Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek w celu obserwacji podstawowych procesów podczas wzrostu komórek drobnoustrojów

Ogólnym celem tego podejścia opartego na mikroskopii jest obserwacja centralnych procesów podczas wzrostu komórek bakteryjnych. Metoda ta pozwala nam odpowiedzieć na ważne pytania w bakteriologii, takie jak to, w jaki sposób koordynowane są podstawowe procesy podczas wzrostu i podziału komórek bakteryjnych. Główną zaletą tej techniki jest to, że jesteśmy w stanie użyć odczynników fluorescencyjnych do wizualizacji powierzchni i struktur komórek bakteryjnych w żywych komórkach.

Tutaj używamy tej metody, aby zapewnić wgląd w podstawowe procesy zachodzące w Agrobacterium tumefaciens. Jednak proces ten można również zastosować do innych bakterii w celu zbadania ich wzrostu. Na początek użyj sterylnego drewnianego patyczka lub końcówki pipety, aby zaszczepić trzy mililitry pożywki ATGN Growth Medium pojedynczą kolonią dzikiego lub zmutowanego szczepu A.Tumifaciens.

Uprawiaj kulturę w temperaturze 28 stopni Celsjusza i 225 obr./min przez noc. Następnego dnia użyj spektrofotometru, aby zmierzyć OD600. Następnie rozcieńczyć kulturę komórkową do OD600 około 0,2 i kontynuować wzrost komórek do OD600 0,6.

Dozuj jeden mililitr kultury wykładniczej do trzech probówek do mikrofuge. I granulować komórki w wirówce stołkowej o sile 7 000 x g przez pięć minut. Ponownie zawiesić każdą osadkę komórkową w jednym mililitrze PBS, a następnie dodać jeden mikrolitr roztworu podstawowego DMSO Orange lub roztworu podstawowego DAPI.

Delikatnie wymieszać pipetując i inkubować ponownie zawieszone komórki w ciemności przez pięć minut. Osadzać komórki przez odwirowanie przy 7 000 x g przez pięć minut i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze PBS w celu usunięcia nadmiaru odczynnika. Następnie umyj komórki jeszcze dwa razy i ponownie zawieś granulat w 50 mikrolitrach PBS lub pożywki.

Aby uzyskać jednoczesne obrazowanie poklatkowe, połącz dziesięć mikrolitrów komórek z każdego zabiegu w nowej probówce do mikrofuge. Aby przygotować płatki agarozowe do obrazowania komórek, użyj szkiełka nakrywkowego jako przewodnika i wytnij kwadrat folii laboratoryjnej o wymiarach 22 na 22 milimetry, przesuwając skalpelem po krawędziach. Wytnij kwadrat ze środka folii laboratoryjnej, pozostawiając około dwóch do pięciu milimetrowych obwódek, które posłużą jako uszczelka do podkładki agarozowej.

Następnie wyrzuć środkowe wycięcie. Umieść uszczelkę foliową na szkiełku szkiełkowym, oczyszczonym amoniakiem i bezalkoholowym środkiem czyszczącym. I użyj bloku grzewczego ustawionego na 70 stopni Celsjusza lub płomienia, aby podgrzać szkiełko, aż folia lekko stopi się na szkle.

Następnie przygotuj roztwór agarozy, mieszając około 0,075 grama agarozy i pięć mililitrów pożywki w małej kolbie. Podgrzej roztwór w kuchence mikrofalowej z okresowym wirowaniem, aby wymieszać, aż agaroza się rozpuści, a roztwór będzie klarowny. Utrzymuj roztwór agarozy w temperaturze 55-70 stopni Celsjusza i użyj go do budowy wielu płatków agarozowych w ciągu 48 godzin.

Odpipetować ciepłą pożywkę agarozową do środka uszczelki. Następnie umieść szkiełko nakrywkowe na uszczelce, aby równomiernie rozprowadzić agarozę. Umieść szkiełko na chłodnej, równej powierzchni, aby zastygło przez około dwie minuty.

Teraz ostrożnie zsuń szkiełko nakrywkowe z podkładki agarozowej, a następnie pozostaw podkładkę z agarozy do wyschnięcia na powietrzu przez jedną do dwóch minut w temperaturze pokojowej, aż powierzchnia podkładki będzie wyglądać na suchą. Właściwa konstrukcja podkładki agarozowej ma kluczowe znaczenie dla uzyskania wysokiej jakości obrazów. Nie próbuj obrazować na złym padzie.

Jeśli podkładka agarozowa wyschnie, pomarszczy się lub rozerwie, najlepiej nie być leniwym i zamiast tego zrobić nową podkładkę. Następnie za pomocą skalpela usuń mały pasek agarozy, aby utworzyć kieszeń powietrzną o wymiarach około dwóch na siedem do dziesięciu milimetrów. Komórki A. Tumemasiena mają tendencję do najlepszego wzrostu w pobliżu kieszeni powietrznej.

Umieść od 0,8 do 1 mikrolitra komórek na podkładce agarozowej. Następnie delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu podkładki agarozowej, aby rozprowadzić komórki na powierzchni podkładki. W przypadku długotrwałego obrazowania poklatkowego należy użyć stopionego Valap do uszczelnienia krawędzi szkiełka nakrywkowego.

Pamiętaj, aby uszczelnić wzdłuż wszystkich krawędzi i rogów szkiełka nakrywkowego za pomocą Valap. Niezastosowanie się do tego może spowodować dryfowanie podczas obrazowania poklatkowego z podkładką agarozową. Aby przeprowadzić mikroskopię epifluorescencyjną, umieść olejek immersyjny na żądanym obiektywie i umieść odwrócony szkiełko w uchwycie na stoliku.

Użyj pokręteł ostrości, aby ustawić ostrość komórek. Uzyskuj obrazy w fazie lub DIC i fluorescencji, używając żądanego filtra fluorescencyjnego dla obrazów fluorescencyjnych. Opcjonalnie uzyskaj wiele pozycji x, y, losowo wybierając dziesięć pól komórek w bliskiej odległości od kieszeni powietrznej poduszek agarozowych.

Skonfiguruj akwizycję sekwencji czasowej do obrazu w fazie lub DIC w żądanym interwale czasu. Jak pokazano tutaj, komórki obrazowano bezpośrednio z hodowli po umyciu przez odwirowanie i po inkubacji komórek z 0,1% DMSO, wyniki wykazały, że samo DMSO nie wpływa na morfologię komórek. Zarówno Orange, jak i DAPI znakowały DNA w żywych komórkach A. Tumefaciens.

W późnych komórkach sprzed podziału obserwuje się dwa odrębne nukleoloidy z barwieniem pomarańczowym, podczas gdy znakowanie DNA wydaje się bardziej rozproszone w przypadku barwienia DAPI. W tym eksperymencie poklatkowym z równym odsetkiem nieoznakowanych, znakowanych DAPI i oznaczonych na pomarańczowo A.Tumefaciens typu dzikiego, wszystkie komórki rosły po zobrazowaniu za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym, co wskazuje, że żadne barwienie nie upośledzało wzrostu komórek. Komórki rosły również pod wpływem kontrastu fazowego w mikroskopii epifluorescencyjnej przy użyciu filtra TRITC.

Jednak po zobrazowaniu za pomocą filtra DAPI komórki przestały rosnąć w ciągu godziny. Stosując podobne metody, inne odczynniki fluorescencyjne mogą być również używane do wizualizacji ściany komórkowej lub błon bakteryjnych. Co więcej, wiele z tych barwników fluorescencyjnych można łączyć, aby uzyskać kompleksowy obraz powierzchni komórek bakteryjnych.

Wizualizacja podstawowych procesów zachodzących w żywych bakteriach jest ekscytująca, ponieważ otwiera możliwość badania tych procesów w mutantach warunkowych lub bakteriach niemodelowych. Dzięki temu możemy poszerzyć nasze badania nad różnymi gatunkami bakterii.