Name: Ocena uszkodzeń DNA in vitro za pomocą testu komety (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Poznaj test kometowy do oceny uszkodzeń DNA in vitro w komórkach nowotworowych. Ta metoda pozwala ilościowo mierzyć uszkodzenia DNA i jest stosowana w badaniach genotoksyczności oraz ocenie skuteczności chemioterapii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Intramural Research Program NIH, NCI i CCR. Wszyscy autorzy otrzymali Intramural Research Grant od NIH, NCI i CCR.

1. Przygotowanie odczynników
<ol>
	<li>1x PBS
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć 10 mL 10x PBS w 90 mL dH2O i dostosować pH do 7,4 za pomocą pH-metru. Przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwór do lizy (LS)
	<ol>
		<li>Przygotować 2,5 M NaCl, 10 mM EDTA dwusodowego, 10 mM Tris base oraz 20 mM NaOH w 90 mL dH2O; zazwyczaj potrzeba około 20 min, aby mieszanina całkowicie się rozpuściła. Dostosować pH do 10 za pomocą pH-metru. Dodać 1% sarcosinianu sodu oraz 1% Triton X-10 i dopełnić końcową objętość do 1 0 mL. Chłodzić w temperaturze 4 °C przez co najmniej 30 min przed użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zasadowy roztwór do elektroforezy (AES), pH &gt;13
	<ol>
		<li>Przygotować 20 mM NaOH i 1 mM EDTA dwusodowego w 80 mL dH2O. Skorygować pH i upewnić się, że pH &gt;13. Dopełnić końcową objętość do 1 0 mL. Przygotować świeżą porcję przed użyciem i chłodzić w temperaturze 4 °C przez co najmniej 30 min przed użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Neutralny roztwór do elektroforezy (NES)
	<ol>
		<li>Przygotować 1 0 mL neutralnego buforu do elektroforezy, mieszając 10 mM Tris base i 30 mM octanu sodu w 1 0 mL dH2O. Dostosować pH do 9,0 za pomocą octowego kwasu lodowatego. Chłodzić w temperaturze 4 °C przez co najmniej 30 min przed użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwór do precypitacji DNA (DPS)
	<ol>
		<li>Przygotować 10 mL roztworu zapasowego 7,5 M octanu amonu. Aby uzyskać 50 mL roztworu do precypitacji DNA, zmieszać 6,7 mL 7,5 M octanu amonu z 43,3 mL 95% etanolu. Przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwór barwiący
	<ol>
		<li>Dodać 1 µL 10 0x zielonego fluorescencyjnego barwnika do kwasów nukleinowych (np. SYBR Green) do 30 mL buforu Tris-EDTA (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA dwusodowego, pH 7,4) i przechowywać w temperaturze 4 °C. Chronić przed światłem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>1% agaroza niskotopliwa
	<ol>
		<li>Roztopić 1% agarozę niskotopliwą (1 g w 10 mL dH2O) w mikrofalówce. Mieszać agarozę co 15-20 s, aby upewnić się, że jest całkowicie roztopiona. Umieścić agarozę w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C na co najmniej 20 min przed użyciem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podgrzane końcówki do pipet
	<ol>
		<li>Odciąć wąskie końce końcówek do pipet P20 o 3 mm i ogrzać w temperaturze 37 °C przed pipetowaniem agarozy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie szkiełek do testu kometowego
<ol>
	<li>Powlekanie szkiełek
	<ol>
		<li>Rozpuścić 1% agarozę (1 g w 10 mL dH2O) w mikrofalówce przez 2 - 3 min lub do całkowitego roztopienia agarozy. Zanurzyć szklane szkiełka mikroskopowe w agarozie i przetrzeć jedną stronę szkiełka za pomocą bezpyłowej chusteczki.</li>
		<li>Położyć szkiełka na płaskiej powierzchni do wyschnięcia na powietrzu lub podgrzać w temperaturze 50 °C w celu przyspieszenia suszenia; po wyschnięciu powinna utworzyć się przezroczysta warstwa agarozy. Przed użyciem umieścić powleczone szkiełka w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek
	<ol>
		<li>Hodowla i przygotowanie komórek glejaka
		<ol>
			<li>Hodować komórki U251 MG w pożywce DMEM-Ham F-12 uzupełnionej o 10% FBS, 100 U/mL penicyliny i 10 µg/mL streptomycyny w temperaturze 37 °C przy 5% CO2.</li>
			<li>Przebrać komórki, stosując 1 mL trypsyny przez 3 min, a następnie zneutralizować trypsynę za pomocą pożywki DMEM-Ham F-12 z FBS. Zebrać komórki do probówki 15 mL, wirować przy 300 x g przez 4 min, odessać pożywkę i zawiesić komórki w stężeniu 2 x 105 komórek/mL w 1x PBS. 
			UWAGA: Próbkę komórkową należy przygotować bezpośrednio przed rozpoczęciem analizy, a wszystkie próbki należy przechowywać i przetwarzać w ciemności lub przy przyciemnionym świetle, aby zapobiec uszkodzeniom DNA wywołanym przez światło.</li>
			<li>Połączyć zawiesinę komórkową z 1% roztopioną agarozą o niskiej temperaturze topnienia (w 37 °C) w stosunku 1:10 (v/v), delikatnie wymieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół, a następnie niezwłocznie nanieść 30 µL na szkiełko. Użyć boku końcówki pipety do rozprowadzenia mieszaniny agarozy i komórek, aby zapewnić utworzenie cienkiej warstwy.</li>
			<li>Położyć szkiełko płasko w temperaturze 4 °C w ciemności przez 10 min. Wydłużenie czasu żelowania do 30 min poprawia przyleganie próbek w środowiskach o wysokiej wilgotności.</li>
			<li>Zanurzyć szkiełko w 4 °C LS w ciemności od 1 h do całej nocy.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Elektroforeza pojedynczych komórek
<ol>
	<li>Przejdź do analizy komet w warunkach zasadowych (krok 3.2) lub neutralnych (krok 3.3)</li>
	<li>Dla analizy komet w warunkach zasadowych
	<ol>
		<li>Ostrożnie wyjmij preparaty z LS, odlej nadmiar buforu i delikatnie zanurz w AES na 1 h w temperaturze 4 °C, aby umożliwić rozwijanie DNA. Przechowuj preparaty w ciemności.</li>
		<li>Wlej schłodzony AES do kuwety elektroforetycznej, nie przekraczając poziomu 0,5 cm powyżej preparatów (zależy to od rozmiaru urządzenia do elektroforezy), umieść w niej preparaty i przykryj pokrywką. Ustaw napięcie zasilacza na 1 V/cm (odległość między elektrodami) i prowadź elektroforezę przez 30 min w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Odlej nadmiar roztworu elektroforetycznego z preparatów. Delikatnie zanurz preparaty dwukrotnie w dH2O na 5 min każdy w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Delikatnie zanurz preparaty w 70% etanolu na 5 min w temperaturze pokojowej. Przejdź do kroku 4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dla analizy komet w warunkach neutralnych
	<ol>
		<li>Ostrożnie wyjmij preparaty z LS, odlej nadmiar buforu i delikatnie zanurz w NES na 30 min w temperaturze 4 °C. Przechowuj preparaty w ciemności.</li>
		<li>Wlej schłodzony neutralny bufor elektroforetyczny do kuwety elektroforetycznej, nie przekraczając poziomu 0,5 cm powyżej preparatów (zależy to od rozmiaru urządzenia do elektroforezy), umieść w niej preparaty i przykryj pokrywką. Ustaw napięcie zasilacza na 1 V/cm (odległość między elektrodami) i prowadź elektroforezę przez 45 min w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Odlej nadmiar buforu z preparatów. Delikatnie zanurz preparaty w DPS na 30 min w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Delikatnie zanurz preparaty w 70% etanolu na 30 min w temperaturze pokojowej. Przejdź do kroku 4.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Barwienie preparatów Comet
<ol>
	<li>Suszyć preparaty w temperaturze 37 °C przez 10 - 15 min w ciemności.</li>
	<li>Nanieść 50 - 10 µL zielonego fluorescencyjnego roztworu do barwienia kwasów nukleinowych na każdy wysuszony żel agarozowy i barwić przez 15 min w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Krótko wypłukać preparaty w dH2O i całkowicie wysuszyć w temperaturze 37 °C w ciemności. Przejść do akwizycji obrazów i analizy.</li>
</ol>
5. Pozyskiwanie i analiza obrazów
UWAGA: Wizualizacja i kwantyfikacja pęknięć DNA opierają się na mikroskopii epifluorescencyjnej oraz oprogramowaniu do testu komet (patrz Tabela materiałów)12.
<ol>
	<li>Umieść preparaty na mikroskopie, używając uchwytu do szkiełek. Upewnij się, że żel agarozy jest skierowany w stronę obiektywu. Wykonaj losowe zdjęcia barwionych preparatów do testu komet, używając mikroskopu fluorescencyjnego z obiektywem 10x. Unikaj krawędzi oraz obszarów wokół pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Należy upewnić się, że każdy ogon komety jest rozłożony poziomo. Glowy komet powinny znajdować się po lewej stronie, a ogony po prawej.</li>
	<li>Zapisz każdy obraz w binarnym formacie TIF z jasnym barwieniem DNA i ciemnym tłem. Wczytaj obrazy do oprogramowania, korzystając z przycisku „Select files to analyze” (Wybierz pliki do analizy), który znajduje się po lewej stronie paska narzędzi. Powinno pojawić się okno podglądu obrazu (Rycina 1).</li>
	<li>Narysuj na ekranie ramkę pomiarową i dostosuj jej rozmiar do komety komórkowej. Kliknij przycisk „Adjust”, aby ustawić próg dla głowy, komety i ogona zgodnie z obrazem, a następnie kliknij przycisk „Start measurements” (Rysunek 1).</li>
	<li>Wybierz komórkę za pomocą ramki i uruchom pomiar, klikając myszą przycisk „Assay the comet”; w oknie „profiles” pojawi się obraz intensywności z wybranymi parametrami pomiaru. Wyniki można zapisać, klikając przycisk „store result” (Rysunek 1). 
	UWAGA: Oprogramowanie oblicza parametry, w tym długość ogona komety, procent DNA w ogonie oraz moment ogona (TM) i moment ogona Olive'a (OTM). Moment ogona oblicza się według następujących wzorów: 
	<img alt="Wzór na obliczanie Tm; analiza uszkodzeń DNA; równanie." src="/files/ftp_upload/56450/56450eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"> 
	<img alt="Równanie OTM do oceny uszkodzeń DNA; wzór przedstawia Tail.mean minus Head.mean podzielone przez 10." src="/files/ftp_upload/56450/56450eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 2"></li>
	<li>Przeanalizuj co najmniej 50 komórek dla każdej grupy badawczej.</li>
</ol>

<ol><li>Ostling, O., Johanson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrophoretic+study+of+radiation-induced+DNA+damages+in+individual+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 123 (1), 291-298 (1984).</li>
<li>Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Exp Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).</li>
<li>Tice, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+gel%2Fcomet+assay%3A+guidelines+for+in+vitro+and+in+vivo+genetic+toxicology+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Mol+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Single cell gel/comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing.</a> Environ Mol Mutagen. 35 (3), 206-221 (2000).</li>
<li>Shah, A. J., Lakkad, B. C., Rao, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotoxicity+in+lead+treated+human+lymphocytes+evaluated+by+micronucleus+and+comet+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Genotoxicity in lead treated human lymphocytes evaluated by micronucleus and comet assays.</a> Indian J Exp Biol. 54 (8), 502-508 (2016).</li>
<li>Azqueta, A., Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essential+comet+assay%3A+a+comprehensive+guide+to+measuring+DNA+damage+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Toxicol%22%5BJournal%5D)">The essential comet assay: a comprehensive guide to measuring DNA damage and repair.</a> Arch Toxicol. 87 (6), 949-968 (2013).</li>
<li>Goldstein, M., Kastan, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+damage+response%3A+implications+for+tumor+responses+to+radiation+and+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">The DNA damage response: implications for tumor responses to radiation and chemotherapy.</a> Annu Rev Med. 66, 129-143 (2015).</li>
<li>Gavande, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+repair+targeted+therapy%3A+The+past+or+future+of+cancer+treatment%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">DNA repair targeted therapy: The past or future of cancer treatment?</a> Pharmacol Ther. 160, 65-83 (2016).</li>
<li>Torgovnick, A., Schumacher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+repair+mechanisms+in+cancer+development+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">DNA repair mechanisms in cancer development and therapy.</a> Front Genet. 6, 157(2015).</li>
<li>Weston, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PARP+inhibitor+olaparib+induces+significant+killing+of+ATM-deficient+lymphoid+tumor+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The PARP inhibitor olaparib induces significant killing of ATM-deficient lymphoid tumor cells in vitro and in vivo.</a> Blood. 116 (22), 4578-4587 (2010).</li>
<li>Brown, J. S., O'Carrigan, B., Jackson, S. P., Yap, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+DNA+Repair+in+Cancer%3A+Beyond+PARP+Inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Targeting DNA Repair in Cancer: Beyond PARP Inhibitors.</a> Cancer Discov. 7 (1), 20-37 (2017).</li>
<li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensitivity+of+IDH1-Mutated+Gliomas+Due+to+an+Impairment+in+PARP1-Mediated+DNA+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Chemosensitivity of IDH1-Mutated Gliomas Due to an Impairment in PARP1-Mediated DNA Repair.</a> Cancer Res. 77 (7), 1709-1718 (2017).</li>
<li>Konca, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cross-platform+public+domain+PC+image-analysis+program+for+the+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">A cross-platform public domain PC image-analysis program for the comet assay.</a> Mutat Res. 534 (1-2), 15-20 (2003).</li>
<li>Valverde, M., Rojas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+and+occupational+biomonitoring+using+the+Comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Environmental and occupational biomonitoring using the Comet assay.</a> Mutat Res. 681 (1), 93-109 (2009).</li>
<li>Collins, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay+for+DNA+damage+and+repair%3A+principles%2C+applications%2C+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations.</a> Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).</li>
<li>Karbaschi, M., Cooke, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+for+the+high-throughput+processing+of+slides+for+the+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Novel method for the high-throughput processing of slides for the comet assay.</a> Sci Rep. 4, 7200(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Test kometarny jest skutecznym narzędziem do pomiaru pęknięć jedno- i dwuniciowego DNA na poziomie komórkowym. Test ten jest szeroko stosowany jako "złoty standard" w badaniach dotyczących genotoksyczności i biomonitoringu13, począwszy od zmian podstawowych, wiązań krzyżowych DNA, opracowywania leków i miejsc wrażliwych na zasady. W niniejszym badaniu pokazaliśmy dwa odrębne protokoły krok po kroku odpowiednio dla alkalicznych i neutralnych testów komet. Łącząc elektroforezę jednokomórkową, mikros...

Test komet został po raz pierwszy opracowany przez Ostlinga i Johansona w 1984 roku, poprzez demonstrację migracji fragmentów DNA z jąder w warunkach neutralnych1. Technika ta została później opracowana przez Singha i wsp., wykazując, że warunki alkaliczne znacznie zwiększyły specyficzność i odtwarzalność testu2. Od tego czasu neutralny test kometarny jest najczęściej używany do wykrywania dwuniciowych pęknięć DNA, podczas gdy alkaliczny test komet jest bardziej czuły na mniejsze ilości uszkodzeń DNA, w tym pęknięcia jedno- i dwuniciowego DNA, miejsca alkaliczno-labilne, sieciowanie DNA-DNA lub DNA-białko oraz pęknięcia pojedynczej nici DNA związane z niekompletnymi miejscami naprawy wycięcia3,4. Oba testy umożliwiają wizualizację pofragmentowanego DNA i zapewniają prosty sposób ilościowej oceny uszkodzeń DNA. Test komet jest uważany za czułą metodę dla genetycznych badań toksykologicznych in vitro i in vivo i ma zastosowanie w różnych obszarach badawczych, takich jak wczesna selekcja kandydatów na leki, monitorowanie środowiska, biomonitoring człowieka oraz podstawowe badania nad uszkodzeniem i naprawą DNA5. 
Zasada testu polega na tym, że pod wpływem pola elektrycznego, rozdrobnione DNA migruje z ciała nukleoidowego (znanego również jako "głowa komety") i tworzy plamę DNA w żelu agarozowym (znanym również jako "warkocz komety"). Dzięki barwieniu nukleotydami zakres uszkodzeń DNA można określić ilościowo, analizując "komety" utworzone przez elektroforezę pojedynczej komórki. Obliczanie momentu ogonowego może dodatkowo pomóc w porównaniu uszkodzeń DNA między różnymi grupami eksperymentalnymi. W porównaniu z tradycyjnymi metodami wykrywania uszkodzeń DNA, test komety jest bezpośredni, czuły, niedrogi i stosunkowo prosty.
Radioterapia i chemioterapia to powszechne strategie leczenia raka poprzez generowanie jedno- i dwuniciowych pęknięć DNA w chromosomach6. Niedawny postęp w dziedzinie inhibitorów naprawy DNA pozwala na bardziej skuteczne działanie genotoksyczne poprzez chemioterapię skojarzoną, a tym samym potencjalnie zmniejsza ogólnoustrojowe skutki uboczne, takie jak niedokrwistość, infekcje i supresja szpiku kostnego7,8. W tym badaniu pokazaliśmy badanie inhibitora polimerazy poli(ADP-rybozy) (PARP), olaparybu (Ola)9. PARP jest powszechnie występującym białkiem jądrowym i jest odpowiedzialny za naprawę przez wycinanie zasad DNA poprzez tworzenie polimeru poli (ADP-rybozy) 10. Temozolomid (TMZ) jest dostępnym doustnie środkiem alkilującym i jest szeroko stosowany w leczeniu pacjentów z glejakiem. Używając testu komety do ilościowego określenia uszkodzeń DNA, wykazaliśmy, że połączenie olaparybu z temozolomidem znacznie zwiększa uszkodzenia DNA w komórkach glejaka, co sugeruje, że terapia skojarzona olaparyb/temozolomid jest skuteczną strategią leczenia glejaka, w porównaniu z samym temozolomidem11.

<table><tbody><tr><td>Reodczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x PBS(Ca++, Mg++ wolny)</td><td>TEKnova</td><td>P0196</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>TEKnova</td><td>E0308</td><td></td></tr><tr><td>Baza Trizma</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>Lauryl sarkozynian sodu</td><td>Sigma</td><td>L7414</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>Sigma</td><td>32318</td><td></td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>Sigma</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>Octan amonu</td><td>Sigma</td><td>A1542</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Zielony</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Niski temperatura topnienia agarozy</td><td>Invitrogen</td><td>16520</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Invitrogen</td><td>16500</td><td></td></tr><tr><td>95% etanol</td><td>WARNER-GRAHAM</td><td>#64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>GIBICO</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Comments</mocny></td></tr><tr><td><mocny>Materiały eksploatacyjne</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka bibułkowe</td><td>MIKROSKOPIA ELEKTRONOWA NAUKI</td><td>63422-11</td><td></td></tr><tr><td>Chusteczki Kimwipes</td><td>KIMberly-Clark</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Mikrowirówki</td><td>DENVILLE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet</td><td>SHARP</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>strong>Nazwa</td><td>Firma<</td><td>strong>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Wyposażenia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microwave</td><td>Avanti</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>PRECISION</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pozioma komora do elektroforezy</td><td>TREVIGEN</td><td>Cometassay ES II</td><td></td></tr><tr><td>Zasilanie</td> Inkubator <td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Quincy Lab</td><td>Model 12-140E</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Zeiss</td><td>LSM700</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ocena uszkodzeń dna in vitro za pomocą testu komety

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Uszkodzenie DNA jest powszechnym zjawiskiem dla każdej komórki podczas jej życia i jest definiowane jako zmiana struktury chemicznej genomowego DNA. Terapie przeciwnowotworowe, takie jak radioterapia i chemioterapia, wprowadzają ogromne ilości dodatkowych uszkodzeń DNA, prowadząc do zatrzymania cyklu komórkowego i apoptozy w celu ograniczenia progresji raka. Ilościowa ocena uszkodzeń DNA podczas eksperymentalnej terapii przeciwnowotworowej jest kluczowym krokiem w celu uzasadnienia skuteczności czynnika genotoksycznego. W tym badaniu skupiamy się na teście elektroforezy jednokomórkowej, znanym również jako test kometowy, który może określić ilościowo pęknięcia jedno- i dwuniciowego DNA in vitro. Test komety to metoda kwantyfikacji uszkodzeń DNA, która jest wydajna i łatwa do wykonania, a także charakteryzuje się niskimi wymaganiami czasowymi/budżetowymi i wysoką odtwarzalnością. W tym miejscu podkreślamy przydatność testu kometarnego w badaniu przedklinicznym poprzez ocenę genotoksycznego wpływu terapii skojarzonej olaparyb/temozolomid na komórki glejaka U251.

Niniejszy protokół opisuje krok po kroku przebieg analizy w metodzie kometowej oraz analizy danych (Rysunek 1). Wyniki alkalicznego i neutralnego testu kometowego wykazały, że ogon komety w komórkach U251 traktowanych doksorubicyną (1 µM, 20 h) był dłuższy i charakteryzował się wyższą intensywnością DNA, co sugeruje znaczną akumulację pofragmentowanego DNA w wyniku chemioterapii (Rysunek 2).
<p class="jove_content" fo:keep-to...

Test komet jest skuteczną metodą wykrywania uszkodzeń DNA, w tym jedno- i dwuniciowych pęknięć DNA. Opisujemy alkaliczne i neutralne testy komet w celu zmierzenia uszkodzeń DNA w komórkach nowotworowych w celu oceny efektu terapeutycznego chemioterapii.

Ocena uszkodzeń DNA in vitro za pomocą testu komety

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest zbadanie skuteczności czynników genotoksycznych w komórkach nowotworowych za pomocą testu elektroforezy pojedynczej komórki, który jest również nazywany testem kometowym. Procedura ta ma na celu zmierzenie czterech genetycznych badań toksykologicznych. Ma to zastosowanie do różnych etapów, takich jak wcześniejsza selekcja kandydatów na leki oraz podstawowe badania nad uszkodzeniem i naprawą DNA.Technika ta zapewnia bezpośredni sposób ilościowej oceny uszkodzeń DNA. Jest wydajny, łatwy do wykonania i stosunkowo niedrogi. Przygotuj agarozę do powlekania szkiełkiem, topiąc jeden procent agarozy w kuchence mikrofalowej przez dwie do trzech minut lub do momentu, gdy agaroza całkowicie się stopi.Zanurz szklane szkiełko mikroskopowe w agarozie i użyj niestrzępiącej się chusteczki, aby wytrzeć jedną stronę szkiełka. Połóż szkiełko na płaskiej powierzchni do wyschnięcia na powietrzu. Po wysuszeniu należy utworzyć przezroczysty film agarozowy.Przed użyciem umieść powlekane szkiełka w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Efekt terapeutyczny chemioterapii ocenia się w komórkach glejaka U251 hodowanych w pożywce DMEM/Ham F-12 uzupełnionej 10% FBS, 100 jednostek na mililitr penicyliny i 10 mikrogramów na mililitr streptomycyny. Trawić komórki za pomocą jednego mililitra trypsyny przez trzy minuty, a następnie zneutralizować trypsynę za pomocą pożywki DMEM/Ham F-12 z FBS.Zbierz komórki w 15-mililitrowej probówce. I wiruj z prędkością 300 razy G przez cztery minuty. Zassać pożywkę.I zawieś komórki dwa razy od 10 do piątych komórek na mililitr w 1x PBS. i powinny być przygotowane bezpośrednio przed rozpoczęciem testu. A z nim należy obchodzić się w ciemności.Wszystko w przyćmionym świetle, aby zapobiec uszkodzeniom. Połącz zawiesinę komórkową z jednym procentem stopionej agarozy o niskiej temperaturze topnienia w stosunku objętościowym od jednego do 10. Delikatnie mieszać, pipetując w górę i w dół.I natychmiast odpipetować 30 mikrolitrów na szkiełko. Użyj suwaka końcówki pipety, aby rozprowadzić mieszaninę agarozy, aby zapewnić utworzenie cienkiej warstwy. Umieść szkiełka płasko w temperaturze czterech stopni Celsjusza, w ciemności, na 10 minut.Zanurz szkiełka w roztworze do lizy o temperaturze czterech stopni Celsjusza, w ciemności na godzinę do nocy. W przypadku alkalicznego testu komety delikatnie usuń szkiełka z roztworu do lizy, spuść nadmiar płynu i delikatnie zanurz szkiełka w AES w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza na jedną godzinę, aby umożliwić rozwinięcie DNA. Dodaj wstępnie schłodzony AES do tacki na szkiełka do elektroforezy.Nie przekraczaj 0.5 centymetra nad zjeżdżalniami. Umieść szkiełka w środku i przykryj nakrętką. Ustaw napięcie zasilania na jeden wolt na centymetr i pracuj w czterech stopniach Celsjusza przez 30 minut.Po zakończeniu elektroforezy spuść nadmiar AES ze szkiełek. Delikatnie zanurz szkiełka dwukrotnie w wodzie destylowanej o temperaturze pokojowej na pięć minut za każdym razem. Następnie delikatnie zanurz szkiełka w 70% etanolu o temperaturze pokojowej na pięć minut.W przypadku neutralnego testu komety delikatnie wyjmij szkiełka z roztworu do lizy, spuść nadmiar płynu i delikatnie zanurz w NES w ciemności, w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 30 minut. Dodaj wstępnie schłodzony NES do tacki na szkiełka do elektroforezy, nie przekraczając 0,5 centymetra nad szkiełkami. Umieść szkiełka w środku i przykryj nakrętką.Ustaw napięcie zasilania na jeden wolt na centymetr i pracuj w czterech stopniach Celsjusza przez 45 minut. Spuść nadmiar bufora ze szkiełek. Delikatnie zanurz szkiełka w roztworze do wytrącania DNA o temperaturze pokojowej na 30 minut.Po 30 minutach delikatnie zanurz szkiełka w 70% etanolu w temperaturze pokojowej na 30 minut. Rozpocznij tę procedurę od wysuszenia szkiełek w ciemności w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10-15 minut. Następnie umieść 50-100 mikrolitrów zielonego fluorescencyjnego roztworu barwiącego kwasy nukleinowe na wysuszonej agarozie każdego szkiełka i barwić przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.Szkiełka należy krótko opłukać w wodzie destylowanej i całkowicie wysuszyć w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemności. Wykonaj akwizycję i analizę obrazu natychmiast po zabarwieniu szkiełek komety. Umieść szkiełko pod mikroskopem fluorescencyjnym z uchwytem na szkiełko.Wybierz soczewkę obiektywu 10X i upewnij się, że żel agarozowy jest skierowany w stronę soczewki obiektywu. Losowo przechwytuj obrazy z każdego poplamionego slajdu komety. Unikaj krawędzi i obszarów wokół pęcherzyków powietrza.Upewnij się, że każdy warkocz komety jest rozłożony poziomo. Głowy komety powinny zaczynać się z lewej strony, a warkocz z prawej. Zapisz każde zdjęcie w formacie binarnym z jasnym barwnikiem DNA i ciemnym tłem.W celu analizy obrazu, najpierw załaduj wszystkie obrazy do oprogramowania do oznaczania komet, używając przycisku Wybierz pliki do analizy, który znajduje się po lewej stronie paska narzędzi. Powinno pojawić się okno widoku obrazu. Narysuj ramkę pomiarową na ekranie i dostosuj jej rozmiar zgodnie z kometą komórki.Kliknij dostosuj, aby ustawić próg głowy, komety i warkocza, zgodnie z obrazem. A następnie kliknij przycisk Rozpocznij pomiary. Wybierz komórkę za pomocą ramki i aktywuj pomiar, klikając przycisk Test komety.W oknie profili pojawi się obraz intensywności z wybranymi parametrami pomiaru. Zapisz wyniki, klikając przycisk Przechowuj wyniki. Przeanalizuj co najmniej 50 komórek na zabieg.Wyniki testów komet alkalicznych i neutralnych pokazują, że warkocze komet komórek UT51 traktowanych doksorubicyną były dłuższe i miały większą intensywność DNA, co sugeruje znaczną akumulację pofragmentowanego DNA. Analiza ilościowa dla testu alkalicznego lub neutralnego komety wykazała znacznie zwiększone tworzenie warkocza komety po leczeniu doksorubicyną, co wskazuje na uszkodzenie DNA. Skojarzone leczenie inhibitorem PARP, olaporibem, i środkiem alkilującym, temozolomidem, znacznie zwiększyło uszkodzenia DNA w komórkach glejaka, co znalazło odzwierciedlenie w zwiększonej długości i intensywności sygnału warkocza komety.Sam Olaporib nie powodował uszkodzeń DNA. Gdzie, ponieważ nasilał genotoksyczne działanie temozolomidu. Reprezentatywne obrazy komórek glejaka poddanych leczeniu pojedynczemu i skojarzonemu wykazały dłuższe i bardziej intensywne warkocze kometarne komórek leczonych temozolomidem i olaporibem.Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu pięciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się genotoksycznością do pomiaru pęknięć łańcucha DNA w wielu typach komórek ukaryotycznych. Takich jak hodowane komórki lub komórki wyizolowane z organizmów.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać testu komety do zbadania skuteczności czynnika genotoksycznego na poziomie pojedynczej komórki. Nie zapominaj, że praca z odczynnikiem do uszkodzeń może być bardzo niebezpieczna. Środki ostrożności, takie jak noszenie fartucha laboratoryjnego i rękawiczek, należy zawsze podejmować podczas wykonywania tej procedury.

evaluating-in-vitro-dna-damage-using-comet-assay

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

W tym filmie demonstrujemy alkaliczny test elektroforezy pojedynczej komórki, aby określić ilościowo zarówno jedno-, jak i dwuniciowe pęknięcia DNA w komórkach traktowanych doksorubicyną. Warunki alkaliczne przerywają wiązania wodorowe między parami zasad DNA, co powoduje całkowite odwijanie i rozdzielanie nici DNA. Pozwala to na różnicową migrację nieuszkodzonych i uszkodzonych fragmentów DNA w żelu agarozowym po elektroforezie, odsłaniając strukturę w kształcie komety składającą się z wolno...

Elektroforeza w żelu alkalicznym z pojedynczymi komórkami: czuła technika ilościowego szacowania uszkodzeń DNA w poszczególnych komórkach rakowych po chemioterapii

Film demonstruje test komety do wykrywania uszkodzeń DNA po ekspozycji na szkodliwe czynniki. W warunkach zasadowych DNA rozwija się i denaturuje, a po elektroforezie nieuszkodzone i uszkodzone DNA migruje inaczej w żelu agarozowym, tworząc strukturę w kształcie komety. Wolno migrujące, nieuszkodzone DNA tworzy okrągłą głowę komety, podczas gdy szybko migrujące uszkodzone fragmenty DNA tworzą wydłużony warkocz komety.

Test komety do wykrywania uszkodzeń DNA w komórkach

Test komet jest skutecznym sposobem wykrywania pęknięć jedno- i dwuniciowych, w tym miejsc alkaliczno-labilnych i powiązań krzyżowych DNA-DNA/DNA-protein na DNA we wszystkich komórkach, w tym w neuronach hipokampa. Metoda wykorzystuje zróżnicowaną migrację DNA w polu elektrycznym ze względu na różnice w ilości uszkodzeń DNA.

Oznaczanie uszkodzeń DNA w neuronach hipokampa za pomocą testu komety

Opisujemy tutaj platformę, która pozwala na wykrywanie uszkodzeń DNA metodą testów komet z niespotykaną dotąd wydajnością. Urządzenie tworzy modele komórek ssaków w mikromacierz i umożliwia równoległe przetwarzanie 96 próbek. Podejście to ułatwia analizę uszkodzeń DNA na poziomie podstawowym, uszkodzeń DNA wywołanych ekspozycją oraz kinetyki naprawy DNA.

CometChip: wysokowydajna, 96-dołkowa platforma do pomiaru uszkodzeń DNA w mikromacierzowanych komórkach ludzkich

Test Comet mierzy pęknięcia DNA, wywołane przez różne czynniki. Jeśli wszystkie czynniki (z wyjątkiem stresu oksydacyjnego) powodujące uszkodzenie DNA są utrzymywane na stałym poziomie, ilość uszkodzeń DNA jest dobrym pośrednim parametrem stresu oksydacyjnego. Celem tego protokołu jest wykorzystanie testu kometarnego do pośredniego pomiaru stresu oksydacyjnego.

Test komety jako pośrednia miara ogólnoustrojowego stresu oksydacyjnego

Alkaliczny test komet mierzy pęknięcia nici DNA w komórkach eukariotycznych. Dodając etap trawienia endonukleazy III lub ludzkiej 8-oksoguaniny-DNA-N-glikozylazy, test może skutecznie wykryć oksydacyjne uszkodzenie DNA. Opisujemy metody stosowania tych testów do wykrywania uszkodzeń DNA w wątrobie szczura.

In vivo (in vivo) Alkaliczny test kometologiczny i test alkaliczny komety modyfikowany enzymami do pomiaru pęknięć nici DNA i oksydacyjnych uszkodzeń DNA w wątrobie szczura

Ten protokół opisuje kilka procedur przygotowania wysokiej jakości zamrożonych próbek tkanek podczas sekcji zwłok do użycia w teście kometarnym do oceny uszkodzeń DNA: 1) zmielona tkanka, 2) zeskrobane komórki nabłonkowe z przewodu pokarmowego, oraz 3) sześcienne próbki tkanek, wymagające homogenizacji za pomocą urządzenia do mielenia tkanek.

Wykorzystanie zamrożonej tkanki w teście komety do oceny uszkodzeń DNA

Test kometarny jest popularnym sposobem wykrywania uszkodzeń DNA. W tym badaniu opisano podejście do przeprowadzania slajdów w reprezentatywnych wariantach testu komety. Takie podejście znacznie zwiększyło liczbę próbek przy jednoczesnym skróceniu czasu trwania testu, liczby manipulacji szkiełkami i ryzyka uszkodzenia żeli.

Wysokoprzepustowy test kometowy do oceny uszkodzeń DNA komórkowego

Protokół ten opisuje skuteczną metodę ilościowego określania różnic w uszkodzeniach DNA wywołanych przez inhibitory typu I i typu II w zmutowanych komórkach FLT3 poprzez zastosowanie testu komety.

Test kometarny w celu ilościowego określenia uszkodzeń DNA w komórkach 32D z ekspresją mutanta FLT3 po ekspozycji na inhibitory FLT3 typu I i II

Ten protokół opisuje odwrócony test inwazji pionowej, który może być użyty do ilościowego określenia zdolności migracji i inwazji komórek w trójwymiarowym otoczeniu, przy jednoczesnym zachowaniu mikrośrodowiska komórki. Ten test jest odpowiedni dla rzadkich i/lub wrażliwych komórek.

Ruch w górę: prosty i elastyczny protokół trójwymiarowego testu inwazyjnego in vitro

Poznaj test kometowy do oceny uszkodzeń DNA in vitro w komórkach nowotworowych. Ta metoda pozwala ilościowo mierzyć uszkodzenia DNA i jest stosowana w badaniach genotoksyczności oraz ocenie skuteczności chemioterapii.

Ocena uszkodzeń DNA in vitro za pomocą testu komety

Przeglądaj więcej filmów