Ocena uszkodzeń DNA in vitro za pomocą testu komety

Ogólnym celem tego eksperymentu jest zbadanie skuteczności czynników genotoksycznych w komórkach nowotworowych za pomocą testu elektroforezy pojedynczej komórki, który jest również nazywany testem kometowym. Procedura ta ma na celu zmierzenie czterech genetycznych badań toksykologicznych. Ma to zastosowanie do różnych etapów, takich jak wcześniejsza selekcja kandydatów na leki oraz podstawowe badania nad uszkodzeniem i naprawą DNA.

Technika ta zapewnia bezpośredni sposób ilościowej oceny uszkodzeń DNA. Jest wydajny, łatwy do wykonania i stosunkowo niedrogi. Przygotuj agarozę do powlekania szkiełkiem, topiąc jeden procent agarozy w kuchence mikrofalowej przez dwie do trzech minut lub do momentu, gdy agaroza całkowicie się stopi.

Zanurz szklane szkiełko mikroskopowe w agarozie i użyj niestrzępiącej się chusteczki, aby wytrzeć jedną stronę szkiełka. Połóż szkiełko na płaskiej powierzchni do wyschnięcia na powietrzu. Po wysuszeniu należy utworzyć przezroczysty film agarozowy.

Przed użyciem umieść powlekane szkiełka w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Efekt terapeutyczny chemioterapii ocenia się w komórkach glejaka U251 hodowanych w pożywce DMEM/Ham F-12 uzupełnionej 10% FBS, 100 jednostek na mililitr penicyliny i 10 mikrogramów na mililitr streptomycyny. Trawić komórki za pomocą jednego mililitra trypsyny przez trzy minuty, a następnie zneutralizować trypsynę za pomocą pożywki DMEM/Ham F-12 z FBS.

Zbierz komórki w 15-mililitrowej probówce. I wiruj z prędkością 300 razy G przez cztery minuty. Zassać pożywkę.

I zawieś komórki dwa razy od 10 do piątych komórek na mililitr w 1x PBS. i powinny być przygotowane bezpośrednio przed rozpoczęciem testu. A z nim należy obchodzić się w ciemności.

Wszystko w przyćmionym świetle, aby zapobiec uszkodzeniom. Połącz zawiesinę komórkową z jednym procentem stopionej agarozy o niskiej temperaturze topnienia w stosunku objętościowym od jednego do 10. Delikatnie mieszać, pipetując w górę i w dół.

I natychmiast odpipetować 30 mikrolitrów na szkiełko. Użyj suwaka końcówki pipety, aby rozprowadzić mieszaninę agarozy, aby zapewnić utworzenie cienkiej warstwy. Umieść szkiełka płasko w temperaturze czterech stopni Celsjusza, w ciemności, na 10 minut.

Zanurz szkiełka w roztworze do lizy o temperaturze czterech stopni Celsjusza, w ciemności na godzinę do nocy. W przypadku alkalicznego testu komety delikatnie usuń szkiełka z roztworu do lizy, spuść nadmiar płynu i delikatnie zanurz szkiełka w AES w ciemności w temperaturze czterech stopni Celsjusza na jedną godzinę, aby umożliwić rozwinięcie DNA. Dodaj wstępnie schłodzony AES do tacki na szkiełka do elektroforezy.

Nie przekraczaj 0.5 centymetra nad zjeżdżalniami. Umieść szkiełka w środku i przykryj nakrętką. Ustaw napięcie zasilania na jeden wolt na centymetr i pracuj w czterech stopniach Celsjusza przez 30 minut.

Po zakończeniu elektroforezy spuść nadmiar AES ze szkiełek. Delikatnie zanurz szkiełka dwukrotnie w wodzie destylowanej o temperaturze pokojowej na pięć minut za każdym razem. Następnie delikatnie zanurz szkiełka w 70% etanolu o temperaturze pokojowej na pięć minut.

W przypadku neutralnego testu komety delikatnie wyjmij szkiełka z roztworu do lizy, spuść nadmiar płynu i delikatnie zanurz w NES w ciemności, w temperaturze czterech stopni Celsjusza na 30 minut. Dodaj wstępnie schłodzony NES do tacki na szkiełka do elektroforezy, nie przekraczając 0,5 centymetra nad szkiełkami. Umieść szkiełka w środku i przykryj nakrętką.

Ustaw napięcie zasilania na jeden wolt na centymetr i pracuj w czterech stopniach Celsjusza przez 45 minut. Spuść nadmiar bufora ze szkiełek. Delikatnie zanurz szkiełka w roztworze do wytrącania DNA o temperaturze pokojowej na 30 minut.

Po 30 minutach delikatnie zanurz szkiełka w 70% etanolu w temperaturze pokojowej na 30 minut. Rozpocznij tę procedurę od wysuszenia szkiełek w ciemności w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10-15 minut. Następnie umieść 50-100 mikrolitrów zielonego fluorescencyjnego roztworu barwiącego kwasy nukleinowe na wysuszonej agarozie każdego szkiełka i barwić przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.

Szkiełka należy krótko opłukać w wodzie destylowanej i całkowicie wysuszyć w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemności. Wykonaj akwizycję i analizę obrazu natychmiast po zabarwieniu szkiełek komety. Umieść szkiełko pod mikroskopem fluorescencyjnym z uchwytem na szkiełko.

Wybierz soczewkę obiektywu 10X i upewnij się, że żel agarozowy jest skierowany w stronę soczewki obiektywu. Losowo przechwytuj obrazy z każdego poplamionego slajdu komety. Unikaj krawędzi i obszarów wokół pęcherzyków powietrza.

Upewnij się, że każdy warkocz komety jest rozłożony poziomo. Głowy komety powinny zaczynać się z lewej strony, a warkocz z prawej. Zapisz każde zdjęcie w formacie binarnym z jasnym barwnikiem DNA i ciemnym tłem.

W celu analizy obrazu, najpierw załaduj wszystkie obrazy do oprogramowania do oznaczania komet, używając przycisku Wybierz pliki do analizy, który znajduje się po lewej stronie paska narzędzi. Powinno pojawić się okno widoku obrazu. Narysuj ramkę pomiarową na ekranie i dostosuj jej rozmiar zgodnie z kometą komórki.

Kliknij dostosuj, aby ustawić próg głowy, komety i warkocza, zgodnie z obrazem. A następnie kliknij przycisk Rozpocznij pomiary. Wybierz komórkę za pomocą ramki i aktywuj pomiar, klikając przycisk Test komety.

W oknie profili pojawi się obraz intensywności z wybranymi parametrami pomiaru. Zapisz wyniki, klikając przycisk Przechowuj wyniki. Przeanalizuj co najmniej 50 komórek na zabieg.

Wyniki testów komet alkalicznych i neutralnych pokazują, że warkocze komet komórek UT51 traktowanych doksorubicyną były dłuższe i miały większą intensywność DNA, co sugeruje znaczną akumulację pofragmentowanego DNA. Analiza ilościowa dla testu alkalicznego lub neutralnego komety wykazała znacznie zwiększone tworzenie warkocza komety po leczeniu doksorubicyną, co wskazuje na uszkodzenie DNA. Skojarzone leczenie inhibitorem PARP, olaporibem, i środkiem alkilującym, temozolomidem, znacznie zwiększyło uszkodzenia DNA w komórkach glejaka, co znalazło odzwierciedlenie w zwiększonej długości i intensywności sygnału warkocza komety.

Sam Olaporib nie powodował uszkodzeń DNA. Gdzie, ponieważ nasilał genotoksyczne działanie temozolomidu. Reprezentatywne obrazy komórek glejaka poddanych leczeniu pojedynczemu i skojarzonemu wykazały dłuższe i bardziej intensywne warkocze kometarne komórek leczonych temozolomidem i olaporibem.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu pięciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się genotoksycznością do pomiaru pęknięć łańcucha DNA w wielu typach komórek ukaryotycznych. Takich jak hodowane komórki lub komórki wyizolowane z organizmów.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać testu komety do zbadania skuteczności czynnika genotoksycznego na poziomie pojedynczej komórki. Nie zapominaj, że praca z odczynnikiem do uszkodzeń może być bardzo niebezpieczna. Środki ostrożności, takie jak noszenie fartucha laboratoryjnego i rękawiczek, należy zawsze podejmować podczas wykonywania tej procedury.