Name: Frakcjonowanie subkomórkowe w celu aktywacji ERK po leczeniu peptydami pochodzącymi z mitochondriów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Poznaj frakcjonowanie subkomórkowe w celu aktywacji ERK po leczeniu peptydami pochodzącymi z mitochondriów w liniach komórkowych SH-SY5Y i HEK293. Ta metoda pozwala badać szlaki sygnałowe i lokalizację fosfoprotein.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez Ellison/AFAR Postdoctoral Fellowship in Aging Research Program dla SJK, oraz Glenn Foundation Award i granty NIH dla PC (1P01AG034906, 1R01GM 090311, 1R01ES 020812). W filmie pojawiają się wszyscy autorzy.

1. Leczenie komórek peptydami
<ol>
	<li>Umieść dwa miliony komórek SH-SY5Y lub HEK293 (2 x 106) w naczyniu o średnicy 10 cm i hoduj je przez 2 dni</li>
	<li>(Opcjonalnie) Następnego dnia przemyj komórki jednokrotnie zmodyfikowanym podłożem Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco bez surowicy i inkubuj z DMEM bez surowicy przez noc, jeśli zabieg musi być wykonany w pożywce wolnej od surowicy.</li>
	<li>W dniu 3 rozpuść peptydy S14G-humaniny w przefiltrowanej wodzie destylowanej o stężeniu 0,2 μm i rozpuść je w postaci 1 mM roztworu podstawowego. 
	UWAGA: Peptydy powinny być rozpuszczone w odpowiednim rozpuszczalniku, który można określić na podstawie charakterystyki sekwencji peptydu (np. całkowitego ładunku) i może być dostarczony przez producenta, jeśli peptydy są dostępne w handlu. Na przykład S14G-humanina, SHLP2 i SHLP6 oraz MOTS-c rozpuszczają się w wodzie. Podwielokrotność peptydów należy podać w odpowiedniej objętości (np. 50 μl), aby uniknąć cykli zamrażania i rozmrażania. Po rozmrożeniu nie używaj ich ponownie.</li>
	<li>Podwielokrotnić wstępnie ogrzaną pożywkę zawierającą surowicę lub bezsurowicę w stożkowej probówce o pojemności 50 ml i dodać 1 mM roztworu podstawowego o temperaturze pokojowej, aby uzyskać stężenie robocze (np. 1 μM, 10 μM).</li>
	<li>Zastąp pożywkę 6 ml roztworu peptydowego z kroku 1.4. i inkubuj komórki przez odpowiedni czas. 
	UWAGA: Wybierz czas inkubacji w zależności od swojego stanu, który aktywuje ERK.</li>
</ol>
2. Subkomórkowe frakcjonowanie cytozolu i jądra
<ol>
	<li>Umyj komórki dwukrotnie 10 ml lodowatego PBS, zeskrob komórki z płytki w 5 ml lodowatego PBS i przenieś zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odessać PBS i ponownie zawiesić osad w 200 μl lodowatego buforu frakcjonującego (10 mM HEPES pH = 7,6, 3 mM MgCl2, 10 mM KCl, 5% (v/v) glicerol, 1% niejonowy środek powierzchniowo czynny (C13H22O(C2H4O)n), inhibitory proteazy/fosfatazy). 
	UWAGA: Aby utrzymać białka w stanie fosforylacji, inhibitor fosfatazy oraz inhibitor proteazy powinny być świeżo dodane, a próbki powinny być przez cały czas przechowywane na lodzie. Należy unikać powtarzania cykli zamrażania i rozmrażania próbek. Podwielokrotność próbek rozdrabnia się do niewielkiej ilości (np. 50 μg) przed zamrożeniem w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Zawiesinę zawiesiny inkubować na lodzie przez 15 minut, a następnie odwirować przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zbierz supernatant jako frakcję cytoplazmatyczną i zachowaj osad dla frakcji jądrowej.</li>
	<li>Odwirować supernatant w celu usunięcia resztek komórkowych i innych zanieczyszczeń w temperaturze 18 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, a następnie przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki. To jest frakcja cytozolu.</li>
	<li>Zawiesić osad w 200 μl lodowatego buforu do przemywania (10 mM HEPES pH = 7,6, 1,5 mM MgCl2, 420 mM NaCl, 25% (v/v) glicerolu, 0,2 mM EDTA, inhibitory proteazy/fosfatazy) i odwirować przy 250 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 μl lodowatego buforu do ekstrakcji jądrowej (20 mM HEPES pH = 7,6, 1,5 mM MgCl2, 420 mM NaCl, 25% (v/v) glicerol, 0,2 mM EDTA, inhibitory proteazy/fosfatazy) i sonikować 10 razy (5 s wł., 10 s wyłącz., 30% amp.) na lodzie.</li>
	<li>Wirować przy 18 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki. To jest frakcja jądrowa.</li>
	<li>Określić ilościowo ilość białka za pomocą testu BCA</li>
</ol>
3. Surowa frakcja mitochondrialna
<ol>
	<li>Umyj komórki w każdym 10 cm naczyniu 10 ml lodowatego PBS, dodaj 5 ml lodowatego PBS i odłącz komórki za pomocą skrobaka do komórek. 
	UWAGA: Użyj trzech 10-centymetrowych szalek komórek, aby uzyskać dobrą wydajność mitochondriów do Western Blotting.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i połączyć wszystkie z trzech 10-centymetrowych szalek w jedną stożkową probówkę o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Odwirować komórki przy 600 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odessać PBS i ponownie zawiesić osad w 1 ml lodowatego buforu do izolacji mitochondriów (10 mM Tris-MOPS, 1 mM EGTA/Tris, 200 mM sacharozy, dostosować do pH = 7,4).</li>
	<li>Homogenizować komórki za pomocą 25 pociągnięć homogenizatora o pojemności 2 ml tłuczkiem pokrytym politetrafluoroetylenem na lodzie. 
	UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie dla utrzymania integralności mitochondriów i maksymalizacji wydajności frakcji mitochondrialnej. Liczba pociągnięć powinna być zoptymalizowana dla każdego typu komórki. Wstępnie schłodzić homogenizator przed rozpoczęciem procedury.</li>
	<li>Przenieść homogenat do probówki do mikrowirówki i odwirować go przy 600 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia jąder i nieuszkodzonych komórek.</li>
	<li>Zebrać supernatant, przenieść go do nowej probówki do mikrowirówki i odwirować przy 7 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Osad jest luźny, należy ostrożnie zebrać supernatant i starać się nie naruszyć osadu.</li>
	<li>Usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad z 200 μl lodowatego buforu do izolacji mitochondriów i przenieść roztwór do nowej probówki do mikrowirówki. Odwirować probówkę o sile 7 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Powtórz krok 3.8, aby umyć granulkę. Na tym etapie nie jest konieczne przenoszenie supernatantu do nowej probówki do mikrowirówki.</li>
	<li>Usunąć supernatant z przemytego osadu i ponownie zawiesić osad zawierający mitochondria za pomocą 50 μl buforu RIPA.</li>
	<li>Inkubować zawiesinę na lodzie przez 10 minut.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę o sile 16 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść supernatant do nowej probówki do mikrowirówki. To jest frakcja mitochondrialna.</li>
	<li>Określ ilościowo ilość białka za pomocą testu BCA.</li>
</ol>
4. Western Blotting dla białek fosfospecyficznych
<ol>
	<li>Wykonaj elektroforezę w żelu poliakrylamidowym SDS (8-16% wstępnie przygotowanego żelu) i przenieś białko do membrany PVDF4.</li>
	<li>Inkubować membranę z 5% BSA w TBST (0,1% Polisorbat 20) przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby zablokować niespecyficzne miejsca wiązania tła. 
	UWAGA: W celu wykrycia fosforylowanego białka, zablokuj błonę za pomocą BSA, a nie Milk. Mleko zawiera kazeinę, obficie występującą fosfoproteinę, która powoduje wysoki sygnał niespecyficzny.</li>
	<li>Inkubować błonę z pierwszorzędowym przeciwciałem (anty-fosfo-ERK1/2) w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Następnego dnia przemyj membranę TBST (0,1% polisorbatu 20) trzykrotnie przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować błonę z przeciwciałem drugorzędowym (anty-króliczym HRP) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyć membranę TBST (0,1% polisorbatu 20) trzy razy przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować membranę z roztworem ECL i obrazować membranę w analizatorze obrazu.</li>
	<li>Zdjąć membranę z buforem do oddzielania przez 15 minut w temperaturze pokojowej i przemyć membranę TBST trzy razy przez 5 minut.</li>
	<li>Powtórzyć kroki od 4.2 do 4.7 przy użyciu przeciwciała anty-całkowitego ERK1/2.</li>
	<li>Aby sprawdzić czystość każdej frakcji, uruchom SDS-PAGE i wykonaj immunobloty przy użyciu przeciwciał rozpoznających markery dla każdego przedziału (np. Lamina B1 dla jądra, GAPDH dla cytozolu i TOM20 dla mitochondriów).</li>
</ol>

<ol><li>Yen, K., Lee, C., Mehta, H., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+the+mitochondrial-derived+peptide+humanin+in+stress+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The emerging role of the mitochondrial-derived peptide humanin in stress resistance.</a> J. Mol. Endocrinol. 50 (1), 11-19 (2013).</li>
<li>Muzumdar, R. H., Huffman, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanin%3A+a+novel+central+regulator+of+peripheral+insulin+action%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Humanin: a novel central regulator of peripheral insulin action.</a> PloS one. 4 (7), 6334(2009).</li>
<li>Lee, C., Yen, K., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanin%3A+a+harbinger+of+mitochondrial-derived+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Humanin: a harbinger of mitochondrial-derived peptides.</a> Trends Endocrinol. Metab. 24 (5), 222-228 (2013).</li>
<li>Kim, S. J., Guerrero, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial-derived+peptide+humanin+activates+the+ERK1%2F2%2C+AKT%2C+and+STAT3+signaling+pathways+and+has+age-dependent+signaling+differences+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial-derived peptide humanin activates the ERK1/2, AKT, and STAT3 signaling pathways and has age-dependent signaling differences in the hippocampus.</a> Oncotarget. 7 (30), 46899-46912 (2016).</li>
<li>Ying, G., Iribarren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanin%2C+a+newly+identified+neuroprotective+factor%2C+uses+the+G+protein-coupled+formylpeptide+receptor-like-1+as+a+functional+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor.</a> J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).</li>
<li>Zhang, W., Liu, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPK+signal+pathways+in+the+regulation+of+cell+proliferation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">MAPK signal pathways in the regulation of cell proliferation in mammalian cells.</a> Cell Res. 12 (1), 9-18 (2002).</li>
<li>Huang, C., Jacobson, K., Schaller, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAP+kinases+and+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">MAP kinases and cell migration.</a> J. Cell Sci. 117, Pt 20 4619-4628 (2004).</li>
<li>Cagnol, S., Chambard, J. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERK+and+cell+death%3A+mechanisms+of+ERK-induced+cell+death--apoptosis%2C+autophagy+and+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">ERK and cell death: mechanisms of ERK-induced cell death--apoptosis, autophagy and senescence.</a> FEBS J. 277 (1), 2-21 (2010).</li>
<li>Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+and+properties+of+MAPKs%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Differential regulation and properties of MAPKs.</a> Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).</li>
<li>Morrison, D. K., Davis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+MAP+kinase+signaling+modules+by+scaffold+proteins+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev%22%5BJournal%5D)">Regulation of MAP kinase signaling modules by scaffold proteins in mammals.</a> Annu. Rev. Cell Dev. 19 (1), 91-118 (2003).</li>
<li>Wainstein, E., Seger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+subcellular+localization+of+ERK%3A+mechanisms+of+translocation+and+role+in+various+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The dynamic subcellular localization of ERK: mechanisms of translocation and role in various organelles.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 39, 15-20 (2016).</li>
<li>Zehorai, E., Yao, Z., Plotnikov, A., Seger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subcellular+localization+of+MEK+and+ERK--a+novel+nuclear+translocation+signal+%28NTS%29+paves+a+way+to+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The subcellular localization of MEK and ERK--a novel nuclear translocation signal (NTS) paves a way to the nucleus.</a> Mol. Cell. Endocrinol. 314 (2), 213-220 (2010).</li>
<li>Kolch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinating+ERK%2FMAPK+signalling+through+scaffolds+and+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Coordinating ERK/MAPK signalling through scaffolds and inhibitors.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 (11), 827-837 (2005).</li>
<li>Horbinski, C., Chu, C. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15589366">Kinase signaling cascades in the mitochondrion: a matter of life or death.</a> Free Radic. Biol. Med. 38 (1), 2-11 (2005).</li>
<li>Aebersold, D. M., Shaul, Y. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+signal-regulated+kinase+1c+%28ERK1c%29%2C+a+novel+42-kilodalton+ERK%2C+demonstrates+unique+modes+of+regulation%2C+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular signal-regulated kinase 1c (ERK1c), a novel 42-kilodalton ERK, demonstrates unique modes of regulation, localization.</a> Mol Cell Biol. 24 (22), 10000-10015 (2004).</li>
<li>Zhu, J. -H., Guo, F., Shelburne, J., Watkins, S., Chu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+phosphorylated+ERK%2FMAP+kinases+to+mitochondria+and+autophagosomes+in+Lewy+body+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Localization of phosphorylated ERK/MAP kinases to mitochondria and autophagosomes in Lewy body diseases.</a> Brain Pathol. 13 (4), 473-481 (2003).</li>
<li>Cobb, L. J., Lee, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+mitochondrial-derived+peptides+are+age-dependent+regulators+of+apoptosis%2C+insulin+sensitivity%2C+and+inflammatory+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Aging%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring mitochondrial-derived peptides are age-dependent regulators of apoptosis, insulin sensitivity, and inflammatory markers.</a> Aging. 8 (4), 796-809 (2016).</li>
<li>Ihle, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Stat+family+in+cytokine+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Stat family in cytokine signaling.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 13 (2), 211-217 (2001).</li>
<li>Xu, Y. S., Liang, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+Undergoes+Acetylation-dependent+Mitochondrial+Translocation+to+Regulate+Pyruvate+Metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">STAT3 Undergoes Acetylation-dependent Mitochondrial Translocation to Regulate Pyruvate Metabolism.</a> Sci. Rep. 6 (1), 39517(2016).</li>
<li>You, L., Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25951043">The role of STAT3 in autophagy.</a> Autophagy. 11 (5), 729-739 (2015).</li>
<li>Hashimoto, Y., Niikura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+characterization+of+neuroprotection+by+a+rescue+factor+humanin+against+various+Alzheimer%27s+disease-relevant+insults%5BTitle%5D)+AND+%22The+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Detailed characterization of neuroprotection by a rescue factor humanin against various Alzheimer's disease-relevant insults.</a> The J Neurosci. 21 (23), 9235-9245 (2001).</li>
<li>Ying, G., Iribarren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanin%2C+a+newly+identified+neuroprotective+factor%2C+uses+the+G+protein-coupled+formylpeptide+receptor-like-1+as+a+functional+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Humanin, a newly identified neuroprotective factor, uses the G protein-coupled formylpeptide receptor-like-1 as a functional receptor.</a> J. Immunol. 172 (11), 7078-7085 (2004).</li>
<li>Hashimoto, Y., Kurita, M., et al. Humanin inhibits apoptosis in pituitary tumor cells through several signaling pathways including NF-κB activation. Mol. Biol. Cell. 20 (12), 2864-2873 (2009).</li>
</ol>

Pinchas Cohen jest udziałowcem i konsultantem w CohBar, Inc. Kelvin Yen pełnił funkcję konsultanta w CohBar, Inc.

Tutaj wykazaliśmy, że aktywacja ERK1 / 2 za pośrednictwem peptydu humaniny zachodzi w dwóch różnych typach komórek, a subkomórkowa lokalizacja aktywowanego ERK1 / 2 może być różna w zależności od warunków (np. dawki peptydu, punktu czasowego i typu komórki). Wykazano, że humanina wysyła sygnały przez dwa różne receptory22,23, co może wyjaśniać różnice w sygnalizacji między dwiema liniami komórkowymi, a także zapotrzebowanie na różne dawki humaniny. Fizjo...

Pojawiające się badania pokazują, że peptydy pochodzenia mitochondrialnego (MDP) odgrywają ważną rolę w cytoprotekcji i metabolizmie1,2,3. Zrozumienie szlaku transdukcji sygnału w obecności MDP daje nam wgląd w mechanizm, za pomocą którego MDP modulują różne funkcje. Wykazano, że pierwszy zidentyfikowany MDP, humanina, zwiększa fosforylację kinazy 1/2 regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK1/2) poprzez wiązanie z receptorem4,5. Jednak dalszy efekt aktywacji ERK1/2 jest nadal niedostatecznie zbadany.
Kaskada ERK1/2 służy jako niezbędny mediator w różnych procesach komórkowych, w tym proliferacji, migracji komórek, metabolizmu komórkowego, przeżycia i apoptozy6,7,8. Aby zaaranżować wszystkie te odrębne procesy komórkowe, aktywność i subkomórkowa lokalizacja ERK1/2 są ściśle regulowane przez fosfatazy i białka rusztowania9,10. Oprócz modyfikacji potranslacyjnej, dynamiczne przenoszenie ERK1/2 reguluje również jego funkcję sygnalizacyjną, aktywność i swoistość11,12. ERK1/2 jest przede wszystkim zlokalizowany w klasie cytozol<sup="xref">13. Zestaw białek kotwiczących i rusztujących pomaga zatrzymać ERK1/2 w elementach cytoszkieletu, na powierzchni organelli lub rozproszonych w cytoplazmie13. Po stymulacji ERK1/2 ulega fosforylacji i zostaje odłączony od białek kotwiczących, umożliwiając translokację ERK1/2 do innych przedziałów subkomórkowych, w tym jądra, mitochondriów, Golgiego i lizosomów14,15,16.
Chociaż wiadomo, że humanina aktywuje szlak sygnałowy ERK1/2, aktywacja ERK1/2 jest obserwowana tylko w całkowitych lizatach komórkowych. Jak opisano wcześniej, ponieważ lokalizacja subkomórkowa ERK1 / 2 odgrywa kluczową rolę w jego dalszym efekcie, analiza zarówno lokalizacji subkomórkowej, jak i całkowitych poziomów fosforylowanego ERK1 / 2 jest konieczna, aby zapewnić kompleksowe zrozumienie indukowanej przez człowieka aktywacji ERK1 / 2 i aktywacji dalszych celów.
Aby zrozumieć docelowe organelle aktywowanego ERK1/2, przeprowadzono subkomórkowe frakcjonowanie, a następnie western blot dla fosforylowanego ERK1/2. Ta metoda może być łatwo wdrożona, ponieważ wykorzystuje standardowy sprzęt laboratoryjny i odczynniki. Izolowane przedziały subkomórkowe mają wysoką czystość, co pozwala na bezpośrednią interpretację wyników. Barwienie immunologiczne ERK1/2 może dać podobne wyniki. Jednak niektóre przedziały subkomórkowe są stosunkowo trudne do uwidocznienia i wymagają specjalnych metod utrwalania i przepuszczalności. Poziomy ERK1/2 różnią się w przedziałach subkomórkowych, a ta zmienność może powodować fałszywie dodatnie i fałszywie ujemne sygnały, gdy patrzy się na lizaty całych komórek. Dlatego immunoblot wykorzystujący izolowane przedziały subkomórkowe daje nam lepsze zrozumienie lokalizacji ERK1/2.
Wszechstronność metody umożliwia modyfikacje protokołu w celu zbadania efektów innych stymulantów, w tym innych MDP, lub translokacji innych cząsteczek sygnałowych, takich jak STAT3. Niedawno odkryte małe peptydy podobne do humaniny (THLP) są kodowane z regionu 16S rRNA, w którym kodowana jest humanina, i mają podobne, ale odrębne właściwości w porównaniu do HN17. Na przykład SHLP2 i SHLP3 aktywują ERK1/2 po 8 godzinach, chociaż humanin aktywuje ERK1/2 w ciągu 5 minut. Badanie subkomórkowej lokalizacji ERK1/2 w odpowiedzi na różne peptydy pozwoli nam lepiej zrozumieć biologię tych peptydów. Pojawiające się dowody wykazały, że subkomórkowa lokalizacja cząsteczek sygnałowych odgrywa kluczową rolę w ich dalszych skutkach. Na przykład, tradycyjnie wiadomo, że STAT3 jest pierwotnie zlokalizowany w cytozolu w komórkach w stanie spoczynku, a następnie przemieszcza się do jądra, aby aktywować ekspresję genów w odpowiedzi na cytokiny18. STAT3 również translokuje się do mitochondriów i reguluje cykl TCA oraz produkcję ATP19. Jeśli chodzi o regulację autofagii, różna subkomórkowa lokalizacja STAT3 moduluje autofagię na różne sposoby20. Na przykład jądrowy STAT3 transkrypcyjnie reguluje geny związane z autofagią i działa jako modulator autofagii. Cytoplazmatyczny STAT3 konstytutywnie hamuje autofagię poprzez interakcję z cząsteczkami sygnalizacyjnymi autofagii. Mitochondrialny STAT3 hamuje i zapobiega mitofagii poprzez tłumienie autofagii wywołanej stresem oksydacyjnym. Dlatego ta metoda izolacji przedziałów subkomórkowych ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia roli innych cząsteczek sygnałowych, a także ERK1/2.

<table><tbody><tr><td>p44 / 42 MAPK (ERK1 / 2)</td> <td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>9102</td><td>Rozcieńczenie 1: 1,000</td></tr><tr><td>phospho-p44 / 42 MAPK (ERK1 / 2) (Thr202 / Tyr204)</td> <td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>4370</td><td>Rozcieńczenie 1: 1,000</td></tr><tr><td>Lamina B1</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>12586</td><td>Marker jądrowy, Rozcieńczenie 1: 1,000</td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>5174</td><td>Marker cytoplazmatyczny, Rozcieńczenie 1: 2,000</td></tr><tr><td>Tom20</td><td>Santa cruz</td><td>SC-17764</td><td>Marker mitochondriów, Rozcieńczenie 1:2,000</td></tr><tr><td>Sprzężony anty-Rabbit-HRP</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>7074</td><td>Rozcieńczenie 1:30,000</td></tr><tr><td>Bufor do lizy i ekstrakcji RIPA</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>89900</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Naczynie hodowlane</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>12556002</td><td></td></tr><tr><td>Peptyd HNG</td><td>Genescript</td><td></td><td></td></tr><tr><td>25mm Filtr filtracyjny</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>09-719A</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>3609</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>HCL</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td></td></tr><tr><td>Skrobak do komórek</td><td>FALCON</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>Zatrzymaj się i handluj; Koktajl inhibitorów proteazy i fosfatazy (100X)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>78440</td><td></td></tr><tr><td>Thomas Pulle Młynek do tkanek z gładkimi tłuczkami</td><td>Thomas Scientific</td><td>3432S90</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>8-16% prefabrykowane żele</td> <td>białkowe Mini-PROTEAN TGXBIO RAD</td><td>4561104</td><td></td></tr><tr><td>Mini moduł Trans-Blot</td><td>BIO RAD</td><td>1658030</td><td></td></tr><tr><td>System Turbotransferu Trans-Blot</td><td>BIO RAD</td><td>1704150</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw transferowy Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF</td><td>BIO RAD</td><td>1704272</td><td></td></tr><tr><td>Clarity Zachodnie podłoża do bibułowania ECL</td> BIO <td>RAD</td><td>1705060</td><td></td></tr><tr><td>Restore Bufor</td> <td>do usuwania plam Western blotThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>21059</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowany Dulbecco's Eagle Medium</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Sonikator, Nazwa: FB120</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>695320-07-12</td><td></td></tr></tbody></table>

frakcjonowanie subkomórkowe w celu aktywacji erk po leczeniu peptydami pochodzącymi z mitochondriów

Subcellular Fractionation for ERK Activation Upon Mitochondrial-derived Peptide Treatment

Peptydy pochodzące z mitochondriów (MDP) to nowa klasa peptydów, które są kodowane przez małe otwarte ramki odczytu w innych znanych genach genomu mitochondrialnego. MDP mają szeroką gamę efektów biologicznych, takich jak ochrona neuronów przed apoptozą, poprawa markerów metabolicznych i ochrona komórek przed chemioterapią. Humanina była pierwszym odkrytym MDP i jest najlepiej przebadanym peptydem z rodziny MDP. Receptory błonowe i dalsze szlaki sygnałowe humaniny zostały dokładnie scharakteryzowane. Dodatkowe MDP, takie jak MOTS-c i SHLP1-6, zostały niedawno odkryte, a mechanizmy sygnalizacji nie zostały jeszcze wyjaśnione. Tutaj opisujemy metodę opartą na hodowli komórkowej w celu określenia funkcji tych peptydów. W szczególności techniki frakcjonowania komórek w połączeniu z western blotting pozwalają na ilościowe określenie aktywacji i translokacji ważnej cząsteczki sygnałowej. Chociaż istnieją inne metody frakcjonowania komórek, opisana tutaj metoda jest łatwa i nieskomplikowana. Metody te można wykorzystać do dalszego wyjaśnienia mechanizmu działania tych peptydów i innych środków terapeutycznych.

Stosując przedstawioną tutaj procedurę, traktowaliśmy komórki HEK293 i SH-SY5Y odpowiednio 1 μM i 100 μM S14G-humaniny, silnego analogu humaniny21, w pożywce kompletnej przez wskazane okresy czasu (Rycina 1A i Rycina 1B). Następnie w całkowitych ekstraktach białkowych badaliśmy całkowitą i fosforylowaną formę ERK1/2 w obrębie Thr202/Tyr204. Leczenie S...

Ten protokół opisuje, jak stymulować komórki peptydami pochodzącymi z mitochondriów i oceniać kaskadę sygnałową oraz lokalizację fosfobiałek.

Frakcjonowanie subkomórkowe w celu aktywacji ERK po leczeniu peptydami pochodzącymi z mitochondriów

Mitochondrial-derived peptides (MDPs) are a new class of peptides that are encoded by small open reading frames within other known genes of the ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest zidentyfikowanie kaskady sygnalizacyjnej zaangażowanej w komórki stymulowane peptydami pochodzącymi z mitochondriów. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania w polu peptydów pochodzących z mitochondriów, takie jak to, jakie szlaki sygnałowe są zaangażowane i gdzie to zachodzi. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest prosta i stosunkowo łatwa do wykonania.Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zbadaliśmy sygnalizację ERK za pośrednictwem człowieka, która dostarczyła nam ograniczonych informacji na temat dalszych faktów. Metoda Kershera w podskali dała nam lepsze wyobrażenie o roli sygnalizacji za pośrednictwem człowieka. Trzeciego dnia po posiewie i umyciu dwa razy od dziesięciu do szóstego, komórki SH-SY5Y lub HEK293 zgodnie z protokołem tekstowym.Rozpuść peptydy humaniny S14G w przefiltrowanej wodzie destylowanej o temperaturze zerowej dwóch mikronów. I rozpuść je ponownie w postaci jednomilimolowego roztworu podstawowego. Podwielokrotnić wstępnie podgrzaną pożywkę zawierającą surowicę lub bezsurowicę w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów i dodać roztwór podstawowy peptydu humaniny o temperaturze pokojowej, aby

subcellular-fractionation-for-erk-activation-upon-mitochondrial

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W tym filmie pokażemy, w jaki sposób można analizować kompleksy łańcucha oddechowego mitochondriów ludzkich embrionalnych komórek macierzystych przy użyciu testów aktywności w żelu.

Badanie aktywności kompleksów mitochondrialnych w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych

Opisano wpływ aktywacji izoformy kinazy białkowej C (PKC) na funkcje mitochondrialne związane z oddychaniem i fosforylacją oksydacyjną oraz na żywotność komórek. Podejście to adaptuje technikę adenowirusową w celu selektywnej nadekspresji izoform PKC w pierwotnych hodowlach komórkowych oraz szereg analiz służących do określenia funkcji mitochondriów i stanu energetycznego komórki.

Ocena funkcji mitochondriów i żywotności komórek w komórkach nerkowych z nadekspresją izoform kinazy białkowej C

Wiele mRNA kodujących białka mitochondrialne jest związanych z zewnętrzną błoną mitochondriów. Opisujemy procedurę frakcjonowania subkomórkowego mającą na celu wyizolowanie mitochondriów drożdży wraz z powiązanymi z nimi mRNA i rybosomami. Protokół ten można zastosować do komórek hodowanych w różnych warunkach w celu ujawnienia mechanizmów lokalizacji mRNA i zlokalizowanej translacji w pobliżu mitochondriów.

Izolacja mRNA związanych z mitochondriami drożdży w celu zbadania mechanizmów zlokalizowanej translacji

Tutaj opisujemy, jak badać mitochondrialną lokalizację kinazy (cyklu komórkowego) i jak określić jej submitochondrialne położenie, a także potencjalne substraty/cele mitochondrialne. Wymuszona ekspresja białek w mitochondriach stanowi użyteczne narzędzie do badania funkcjonalnych konsekwencji mitochondrialnej lokalizacji białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Eksperymentalne podejścia do badania lokalizacji mitochondrialnej i funkcji kinazy jądrowego cyklu komórkowego, Cdk1

Kinazy białkowe to wysoce rozwinięte enzymy sygnalizacyjne i rusztowania, które są kluczowe dla między- i wewnątrzkomórkowej transdukcji sygnału. Przedstawiamy protokół pomiaru aktywności kinazy za pomocą znakowanego radioaktywnie trifosforanu adenozyny ([γ-32P] ATP), niezawodnej metody pomagającej w wyjaśnieniu regulacji sygnalizacji komórkowej.

Oznaczanie aktywności kinazy białkowej za pomocą znakowanego radioaktywnie ATP

Napad elektrowstrząsowy (ECS) to eksperymentalny model terapii elektrowstrząsowej w ciężkiej depresji. ECS globalnie stymuluje aktywność hipokampa, prowadząc do synaptogenezy i plastyczności synaptycznej. W tym miejscu opisujemy metody indukcji ECS u szczurów i subkomórkowego frakcjonowania ich hipokampów w celu zbadania zmian w białkach synaptycznych wywołanych napadami.

Napady elektrowstrząsowe u szczurów i frakcjonowanie ich hipokampów w celu zbadania wywołanych napadami zmian w białkach o gęstości postsynaptycznej

Tutaj prezentujemy protokół izolacji błony plazmatycznej, cytoplazmy i mitochondriów komórek U937 bez użycia szybkiego wirowania. Technika ta może być stosowana do oczyszczania frakcji subkomórkowych w celu późniejszego zbadania lokalizacji białka za pomocą immunoblottingu.

Frakcjonowanie komórek U937 przy braku wirowania z dużą prędkością

Ściśle skoncentrowany laser femtosekundowy może dostarczać precyzyjną stymulację komórkom poprzez połączenie z mikroskopią konfokalną, umożliwiając obserwację w czasie rzeczywistym i fotostymulację. Fotostymulacja może aktywować zdarzenia molekularne komórki, w tym szlak sygnałowy ERK i mitochondrialne błyski reaktywnych form tlenu.

Fotostymulacja laserem femtosekundowym aktywuje sygnalizację kinazy regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK) lub zdarzenia mitochondrialne w komórkach docelowych

Pomimo ostatnich osiągnięć, wiele białek mitochondrialnych drożdży nadal pozostaje ze swoimi funkcjami zupełnie nieznanymi. Protokół ten zapewnia prostą i niezawodną metodę określania submitochondrialnej lokalizacji białek, co ma fundamentalne znaczenie dla wyjaśnienia ich funkcji molekularnych.

Ocena lokalizacji białek submitochondrialnych u pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae

RASopatie to wielosystemowe zespoły genetyczne wywołane hiperaktywacją szlaku RAS-MAPUK. Potencjalnie patogenne warianty oczekujące na walidację pojawiają się nieustannie, podczas gdy słabe dowody przedkliniczne ograniczają terapię. Tutaj opisujemy nasz protokół in vivo polegający na testowaniu i krzyżowej weryfikacji poziomów aktywacji ERK związanych z RASopatią oraz jego modulacji farmakologicznej podczas embrigenezy za pomocą obrazowania FRET na żywo u danio danio młodego typu Teen-reporter.

Efektywny protokół oceny modulacji aktywności ERK w wczesnych modelach zespołu Noonana u danio danio za pomocą mikroskopii na żywo FRET i immunofluorescencji

Poznaj frakcjonowanie subkomórkowe w celu aktywacji ERK po leczeniu peptydami pochodzącymi z mitochondriów w liniach komórkowych SH-SY5Y i HEK293. Ta metoda pozwala badać szlaki sygnałowe i lokalizację fosfoprotein.

Frakcjonowanie subkomórkowe w celu aktywacji ERK po leczeniu peptydami pochodzącymi z mitochondriów

Przeglądaj więcej filmów