Name: Multimodalne podejście do obrazowania oparte na mikrotomografii komputerowej i fluorescencyjnej tomografii molekularnej do podłużnej oceny zwłóknienia płuc wywołanego bleomycyną u myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Poznaj nieinwazyjne obrazowanie mikro-CT i FMT do podłużnej oceny zwłóknienia płuc u myszy. Ta metoda umożliwia monitorowanie zmian anatomicznych i zdarzeń molekularnych w modelu IPF.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować dr Danieli Pompilio i Robercie Ciccimarra za pomoc techniczną.

Wszystkie doświadczenia na zwierzętach opisane w niniejszym dokumencie zostały zatwierdzone przez wewnętrzny komitet ds. dobrostanu zwierząt do eksperymentów na zwierzętach Chiesi Farmaceutici i ERASMUS MC pod numerem protokołu: EMC 3349 (138-14-07) zgodnie z Dyrektywą Europejską 2010/63 UE, włoską D.Lgs 26/2014 oraz zmienionym "Przewodnikiem do opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych"23.
UWAGA: Przed użyciem, samice myszy wsobnych C57Bl/6 (7-8 tygodni) były aklimatyzowane przez co najmniej 7 dni do lokalnych warunków wiwarium (temperatura pokojowa: 20-24 °C; wilgotność względna: 40-70%; 12-godzinny cykl jasny-ciemny), mając swobodny dostęp do standardowej karmy dla gryzoni i zmiękczonej wody z kranu.
1. Leczenie dotchawicze myszy bleomycyną
<ol>
	<li>Przygotuj sprzęt do wkraplania dotchawiczego12,13,14.</li>
	<li>Umieść myszy w komorze anestezjologicznej podłączonej do parownika izofluranu ustawionego na 2,5% zmieszanego z tlenem. Sprawdź głębokość znieczulenia przez brak reakcji na uszczypnięcie palca u nogi. Efekt znieczulenia pojawił się po 3-5 minutach.</li>
	<li>Umieść znieczuloną mysz na platformie intubacyjnej, zawieszając ją za siekacze umieszczone na drucie.</li>
	<li>Włącz laryngoskop, weź parę kleszczy z końcami i użyj kleszczy lub końcówki laryngoskopu, aby delikatnie otworzyć usta.</li>
	<li>Wyciągnij język i przytrzymaj go na bok kleszczami. Umieść ostrze laryngoskopu w kierunku tylnej części jamy ustnej, aż ujrzenie tchawicy zostanie uwidocznione i utrzymuj laryngoskop na miejscu.</li>
	<li>Drugą ręką włóż rurkę doprowadzającą połączoną z końcem rurki PE do tchawicy, obracając zawór trójdrogowy. Dostarcz 50 μl bleomycyny (0,020 μg/mysz). Po wkropleniu szybko wyjmij rurkę z tchawicy, aby zapobiec uduszeniu. Trzymaj myszy pionowo przez kilka sekund.
	<ol>
		<li>Bleomycynę podawać dotchawiczo w dniu 0 i powtórzyć w dniu 4 (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zdejmij mysz z platformy intubacyjnej i monitoruj ją przez 30 minut (czas potrzebny do pełnego wyzdrowienia ze znieczulenia).</li>
	<li>Wykonaj obrazowanie in vivo płuc myszy za pomocą FMT i Micro-CT po podwójnym wkropleniu bleomycyny w 7, 14 i 21 dniu.</li>
</ol>
2. Obrazowanie in vivo za pomocą fluorescencyjnej tomografii molekularnej
UWAGA: Zanim użyjesz, przygotuj świeży roztwór podstawowy 6 nmol/ml wrażliwego na MMP podłoża fluorescencyjnego 680 w roztworze soli (0,9% chlorku sodu) i przechowuj przed użyciem w temperaturze 4 °C. Jest stabilny przez okres do 6 miesięcy w temperaturze 4 °C. Przed wstrzyknięciem zwierzętom należy pozwolić, aby środek do obrazowania MMP osiągnął odpowiednią temperaturę pokojową.
<ol>
	<li>Wtrysk sondy
	<ol>
		<li>Przygotować sprzęt do dożylnego wstrzyknięcia roztworu z sondy MMP. Podgrzej wodę o temperaturze 50 °C, aby podgrzać ogon myszy.</li>
		<li>Aby mocno chwycić kark myszy, chwyć go za ogon i pozwól mu chwycić pokrywę klatki. Trzymając myszy na ramionach zwierzęcia, umieść ogon w zlewce z ciepłą wodą, na 4 do maksymalnie 8 s urazu termicznego, aby zapobiec termicznemu uszkodzeniu skóry ogona. Sprawdź obrzęk żył, aby ułatwić wizualizację i wprowadzenie igły.</li>
		<li>Podczas procedury wstrzykiwania należy umieścić myszy w plastikowym ograniczniku, aby utrzymać go stabilnie i przeciągnąć ogon przez specjalny otwór z tyłu. Znajdź dwie żyły ogonowe po obu stronach ogona; nie tętnica na spodniej stronie ogona.</li>
		<li>Wprowadzić igłę (26G) strzykawki o pojemności 1 ml do żyły. Jeśli igła zostanie prawidłowo umieszczona, wstrzyknięcie będzie łatwe, a roztwór z sondy wpłynie do naczynia.</li>
		<li>Wstrzyknąć roztwór sondy MMP w stężeniu 10 ml/kg.</li>
		<li>Wyrzuć igłę. 
		UWAGA: Optymalny punkt czasowy obrazowania to 24 godziny po wstrzyknięciu sondy MMP, ponieważ jest to czas wymagany przez sondę do aktywacji. W przypadku przeprowadzenia badań podłużnych optymalny czas ponownego wstrzyknięcia wynosi 7 dni, co pozwala na całkowite usunięcie środka z myszy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie FMT 
	UWAGA: Przed rozpoczęciem należy zawsze usunąć sierść z obszarów zwierzęcia i wokół nich, które mają być obrazowane, w tym przypadku klatki piersiowej, aby uniknąć rozproszenia i absorpcji w tkance.
	<ol>
		<li>Aby znieczulić mysz, umieść ją w komorze anestezjologicznej i przekręć pokrętło izofluranu na 2,5% w przypadku indukcji i 2% w celu konserwacji.</li>
		<li>Zainicjuj oprogramowanie do akwizycji danych i otwórz nowe badanie w bazie danych dla eksperymentu.</li>
		<li>Przed rozpoczęciem obrazowania za pomocą FMT przenieś mysz do kasety obrazowej. Umieść znieczuloną mysz na środku kasety obrazowej, aby optymalnie wykorzystać pole widzenia FMT. Trzymaj myszy płasko, bezpiecznie i delikatnie dociśnięte do obu okien kasety obrazowej. Wyreguluj wysokość za pomocą pokręteł na kasecie, a następnie wsuń ją do stacji dokującej.</li>
		<li>Kliknij temat w oknie skanowania i kliknij podgląd, aby zobaczyć obraz na żywo.</li>
		<li>Narysuj obszar skanowania wystarczająco duży, aby uchwycona została tkanka otaczająca przewidywany obszar fluorescencji. Łącznie 25 punktów skanowania gwarantuje, że obszar płuc zostanie całkowicie zeskanowany.</li>
		<li>Po narysowaniu ROI najpierw kliknij dodaj do kolejki rekonstrukcji, a następnie kliknij Skanuj, aby zobrazować mysz. Upewnij się, że wybrano właściwy laser o długości fali 680 nm.</li>
		<li>Po zakończeniu akwizycji obrazu umieść mysz z powrotem w klatce. Upewnij się, że w pełni wyzdrowieje po znieczuleniu.</li>
		<li>Określ ilościowo pikobole fluorescencji w oknie Analiza oprogramowania analitycznego za pomocą narzędzia ROI i zmniejsz ROI o około 700-800 mm3 na sygnał pochodzący z obszaru płuc. Uważaj, aby wykluczyć sygnał wątrobowy. Skopiuj ROI na innych obiektach, aby miały podobny wymiar i dostosuj ich położenie na każdym obrazie zwierzęcia.</li>
		<li>Eksportuj obrazy jako pliki jpg.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Obrazowanie in vivo za pomocą Micro-CT
UWAGA: Zanim zaczniesz, zawsze zdejmuj metalową biżuterię lub metalowe przedmioty w pobliżu obszaru obrazowania, aby uniknąć rozproszenia promieni rentgenowskich.
UWAGA: Zwłóknienie płuc wywołane promieniowaniem jest częstym zjawiskiem podczas uszkodzenia płuc wywołanego promieniowaniem24. Ani wskaźniki pochodzące z mikrotomografii komputerowej, ani wyniki histologiczne związane ze zwłóknieniem płuc nie były obecne u myszy kontrolnych leczonych solą fizjologiczną w dniu 21 poddanych czterem sesjom obrazowania mikro-CT, co wskazuje, że dawka promieniowania rentgenowskiego dostarczona zwierzętom podczas badań mikro-CT nie była wystarczająca, aby wpłynąć na wyniki.
<ol>
	<li>Włącz Micro-CT, naciskając zielony przycisk zasilania i uruchom oprogramowanie, aby rozgrzać źródło promieniowania rentgenowskiego. Użyj małego otworu i łóżka dla zwierząt do obrazowania myszy.</li>
	<li>Utwórz bazę danych, klikając pozycję Nowa baza danych dla nowej bazy danych i zbuduj przeglądarkę na podstawie liczby myszy w eksperymencie lub kliknij pozycję Łączenie z istniejącą bazą danych, aby zapisać dane we wcześniej utworzonej bazie danych.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem skanowania należy wybrać parametry akwizycji w oknie sterowania oprogramowaniem: napięcie lampy rentgenowskiej, 90 kV; Prąd lampy rentgenowskiej CT, 160 μA; Prąd lampy rentgenowskiej pod napięciem, 80 μA; Pole widzenia, 36 mm; Brak techniki bramkowania; Technika skanowania, wysoka rozdzielczość 4 min.</li>
	<li>Znieczulić myszy przez inhalację 3% izofluranu i umieścić je na łóżku włożonym do otworu ze stożkiem nosowym zapewniającym stały dopływ środka znieczulającego. Unieruchom łapy myszy za pomocą taśmy na łóżku, aby umożliwić odsłonięcie klatki piersiowej.</li>
	<li>Przesuń drzwiczki instrumentu i włącz tryb Live, aby zobaczyć pozycję myszy w czasie rzeczywistym, naciskając przycisk przechwytywania. Przesuń legowisko dla zwierząt, aby wyrównać klatkę piersiową z polem widzenia (FOV) za pomocą przycisków znajdujących się bezpośrednio na przyrządzie CT. Wyśrodkuj skanowanie na myszy; jeśli nie, dostosuj pozycję za pomocą strzałek w lewo i w prawo znajdujących się na przyrządzie CT.</li>
	<li>Potwierdź optymalną pozycję łoża, obracając suwnicę, wybierając 90° i klikając Ustaw. Upewnij się, że obszar do zobrazowania znajduje się całkowicie wewnątrz pola widzenia.</li>
	<li>Nie stosuj żadnej techniki bramkowania i rozpocznij skanowanie, klikając przycisk CT Scan. Kliknij przycisk yes (tak), aby wyświetlić komunikat informujący, że źródło promieniowania rentgenowskiego zostanie włączone. 
	UWAGA: Po włączeniu promieni rentgenowskich pomarańczowa lampka na górze przyrządu zostanie podświetlona, a drzwi przesuwne nie będą mogły zostać otwarte ze względu na bezpieczeństwo operatora. Po zakończeniu skanowania pojawi się nowe okno oprogramowania 2D Viewer pokazujące transosiowy, czołowy i strzałkowy wycinek rekonstrukcji.</li>
	<li>Sprawdź jakość obrazu i upewnij się, że obrazy z ruchów nie są rozmazane z powodu niskiego poziomu znieczulenia. W razie potrzeby powtórz skanowanie.</li>
	<li>Umieść zwierzęta z powrotem w klatce i upewnij się, że w pełni wyzdrowieją po znieczuleniu.</li>
</ol>
4. Płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe
<ol>
	<li>Znieczulić zwierzęta 3% izofluranem i złożyć je w uśmierceniu poprzez krwawienie z aorty brzusznej.</li>
	<li>Użyj nożyczek, aby odsłonić klatkę piersiową i szyję. Następnie odsłoń tchawicę i wykonaj małe nacięcie, aby umożliwić wykonanie procedury BAL za pomocą rurki do płukania o rozmiarze 21 dołączonej do strzykawki o pojemności 1 ml bez igły. Uważaj, aby nie przeciąć tchawicy.</li>
	<li>Aby wykonać BAL, napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml bez igły 0,6 ml sterylnego roztworu [10x zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS); 100 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA); 1 mM kwas 4-(2-hydroksy-etylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES); woda destylowana].</li>
	<li>Wprowadzić rurkę do płukania do nacięcia w tchawicy i powoli wstrzykiwać i odciągać roztwór 3 razy, zatrzymując się przy trzecim pobraniu, aby umożliwić optymalne pobranie BALF do późniejszej analizy.</li>
</ol>
5. Histologia i histomorfometria
<ol>
	<li>Odsłoń i usuń płuca, napompuj je kaniulą przez tchawicę przez delikatny wlew 0,6 ml 10% neutralnie buforowanej formaliny i przechowuj próbki w temperaturze pokojowej przez 24 godziny.</li>
	<li>Odwadniać próbki przez różne kanały w rosnących stężeniach roztworów alkoholowych (60% etanolu przez 1 godzinę, 70% etanolu przez 1 godzinę, 90% etanolu przez 1 godzinę, 95% etanolu przez 2 godziny i 100% etanolu przez 2 godziny) za pomocą automatycznego procesora tkanek.</li>
	<li>Umieść próbki w ksylenie na 2 godziny, aby były przezroczyste. Pod koniec odwadniania próbki należy zanurzyć w parafinie w temperaturze 60 °C przez 3 godziny i zatopić je w automatycznym procesorze.</li>
	<li>Uzyskać odcinki szeregowe o grubości 5 μm za pomocą mikrotomu obrotowego.</li>
	<li>Deparafinowanie i ponowne uwodnienie szkiełek w malejących gatunkach etanolu i barwienie za pomocą Trichromu Massona za pomocą automatycznego procesora tkankowego.</li>
	<li>Ręcznie ustaw ostrość na wycinkach płuc, skanując w 20-krotnym powiększeniu za pomocą skanera slajdów i przechwytuj cyfrowe obrazy całych odcinków płuc za pomocą oprogramowania do przeglądania o rozdzielczości 451 nm/piksel.</li>
	<li>Morfologicznie ocenić zwłóknienie płuc za pomocą parametrów półilościowych i ilościowych w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Określ wynik Ashcrofta. Półilościowo oceniane zmiany morfologiczne w przekrojach płuc według skali zdefiniowanej przez Ashcroft10 zmodyfikowanej przez Hübnera i wsp.25 Użyj systemu punktacji 0-8, aby ocenić wszystkie miąższy w odcinkach płuc.</li>
		<li>Określ zawartość kolagenu. Określ ilościowo stopień zwłóknienia10,25 za pomocą oprogramowania do analizy obrazu mikroskopowego. Losowo wybierz trzy zwroty z inwestycji przy 10-krotnym powiększeniu na każdy slajd. Poprzez standaryzację ustawień progu koloru, wykryj kolagen jako obszar zabarwiony na zielono.</li>
		<li>Określ obszar powietrza pęcherzyków płucnych. Określ ilościowo obszar powietrza pęcherzykowego jako pośredni parametr zwłóknienia10,25. Za pomocą tego samego oprogramowania i ROI, które są stosowane dla frakcji zwłóknienia, wykryj obszar powietrza w ROI za pomocą białego progu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Wynn, T. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21727191">Integrating mechanisms of pulmonary fibrosis.</a> J. Exp. Med. 208 (7), 1339-1350 (2011).</li>
<li>Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+fibrosis%3A+therapeutic+translation+for+fibrotic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease.</a> Nat. Med. 18 (7), 1028-1040 (2012).</li>
<li>Moore, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+fibrotic+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Animal models of fibrotic lung disease.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 49 (2), 167-179 (2013).</li>
<li>Ackermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+nintedanib+on+the+microvascular+architecture+in+a+lung+fibrosis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Effects of nintedanib on the microvascular architecture in a lung fibrosis model.</a> Angiogenesis. , (2017).</li>
<li>Moore, B. B., Hogaboam, C. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17993587">Murine models of pulmonary fibrosis.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 294 (2), 152-160 (2008).</li>
<li>Organ, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+segmental+challenge+model+for+bleomycin-induced+pulmonary+fibrosis+in+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Lung+Res%22%5BJournal%5D)">A novel segmental challenge model for bleomycin-induced pulmonary fibrosis in sheep.</a> Exp Lung Res. 41 (3), 115-134 (2015).</li>
<li>Organ, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+correlations+in+a+large+animal+model+of+bleomycin-induced+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Pulm+Med%22%5BJournal%5D)">Structural and functional correlations in a large animal model of bleomycin-induced pulmonary fibrosis.</a> BMC Pulm Med. 15, 81(2015).</li>
<li>Shen, B., Du, L., Sanchez, C., Edwards, D. J., Chen, M., Murrell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+the+bleomycin+biosynthetic+gene+cluster+from+Streptomyces+verticillus+ATCC15003%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nat+Prod%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of the bleomycin biosynthetic gene cluster from Streptomyces verticillus ATCC15003.</a> J Nat Prod. 65 (3), 422-431 (2002).</li>
<li>Yu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Delivery+of+Bleomycin%3A+A+Comprehensive+Anticancer+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Cancer+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Targeted Delivery of Bleomycin: A Comprehensive Anticancer Review.</a> Curr Cancer Drug Targets. 16 (6), 509-521 (2016).</li>
<li>Ashcroft, T., Simpson, J. M., Timbrell, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+method+of+estimating+severity+of+pulmonary+fibrosis+on+a+numerical+scale%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Simple method of estimating severity of pulmonary fibrosis on a numerical scale.</a> J Clin Pathol. 41 (4), 467-470 (1988).</li>
<li>Stellari, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+the+lung+inflammatory+response+to+Pseudomonas+aeruginosa+and+its+modulation+by+azithromycin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of the lung inflammatory response to Pseudomonas aeruginosa and its modulation by azithromycin.</a> J Transl Med. 13, 251(2015).</li>
<li>Stellari, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+monitoring+of+lung+inflammation+in+CFTR-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo monitoring of lung inflammation in CFTR-deficient mice.</a> J Transl Med. 14 (1), 226(2016).</li>
<li>Stellari, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+transiently+transgenized+mice+with+a+bovine+interleukin+8+%28CXCL8%29+promoter%2Fluciferase+reporter+construct%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of transiently transgenized mice with a bovine interleukin 8 (CXCL8) promoter/luciferase reporter construct.</a> PloS one. 7 (6), 39716(2012).</li>
<li>Stellari, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enlightened+Mannhemia+haemolytica+lung+inflammation+in+bovinized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Enlightened Mannhemia haemolytica lung inflammation in bovinized mice.</a> Vet Res. 45, 8(2014).</li>
<li>Tassali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MR+imaging%2C+targeting+and+characterization+of+pulmonary+fibrosis+using+intra-tracheal+administration+of+gadolinium-based+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Contrast+Media+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">MR imaging, targeting and characterization of pulmonary fibrosis using intra-tracheal administration of gadolinium-based nanoparticles.</a> Contrast Media Mol Imaging. 11 (5), 396-404 (2016).</li>
<li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+asthmatic+inflammation+using+hybrid+fluorescence+molecular+tomography-x-ray+computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Assessment of asthmatic inflammation using hybrid fluorescence molecular tomography-x-ray computed tomography.</a> J Biomed Opt. 21 (1), 15009(2016).</li>
<li>Van de Velde, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+micro-CT+provides+biomarkers+of+lung+disease+that+can+be+used+to+assess+the+effect+of+therapy+in+preclinical+mouse+models%2C+and+reveal+compensatory+changes+in+lung+volume%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Longitudinal micro-CT provides biomarkers of lung disease that can be used to assess the effect of therapy in preclinical mouse models, and reveal compensatory changes in lung volume.</a> Dis Model Mech. 9 (1), 91-98 (2016).</li>
<li>Stellari, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterologous+Matrix+Metalloproteinase+Gene+Promoter+Activity+Allows+In+Vivo+Real-time+Imaging+of+Bleomycin-Induced+Lung+Fibrosis+in+Transiently+Transgenized+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Heterologous Matrix Metalloproteinase Gene Promoter Activity Allows In Vivo Real-time Imaging of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Transiently Transgenized Mice.</a> Front Immunol. 8, 199(2017).</li>
<li>Hellbach, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+dark-field+radiography+facilitates+the+diagnosis+of+pulmonary+fibrosis+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">X-ray dark-field radiography facilitates the diagnosis of pulmonary fibrosis in a mouse model.</a> Sci Rep. 7 (1), 340(2017).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+imaging+of+experimental+lung+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Noninvasive imaging of experimental lung fibrosis.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 53 (1), 8-13 (2015).</li>
<li>Ruscitti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+assessment+of+bleomycin-induced+lung+fibrosis+by+Micro-CT+correlates+with+histological+evaluation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Multidiscip+Respir+Med%22%5BJournal%5D)">Longitudinal assessment of bleomycin-induced lung fibrosis by Micro-CT correlates with histological evaluation in mice.</a> Multidiscip Respir Med. 12, 8(2017).</li>
<li>Stellari, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+inflammation+and+airway+remodeling+by+fluorescence+molecular+tomography+in+a+chronic+asthma+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Monitoring inflammation and airway remodeling by fluorescence molecular tomography in a chronic asthma model.</a> J Transl Med. 13, 336(2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals%2C+8th+ed%22">Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8th ed</a>. , National Research Council. Washington DC. (2011).</li>
<li>Meganck, J. A., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dosimetry+in+Micro-computed+Tomography%3A+a+Review+of+the+Measurement+Methods%2C+Impacts%2C+and+Characterization+of+the+Quantum+GX+Imaging+System%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">Dosimetry in Micro-computed Tomography: a Review of the Measurement Methods, Impacts, and Characterization of the Quantum GX Imaging System.</a> Mol Imaging Biol. , (2016).</li>
<li>Hubner, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+quantification+of+pulmonary+fibrosis+in+histological+samples%29%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples).</a> BioTechniques. 44 (4), 507-514 (2008).</li>
<li>King, T. E., Pardo, A., Selman, M. <a target="_blank" href="http://www.soneco.com.ar/images/diapositivas/fibrosis_pulmonar_idiopatica.pdf">Idiopathic pulmonary fibrosis.</a> Lancet. 378 (9807), 1949-1961 (2011).</li>
<li>De Langhe, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+lung+fibrosis+and+emphysema+in+mice+using+automated+micro-computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Quantification of lung fibrosis and emphysema in mice using automated micro-computed tomography.</a> PloS one. 7 (8), 43123(2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Pomimo tego, że wiele grup badawczych koncentruje się na opracowywaniu nowych leków do leczenia IPF, w tej chwili tylko dwa są dostępne dla pacjentów. Istnieje pilna potrzeba medyczna znalezienia skuteczniejszych terapii7 , ponieważ tylko przeszczep płuc jest w stanie przedłużyć przeżycie o 4-5 lat26. Podstawowym warunkiem wstępnym dla medycyny translacyjnej i opracowywania nowych leków jest dostępność modelu zwierzęcego, który naśladuje cechy IPF i w którym badania interwe...

Idiopatyczne zwłóknienie płuc (IPF) to przewlekła choroba płuc z postępującym spadkiem funkcji płuc, która niestety często kończy się śmiercią w ciągu czterech lat od diagnozy1. Głównymi cechami IPF są odkładanie się macierzy zewnątrzkomórkowej i proliferacja fibroblastów, ale patogeneza nie jest jeszcze w pełni poznana. Najbardziej uzasadnioną hipotezą jest to, że wielokrotne cykle urazów płuc powodują niszczenie komórek nabłonka pęcherzyków płucnych, co prowadzi do zmiany proliferacji mezenchymalnego cyklu komórkowego, nadmiernej akumulacji fibroblastów i miofibroblastów oraz zwiększonej produkcji macierzy. Stwierdzono, że mediatory zaangażowane w te procesy, takie jak metaloproteinazy macierzy (MMP), są rozregulowane w rozwoju zwłóknienia zarówno w ludzkim IPF, jak i w modelach zwierzęcych indukowanych bleomycyną. Niekontrolowana produkcja MMP prowadzi do niezrównoważonego odkładania się kolagenu w śródmiąższu płuc i przestrzeni pęcherzykowej, naśladując nieprawidłowe gojenie się ran1,2.
Jedną z głównych przeszkód w odkrywaniu i opracowywaniu leków jest dostępność dostępnych modeli mysich, które naśladują ludzką patogenezę i fenotyp choroby. Do wywołania zwłóknienia płuc w modelach zwierzęcych zastosowano różne czynniki: uszkodzenie spowodowane promieniowaniem, podawanie azbestu i krzemionki, podawanie cytokin fibrynogennych i bleomycyny3,4; Jednak bleomycyna jest najczęściej stosowana u myszy, szczurów, świnek morskich, chomików, królików5 lub u dużych zwierząt (naczelnych, koni, psów i przeżuwaczy)6,7. Bleomycyna jest antybiotykiem wytwarzanym przez bakterię Streptomyces verticillus8 i jest stosowana jako środek przeciwnowotworowy9. Zwłóknienie płuc jest częstym skutkiem ubocznym leku i z tego powodu jest on stosowany w eksperymentalnych modelach zwierzęcych do wywoływania zwłóknienia płuc.
W modelach zwłóknienia płuc wywołanego bleomycyną, zmiany zwłóknieniowe występują 14 - 21 dni po podaniu bleomycyny. W prezentowanej pracy zastosowaliśmy nowy protokół indukcji zwłóknienia płuc u myszy poprzez podwójne wkroplenie bleomycyny dotchawiczej. Mysi model bleomycyny jest bardzo czasochłonny, ponieważ nowe leki muszą być oceniane na ustalonych zmianach zwłóknieniowych i testowane w celu odróżnienia ich działania przeciwzwłóknieniowego od przeciwzapalnego.
Biochemiczne określenie zawartości kolagenu, analiza morfometryczna i histologiczna opierały się na analizie post mortem, co ograniczyło możliwość śledzenia patogenezy choroby u tego samego zwierzęcia. Chociaż parametry te zostały uznane za złoty standard oceny zwłóknienia, nie zapewniały one żadnego czasowego ani przestrzennego rozkładu zmiany zwłóknieniowej i wykluczały sposób badania procesu progresji choroby. 10
Ostatnio zastosowano nieinwazyjne technologie obrazowania do monitorowania przebudowy dróg oddechowych, stanu zapalnego i postępu zwłóknienia w modelach mysich: rezonans magnetyczny (MRI), mikrotomografia komputerowa (Micro-CT), fluorescencyjna tomografia molekularna (FMT) i bioluminescencyjna (BLI)11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21. Proponujemy nieinwazyjne podejście do obrazowania w celu monitorowania podłużnej progresji zwłóknienia płuc za pomocą FMT i Micro-CT w różnych punktach czasowych po prowokacji bleomycyną 22.
Wiele ścieżek bierze udział w powstawaniu i rozwoju zwłóknienia, a niewiele wiadomo. Tylko głębsze zrozumienie tych procesów może przełożyć się na większą liczbę celów lekowych, które mogą zostać przeniesione do kliniki. Możliwość wzdłużnego monitorowania aktywacji MMP za pomocą fluorescencyjnej tomografii molekularnej w połączeniu z wykrywaniem zmian miąższowych płuc za pomocą mikrotomografii komputerowej może być w przyszłości wykorzystana w celu uzyskania dostępu do odpowiedzi klinicznej na leczenie.

<table><tbody><tr><td>System tomografii fluorescencyjnej FMT 2500</td><td>Perkin Elmer Inc.</td><td>Eksperymentalny budowniczy</td><td></td></tr><tr><td>MMPsense 680</td><td>Perkin Elmer Inc.</td><td>NEV10126</td><td>Chronić przed światłem, przechowuj sondę w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Oprogramowanie TrueQuant</td><td>Perkin Elmer Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Samica wsobna C57BL/6</td><td>San Pietro NatisoneHorst, Holandia (UD),&nbsp;</td><td></td><td>Przed użyciem zwierzęta były aklimatyzowane przez co najmniej 5 dni do lokalnych warunków wiwarium</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>ESTEVE spa</td><td>571329.8</td><td>Nie wdychać</td></tr><tr><td>Automatyczny licznik komórek</td><td>Dasit XT 1800J</td><td>Eksperymentalny budowniczy</td><td></td></tr><tr><td>roztwór soli fizjologicznej, 0,9% chlorek sodu (NaCl)</td><td>Eurospital</td><td>15A2807</td><td></td></tr><tr><td>Skaner mikrotomografii komputerowej Quantum FX&nbsp;</td><td>Perkin Elmer Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siarczan bleomycyny ze Streptomyces Verticillus&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; B2434&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Automatyczny procesor tkanek&nbsp;</td><td>ATP700 Histo-Line Laboratories</td><td>ATP700&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>System osadzania&nbsp;</td><td>EG 1160 Leica Biosystems</td><td>EG 1160</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom obrotowy&nbsp;</td><td>Cyfrowy skaner slajdów Slee Cut 6062</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>NanoZoomer S60, oprogramowanie do analizy obrazu NIS-AR firmy Hamamatsu Photonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Masson' s Trichrome Staining</td><td>Histo-Line Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% neutralnie buforowana formalina</td><td>Sigma</td><td>HT5012-1CS</td><td></td></tr><tr><td>Penn-century model DP-4M Insulator suchej energii</td><td>Penn-century</td><td>DPM-EXT</td><td></td></tr><tr><td>PE190 mikrorurki medyczne</td><td>2instrumenty biologiczne snc</td><td>BB31695-PE/8</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka bez igły 5 ml</td><td>Terumo</td><td>SS*05SE1</td><td>Wytnij deski tłoka nożyczkami</td></tr><tr><td>Hamilton 0,10 ml (model 1710)</td><td>Gazoszczelny</td><td>81022</td><td></td></tr><tr><td>Discofix 3-drożny kran</td><td>Braun</td><td>4095111</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka z igłą 1 ml</td><td>Roztwór</td><td>3,071,260,300,320</td><td>Używaj bez igły</td></tr><tr><td>Plastikowe rurki do karmienia 18 ga x 50 mm</td><td>2instrumenty biologiczne snc</td><td>FTP-18-50</td><td>Przyciąć ukośnie końcówkę&nbsp;</td></tr></tbody></table>

multimodalne podejście do obrazowania oparte na mikrotomografii komputerowej i fluorescencyjnej tomografii molekularnej do podłużnej oceny zwłóknienia płuc wywołanego bleomycyną u myszy

A Multimodal Imaging Approach Based on Micro-CT and Fluorescence Molecular Tomography for Longitudinal Assessment of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Mice

Idiopatyczne zwłóknienie płuc (IPF) jest śmiertelną chorobą płuc charakteryzującą się postępującym i nieodwracalnym niszczeniem architektury płuc, co powoduje znaczne pogorszenie czynności płuc i późniejszą śmierć z powodu niewydolności oddechowej.
Patogeneza IPF w eksperymentalnych modelach zwierzęcych została wywołana przez podanie bleomycyny. W tym badaniu badamy mysi model podobny do IPF wywołany podwójnym wkropleniem bleomycyny dotchawiczej. Standardowe oceny histologiczne stosowane do badania zwłóknienia płuc są inwazyjnymi procedurami terminalnymi. Celem tej pracy jest monitorowanie zwłóknienia płuc za pomocą nieinwazyjnych technik obrazowania, takich jak fluorescencyjna tomografia molekularna (FMT) i mikrotomografia komputerowa. Te dwie technologie, zweryfikowane za pomocą wyników histologicznych, mogą stanowić rewolucyjne podejście funkcjonalne do nieinwazyjnego monitorowania w czasie rzeczywistym ciężkości i progresji choroby IPF. Połączenie różnych podejść stanowi krok naprzód w zrozumieniu choroby IPF, w której zdarzenia molekularne występujące w stanie patologicznym można obserwować za pomocą FMT, a późniejsze zmiany anatomiczne można monitorować za pomocą mikrotomografii komputerowej.

Spontaniczna regresja zmian włóknienia płuc obserwowana trzy tygodnie po jednorazowym podaniu bleomycyny oraz umiarkowane zmiany strukturalne wskazują na ograniczenia tego modelu. Ze względu na wąskie okno terapeutyczne, które nie odzwierciedla praktyki klinicznej, możliwe było przeprowadzenie jedynie leczenia zapobiegawczego17.
W niniejszej pracy wykazujemy, że nasz protokół podwójnej intratrachealnej in...

Opisujemy nieinwazyjne podejście do obrazowania multimodalnego oparte na Micro-CT i fluorescencyjnej tomografii molekularnej do podłużnej oceny modelu zwłóknienia płuc myszy wywołanego podwójnym wkropleniem dotchawiczym bleomycyny.

Multimodalne podejście do obrazowania oparte na mikrotomografii komputerowej i fluorescencyjnej tomografii molekularnej do podłużnej oceny zwłóknienia płuc wywołanego bleomycyną u myszy

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a fatal lung disease characterized by the progressive and irreversible destruction of lung architecture, which ...

Ogólnym celem tego badania na mysim modelu podobnym do IPF jest podłużne monitorowanie zwłóknienia płuc za pomocą nieinwazyjnych technik obrazowania, takich jak FMT i mikro-CT. Metoda ta może posunąć naprzód sekwencję w odniesieniu do tych konkretnych zdarzeń molekularnych występujących w zwłóknieniu płuc. Główną zaletą tej techniki jest to, że zmiany anatomiczne określonych zdarzeń molekularnych mogą być monitorowane w sposób nieinwazyjny.Zastosowania tych technologii rozszerzają się na terapię patologii IPF, ponieważ połączenie FMT i mikro-CT daje możliwość badania progresji choroby i oceny nowej terapii. Zacznij od umieszczenia znieczulonej myszy na platformie intubacyjnej, zawieszając ją za siekacze umieszczone na drucie. Włącz laryngoskop, a następnie weź parę kleszczy z końcami i delikatnie otwórz usta.Umieść ostrze laryngoskopu w kierunku tylnej części jamy ustnej, aż ujrzenie tchawicy zostanie uwidocznione. Drugą ręką włóż rurkę doprowadzającą podłączoną do końca rurki PE do tchawicy. Obróć zawór trójdrogowy, aby dostarczyć 50 mikrolitrów bleomycyny.Po instalacji szybko wyjmij rurkę z tchawicy, aby zapobiec uduszeniu. Trzymaj myszy pionowo przez kilka sekund. W celu wstrzyk

a-multimodal-imaging-approach-based-on-micro-ct-fluorescence

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Eksperymentalny model przerzutów do kości u myszy został ustanowiony po dokardialnym podaniu komórek guza piersi wykazujących ekspresję lucyferazy. Rozwój guza oraz powstałe zmiany osteolityczne monitorowano podłużnie za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego oraz mikro-CT.

Monitorowanie przerzutów nowotworowych i zmian osteolitycznych za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego i mikro-tomografii komputerowej

Dyfuzyjna tomografia fluorescencyjna oferuje stosunkowo niskokosztowe i potencjalnie wysokoprzepustowe podejście do przedklinowego obrazowania guzów in vivo. Przedstawiono metodologię zbierania danych optycznych, kalibracji i rekonstrukcji obrazu dla bezkontaktowego systemu w dziedzinie czasu sterowanego tomografią komputerową, z wykorzystaniem fluorescencyjnego celowania w biomarker nowotworowy – receptor Epidermal Growth Factor Receptor w modelu glejaka u myszy.

Tomografia dyfuzyjna fluorescencji w dziedzinie czasu sterowana tomografią komputerową u małych zwierząt w celu lokalizacji biomarkerów nowotworowych

Opisujemy protokół obrazowania hybrydowego, łączący tomografię za pośrednictwem fluorescencji (FMT) z mikrotomografią komputerową (μCT). Po fuzji i rekonstrukcji przeprowadzamy interaktywną segmentację narządów w celu wyodrębnienia ilościowych pomiarów rozkładu fluorescencji.

Hybrydowe obrazowanie μCT-FMT i analiza obrazu

Opisujemy metodę wykrywania rozwoju guzka guza w płucach mysiego modelu gruczolakoraka za pomocą mikrotomografii komputerowej i jej użycie do monitorowania zmian wielkości guzka w czasie i w odpowiedzi na leczenie. Dokładność oceny potwierdzono kwantyfikacją histologiczną punktu końcowego.

Wykorzystanie mikrotomografii komputerowej do oceny rozwoju guza i obserwacji odpowiedzi na leczenie w mysim modelu raka płuc

Opisujemy metodę znacznego zwiększenia ortotopowego wszczepienia komórek raka płuc do płuc myszy poprzez wstępne kondycjonowanie dróg oddechowych z uszkodzeniem. Podejście to może być również stosowane do badania interakcji zrębu w mikrośrodowisku płuc, rozsiewu przerzutów, chorób współistniejących raka płuc oraz do bardziej efektywnego generowania ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów.

Wstępne kondycjonowanie dróg oddechowych myszy za pomocą bleomycyny zwiększa skuteczność ortotopowego wszczepienia komórek raka płuc

Tutaj używamy obrazowania bioluminescencyjnego, rentgenowskiego i pozytonowej tomografii emisyjnej/tomografii komputerowej, aby zbadać, jak hamowanie aktywności mTOR wpływa na guzy szpiczaka kostnego przeszczepionego szpiczakiem kostnym w modelu ksenoprzeszczepu. Pozwala to na fizjologicznie istotne, nieinwazyjne i multimodalne analizy działania przeciwszpiczaka mózgu terapii ukierunkowanych na guzy szpiczaka kostnego przeszczepione szpiczakiem kostnym in vivo.

Multimodalna bioluminescencyjna i pozytroniczna tomografia emisyjna/tomografia obliczeniowa ksenoprzeszczepów szpiczaka mnogiego szpiku kostnego u myszy NOG

Tutaj prezentujemy skuteczną metodę badania aktywności przeciwzwłóknieniowej ludzkich mezenchymalnych komórek zrębu podawanych dożylnie, uzyskanych z całej pępowiny po indukcji uszkodzenia płuc przez wstrzyknięcie dotchawicze bleomycyny u myszy C57BL/6. Protokół ten można łatwo rozszerzyć na badania przedkliniczne innych środków terapeutycznych.

Indukcja uszkodzenia płuc myszy przez wstrzyknięcie dotchwiaczą bleomycyny

W tym miejscu przedstawiamy protokół wykorzystania mikrotomografii komputerowej (mikro-CT) do ilościowego oznaczania wentylowanych regionów w jednostronnym modelu zwłóknienia płuc wywołanego bleomycyną poprzez wkroplenie dotchawicze po stronie zmiany.

Jednostronna analiza objętości płuc za pomocą mikrotomografii komputerowej w celu lepszej oceny zwłóknienia płuc w modelach przedklinicznych

Ten protokół demonstruje technikę aspiracji ustno-gardłowej do użycia w mysim modelu zwłóknienia płuc z bleomycyną.

Podawanie bleomycyny w jamie ustnej i gardłowej w mysim modelu zwłóknienia płuc

Przedstawiamy protokół modelowania włóknienia płuc u myszy z wykorzystaniem aerozozolizowanej bleomycyny podanej przez tchawicę. Ta zoptymalizowana metoda umożliwia jednolite, ilościowe i precyzyjne podanie bez nacięcia chirurgicznego, zwiększając powtarzalność i wiarygodność włóknienia wywołanego bleomycyną.

Udoskonalona metoda podawania bleomycyny wewnątrztchawicowej oparta na aerozoli dla powtarzalnych i minimalnie inwazyjnych modeli myszy z włóknieniem płuc

Poznaj nieinwazyjne obrazowanie mikro-CT i FMT do podłużnej oceny zwłóknienia płuc u myszy. Ta metoda umożliwia monitorowanie zmian anatomicznych i zdarzeń molekularnych w modelu IPF.

Multimodalne podejście do obrazowania oparte na mikrotomografii komputerowej i fluorescencyjnej tomografii molekularnej do podłużnej oceny zwłóknienia płuc wywołanego bleomycyną u myszy (Wideo) | JoVE Journal

Multimodalne podejście do obrazowania oparte na mikrotomografii komputerowej i fluorescencyjnej tomografii molekularnej do podłużnej oceny zwłóknienia płuc wywołanego bleomycyną u myszy

Przeglądaj więcej filmów