Frakcjonowanie subkomórkowe w celu aktywacji ERK po leczeniu peptydami pochodzącymi z mitochondriów
25 września 2017
Ten protokół opisuje, jak stymulować komórki peptydami pochodzącymi z mitochondriów i oceniać kaskadę sygnałową oraz lokalizację fosfobiałek.
Ogólnym celem tego eksperymentu jest zidentyfikowanie kaskady sygnalizacyjnej zaangażowanej w komórki stymulowane peptydami pochodzącymi z mitochondriów. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania w polu peptydów pochodzących z mitochondriów, takie jak to, jakie szlaki sygnałowe są zaangażowane i gdzie to zachodzi. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest prosta i stosunkowo łatwa do wykonania.
Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zbadaliśmy sygnalizację ERK za pośrednictwem człowieka, która dostarczyła nam ograniczonych informacji na temat dalszych faktów. Metoda Kershera w podskali dała nam lepsze wyobrażenie o roli sygnalizacji za pośrednictwem człowieka. Trzeciego dnia po posiewie i umyciu dwa razy od dziesięciu do szóstego, komórki SH-SY5Y lub HEK293 zgodnie z protokołem tekstowym.
Rozpuść peptydy humaniny S14G w przefiltrowanej wodzie destylowanej o temperaturze zerowej dwóch mikronów. I rozpuść je ponownie w postaci jednomilimolowego roztworu podstawowego. Podwielokrotnić wstępnie podgrzaną pożywkę zawierającą surowicę lub bezsurowicę w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów i dodać roztwór podstawowy peptydu humaniny o temperaturze pokojowej, aby uzyskać stężenie robocze.
Natychmiast zastąp pożywkę w komórkach sześcioma mililitrami roztworu peptydowego. I inkubuj komórki przez odpowiedni czas. Użyj 10 mililitrów lodowatego PBS, aby dwukrotnie umyć komórki.
Następnie zeskrob komórki z płytki w pięciu mililitrach lodowatego PBS. I przenieś zawiesinę komórkową do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Odwiruj komórki w temperaturze 500 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut.
Ponownie zawiesić osad w 200 mikrolitrach lodowatego buforu do frakcjonowania i inkubować na lodzie przez 15 minut. Odwirować probówkę w temperaturze 250 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Następnie zbierz supernatant jako frakcję cytoplazmatyczną i zachowaj osad dla frakcji jądrowej.
Odwirować supernatant w celu usunięcia resztek komórkowych i innych zanieczyszczeń w temperaturze 18000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez dziesięć minut. A następnie przenieś supernatant do nowej probówki do mikrowirówki. Jest to frakcja cytisolowa.
Ponownie zawiesić osad w 200 mikrolitrach lodowatego buforu do płukania i odwirować roztwór o temperaturze 250 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Usunąć supernatant i użyć 100 mikrolitrów lodowatego buforu do ekstrakcji jądrowej w celu ponownego zawieszenia osadu. Następnie poddać próbkę sonikacji na lodzie 10 razy.
Ponownie odwirować próbkę. Następnie przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki. Aby wyizolować surową frakcję mitochondrialną, użyj 10 mililitrów lodowatego PBS do umycia komórek w każdym 10-centymetrowym naczyniu.
Następnie dodaj pięć mililitrów lodowatego PBS i użyj skrobaka do komórek, aby odłączyć komórki. Przenieś zawiesiny komórek do pojedynczej stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów. Następnie odwiruj komórki w temperaturze 600 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut.
Odessać PBS i użyć jednego mililitra lodowatego buforu izolacyjnego mitochondriów, aby ponownie zawiesić osad. Następnie za pomocą tłuczka pokrytego politetrafluoroetylenem na lodzie homogenizuj komórki za pomocą 25 pociągnięć dwumililitrowego homogenizatora. Przenieść homogenat do probówki mikrowirówkowej i odwirować próbkę w temperaturze 600 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut w celu usunięcia jąder i nieuszkodzonych komórek.
Następnie zebrać supernatant, przenieść go do nowej probówki do mikrowirówki i odwirować roztwór w temperaturze 7000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut. Po usunięciu supernatantu ponownie zawiesić osad z 200 mikrolitrami lodowatego buforu izolacyjnego mitochondriów i przenieść roztwór do nowej probówki do mikrowirówki. Odwirować probówkę w temperaturze 7000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut.
Po powtórzeniu prania należy użyć 15 mikrolitrów buforu RIPA do ponownego zawieszenia osadu i inkubacji zawiesiny na lodzie przez 10 minut. Następnie odwirować próbkę w temperaturze 16000 razy G i czterech stopniach Celsjusza przez 15 minut. Przenieś supernatant, który jest frakcją mitochondrialną, do nowej probówki.
Określ ilościowo i przeprowadź western blot zgodnie z protokołem tekstowym. Korzystając z procedury pokazanej w tym filmie, komórki HEK293 i SH-SY5Y wycofały się z jedną i 100 mikromolową humaniną S14 G, silnym analogiem człowieka. Przeanalizowano całkowitą i ufosforylowaną formę ERK12 przy teaninie 202, tyrozynie 204 z całkowitych ekstraktów białkowych.
Jak widać tutaj, leczenie humaniną S14G wykazało wzrost fosforylacji ERK12 i jego regulatorowego miejsca teaniny-202, tyrozyny-204. Aby zrozumieć cel aktywacji ERK12 za pośrednictwem człowieka S14G, przeanalizowano subkomórkową lokalizację całkowitego i fosforylowanego ERK12 po leczeniu S14G humaniną. Jak wykazano w tych zachodnich plamach, w komórkach HEK293 fosforylowany ERK wzrósł zarówno w cytoplazmie, jak i jądrze, ale nie w mitochondriach.
Jednak w komórkach SH-SY5Y fosforylowany ERK zmniejszył się w jądrze cytoplazmy i mitochondriach. Sugeruje to, że fosforylacja ERK za pośrednictwem człowieka S14G może odgrywać różną rolę w różnych typach komórek i różnych warunkach. Po opanowaniu frakcjonowanie jądra komórkowego można przeprowadzić w ciągu jednej godziny, a frakcjonowanie mitochondrialne można wykonać w ciągu godziny i 30 minut, jeśli zostanie wykonane prawidłowo.
Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby wszystkie próbki trzymać na lodzie. Po tej procedurze można zastosować inne metody, w tym jednoczesne wytrącanie immunologiczne i spektrometrię mas, w celu zrozumienia dalszych celów cząsteczek sygnałowych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje sposób stymulacji komórek peptydami pochodzenia mitochondrialnego oraz ocenę kaskady sygnalizacyjnej i lokalizacji białek fosforylowanych. Ogólnym celem jest zidentyfikowanie kaskady sygnalizacji efektorowej zaangażowanej w komórkach stymulowanych tymi peptydami.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Sygnalizacja komórkowa
- Biologia mitochondriów
- Fosforylacja białek
Wprowadzenie
- Peptydy pochodzenia mitochondrialnego odgrywają rolę w sygnalizacji komórkowej.
- Zrozumienie tych szlaków może dostarczyć wiedzy na temat funkcjonowania komórek.
- Poprzednie metody dostarczały ograniczonych informacji na temat efektów downstream.
- Metoda Subscale Kersher zwiększa zrozumienie sygnalizacji pośredniczonej przez humaninę.
Cel badania
- Zbadanie szlaków sygnalizacyjnych aktywowanych przez peptydy pochodzenia mitochondrialnego.
- Określenie lokalizacji białek fosforylowanych w odpowiedzi na stymulację.
- Przedstawienie prostego sposobu badania tych efektów.
Zastosowane metody
- Stymulacja komórek SH-SY5Y lub HEK293 peptydami pochodzenia mitochondrialnego.
- Ocena kaskad sygnalizacyjnych downstream.
- Badania lokalizacji białek fosforylowanych.
- Zastosowanie metody Subscale Kersher w celu przeprowadzenia rozszerzonej analizy.
Główne wyniki
- Identyfikacja kluczowych szlaków sygnałowych zaangażowanych w odpowiedź na peptydy pochodzenia mitochondrialnego.
- Wgląd w lokalizację białek fosforylowanych podczas przekazywania sygnału.
- Walidacja metody Subscale Kersher w badaniu sygnalizacji zapośredniczonej przez humaninę.
- Opracowanie prostego protokołu eksperymentalnego.
Wnioski
- Badanie dostarcza przejrzystej metody badania sygnalizacji peptydów pochodzenia mitochondrialnego.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia biologii mitochondriów.
- Protokół może zostać wykorzystany w dalszych badaniach w tej dziedzinie.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia zespołom badawczo-rozwojowym w sektorze biofarmaceutycznym ilościową ocenę aktywacji ERK oraz lokalizacji subkomórkowej w odpowiedzi na peptydy pochodzenia mitochondrialnego, co wspiera walidację celu i redukcję ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkrywania leków. Dzięki zapewnieniu prostego schematu frakcjonowania kompatybilnego z analizą western blot, metoda ta ułatwia testowanie hipotez dotyczących kaskad sygnalizacyjnych indukowanych przez peptydy, które mają znaczenie w kontekście neuroprotekcji i wskazań w chorobach metabolicznych. Podejście to zwiększa pewność predykcyjną podczas badania szlaków sygnałowych przed etapem identyfikacji wiodących związków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotezy terapeutycznej dotyczącej zaangażowania peptydów pochodzenia mitochondrialnego w szlaki sygnalizacyjne ERK.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celu poprzez ilościowy pomiar fosfo-ERK w frakcjach cytoplazmatycznych, jądrowych i mitochondrialnych.
- Wartość prognostyczna: Wspomaga selekcję projektów w portfolio poprzez ujawnienie specyficznych dla typu komórek odpowiedzi sygnalizacyjnych, co pozwala na ograniczenie ryzyka mechanistycznego.
Przesiewy i rozwój testów
- Gotowość do analizy: Pozwala na otrzymanie zestandaryzowanych frakcji subkomórkowych odpowiednich do późniejszej analizy zdarzeń fosforylacji metodą western blot.
- Powtarzalność: Zapewnia prosty, utrzymywany w temperaturze lodu protokół, gwarantujący spójną izolację frakcji cytoplazmatycznych, jądrowych i mitochondrialnych.
- Możliwość screeningu: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do wiarygodnej oceny związków w kaskadach screeningu fenotypowego.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie chorobowe: Wspiera badania nad peptydami pochodzenia mitochondrialnego w modelach neuroprotekcji i stresu metabolicznego zgodnie z przedklinicznym znaczeniem chorobowym.
- Ciągłość translacyjna: Łączy obserwacje sygnalizacji z fazy odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez mierzalne dane dotyczące lokalizacji białek fosforylowanych.
- Postęp dostosowany do ryzyka: Wspiera decyzje typu go/no-go poprzez wyjaśnienie, czy obserwowana aktywacja ERK zachodzi w istotnych dla choroby przedziałach subkomórkowych.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków – od oceny oddziaływania z celem molekularnym po wyjaśnienie szlaku sygnałowego – umożliwiając przejście od hitów fenotypowych do zrozumienia mechanizmu działania przed optymalizacją związku wiodącego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących mechanizmów działania peptydów pochodzenia mitochondrialnego poprzez analizę zdarzeń aktywacji ERK w rozdzielczości subkomórkowej.
- Przesiewanie: Dostarcza frakcji gotowych do analizy z ilościowymi odczytami fosforylacji w celu porównania efektów działania związków.
- Analityka: Generuje pomiary phospho-ERK1/2 (Thr202/Tyr204), które umożliwiają zespołom porównywanie warunków stymulacji oraz efektów inhibitorów.
- Badania translacyjne: Łączy wzorce lokalizacji ERK z ciągłością przedkliniczną poprzez identyfikację dominacji sygnalizacji jądrowej względem cytoplazmatycznej w odpowiednich modelach komórkowych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia wielokrotnego użytku platformę frakcjonowania, którą można zastosować do wielu peptydów pochodzenia mitochondrialnego i środków terapeutycznych poza analogami humaniny.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji docelowych szlaków poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w sygnalizacji pośredniczonej przez peptydy.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzowane i powtarzalne frakcjonowanie, kompatybilne z analizami western blot w różnych zespołach badawczych.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wczesnej minimalizacji ryzyka w odniesieniu do celów mitochondrialnych przed znacznymi inwestycjami w generowanie wiodących związków.
- Wpływ na portfolio: Ułatwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez odróżnienie produktywnej aktywacji sygnalizacji od szumu artefaktowego lub specyficznego dla przedziałów komórkowych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w technikach frakcjonowania subkomórkowego oraz detekcji fosfo-epitopów metodą western blot.
- Metoda jest uzależniona od dostępu do wirówki umożliwiającej precyzyjną kontrolę siły odśrodkowej G oraz temperatury w celu izolacji frakcji.
- Konieczna jest standaryzacja czasu frakcjonowania oraz stosowania inhibitorów proteaz i fosfataz pomiędzy zespołami w celu zapewnienia spójnych wyników.
- Kwestie adaptacyjne obejmują optymalizację dla różnych typów komórek oraz stężeń peptydów w zależności od profilu rozpuszczalności i stabilności.
- Ograniczenia praktyczne obejmują możliwość zanieczyszczenia krzyżowego pomiędzy frakcjami, jeśli etapy płukania nie będą rygorystycznie przestrzegane, zgodnie z opisem w protokole.
