Wykrywanie krętka boreliozy, Borrelia burgdorferi, u kleszczy za pomocą zagnieżdżonego PCR

Borelioza jest wyniszczającą chorobą wywoływaną przez patogen krętków Borrelia burgdorferi sensu lato. Bakteria jest przenoszona na ludzi poprzez ukąszenie zakażonego kleszcza i powoduje objawy wieloukładowe, które mogą wpływać na skórę, stawy, serce i układ nerwowy. Codzienne czynności, takie jak spacery z psem i wędrówki, mogą narażać ludzi na zwiększone ryzyko zarażenia się boreliozą.

Strategie walki z tym rosnącym zagrożeniem obejmują zatem solidne środki nadzoru, które mogą wskazać rozpowszechnienie patogenów u kleszczy i zidentyfikować niepokojące regiony geograficzne. Ten film pokazuje użyteczność zagnieżdżonej polimerowej reakcji łańcuchowej jako molekularnego narzędzia przesiewowego w kierunku Borrelia. Aby konkretnie zwiększyć, zarówno geny białka A na powierzchni zewnętrznej, jak i geny witeleliny B są celem amplifikacji.

Przepływ pracy rozpoczyna się od pobrania kleszczy, ekstrakcji DNA, a następnie wstępnej rundy PCR w celu wykrycia loci specyficznych dla Borrelia. PCR drugiej rundy wykorzystuje produkt pierwszej reakcji jako nową matrycę do generowania mniejszych fragmentów amplifikacji wewnętrznej. Kleszcz jest uważany za pozytywny dla patogenu, gdy wewnętrzne amplikony z obu genów Borrelia można wykryć za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.

Pasywny nadzór polega na pomocy obywateli i weterynarzy w zbieraniu i przekazywaniu kleszczy do testów. W ramach tego procesu ważne jest, aby uchwycić informacje, takie jak gospodarz kleszcza, data i miejsce spotkania. W laboratorium kleszcze powinny być najpierw sfotografowane i zidentyfikowane na podstawie porównania morfologicznego ze standardowymi kluczami.

Czułość zagnieżdżonego PCR sprawia, że technika ta jest podatna na zanieczyszczenie, dlatego każdy etap przetwarzania próbki powinien odbywać się w oddzielnym, czystym miejscu, a także należy uwzględnić wiele kontroli, aby upewnić się, że odczynniki i środowisko są wolne od zanieczyszczeń. Po odpowiednim przygotowaniu miejsca pracy przetnij kleszcza na pół w wysterylizowanej komorze bezpieczeństwa biologicznego i umieść połowę w probówce do mikrowirówki. Można zastosować dowolną procedurę izolacji DNA, która daje matrycę kompatybilną z PCR.

Ten film pokazuje prostą ekstrakcję DNA opartą na chelatacji. Na początek dodaj odpowiednią objętość buforu chelatacji litycznej w zależności od wielkości fragmentu kleszcza i homogenizuj za pomocą tłuczka do mikroprobówek. Próbki inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez 45 minut, wirować, a następnie odwirować zawartość.

Czekając, przygotuj świeże probówki do mikrowirówek dla każdej próbki, dozując 50 mikrometrów izopropanolu. Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki, wymieszać przez odwrócenie i ponownie odwirować jak poprzednio. Tym razem wyrzuć supernatant i przepłucz osad DNA 70% etanolem.

Usuń resztki płynu za pomocą pipety i susz granulkę na powietrzu przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Na koniec dodaj 50 mikrometrów 1-milimolowego Tris do każdej osadki i inkubuj przez godzinę w łaźni wodnej o temperaturze 60 stopni, aby ponownie zawiesić DNA. Próbki mogą być teraz przechowywane w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do przyszłych analiz molekularnych.

Zacznij od sterylizacji szafki PCR za pomocą światła UV i 70% etanolu. Koktajl reakcyjny składa się z mieszanki wzorcowej zawierającej polimerazę, wodę, startery zewnętrzne do przodu i do tyłu oraz DNA wyekstrahowane w poprzedniej procedurze. Oddzielne reakcje są ustawione tak, aby wykrywać OspA i FlaB niezależnie w każdej próbce kleszcza.

Odwiruj impulsowo próbki, umieść je w termocyklerze i zaprogramuj maszynę. Początkowy eksperyment PCR wykorzystuje zewnętrzne startery specyficzne dla genu, które wytwarzają długie amplikony. Produkty PCR z pierwszej reakcji stają się następnie matrycą do późniejszej amplifikacji.

Ten zagnieżdżony PCR wykorzystuje startery specyficzne dla genu, które wyżarzają się w pierwszym amplikonie, aby wytworzyć nowe, krótsze fragmenty DNA. Produkt z drugiej reakcji można teraz załadować obok drabinki referencyjnej masy cząsteczkowej na 1,2% żel agarozowy i poddać elektroforezie przez godzinę. Na koniec obejrzyj żel za pomocą transiluminatora.

W tym przykładzie każdy pas reprezentuje inną próbkę kleszcza, analizowaną zarówno pod kątem OspA, jak i FlaB. Amplikony są obecne tylko na niektórych pasach. Chociaż obie te próbki wygenerowały produkty PCR dla OspA, tylko jedna z nich wychwyciła FlaB.

Próbka musi wytwarzać prążki, aby oba geny zostały uznane za dodatnie. Oględziny produktów PCR pozwalają zatem na określenie statusu Borrelia każdego kleszcza. Ogólnie rzecz biorąc, zagnieżdżony PCR jest czułą, specyficzną i stosunkowo prostą techniką, którą można zastosować do nadzoru nad Borrelią.

Dane uzyskane w ramach takich inicjatyw mogą pomóc w identyfikacji regionów o znaczeniu geograficznym dla boreliozy i oszacowaniu częstości występowania tego patogenu w przyrodzie.