Name: Frakcjonowanie subkomórkowe w celu aktywacji ERK po leczeniu peptydami pochodzącymi z mitochondriów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Poznaj frakcjonowanie subkomórkowe w celu aktywacji ERK po leczeniu peptydami pochodzącymi z mitochondriów w liniach komórkowych SH-SY5Y i HEK293. Ta metoda pozwala badać szlaki sygnałowe i lokalizację fosfoprotein.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Ellison/AFAR Postdoctoral Fellowship in Aging Research Program dla SJK, oraz Glenn Foundation Award i granty NIH dla PC (1P01AG034906, 1R01GM 090311, 1R01ES 020812). W filmie pojawiają się wszyscy autorzy.

1. Leczenie komórek peptydami
<ol>
	<li>Umieść dwa miliony komórek SH-SY5Y lub HEK293 (2 x 106) w naczyniu o średnicy 10 cm i hoduj je przez 2 dni</li>
	<li>(Opcjonalnie) Następnego dnia przemyj komórki jednokrotnie zmodyfikowanym podłożem Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco bez surowicy i inkubuj z DMEM bez surowicy przez noc, jeśli zabieg musi być wykonany w pożywce wolnej od surowicy.</li>
	<li>W dniu 3 rozpuść peptydy S14G-humaniny w przefiltrowanej wodzie destylowanej o stężeniu 0,2 μm i rozpuść je w postaci 1 mM roztworu podstawowego. 
	UWAGA: Peptydy powinny być rozpuszczone w odpowiednim rozpuszczalniku, który można określić na podstawie charakterystyki sekwencji peptydu (np. całkowitego ładunku) i może być dostarczony przez producenta, jeśli peptydy są dostępne w handlu. Na przykład S14G-humanina, SHLP2 i SHLP6 oraz MOTS-c rozpuszczają się w wodzie. Podwielokrotność peptydów należy podać w odpowiedniej objętości (np. 50 μl), aby uniknąć cykli zamrażania i rozmrażania. Po rozmrożeniu nie używaj ich ponownie.</li>
	<li>Podwielokrotnić wstępnie ogrzaną pożywkę zawierającą surowicę lub bezsurowicę w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i dodać 1 mM roztworu podstawowego o temperaturze pokojowej, aby uzyskać stężenie robocze (np. 1 μM, 10 μM).</li>
	<li>Zastąp pożywkę 6 ml roztworu peptydowego z kroku 1.4. i inkubuj komórki przez odpowiedni czas. 
	UWAGA: Wybierz czas inkubacji w zależności od swojego stanu, który aktywuje ERK.</li>
</ol>
2. Subkomórkowe frakcjonowanie cytozolu i jądra
<ol>
	<li>Umyj komórki dwukrotnie 10 ml lodowatego PBS, zeskrob komórki z płytki w 5 ml lodowatego PBS i przenieś zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odessać PBS i ponownie zawiesić osad w 200 μl lodowatego buforu frakcjonującego (10 mM HEPES pH = 7,6, 3 mM MgCl2, 10 mM KCl, 5% (v/v) glicerol, 1% niejonowy środek powierzchniowo czynny (C13H22O(C2H4O)n), inhibitory proteazy/fosfatazy). 
	UWAGA: Aby utrzymać białka w stanie fosforylacji, inhibitor fosfatazy oraz inhibitor proteazy powinny być świeżo dodane, a próbki powinny być przez cały czas przechowywane na lodzie. Należy unikać powtarzania cykli zamrażania i rozmrażania próbek. Podwielokrotność próbek rozdrabnia się do niewielkiej ilości (np. 50 μg) przed zamrożeniem w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Zawiesinę zawiesiny inkubować na lodzie przez 15 minut, a następnie odwirować przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zbierz supernatant jako frakcję cytoplazmatyczną i zachowaj osad dla frakcji jądrowej.</li>
	<li>Odwirować supernatant w celu usunięcia resztek komórkowych i innych zanieczyszczeń w temperaturze 18 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, a następnie przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki. To jest frakcja cytozolu.</li>
	<li>Zawiesić osad w 200 μl lodowatego buforu do przemywania (10 mM HEPES pH = 7,6, 1,5 mM MgCl2, 420 mM NaCl, 25% (v/v) glicerolu, 0,2 mM EDTA, inhibitory proteazy/fosfatazy) i odwirować przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 μl lodowatego buforu do ekstrakcji jądrowej (20 mM HEPES pH = 7,6, 1,5 mM MgCl2, 420 mM NaCl, 25% (v/v) glicerol, 0,2 mM EDTA, inhibitory proteazy/fosfatazy) i sonikować 10 razy (5 s wł., 10 s wyłącz., 30% amp.) na lodzie.</li>
	<li>Wirować przy 18 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki. To jest frakcja jądrowa.</li>
	<li>Określić ilościowo ilość białka za pomocą testu BCA</li>
</ol>
3. Surowa frakcja mitochondrialna
<ol>
	<li>Umyj komórki w każdym 10 cm naczyniu 10 ml lodowatego PBS, dodaj 5 ml lodowatego PBS i odłącz komórki za pomocą skrobaka do komórek. 
	UWAGA: Użyj trzech 10-centymetrowych szalek komórek, aby uzyskać dobrą wydajność mitochondriów do Western Blotting.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i połączyć wszystkie z trzech 10-centymetrowych szalek w jedną stożkową probówkę o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 600 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odessać PBS i ponownie zawiesić osad w 1 ml lodowatego buforu do izolacji mitochondriów (10 mM Tris-MOPS, 1 mM EGTA/Tris, 200 mM sacharozy, dostosować do pH = 7,4).</li>
	<li>Homogenizować komórki za pomocą 25 pociągnięć homogenizatora o pojemności 2 ml tłuczkiem pokrytym politetrafluoroetylenem na lodzie. 
	UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie dla utrzymania integralności mitochondriów i maksymalizacji wydajności frakcji mitochondrialnej. Liczba pociągnięć powinna być zoptymalizowana dla każdego typu komórki. Wstępnie schłodzić homogenizator przed rozpoczęciem procedury.</li>
	<li>Przenieść homogenat do probówki do mikrowirówki i odwirować go przy 600 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia jąder i nieuszkodzonych komórek.</li>
	<li>Zebrać supernatant, przenieść go do nowej probówki do mikrowirówki i odwirować przy 7 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Osad jest luźny, należy ostrożnie zebrać supernatant i starać się nie naruszyć osadu.</li>
	<li>Usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad z 200 μl lodowatego buforu do izolacji mitochondriów i przenieść roztwór do nowej probówki do mikrowirówki. Odwirować probówkę o sile 7 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Powtórz krok 3.8, aby umyć granulkę. Na tym etapie nie jest konieczne przenoszenie supernatantu do nowej probówki do mikrowirówki.</li>
	<li>Usunąć supernatant z przemytego osadu i ponownie zawiesić osad zawierający mitochondria za pomocą 50 μl buforu RIPA.</li>
	<li>Inkubować zawiesinę na lodzie przez 10 minut.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę o sile 16 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki. To jest frakcja mitochondrialna.</li>
	<li>Określ ilościowo ilość białka za pomocą testu BCA.</li>
</ol>
4. Western Blotting dla białek fosfospecyficznych
<ol>
	<li>Wykonaj elektroforezę w żelu poliakrylamidowym SDS (8-16% wstępnie przygotowanego żelu) i przenieś białko do membrany PVDF4.</li>
	<li>Inkubować membranę z 5% BSA w TBST (0,1% Polisorbat 20) przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby zablokować niespecyficzne miejsca wiązania tła. 
	UWAGA: W celu wykrycia fosforylowanego białka, zablokuj błonę za pomocą BSA, a nie Milk. Mleko zawiera kazeinę, obficie występującą fosfoproteinę, która powoduje wysoki sygnał niespecyficzny.</li>
	<li>Inkubować błonę z pierwszorzędowym przeciwciałem (anty-fosfo-ERK1/2) w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Następnego dnia przemyj membranę TBST (0,1% polisorbatu 20) trzykrotnie przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować błonę z przeciwciałem drugorzędowym (anty-króliczym HRP) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyć membranę TBST (0,1% polisorbatu 20) trzy razy przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować membranę z roztworem ECL i obrazować membranę w analizatorze obrazu.</li>
	<li>Zdjąć membranę z buforem do oddzielania przez 15 minut w temperaturze pokojowej i przemyć membranę TBST trzy razy przez 5 minut.</li>
	<li>Powtórzyć kroki od 4.2 do 4.7 przy użyciu przeciwciała anty-całkowitego ERK1/2.</li>
	<li>Aby sprawdzić czystość każdej frakcji, uruchom SDS-PAGE i wykonaj immunobloty przy użyciu przeciwciał rozpoznających markery dla każdego przedziału (np. Lamina B1 dla jądra, GAPDH dla cytozolu i TOM20 dla mitochondriów).</li>
</ol>

<ol><li>Yen, K., Lee, C., Mehta, H., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+the+mitochondrial-derived+peptide+humanin+in+stress+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The emerging role of the mitochondrial-derived peptide humanin in stress resistance.</a> J. Mol. Endocrinol. 50 (1), 11-19 (2013).</li>
<li>Muzumdar, R. H., Huffman, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanin%3A+a+novel+central+regulator+of+peripheral+insulin+action%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Humanin: a novel central regulator of peripheral insulin action.</a> PloS one. 4 (7), 6334(2009).</li>
<li>Lee, C., Yen, K., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanin%3A+a+harbinger+of+mitochondrial-derived+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Humanin: a harbinger of mitochondrial-derived peptides.</a> Trends Endocrinol. Metab. 24 (5), 222-228 (2013).</li>
<li>Kim, S. J., Guerrero, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial-derived+peptide+humanin+activates+the+ERK1%2F2%2C+AKT%2C+and+STAT3+signaling+pathways+and+has+age-dependent+signaling+differences+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial-derived peptide humanin activates the ERK1/2, AKT, and STAT3 signaling pathways and has age-dependent signaling differences in the hippocampus.</a> Oncotarget. 7 (30), 46899-46912 (2016).</li>
<li>Ying, G., Iribarren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanin%2C+a+newly+identified+neuroprotective+factor%2C+uses+the+G+protein-coupled+formylpeptide+receptor-like-1+as+a+functional+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor.</a> J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).</li>
<li>Zhang, W., Liu, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPK+signal+pathways+in+the+regulation+of+cell+proliferation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">MAPK signal pathways in the regulation of cell proliferation in mammalian cells.</a> Cell Res. 12 (1), 9-18 (2002).</li>
<li>Huang, C., Jacobson, K., Schaller, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAP+kinases+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">MAP kinases and cell migration.</a> J. Cell Sci. 117, Pt 20 4619-4628 (2004).</li>
<li>Cagnol, S., Chambard, J. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERK+and+cell+death%3A+mechanisms+of+ERK-induced+cell+death--apoptosis%2C+autophagy+and+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">ERK and cell death: mechanisms of ERK-induced cell death--apoptosis, autophagy and senescence.</a> FEBS J. 277 (1), 2-21 (2010).</li>
<li>Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+and+properties+of+MAPKs%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Differential regulation and properties of MAPKs.</a> Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).</li>
<li>Morrison, D. K., Davis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+MAP+kinase+signaling+modules+by+scaffold+proteins+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev%22%5BJournal%5D)">Regulation of MAP kinase signaling modules by scaffold proteins in mammals.</a> Annu. Rev. Cell Dev. 19 (1), 91-118 (2003).</li>
<li>Wainstein, E., Seger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+subcellular+localization+of+ERK%3A+mechanisms+of+translocation+and+role+in+various+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The dynamic subcellular localization of ERK: mechanisms of translocation and role in various organelles.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 39, 15-20 (2016).</li>
<li>Zehorai, E., Yao, Z., Plotnikov, A., Seger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subcellular+localization+of+MEK+and+ERK--a+novel+nuclear+translocation+signal+%28NTS%29+paves+a+way+to+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The subcellular localization of MEK and ERK--a novel nuclear translocation signal (NTS) paves a way to the nucleus.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 314 (2), 213-220 (2010).</li>
<li>Kolch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinating+ERK%2FMAPK+signalling+through+scaffolds+and+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Coordinating ERK/MAPK signalling through scaffolds and inhibitors.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (11), 827-837 (2005).</li>
<li>Horbinski, C., Chu, C. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15589366">Kinase signaling cascades in the mitochondrion: a matter of life or death.</a> Free Radic. Biol. Med. 38 (1), 2-11 (2005).</li>
<li>Aebersold, D. M., Shaul, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+signal-regulated+kinase+1c+%28ERK1c%29%2C+a+novel+42-kilodalton+ERK%2C+demonstrates+unique+modes+of+regulation%2C+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular signal-regulated kinase 1c (ERK1c), a novel 42-kilodalton ERK, demonstrates unique modes of regulation, localization.</a> Mol Cell Biol. 24 (22), 10000-10015 (2004).</li>
<li>Zhu, J. -H., Guo, F., Shelburne, J., Watkins, S., Chu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+phosphorylated+ERK%2FMAP+kinases+to+mitochondria+and+autophagosomes+in+Lewy+body+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Localization of phosphorylated ERK/MAP kinases to mitochondria and autophagosomes in Lewy body diseases.</a> Brain Pathol. 13 (4), 473-481 (2003).</li>
<li>Cobb, L. J., Lee, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+mitochondrial-derived+peptides+are+age-dependent+regulators+of+apoptosis%2C+insulin+sensitivity%2C+and+inflammatory+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring mitochondrial-derived peptides are age-dependent regulators of apoptosis, insulin sensitivity, and inflammatory markers.</a> Aging. 8 (4), 796-809 (2016).</li>
<li>Ihle, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Stat+family+in+cytokine+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Stat family in cytokine signaling.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 13 (2), 211-217 (2001).</li>
<li>Xu, Y. S., Liang, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+Undergoes+Acetylation-dependent+Mitochondrial+Translocation+to+Regulate+Pyruvate+Metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">STAT3 Undergoes Acetylation-dependent Mitochondrial Translocation to Regulate Pyruvate Metabolism.</a> Sci. Rep. 6 (1), 39517(2016).</li>
<li>You, L., Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25951043">The role of STAT3 in autophagy.</a> Autophagy. 11 (5), 729-739 (2015).</li>
<li>Hashimoto, Y., Niikura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+characterization+of+neuroprotection+by+a+rescue+factor+humanin+against+various+Alzheimer%27s+disease-relevant+insults%5BTitle%5D)+AND+%22The+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Detailed characterization of neuroprotection by a rescue factor humanin against various Alzheimer's disease-relevant insults.</a> The J Neurosci. 21 (23), 9235-9245 (2001).</li>
<li>Ying, G., Iribarren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanin%2C+a+newly+identified+neuroprotective+factor%2C+uses+the+G+protein-coupled+formylpeptide+receptor-like-1+as+a+functional+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor.</a> J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).</li>
<li>Hashimoto, Y., Kurita, M., et al. Humanin inhibits apoptosis in pituitary tumor cells through several signaling pathways including NF-κB activation. Mol. Biol. Cell. 20 (12), 2864-2873 (2009).</li>
</ol>

Pinchas Cohen jest udziałowcem i konsultantem w CohBar, Inc. Kelvin Yen pełnił funkcję konsultanta w CohBar, Inc.

Tutaj wykazaliśmy, że aktywacja ERK1 / 2 za pośrednictwem peptydu humaniny zachodzi w dwóch różnych typach komórek, a subkomórkowa lokalizacja aktywowanego ERK1 / 2 może być różna w zależności od warunków (np. dawki peptydu, punktu czasowego i typu komórki). Wykazano, że humanina wysyła sygnały przez dwa różne receptory22,23, co może wyjaśniać różnice w sygnalizacji między dwiema liniami komórkowymi, a także zapotrzebowanie na różne dawki humaniny. Fizjo...

Pojawiające się badania pokazują, że peptydy pochodzenia mitochondrialnego (MDP) odgrywają ważną rolę w cytoprotekcji i metabolizmie1,2,3. Zrozumienie szlaku transdukcji sygnału w obecności MDP daje nam wgląd w mechanizm, za pomocą którego MDP modulują różne funkcje. Wykazano, że pierwszy zidentyfikowany MDP, humanina, zwiększa fosforylację kinazy 1/2 regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK1/2) poprzez wiązanie z receptorem4,5. Jednak dalszy efekt aktywacji ERK1/2 jest nadal niedostatecznie zbadany.
Kaskada ERK1/2 służy jako niezbędny mediator w różnych procesach komórkowych, w tym proliferacji, migracji komórek, metabolizmu komórkowego, przeżycia i apoptozy6,7,8. Aby zaaranżować wszystkie te odrębne procesy komórkowe, aktywność i subkomórkowa lokalizacja ERK1/2 są ściśle regulowane przez fosfatazy i białka rusztowania9,10. Oprócz modyfikacji potranslacyjnej, dynamiczne przenoszenie ERK1/2 reguluje również jego funkcję sygnalizacyjną, aktywność i swoistość11,12. ERK1/2 jest przede wszystkim zlokalizowany w klasie cytozol<sup="xref">13. Zestaw białek kotwiczących i rusztujących pomaga zatrzymać ERK1/2 w elementach cytoszkieletu, na powierzchni organelli lub rozproszonych w cytoplazmie13. Po stymulacji ERK1/2 ulega fosforylacji i zostaje odłączony od białek kotwiczących, umożliwiając translokację ERK1/2 do innych przedziałów subkomórkowych, w tym jądra, mitochondriów, Golgiego i lizosomów14,15,16.
Chociaż wiadomo, że humanina aktywuje szlak sygnałowy ERK1/2, aktywacja ERK1/2 jest obserwowana tylko w całkowitych lizatach komórkowych. Jak opisano wcześniej, ponieważ lokalizacja subkomórkowa ERK1 / 2 odgrywa kluczową rolę w jego dalszym efekcie, analiza zarówno lokalizacji subkomórkowej, jak i całkowitych poziomów fosforylowanego ERK1 / 2 jest konieczna, aby zapewnić kompleksowe zrozumienie indukowanej przez człowieka aktywacji ERK1 / 2 i aktywacji dalszych celów.
Aby zrozumieć docelowe organelle aktywowanego ERK1/2, przeprowadzono subkomórkowe frakcjonowanie, a następnie western blot dla fosforylowanego ERK1/2. Ta metoda może być łatwo wdrożona, ponieważ wykorzystuje standardowy sprzęt laboratoryjny i odczynniki. Izolowane przedziały subkomórkowe mają wysoką czystość, co pozwala na bezpośrednią interpretację wyników. Barwienie immunologiczne ERK1/2 może dać podobne wyniki. Jednak niektóre przedziały subkomórkowe są stosunkowo trudne do uwidocznienia i wymagają specjalnych metod utrwalania i przepuszczalności. Poziomy ERK1/2 różnią się w przedziałach subkomórkowych, a ta zmienność może powodować fałszywie dodatnie i fałszywie ujemne sygnały, gdy patrzy się na lizaty całych komórek. Dlatego immunoblot wykorzystujący izolowane przedziały subkomórkowe daje nam lepsze zrozumienie lokalizacji ERK1/2.
Wszechstronność metody umożliwia modyfikacje protokołu w celu zbadania efektów innych stymulantów, w tym innych MDP, lub translokacji innych cząsteczek sygnałowych, takich jak STAT3. Niedawno odkryte małe peptydy podobne do humaniny (THLP) są kodowane z regionu 16S rRNA, w którym kodowana jest humanina, i mają podobne, ale odrębne właściwości w porównaniu do HN17. Na przykład SHLP2 i SHLP3 aktywują ERK1/2 po 8 godzinach, chociaż humanin aktywuje ERK1/2 w ciągu 5 minut. Badanie subkomórkowej lokalizacji ERK1/2 w odpowiedzi na różne peptydy pozwoli nam lepiej zrozumieć biologię tych peptydów. Pojawiające się dowody wykazały, że subkomórkowa lokalizacja cząsteczek sygnałowych odgrywa kluczową rolę w ich dalszych skutkach. Na przykład, tradycyjnie wiadomo, że STAT3 jest pierwotnie zlokalizowany w cytozolu w komórkach w stanie spoczynku, a następnie przemieszcza się do jądra, aby aktywować ekspresję genów w odpowiedzi na cytokiny18. STAT3 również translokuje się do mitochondriów i reguluje cykl TCA oraz produkcję ATP19. Jeśli chodzi o regulację autofagii, różna subkomórkowa lokalizacja STAT3 moduluje autofagię na różne sposoby20. Na przykład jądrowy STAT3 transkrypcyjnie reguluje geny związane z autofagią i działa jako modulator autofagii. Cytoplazmatyczny STAT3 konstytutywnie hamuje autofagię poprzez interakcję z cząsteczkami sygnalizacyjnymi autofagii. Mitochondrialny STAT3 hamuje i zapobiega mitofagii poprzez tłumienie autofagii wywołanej stresem oksydacyjnym. Dlatego ta metoda izolacji przedziałów subkomórkowych ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia roli innych cząsteczek sygnałowych, a także ERK1/2.

<table><tbody><tr><td>p44 / 42 MAPK (ERK1 / 2)</td> <td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>9102</td><td>Rozcieńczenie 1: 1,000</td></tr><tr><td>phospho-p44 / 42 MAPK (ERK1 / 2) (Thr202 / Tyr204)</td> <td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>4370</td><td>Rozcieńczenie 1: 1,000</td></tr><tr><td>Lamina B1</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>12586</td><td>Marker jądrowy, Rozcieńczenie 1: 1,000</td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>5174</td><td>Marker cytoplazmatyczny, Rozcieńczenie 1: 2,000</td></tr><tr><td>Tom20</td><td>Santa cruz</td><td>SC-17764</td><td>Marker mitochondriów, Rozcieńczenie 1:2,000</td></tr><tr><td>Sprzężony anty-Rabbit-HRP</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>7074</td><td>Rozcieńczenie 1:30,000</td></tr><tr><td>Bufor do lizy i ekstrakcji RIPA</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>89900</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Naczynie hodowlane</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>12556002</td><td></td></tr><tr><td>Peptyd HNG</td><td>Genescript</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25mm Filtr filtracyjny</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>09-719A</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>3609</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>HCL</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>Skrobak do komórek</td><td>FALCON</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>Zatrzymaj się i handluj; Koktajl inhibitorów proteazy i fosfatazy (100X)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>78440</td><td></td></tr><tr><td>Thomas Pulle Młynek do tkanek z gładkimi tłuczkami</td><td>Thomas Scientific</td><td>3432S90</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>8-16% prefabrykowane żele</td> <td>białkowe Mini-PROTEAN TGXBIO RAD</td><td>4561104</td><td></td></tr><tr><td>Mini moduł Trans-Blot</td><td>BIO RAD</td><td>1658030</td><td></td></tr><tr><td>System Turbotransferu Trans-Blot</td><td>BIO RAD</td><td>1704150</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw transferowy Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF</td><td>BIO RAD</td><td>1704272</td><td></td></tr><tr><td>Clarity Zachodnie podłoża do bibułowania ECL</td> BIO <td>RAD</td><td>1705060</td><td></td></tr><tr><td>Restore Bufor</td> <td>do usuwania plam Western blotThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>21059</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowany Dulbecco's Eagle Medium</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Sonikator, Nazwa: FB120</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>695320-07-12</td><td></td></tr></tbody></table>

frakcjonowanie subkomórkowe w celu aktywacji erk po leczeniu peptydami pochodzącymi z mitochondriów

Subcellular Fractionation for ERK Activation Upon Mitochondrial-derived Peptide Treatment

Peptydy pochodzące z mitochondriów (MDP) to nowa klasa peptydów, które są kodowane przez małe otwarte ramki odczytu w innych znanych genach genomu mitochondrialnego. MDP mają szeroką gamę efektów biologicznych, takich jak ochrona neuronów przed apoptozą, poprawa markerów metabolicznych i ochrona komórek przed chemioterapią. Humanina była pierwszym odkrytym MDP i jest najlepiej przebadanym peptydem z rodziny MDP. Receptory błonowe i dalsze szlaki sygnałowe humaniny zostały dokładnie scharakteryzowane. Dodatkowe MDP, takie jak MOTS-c i SHLP1-6, zostały niedawno odkryte, a mechanizmy sygnalizacji nie zostały jeszcze wyjaśnione. Tutaj opisujemy metodę opartą na hodowli komórkowej w celu określenia funkcji tych peptydów. W szczególności techniki frakcjonowania komórek w połączeniu z western blotting pozwalają na ilościowe określenie aktywacji i translokacji ważnej cząsteczki sygnałowej. Chociaż istnieją inne metody frakcjonowania komórek, opisana tutaj metoda jest łatwa i nieskomplikowana. Metody te można wykorzystać do dalszego wyjaśnienia mechanizmu działania tych peptydów i innych środków terapeutycznych.

Stosując przedstawioną tutaj procedurę, traktowaliśmy komórki HEK293 i SH-SY5Y odpowiednio 1 μM i 100 μM S14G-humaniny, silnego analogu humaniny21, w pożywce kompletnej przez wskazane okresy czasu (Rycina 1A i Rycina 1B). Następnie w całkowitych ekstraktach białkowych badaliśmy całkowitą i fosforylowaną formę ERK1/2 w obrębie Thr202/Tyr204. Leczenie S...

Ten protokół opisuje, jak stymulować komórki peptydami pochodzącymi z mitochondriów i oceniać kaskadę sygnałową oraz lokalizację fosfobiałek.

Frakcjonowanie subkomórkowe w celu aktywacji ERK po leczeniu peptydami pochodzącymi z mitochondriów

Mitochondrial-derived peptides (MDPs) are a new class of peptides that are encoded by small open reading frames within other known genes of the ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest zidentyfikowanie kaskady sygnalizacyjnej zaangażowanej w komórki stymulowane peptydami pochodzącymi z mitochondriów. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania w polu peptydów pochodzących z mitochondriów, takie jak to, jakie szlaki sygnałowe są zaangażowane i gdzie to zachodzi. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest prosta i stosunkowo łatwa do wykonania.Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zbadaliśmy sygnalizację ERK za pośrednictwem człowieka, która dostarczyła nam ograniczonych informacji na temat dalszych faktów. Metoda Kershera w podskali dała nam lepsze wyobrażenie o roli sygnalizacji za pośrednictwem człowieka. Trzeciego dnia po posiewie i umyciu dwa razy od dziesięciu do szóstego, komórki SH-SY5Y lub HEK293 zgodnie z protokołem tekstowym.Rozpuść peptydy humaniny S14G w przefiltrowanej wodzie destylowanej o temperaturze zerowej dwóch mikronów. I rozpuść je ponownie w postaci jednomilimolowego roztworu podstawowego. Podwielokrotnić wstępnie podgrzaną pożywkę zawierającą surowicę lub bezsurowicę w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów i dodać roztwór podstawowy peptydu humaniny o temperaturze pokojowej, aby uzyskać stężenie robocze.Natychmiast zastąp pożywkę w komórkach sześcioma mililitrami roztworu peptydowego. I inkubuj komórki przez odpowiedni czas. Użyj 10 mililitrów lodowatego PBS, aby dwukrotnie umyć komórki.Następnie zeskrob komórki z płytki w pięciu mililitrach lodowatego PBS. I przenieś zawiesinę komórkową do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Odwiruj komórki w temperaturze 500 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut.Ponownie zawiesić osad w 200 mikrolitrach lodowatego buforu do frakcjonowania i inkubować na lodzie przez 15 minut. Odwirować probówkę w temperaturze 250 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Następnie zbierz supernatant jako frakcję cytoplazmatyczną i zachowaj osad dla frakcji jądrowej.Odwirować supernatant w celu usunięcia resztek komórkowych i innych zanieczyszczeń w temperaturze 18000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez dziesięć minut. A następnie przenieś supernatant do nowej probówki do mikrowirówki. Jest to frakcja cytisolowa.Ponownie zawiesić osad w 200 mikrolitrach lodowatego buforu do płukania i odwirować roztwór o temperaturze 250 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Usunąć supernatant i użyć 100 mikrolitrów lodowatego buforu do ekstrakcji jądrowej w celu ponownego zawieszenia osadu. Następnie poddać próbkę sonikacji na lodzie 10 razy.Ponownie odwirować próbkę. Następnie przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki. Aby wyizolować surową frakcję mitochondrialną, użyj 10 mililitrów lodowatego PBS do umycia komórek w każdym 10-centymetrowym naczyniu.Następnie dodaj pięć mililitrów lodowatego PBS i użyj skrobaka do komórek, aby odłączyć komórki. Przenieś zawiesiny komórek do pojedynczej stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Następnie odwiruj komórki w temperaturze 600 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut.Odessać PBS i użyć jednego mililitra lodowatego buforu izolacyjnego mitochondriów, aby ponownie zawiesić osad. Następnie za pomocą tłuczka pokrytego politetrafluoroetylenem na lodzie homogenizuj komórki za pomocą 25 pociągnięć dwumililitrowego homogenizatora. Przenieść homogenat do probówki mikrowirówkowej i odwirować próbkę w temperaturze 600 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut w celu usunięcia jąder i nieuszkodzonych komórek.Następnie zebrać supernatant, przenieść go do nowej probówki do mikrowirówki i odwirować roztwór w temperaturze 7000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesić osad z 200 mikrolitrami lodowatego buforu izolacyjnego mitochondriów i przenieść roztwór do nowej probówki do mikrowirówki. Odwirować probówkę w temperaturze 7000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut.Po powtórzeniu prania należy użyć 15 mikrolitrów buforu RIPA do ponownego zawieszenia osadu i inkubacji zawiesiny na lodzie przez 10 minut. Następnie odwirować próbkę w temperaturze 16000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut. Przenieś supernatant, który jest frakcją mitochondrialną, do nowej probówki.Określ ilościowo i przeprowadź western blot zgodnie z protokołem tekstowym. Korzystając z procedury pokazanej w tym filmie, komórki HEK293 i SH-SY5Y wycofały się z jedną i 100 mikromolową humaniną S14 G, silnym analogiem człowieka. Przeanalizowano całkowitą i ufosforylowaną formę ERK12 przy teaninie 202, tyrozynie 204 z całkowitych ekstraktów białkowych.Jak widać tutaj, leczenie humaniną S14G wykazało wzrost fosforylacji ERK12 i jego regulatorowego miejsca teaniny-202, tyrozyny-204. Aby zrozumieć cel aktywacji ERK12 za pośrednictwem człowieka S14G, przeanalizowano subkomórkową lokalizację całkowitego i fosforylowanego ERK12 po leczeniu S14G humaniną. Jak wykazano w tych zachodnich plamach, w komórkach HEK293 fosforylowany ERK wzrósł zarówno w cytoplazmie, jak i jądrze, ale nie w mitochondriach.Jednak w komórkach SH-SY5Y fosforylowany ERK zmniejszył się w jądrze cytoplazmy i mitochondriach. Sugeruje to, że fosforylacja ERK za pośrednictwem człowieka S14G może odgrywać różną rolę w różnych typach komórek i różnych warunkach. Po opanowaniu frakcjonowanie jądra komórkowego można przeprowadzić w ciągu jednej godziny, a frakcjonowanie mitochondrialne można wykonać w ciągu godziny i 30 minut, jeśli zostanie wykonane prawidłowo.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby wszystkie próbki trzymać na lodzie. Po tej procedurze można zastosować inne metody, w tym jednoczesne wytrącanie immunologiczne i spektrometrię mas, w celu zrozumienia dalszych celów cząsteczek sygnałowych.

subcellular-fractionation-for-erk-activation-upon-mitochondrial

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W tym filmie pokażemy, w jaki sposób można analizować kompleksy łańcucha oddechowego mitochondriów ludzkich embrionalnych komórek macierzystych przy użyciu testów aktywności w żelu.

Badanie aktywności kompleksów mitochondrialnych w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych

Opisano wpływ aktywacji izoformy kinazy białkowej C (PKC) na funkcje mitochondrialne związane z oddychaniem i fosforylacją oksydacyjną oraz na żywotność komórek. Podejście to adaptuje technikę adenowirusową w celu selektywnej nadekspresji izoform PKC w pierwotnych hodowlach komórkowych oraz szereg analiz służących do określenia funkcji mitochondriów i stanu energetycznego komórki.

Ocena funkcji mitochondriów i żywotności komórek w komórkach nerkowych z nadekspresją izoform kinazy białkowej C

Ta procedura ilustruje, jak wyizolować z mózgu dorosłej myszy błony ER związane z mitochondriami lub MAM oraz frakcje mikrodomen wzbogacone glikosfingolipidami z MAM i preparatów mitochondrialnych.

Błony ER związane z mitochondriami (MAM) i mikrodomeny wzbogacone w glikosfingolipidy (GEM): izolacja od mózgu myszy

Porównanie potencjału błony mitochondrialnej między próbkami dostarcza cennych informacji o stanie komórek. Opisano szczegółowe etapy izolacji mitochondriów i oceny odpowiedzi na inhibitory i rozprzęgacze za pomocą fluorescencji. Metoda i użyteczność tego protokołu są zilustrowane przez zastosowanie hodowli komórkowej i zwierzęcego modelu stresu komórkowego.

Izolacja i analiza funkcjonalna mitochondriów z hodowanych komórek i tkanek myszy

Tutaj opisujemy, jak badać mitochondrialną lokalizację kinazy (cyklu komórkowego) i jak określić jej submitochondrialne położenie, a także potencjalne substraty/cele mitochondrialne. Wymuszona ekspresja białek w mitochondriach stanowi użyteczne narzędzie do badania funkcjonalnych konsekwencji mitochondrialnej lokalizacji białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Eksperymentalne podejścia do badania lokalizacji mitochondrialnej i funkcji kinazy jądrowego cyklu komórkowego, Cdk1

Kinazy białkowe to wysoce rozwinięte enzymy sygnalizacyjne i rusztowania, które są kluczowe dla między- i wewnątrzkomórkowej transdukcji sygnału. Przedstawiamy protokół pomiaru aktywności kinazy za pomocą znakowanego radioaktywnie trifosforanu adenozyny ([γ-32P] ATP), niezawodnej metody pomagającej w wyjaśnieniu regulacji sygnalizacji komórkowej.

Oznaczanie aktywności kinazy białkowej za pomocą znakowanego radioaktywnie ATP

Tutaj prezentujemy protokół izolacji błony plazmatycznej, cytoplazmy i mitochondriów komórek U937 bez użycia szybkiego wirowania. Technika ta może być stosowana do oczyszczania frakcji subkomórkowych w celu późniejszego zbadania lokalizacji białka za pomocą immunoblottingu.

Frakcjonowanie komórek U937 przy braku wirowania z dużą prędkością

Pomimo ostatnich osiągnięć, wiele białek mitochondrialnych drożdży nadal pozostaje ze swoimi funkcjami zupełnie nieznanymi. Protokół ten zapewnia prostą i niezawodną metodę określania submitochondrialnej lokalizacji białek, co ma fundamentalne znaczenie dla wyjaśnienia ich funkcji molekularnych.

Ocena lokalizacji białek submitochondrialnych u pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae

Obecny protokół podkreśla zastosowanie techniki western blotting do badania funkcji i aktywności kotransportera neuronalnego K-Cl KCC2. Protokół opisuje badanie fosforylacji KCC2 w miejscach regulatora kinazy Thr906/1007 poprzez western blot. W tym tekście pokrótce omówiono również dodatkowe metody potwierdzania aktywności KCC2.

Badanie funkcji i aktywności neuronalnego kotransportera K-Cl KCC2 z wykorzystaniem Western Blotting

RASopatie to wielosystemowe zespoły genetyczne wywołane hiperaktywacją szlaku RAS-MAPUK. Potencjalnie patogenne warianty oczekujące na walidację pojawiają się nieustannie, podczas gdy słabe dowody przedkliniczne ograniczają terapię. Tutaj opisujemy nasz protokół in vivo polegający na testowaniu i krzyżowej weryfikacji poziomów aktywacji ERK związanych z RASopatią oraz jego modulacji farmakologicznej podczas embrigenezy za pomocą obrazowania FRET na żywo u danio danio młodego typu Teen-reporter.

Efektywny protokół oceny modulacji aktywności ERK w wczesnych modelach zespołu Noonana u danio danio za pomocą mikroskopii na żywo FRET i immunofluorescencji

Poznaj frakcjonowanie subkomórkowe w celu aktywacji ERK po leczeniu peptydami pochodzącymi z mitochondriów w liniach komórkowych SH-SY5Y i HEK293. Ta metoda pozwala badać szlaki sygnałowe i lokalizację fosfoprotein.

Frakcjonowanie subkomórkowe w celu aktywacji ERK po leczeniu peptydami pochodzącymi z mitochondriów

Przeglądaj więcej filmów