+phosphate+biosynthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Saccharomyces cerevisiae cis-prenyltransferase required for dolichyl phosphate biosynthesis.</a> Arch Biochem Biophys. 259 (2), 589-596 (1987).</li>
<li>Zelinger, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+missense+mutation+in+DHDDS%2C+encoding+dehydrodolichyl+diphosphate+synthase%2C+is+associated+with+autosomal-recessive+retinitis+pigmentosa+in+Ashkenazi+Jews%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">A missense mutation in DHDDS, encoding dehydrodolichyl diphosphate synthase, is associated with autosomal-recessive retinitis pigmentosa in Ashkenazi Jews.</a> Am J Hum Genet. 88 (2), 207-215 (2011).</li>
<li>Zuchner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-exome+sequencing+links+a+variant+in+DHDDS+to+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Whole-exome sequencing links a variant in DHDDS to retinitis pigmentosa.</a> Am J Hum Genet. 88 (2), 201-206 (2011).</li>
<li>Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+soluble+His%286%29-tagged+TEV+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease.</a> Methods Mol Biol. 498, 297-307 (2009).</li>
<li>Crouse, G. F., Frischauf, A., Lehrach, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+and+simplified+approach+to+cloning+into+plasmids+and+single-stranded+phages%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">An integrated and simplified approach to cloning into plasmids and single-stranded phages.</a> Methods Enzymol. 101, 78-89 (1983).</li>
<li>Middelberg, A. P. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/073497509502007P">Process-scale disruption of microorganisms.</a> Biotechnol Adv. 13 (3), 491-551 (1995).</li>
<li>Block, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilized-metal+affinity+chromatography+%28IMAC%29%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review.</a> Methods Enzymol. 463, 439-473 (2009).</li>
<li>Sachyani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+a+Kv7.1+potassium+channel+gating+module%3A+studies+of+the+intracellular+c-terminal+domain+in+complex+with+calmodulin%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural basis of a Kv7.1 potassium channel gating module: studies of the intracellular c-terminal domain in complex with calmodulin.</a> Structure. 22 (11), 1582-1594 (2014).</li>
<li>Shuart, N. G., Haitin, Y., Camp, S. S., Black, K. D., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+for+3%3A1+subunit+stoichiometry+of+rod+cyclic+nucleotide-gated+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism for 3:1 subunit stoichiometry of rod cyclic nucleotide-gated ion channels.</a> Nat Commun. 2, 457(2011).</li>
<li>Chang, S. Y., Tsai, P. C., Tseng, C. S., Liang, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refolding+and+characterization+of+a+yeast+dehydrodolichyl+diphosphate+synthase+overexpressed+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Refolding and characterization of a yeast dehydrodolichyl diphosphate synthase overexpressed in Escherichia coli.</a> Protein Expr Purif. 23 (3), 432-439 (2001).</li>
<li>Chang, S. Y., Ko, T. P., Liang, P. H., Wang, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytic+mechanism+revealed+by+the+crystal+structure+of+undecaprenyl+pyrophosphate+synthase+in+complex+with+sulfate%2C+magnesium%2C+and+triton%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Catalytic mechanism revealed by the crystal structure of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with sulfate, magnesium, and triton.</a> J Biol Chem. 278 (31), 29298-29307 (2003).</li>
<li>Guo, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structures+of+undecaprenyl+pyrophosphate+synthase+in+complex+with+magnesium%2C+isopentenyl+pyrophosphate%2C+and+farnesyl+thiopyrophosphate%3A+roles+of+the+metal+ion+and+conserved+residues+in+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Crystal structures of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with magnesium, isopentenyl pyrophosphate, and farnesyl thiopyrophosphate: roles of the metal ion and conserved residues in catalysis.</a> J Biol Chem. 280 (21), 20762-20774 (2005).</li>
<li>Collins, F. S., Green, E. D., Guttmacher, A. E., Guyer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vision+for+the+future+of+genomics+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A vision for the future of genomics research.</a> Nature. 422 (6934), Institute, U.S.N.H.G.R. 835-847 (2003).</li>
<li>Freeze, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+human+glycosylation+disorders%3A+biochemistry+leads+the+charge%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Understanding human glycosylation disorders: biochemistry leads the charge.</a> J Biol Chem. 288 (10), 6936-6945 (2013).</li>
<li>LaVallie, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thioredoxin+gene+fusion+expression+system+that+circumvents+inclusion+body+formation+in+the+E.+coli+cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%28N+Y%29%22%5BJournal%5D)">A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm.</a> Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).</li>
<li>Elena, C., Ravasi, P., Castelli, M. E., Peiru, S., Menzella, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+codon+optimized+genes+in+microbial+systems%3A+current+industrial+applications+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Expression of codon optimized genes in microbial systems: current industrial applications and perspectives.</a> Front Microbiol. 5, 21(2014).</li>
<li>Vincentelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+protein+expression+screening+and+purification+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput protein expression screening and purification in Escherichia coli.</a> Methods. 55 (1), 65-72 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany tutaj protokół oczyszczania funkcjonalnych ludzkich DHDDS w komórkach E. coli jest prosty i skuteczny, co pozwala na nadekspresję i oczyszczenie białka w ciągu 3-4 dni, gdy dostępny jest odpowiedni konstrukt. Takie protokoły oczyszczania białek mają szczególne znaczenie ze względu na przełomowe odkrycia w sekwencjonowaniu genomu, które dostarczyły wielu informacji na temat genetyki wielu chorób 18, co wymagało opracowania wysokoprzepustowych metod w celu scharakteryzowania mechani...

Prenylotransferazy to grupa enzymów, które katalizują wydłużanie łańcucha difosforanu allilu za pomocą difosforanu izopentenylu (IPP) poprzez wielokrotne reakcje kondensacji 1,2. Enzymy typu Z katalizują tworzenie podwójnych wiązań cis w wyniku reakcji kondensacji, podczas gdy enzymy typu E katalizują tworzenie podwójnych wiązań trans 3. cis-prenylotransferazy (cis-PT, enzymy typu Z) są klasycznie klasyfikowane według długości łańcucha produktu na krótkołańcuchowe (C15), średniołańcuchowe (C50-55) i długołańcuchowe (C70-120) 4. DHDDS (syntaza difosforanu dehydrodolichylu) jest eukariotycznym długołańcuchowym cis-PT, który katalizuje wydłużenie łańcucha difosforanu farnezylu (FPP, difosforanu allilowego) poprzez wielokrotne kondensacje z difosforanem izopentenylu (IPP) 1,5,6. Powoduje to powstanie difosforanu dehydrodolichylu, difosforanu poliprenylu C55-100służącego jako prekursor dolichylpirofosforanu, cząsteczki nośnika glikozylu zaangażowanej w glikozylację białek sprzężonych z N <klasa sup = "xref">1. Wśród Żydów aszkenazyjskich niekonserwatywna mutacja typu missense (K42E) w DHDDS powoduje autosomalne recesywne barwnikowe zwyrodnienie siatkówki 7,8. W związku z tym niniejszy protokół został opracowany w celu pozyskania oczyszczonych DHDDS nadających się do badań mechanistycznych.
Escherichia coli jest uważana za najwygodniejszego i najbardziej opłacalnego gospodarza do ekspresji białek rekombinowanych, a zatem jest również najczęściej używanym gospodarzem. Jednakże, gdy próbuje się heterologicznie nadekspresję białek w E. coli, należy wziąć pod uwagę specyficzne dla białka. Uzyskanie odpowiednio sfałdowanych, aktywnych białek rekombinowanych z E. coli, nie jest prostą sprawą ze względu na odmienne właściwości różnych białek. Opracowano wiele podejść mających na celu pokonanie tych przeszkód. W tym przypadku wykorzystano fuzję białek, zoptymalizowane warunki hodowli i optymalizację kodonów, aby umożliwić nadekspresję i oczyszczenie funkcjonalnie aktywnych ludzkich DHDDS w E. coli. Warto zauważyć, że poprzednia próba nadekspresji drożdży cis-PT bez fuzji białek nie powiodła się z powodu całkowitej nierozpuszczalności nawet w obecności detergentu 12. Opisany protokół jest prosty, opłacalny, oszczędza czas i pozwala na uzyskanie preparatów DHDDS odpowiednich do badań mechanistycznych. Biorąc pod uwagę homologię cis-PT wśród różnych gatunków, sugerujemy, że protokół ten może być również stosowany do innych eukariotycznych cis-PT.

<table><tbody><tr><td>pET-32b</td><td>Novagen</td><td>69016-3</td><td></td></tr><tr><td>T7 Express&nbsp; lysY&nbsp; Kompetentny&nbsp; E. coli&nbsp; (Wysoka wydajność)</td><td>NEB</td><td>C3010I</td><td></td></tr><tr><td>cKompletny, wolny od EDTA koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>żywica przelewowa TALON</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9574-99</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna odsalająca HiPrep 26/10&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17508701</td><td></td></tr><tr><td>HiLoad 16/60 superdex-200&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>28989335</td><td></td></tr><tr><td>superdex-200 wzrost 5/150 GL&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>28990945</td><td></td></tr><tr><td>14C-pirofosforan izoopentenylu</td><td>Perkin-Elmer</td><td>NEC773050UC&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>pirofosforan trans,trans-farnezylu</td><td>Sigma</td><td>44270-10MG</td><td></td></tr></tbody></table>

nadekspresja i oczyszczanie ludzkiej cis-prenylotransferazy w escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenylotransferazy (PT) to grupa enzymów, które katalizują wydłużenie łańcucha difosforanu allilu za pomocą izofosforanu tenylu (IPP) poprzez wielokrotne reakcje kondensacji. DHDDS (syntaza difosforanu dehydrodolichylu) jest eukariotycznym długołańcuchowym cis-PT (tworzącym podwójne wiązania cis w wyniku reakcji kondensacji), który katalizuje wydłużenie łańcucha difosforanu farnezylu (FPP, difosforanu allilu) poprzez wielokrotne kondensacje z difosforanem izopentenylu (IPP). DHDDS ma znaczenie biomedyczne, ponieważ niekonserwatywna mutacja (K42E) w enzymie powoduje barwnikowe zwyrodnienie siatkówki, ostatecznie prowadząc do ślepoty. W związku z tym niniejszy protokół został opracowany w celu pozyskania dużych ilości oczyszczonych DHDDS, nadających się do badań mechanistycznych. W tym przypadku wykorzystano fuzję białek, zoptymalizowane warunki hodowli i optymalizację kodonów, aby umożliwić nadekspresję i oczyszczenie funkcjonalnie aktywnych ludzkich DHDDS w E. coli. Opisany protokół jest prosty, ekonomiczny i oszczędza czas. Homologia cis-PT między różnymi gatunkami sugeruje, że protokół ten może być również stosowany do innych eukariotycznych cis-PT, takich jak te biorące udział w syntezie kauczuku naturalnego.

Ogólny przegląd zastosowanego tutaj konstruktu oraz procesu oczyszczania przedstawiono na Rysunku 1. Próbki uzyskane na każdym etapie oczyszczania pokazano na Rysunku 2. Ta analiza SDS-PAGE obrazuje etapowe oczyszczanie DHDDS, prowadzące do otrzymania wysoce czystego produktu. Rysunek 3 przedstawia wyniki analitycznej chromatografii SEC oczyszczonego enzymu, wykazując, że białko występuje wyłącznie w...

Opisano prosty protokół nadekspresji i oczyszczania zoptymalizowanej pod kątem kodonów, ludzkiej cis-prenylotransferazy, w warunkach niedenaturujących, z Escherichia coli, wraz z testem aktywności enzymatycznej. Protokół ten można uogólnić na produkcję innych białek cis-prenylotransferazy w ilości i jakości odpowiednich do badań mechanistycznych.

Nadekspresja i oczyszczanie ludzkiej cis-prenylotransferazy w Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Ogólnym celem tego protokołu jest nadekspresja i oczyszczenie zoptymalizowanej pod kątem kodonów ludzkiej cis-prenylotransferazy w warunkach niedenaturujących oraz oznaczenie jej aktywności enzymatycznej. Procedurę dehydrodolichylo-difosforanową dehydrodolichylo-difosforanu wykazano z zastosowaniem eukariotycznej długołańcuchowej cis-prenylotransferazy (DHDDS). Metoda ta może poszerzyć naszą wiedzę na temat syntezy izoprenoidów i dostarczyć kluczowych informacji na temat patofizjologicznego mechanizmu barwnikowego zwyrodnienia siatkówki związanego z mutacjami w DHDDS.Główną zaletą tej techniki jest to, że jest prosta, opłacalna i oszczędza czas. Można go również uogólnić na produkcję dużych ilości innych białek cis-prenylotransferazy. Rozpocznij tę procedurę od sklonowania ekspresji ludzkiego DHDDS, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Ponownie zawiesić komórki w buforze A, jeden mikrogram na mililitr DNazy I i mieszaninie inhibitorów proteazy. Następnie homogenizuj zawieszone komórki za pomocą szklanego homogenizatora teflonowego. Rozerwij komórki za pomocą mikrofluidyzatora lub jego odpowiednika przy 12 000 do 15 000 psi.Następnie odwiruj lizat komórkowy pod ciśnieniem 40 000 g przez 45 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odzyskać supernatant zawierający frakcję rozpuszczalną. Załadować supernatant na kolumnę chromatograficzną o powinowactwie do metalu o średnicy od 5 do 10 milimetrów z 10 milimolowym imidazolem.Po załadowaniu do maszyny do szybkiej chromatografii cieczowej białek należy przeprowadzić dokładne mycie kolumny buforem A w 10 milimolowym imidazolu w celu zmniejszenia niespecyficznego wiązania białek. Rozpocznij program FPLC. Eluować nadekspresję białek buforem A uzupełnionym 250 milimolowym imidazolem.Po elucji usunąć imidazol za pomocą 53 mililitrów preparatywnej kolumny odsalającej zrównoważonej buforem A. Następnie dodać proteazę TEV znakowaną heksahistydyną do eluowanych białek, aby usunąć ich fuzję DHDDS znakowanej heksahistydyną tioredoksyny. Inkubuj mieszaninę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnie załaduj rozszczepione białka na unieruchomioną kobaltem kolumnę chromatograficzną o powinowactwie do metalu, zrównoważoną buforem A uzupełnionym pięciomilimolowym imidazolem.Zebrać przepływ, aby usunąć rozszczepioną ioredoksynę znakowaną heksahistydyną i proteazę TEV. Skoncentrować przepływ do od trzech do czterech mililitrów za pomocą odciętego filtra odśrodkowego o masie cząsteczkowej 30 kilodaltonów. Następnie załadować skoncentrowane białko do kolumny chromatograficznej Superdex 200 do chromatografii wykluczającej o rozmiarze zrównoważonym buforem A w celu ostatecznego oczyszczenia.Umieść próbki w 96-dołkowym stojaku w kolektorze frakcji. Białko eluuje się w postaci dimeru. Wybierz odpowiednie frakcje, porównując profil elucji z krzywą kalibracyjną kolumny.W tym momencie należy ocenić czystość preparatu za pomocą SDS-PAGE. Na koniec należy określić stężenie białka potrzebne do dalszych eksperymentów i błyskawicznego zamrażania podwielokrotności oczyszczonych skoncentrowanych białek w ciekłym azocie. Porcje należy przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu użycia.Aby zapewnić zdolność białka do wytrzymania cykli zamrażania i rozmrażania, należy rozmrozić porcję zamrożonych białek. Odwirować podwielokrotność przy 21 000 g przez 10 minut w celu usunięcia nierozpuszczalnych agregatów. Po odwirowaniu zebrać supernatant.Następnie załaduj białka do kolumny analitycznej Superdex 200 wstępnie zrównoważonej z TNXB przy użyciu systemu ultra sprawnej chromatografii cieczowej. Monitoruj fluorescencję tryptofanu, aby wykryć profil elucji białka. Upewnij się, że masz ważną krzywą kalibracyjną do oceny masy cząsteczkowej, która jest dostępna u producentów kolumn SEC.Aby zapewnić aktywność oczyszczonego białka, najpierw zmieszaj pięć mikromolowych oczyszczonych DHDDS z 10 mikromolowymi FPP i 50 mikromolowymi C14 IPP. Rozpocząć reakcję w buforze A z 0,5 milimolowym chlorkiem magnezu w temperaturze od 22 do 30 stopni Celsjusza. Pobrać 15 mikrolitrów próbek z reakcji po zero, dwóch, czterech i sześciu godzinach po natychmiastowym wygaszeniu reakcji przez dodanie 15 mikrolitrów buforu A uzupełnionego 20 milimolowym EDTA.Następnie dodaj jeden mililitr nasyconego wodą 1-butanolu i dokładnie odwiruj, aby wyekstrahować produkty reakcji. W tym miejscu można zatrzymać protokół, a próbki można zachować do późniejszego odczytu. Następnie dodaj koktajl scyntylacyjny do próbek.Za pomocą licznika scyntylacyjnego oznaczyć ilościowo produkty reakcji w fazie butanolowej obejmującej C14 wraz z radioaktywnością 15 mikrolitrów reakcji, co odpowiada promieniotwórczości całkowitej. Na koniec oblicz inkorporację netto C14 IPP w każdym punkcie czasowym, obliczając procent wykorzystany z całkowitych stężeń C14 IPP i wykreśl wyniki w funkcji czasu. Z czasem spodziewany jest wzrost udziału netto w IPP C14.Próbki otrzymane na każdym etapie oczyszczania są pokazane tutaj. Ta analiza SDS-PAGE pokazuje stopniowe oczyszczanie DHDDS, w wyniku czego uzyskuje się wysoce oczyszczony produkt. Chromatogram ten przedstawia wyniki analitycznej chromatografii wykluczającej wielkość oczyszczonego enzymu, ujawniając, że białko jest obserwowane tylko jako homodimer.Tutaj strzałka wskazuje wolumin pustki. Reprezentatywny test aktywności zależny od czasu ujawnia, że włączenie C14 IPP wyraźnie wzrasta w ciągu sześciu godzin, sprawdzając, czy oczyszczony enzym jest funkcjonalny. Po opanowaniu, ten prosty preparat można wykonać w ciągu dwóch do trzech dni, co daje wysoce czysty i aktywny enzym.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak nadekspresja i oczyszczanie ludzkiej cis-prenylotransferazy z E. coli oraz mierzenie jej aktywności w sposób zależny od czasu.

overexpression-purification-human-cis-prenyltransferase-escherichia

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten pięciodniowy protokół przedstawia wszystkie kroki, sprzęt i dodatkowe oprogramowanie niezbędne do stworzenia i uruchomienia od podstaw wydajnego, endogennego systemu ekspresji TX-TL opartego na Escherichia coli. W przypadku odczynników protokół potrzebuje 8 godzin lub mniej na przygotowanie reakcji, zebranie i przetworzenie danych.

Protokoły wdrażania bezkomórkowego systemu ekspresji TX-TL opartego na Escherichia coli w biologii syntetycznej

Przedstawiono uproszczone podejście do badań przesiewowych pod kątem ekspresji rekombinowanych białek błonowych u Escherichia coli oparte na fuzji z białkiem zielonej fluorescencji.

Badania przesiewowe białek błonowych Escherichia coli oparte na białkach zielonej fluorescencji

Współekspresja białek jest potężną alternatywą dla rekonstytucji in vitro kompleksów białkowych i jest pomocna w przeprowadzaniu testów biochemicznych i genetycznych in vivo. W tym artykule informujemy o wykorzystaniu koekspresji białek w Escherichia coli do uzyskania kompleksów białkowych i dostrojenia częstotliwości mutacji komórek.

Wieloaspektowe korzyści płynące z koekspresji białek w Escherichia coli

Domeny palców cynkowych są z natury przepuszczalne dla komórek i zdolne do pośredniczenia w dostarczaniu białek do szerokiego zakresu typów komórek ssaków. W tym miejscu przedstawiono szczegółowy protokół krok po kroku wdrażania technologii palca cynkowego do wewnątrzkomórkowego dostarczania białka.

Bezpośrednie dostarczanie białek do komórek ssaków za pomocą przepuszczalnych dla komórek domen Cys2-his 2 palców cynkowych

To jest szybki, efektywny kosztowo protokół produkcji wydzielanych, glikozylowanych białek ssaków i późniejszego jednoetapowego oczyszczania z wystarczającą wydajnością jednorodnego białka do krystalografii rentgenowskiej i innych badań biofizycznych.

Wydajna ekspresja komórek ssaków i jednoetapowe oczyszczanie zewnątrzkomórkowych glikoprotein do krystalizacji

Laboratoryjna produkcja białek eukariotycznych z odpowiednią modyfikacją potranslacyjną stanowi istotną barierę. Oto solidny protokół z szybkim ustanowieniem i przekształceniem w ekspresję białek przy użyciu systemu ekspresji ssaków. System ten wspomaga selektywne znakowanie aminokwasów, selektywne znakowanie białek i małocząsteczkowych modulatorów składu glikanów.

Wysoka ekspresja rekombinowanych białek ludzkich z przejściową transfekcją komórek HEK293 w zawiesinie

Analizy biochemiczne i strukturalne glikozylowanych białek wymagają stosunkowo dużej ilości jednorodnych próbek. W tym miejscu przedstawiamy skuteczną metodę chemiczną specyficznej dla miejsca glikozylacji rekombinowanych białek oczyszczonych z bakterii poprzez celowanie w reaktywne tiole Cys.

Ukierunkowanie tioli cysteinowych na glikozylację białek rekombinowanych in vitro specyficzną dla miejsca

Biologia syntetyczna umożliwia inżynierię białek o niespotykanych dotąd właściwościach przy użyciu kotranslacyjnej insercji aminokwasów niekanonicznych. Tutaj przedstawiliśmy, w jaki sposób spektralnie przesunięty ku czerwieni wariant fluoroforu typu GFP o nowych właściwościach spektroskopowych fluorescencji, określany jako "złote" białko fluorescencyjne (GdFP), jest wytwarzany w E. coli poprzez selektywne włączenie ciśnienia (SPI).

Inżynieria "złotej" fluorescencji poprzez selektywne wprowadzanie ciśnieniowe aminokwasów niekanonicznych oraz analiza białek za pomocą spektrometrii mas i fluorescencji

Ten protokół opisuje techniki używane do określania struktur kanałów jonowych za pomocą mikroskopii krioelektronowej, w tym system bakulowirusa używany do efektywnej ekspresji genów w komórkach ssaków przy minimalnym wysiłku i toksyczności, ekstrakcję białek, oczyszczanie i kontrolę jakości, przygotowanie siatki próbek i badanie przesiewowe, a także zbieranie i przetwarzanie danych.

Ekspresja i oczyszczanie ludzkiego wrażliwego na lipidy kanału kationowego TRPC3 do oznaczania strukturalnego za pomocą mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek

Opisujemy metodę charakterystyki transporterów błonowych napędzanych protonami w preparatach pęcherzyków błonowych wytwarzanych przez heterologiczną ekspresję w E. coli i lizę komórek za pomocą prasy francuskiej.

Charakterystyka transporterów błonowych przez ekspresję heterologiczną u E. coli i wytwarzanie pęcherzyków błonowych

W artykule opisano metodologię nadekspresji rekombinowanej Nsp15, toksycznej nukleazy, w systemie ekspresji C41(DE3), a następnie oczyszczania znakowanego białka za pomocą chromatografii wykluczania powinowactwa i wielkości. Protokoły te można dostosować do innych trudnych toksycznych białek.

Nadekspresja i oczyszczanie toksycznej nukleazy z Escherichia coli

Poznaj metodę nadekspresji i oczyszczania ludzkiej cis-prenylotransferazy w Escherichia coli w warunkach niedenaturujących. Protokół umożliwia badanie aktywności enzymatycznej DHDDS i mechanizmów syntezy izoprenoidów związanych z retinitis pigmentosa.

Nadekspresja i oczyszczanie ludzkiej cis-prenylotransferazy w Escherichia coli

Przeglądaj więcej filmów