Nadekspresja i oczyszczanie ludzkiej cis-prenylotransferazy w Escherichia coli

Ogólnym celem tego protokołu jest nadekspresja i oczyszczenie zoptymalizowanej pod kątem kodonów ludzkiej cis-prenylotransferazy w warunkach niedenaturujących oraz oznaczenie jej aktywności enzymatycznej. Procedurę dehydrodolichylo-difosforanową dehydrodolichylo-difosforanu wykazano z zastosowaniem eukariotycznej długołańcuchowej cis-prenylotransferazy (DHDDS). Metoda ta może poszerzyć naszą wiedzę na temat syntezy izoprenoidów i dostarczyć kluczowych informacji na temat patofizjologicznego mechanizmu barwnikowego zwyrodnienia siatkówki związanego z mutacjami w DHDDS.

Główną zaletą tej techniki jest to, że jest prosta, opłacalna i oszczędza czas. Można go również uogólnić na produkcję dużych ilości innych białek cis-prenylotransferazy. Rozpocznij tę procedurę od sklonowania ekspresji ludzkiego DHDDS, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Ponownie zawiesić komórki w buforze A, jeden mikrogram na mililitr DNazy I i mieszaninie inhibitorów proteazy. Następnie homogenizuj zawieszone komórki za pomocą szklanego homogenizatora teflonowego. Rozerwij komórki za pomocą mikrofluidyzatora lub jego odpowiednika przy 12 000 do 15 000 psi.

Następnie odwiruj lizat komórkowy pod ciśnieniem 40 000 g przez 45 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odzyskać supernatant zawierający frakcję rozpuszczalną. Załadować supernatant na kolumnę chromatograficzną o powinowactwie do metalu o średnicy od 5 do 10 milimetrów z 10 milimolowym imidazolem.

Po załadowaniu do maszyny do szybkiej chromatografii cieczowej białek należy przeprowadzić dokładne mycie kolumny buforem A w 10 milimolowym imidazolu w celu zmniejszenia niespecyficznego wiązania białek. Rozpocznij program FPLC. Eluować nadekspresję białek buforem A uzupełnionym 250 milimolowym imidazolem.

Po elucji usunąć imidazol za pomocą 53 mililitrów preparatywnej kolumny odsalającej zrównoważonej buforem A. Następnie dodać proteazę TEV znakowaną heksahistydyną do eluowanych białek, aby usunąć ich fuzję DHDDS znakowanej heksahistydyną tioredoksyny. Inkubuj mieszaninę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnie załaduj rozszczepione białka na unieruchomioną kobaltem kolumnę chromatograficzną o powinowactwie do metalu, zrównoważoną buforem A uzupełnionym pięciomilimolowym imidazolem.

Zebrać przepływ, aby usunąć rozszczepioną ioredoksynę znakowaną heksahistydyną i proteazę TEV. Skoncentrować przepływ do od trzech do czterech mililitrów za pomocą odciętego filtra odśrodkowego o masie cząsteczkowej 30 kilodaltonów. Następnie załadować skoncentrowane białko do kolumny chromatograficznej Superdex 200 do chromatografii wykluczającej o rozmiarze zrównoważonym buforem A w celu ostatecznego oczyszczenia.

Umieść próbki w 96-dołkowym stojaku w kolektorze frakcji. Białko eluuje się w postaci dimeru. Wybierz odpowiednie frakcje, porównując profil elucji z krzywą kalibracyjną kolumny.

W tym momencie należy ocenić czystość preparatu za pomocą SDS-PAGE. Na koniec należy określić stężenie białka potrzebne do dalszych eksperymentów i błyskawicznego zamrażania podwielokrotności oczyszczonych skoncentrowanych białek w ciekłym azocie. Porcje należy przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu użycia.

Aby zapewnić zdolność białka do wytrzymania cykli zamrażania i rozmrażania, należy rozmrozić porcję zamrożonych białek. Odwirować podwielokrotność przy 21 000 g przez 10 minut w celu usunięcia nierozpuszczalnych agregatów. Po odwirowaniu zebrać supernatant.

Następnie załaduj białka do kolumny analitycznej Superdex 200 wstępnie zrównoważonej z TNXB przy użyciu systemu ultra sprawnej chromatografii cieczowej. Monitoruj fluorescencję tryptofanu, aby wykryć profil elucji białka. Upewnij się, że masz ważną krzywą kalibracyjną do oceny masy cząsteczkowej, która jest dostępna u producentów kolumn SEC.

Aby zapewnić aktywność oczyszczonego białka, najpierw zmieszaj pięć mikromolowych oczyszczonych DHDDS z 10 mikromolowymi FPP i 50 mikromolowymi C14 IPP. Rozpocząć reakcję w buforze A z 0,5 milimolowym chlorkiem magnezu w temperaturze od 22 do 30 stopni Celsjusza. Pobrać 15 mikrolitrów próbek z reakcji po zero, dwóch, czterech i sześciu godzinach po natychmiastowym wygaszeniu reakcji przez dodanie 15 mikrolitrów buforu A uzupełnionego 20 milimolowym EDTA.

Następnie dodaj jeden mililitr nasyconego wodą 1-butanolu i dokładnie odwiruj, aby wyekstrahować produkty reakcji. W tym miejscu można zatrzymać protokół, a próbki można zachować do późniejszego odczytu. Następnie dodaj koktajl scyntylacyjny do próbek.

Za pomocą licznika scyntylacyjnego oznaczyć ilościowo produkty reakcji w fazie butanolowej obejmującej C14 wraz z radioaktywnością 15 mikrolitrów reakcji, co odpowiada promieniotwórczości całkowitej. Na koniec oblicz inkorporację netto C14 IPP w każdym punkcie czasowym, obliczając procent wykorzystany z całkowitych stężeń C14 IPP i wykreśl wyniki w funkcji czasu. Z czasem spodziewany jest wzrost udziału netto w IPP C14.

Próbki otrzymane na każdym etapie oczyszczania są pokazane tutaj. Ta analiza SDS-PAGE pokazuje stopniowe oczyszczanie DHDDS, w wyniku czego uzyskuje się wysoce oczyszczony produkt. Chromatogram ten przedstawia wyniki analitycznej chromatografii wykluczającej wielkość oczyszczonego enzymu, ujawniając, że białko jest obserwowane tylko jako homodimer.

Tutaj strzałka wskazuje wolumin pustki. Reprezentatywny test aktywności zależny od czasu ujawnia, że włączenie C14 IPP wyraźnie wzrasta w ciągu sześciu godzin, sprawdzając, czy oczyszczony enzym jest funkcjonalny. Po opanowaniu, ten prosty preparat można wykonać w ciągu dwóch do trzech dni, co daje wysoce czysty i aktywny enzym.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak nadekspresja i oczyszczanie ludzkiej cis-prenylotransferazy z E. coli oraz mierzenie jej aktywności w sposób zależny od czasu.