Name: Ulepszony protokół immunoprecypitacji chromatyny z mięśni szkieletowych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-06T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Poznaj ulepszony protokół immunoprecypitacji chromatyny z mięśni szkieletowych myszy. Ta metoda umożliwia przygotowanie chromatyny klasy ChIP z trudnej tkanki mięśniowej, wspierając badania regulacji ekspresji genów i mechanizmów zaniku mięśni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy całemu personelowi zakładu sekwencjonowania IGBMC o wysokiej przepustowości, członkowi konsorcjum "France Génomique" (ANR10-INBS-09-08) oraz wszystkim ogólnym służbom IGBMC, w szczególności personelowi zakładu dla zwierząt IGBMC. Prace te były wspierane przez dotacje z CNRS, INSERM, AFM, Ligue Nationale contre le Cancer, francuskiego funduszu państwowego za pośrednictwem ANR w ramach programu Investissements d'Avenir oznaczonego jako ANR-10-IDEX-0002-02, Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 oraz ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu. S.J był wspierany przez Ligue Nationale contre le Cancer i ANR-AR2GR-16-CE11-009-01, a V.U przez Ministère de l'Enseignement et de la Recherche. ID jest "équipe labellisée" Ligue Nationale contre le Cancer.

Myszy były trzymane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych oraz zgodnie z Krajowymi Wytycznymi Opieki nad Zwierzętami (dyrektywa Komisji Europejskiej 86/609/CEE; Dekret francuski nr 87-848). Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez francuską krajową komisję etyczną.
1. Izolacja tkanki mięśniowej
<ol>
	<li>Poświęć jedną dorosłą mysz w wieku od 6 do 8 tygodni przez zwichnięcie szyjki macicy. Wysterylizuj kończynę, płucząc ją 70% etanolem i wypreparuj mięśnie kończyn tylnych (brzuchaty łydki, piszczelowy przedni, mięsień czworogłowy) za pomocą cienkich nożyczek i kleszczy. 
	UWAGA: Jedna mysz powinna dać około 500 mg tkanki.</li>
	<li>Zmielić mięśnie w probówce o pojemności 2 ml zawierającej 1 ml lodowatego buforu hipotonicznego na jednorodny preparat z małych (<2 - 3 mm3) kawałków za pomocą drobnych nożyczek i pozostawić probówkę drżącą na mieszadle stołowym w temperaturze 4 °C przez 5 - 10 minut.</li>
</ol>
2. Liza tkanek
UWAGA: Proszę zapoznać się z Tabelą 1 dla wszystkich kompozycji.
<ol>
	<li>Przenieść homogenat do probówki okrągłodennej o pojemności 14 ml i ponownie zamieszać w 5 ml zimnego buforu hipotonicznego (koktajl inhibitorów proteazy bez EDTA i PMSF).
	<ol>
		<li>Homogenizować rozdrobnioną tkankę mięśniową za pomocą luźnego odrzutu (20 - 30 uderzeń w ciągu 3 minut) lub mechanicznego homogenizatora tkanek przez 15 - 30 s w okrągłodennych probówkach o pojemności 14 ml. 
		UWAGA: Skuteczność lizy można ocenić na tym etapie za pomocą mikroskopii świetlnej, a w razie potrzeby można wykonać dodatkowe zakłócenie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść homogenat do probówek o pojemności 15 ml i napełnić objętość do 10 ml za pomocą zimnego buforu hipotonicznego. Napraw homogenat zgodnie z poniższym opisem przed przystąpieniem do następnej myszy.</li>
</ol>
3. Fiksacja
<ol>
	<li>Dodaj formaldehyd do 1% końcowego stężenia i wstrząsaj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodaj glicynę do końcowego stężenia 0,125 M w każdej probówce, aby zatrzymać utrwalanie i wstrząsaj przez 5 - 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
4. Przygotowanie jąder
UWAGA: Proszę zapoznać się z Tabelą 1 dla wszystkich kompozycji.
<ol>
	<li>Utrwalony lizat homogenizować za pomocą luźnego dounce (5 - 10 uderzeń).
	<ol>
		<li>Przenieść do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu uzyskania jąder i resztek komórkowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w świeżym 5 ml buforze hipotonicznym. Przefiltrować lizat przez sitko o wielkości 70 μm do probówki o pojemności 50 ml. Ponownie przefiltrować filtrat przez sitko o wielkości 40 μm.</li>
	<li>Przenieść filtrat do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu uzyskania osadu jądrowego. 
	UWAGA: Na tym etapie jądra mogą być natychmiast poddane sonikacji lub zamrożone w postaci suchego granulatu w ciekłym azocie i przechowywane w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
5. Sonikacja
<ol>
	<li>Ocenić objętość osadu jądrowego (około 50 μl zarówno dla homogenizacji mechanicznej, jak i z odskoku) i ponownie zawiesić go w buforze sonikacyjnym do 3 do 4 razy większej objętości upakowanego jądra i poddać sonikacji przez 10 - 15 minut w temperaturze 4 °C za pomocą sonikatora. 
	UWAGA: Chromatyna może być natychmiast poddana analizie w sposób opisany poniżej (6) lub zamrożona i przechowywana w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
6. Ocena wielkości fragmentu chromatyny po sonikacji
UWAGA: Proszę zapoznać się z Tabelą 1 dla wszystkich kompozycji.
<ol>
	<li>Aby usunąć sieciowanie, weź 30 μl chromatyny do probówki o pojemności 1,5 ml i dodaj 20 μl 5 M NaCl. Uzupełnić objętość do 500 μl i inkubować w temperaturze 65 °C przez noc.
	<ol>
		<li>Następnego dnia należy przeprowadzić zabieg z użyciem 1 μl proteinazy K (20 mg/ml bulionu), 10 μl 2 M Tris pH 6,8 i 10 μl 0,5 M EDTA przez 1 godzinę w temperaturze 42 °C. Przeprowadzić ekstrakcję fenolowo-chloroformową/chloroformową i wytrącić DNA za pomocą 1 objętości octanu sodu (3 M) i 2 objętości 100% etanolu przez jedną godzinę w temperaturze -80 °C lub przez noc w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Osadzać DNA przez odwirowanie przy 13 500 x g przez 15 minut. Zdekantować supernatant i dokładnie umyć osad zimnym 70% etanolem i ponownie odwirować przez 5 minut. Zdekantować supernatant i wysuszyć osad na powietrzu.</li>
	<li>Zawiesić osad w pierwotnej objętości (30 μl) buforu TE. Zmierzyć stężenie DNA w spektrofotometrze przez absorbancję przy 260 nm/280 nm. Pobrać pipetę 500 - 1,000 ng DNA wraz z drabinką wielkości DNA na oddzielnych torach 1,5% żelu agarozowego i wykonać elektroforezę w celu oceny wielkości fragmentu chromatyny. 
	UWAGA: Rozmiar fragmentu powinien wynosić od 200 do 500 par zasad i nie powinno być wykrywalnych fragmentów o dużej masie cząsteczkowej odpowiadających nie- lub słabo pofragmentowanemu DNA. W razie potrzeby, roztwór chromatyny (krok 5) może być ponownie poddany sonikacji przez dłuższy czas, a następnie ponownie analizowany zgodnie z powyższym opisem, aż do uzyskania optymalnej wielkości.</li>
</ol>
7. Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP)
UWAGA: Proszę zapoznać się z Tabelą 1 dla wszystkich kompozycji.
<ol>
	<li>Zablokuj kulki sefarozy białka G, podając 1 ml 50% zawiesiny w etanolu. Granulki osadzać przez odwirowanie przy 400 x g przez 1 minutę w wirówce stołowej i przemyć 1 ml wirówki buforowej TE przy 400 x g i powtórzyć mycie.
	<ol>
		<li>Po drugim odwirowaniu zawiesić ponownie w 1 ml buforu rozcieńczającego ChIP z 25 μl BSA (zapas 20 mg/ml) i 20 μl tRNA drożdży (zapas 10 mg/ml). Zablokuj koraliki na co najmniej 2 godziny przed użyciem poprzez obrót (40 - 60 obr./min) w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Rozcieńczyć 50 μg chromatyny (krok 5) 8 do 10 razy za pomocą buforu rozcieńczającego ChIP. Dodać 50 μl zawiesiny z zablokowanych kulek i inkubować przez 2 godziny, obracając (40-60 obr./min) w temperaturze 4°C. Odwirować przy 400 x g w temperaturze 4 °C, aby uzyskać wstępnie oczyszczoną chromatynę i przenieść ją do świeżej probówki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu immunoprecypitacji dodać odpowiednią ilość przeciwciała pierwszorzędowego (np. 1-2 μg na 10 μg chromatyny) i inkubować przez noc z rotacją w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Optymalna ilość przeciwciał może być zalecana przez dostawcę lub może być określona empirycznie, wykonując ChIP-qPCR z różnymi ilościami przeciwciał, aż do zaobserwowania optymalnego wzbogacenia. Również sefaloza białka G może być zastąpiona sefalozą białka A w zależności od podtypu zastosowanego przeciwciała.</li>
	<li>Dodać zablokowane kulki następnego dnia i inkubować przez 1 godzinę z rotacją (40 - 60 obr./min) w temperaturze 4 °C. Odwirować przy 400 x g przez 20 - 30 s w celu osadzenia kulek, usunięcia supernatantu i rozpoczęcia płukania ChIP.</li>
	<li>Mycie ChIP: Wykonaj następujące płukanie: raz z buforem o niskiej zawartości soli, a następnie dwa razy z buforem o wysokiej zawartości soli, dwa razy z buforem LiCl i na koniec dwa razy z buforem TE.
	<ol>
		<li>Każde płukanie należy wykonywać przez 10 minut z obrotem (40 - 60 obr./min) w temperaturze 4 °C i granulować kulki między każdym myciem przez odwirowanie przy 400 x g przez 20 - 30 s w wirówce stołowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu elucji usunąć ostatnie płukanie i ponownie zawiesić kulki w 250 μl buforze elucyjnym (świeżo przygotowanym) na 15 minut w temperaturze pokojowej, wstrząsając.</li>
	<li>Odwirować przy 400 x g i zebrać eluat do świeżej probówki. Wykonaj ten krok dwukrotnie, a następnie rozsieciuj eluat przez noc za pomocą 20 μl NaCl 5 M i 1 μl RNazy A (10 mg / ml), potraktuj proteinazą K i ekstraktem fenolowo-chloroformowym/chloroformowym, jak w kroku 6.</li>
	<li>Ponownie zawieś w 50 μl buforu TE i użyj podwielokrotności dla ChIP-qPCR zgodnie ze standardowymi protokołami15, aby sprawdzić jakość ChIP.</li>
</ol>

<ol><li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).</li>
<li>Furey, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+and+beyond%3A+new+and+improved+methodologies+to+detect+and+characterize+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions.</a> Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).</li>
<li>Wade, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+Transcription+Regulatory+Networks+with+ChIP-seq+and+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Mapping Transcription Regulatory Networks with ChIP-seq and RNA-seq.</a> Adv Exp Med Biol. 883, 119-134 (2015).</li>
<li>Alpern, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAF4%2C+a+subunit+of+transcription+factor+II+D%2C+directs+promoter+occupancy+of+nuclear+receptor+HNF4A+during+post-natal+hepatocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">TAF4, a subunit of transcription factor II D, directs promoter occupancy of nuclear receptor HNF4A during post-natal hepatocyte differentiation.</a> Elife. 3, e03613(2014).</li>
<li>Martianov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+occupancy+of+an+extended+repertoire+of+CREM+and+CREB+binding+loci+in+male+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Cell-specific occupancy of an extended repertoire of CREM and CREB binding loci in male germ cells.</a> BMC Genomics. 11, 530(2010).</li>
<li>Achour, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+identity+genes+regulated+by+super-enhancers+are+preferentially+down-regulated+in+the+striatum+of+Huntington%27s+disease+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Neuronal identity genes regulated by super-enhancers are preferentially down-regulated in the striatum of Huntington's disease mice.</a> Hum Mol Genet. 24 (12), 3481-3496 (2015).</li>
<li>Joshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TEAD+transcription+factors+are+required+for+normal+primary+myoblast+differentiation+in+vitro+and+muscle+regeneration+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">TEAD transcription factors are required for normal primary myoblast differentiation in vitro and muscle regeneration in vivo.</a> PLoS Genet. 13 (2), e1006600(2017).</li>
<li>Ohkawa, Y., Mallappa, C., Dacwag-Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOhkawa%2C+Y+%22Myogenesis%3A+Methods+and+protocols%22">Myogenesis: Methods and protocols</a>. DiMario, J. 798, Springer Science+Business Media LLC. 517-531 (2012).</li>
<li>Dimauro, I., Pearson, T., Caporossi, D., Jackson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+protocol+for+the+subcellular+fractionation+of+skeletal+muscle+cells+and+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">A simple protocol for the subcellular fractionation of skeletal muscle cells and tissue.</a> BMC Res Notes. 5, 513(2012).</li>
<li>Thomas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAK1+and+CtBP1+Regulate+the+Coupling+of+Neuronal+Activity+to+Muscle+Chromatin+and+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">PAK1 and CtBP1 Regulate the Coupling of Neuronal Activity to Muscle Chromatin and Gene Expression.</a> Mol Cell Biol. 35 (24), 4110-4120 (2015).</li>
<li>Kuo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+glucocorticoid+receptor-binding+sites+in+myotubes+identifies+gene+networks+modulating+insulin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of glucocorticoid receptor-binding sites in myotubes identifies gene networks modulating insulin signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (28), 11160-11165 (2012).</li>
<li>Whyte, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Master+transcription+factors+and+mediator+establish+super-enhancers+at+key+cell+identity+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes.</a> Cell. 153 (2), 307-319 (2013).</li>
<li>Benhaddou, A., Keime, C., Ye, T., Morlon, A., Michel, I., Jost, B., Mengus, G., Davidson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+TEAD4+regulates+expression+of+myogenin+and+the+unfolded+protein+response+genes+during+C2C12+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Transcription factor TEAD4 regulates expression of myogenin and the unfolded protein response genes during C2C12 cell differentiation.</a> Cell Death and Differentiation. 19 (2), 220-231 (2011).</li>
<li>Cowling, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+dynamin+2+expression+rescues+X-linked+centronuclear+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Reducing dynamin 2 expression rescues X-linked centronuclear myopathy.</a> J Clin Invest. 124 (3), 1350-1363 (2014).</li>
<li>Thermo Fisher Scientific. ChIP Analysis. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html">https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html</a> (2017).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Tutaj opisujemy nowy protokół przygotowania chromatyny z mięśni szkieletowych dorosłych myszy i pokazujemy, że ta chromatyna jest odpowiednia do eksperymentów ChIP, które wykrywają wiązanie czynników transkrypcyjnych i kowalencyjne modyfikacje histonów w jądrach włókien mięśniowych. Protokół ten obejmuje kilka krytycznych kroków. Pierwszym z nich jest rozerwanie tkanki, które można wykonać albo przez odbicie, albo przez mechaniczne ścinanie. Ścinanie mechaniczne jest szybsze i bardziej powtarzalne, dlatego jest metodą z ...

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) w połączeniu z ilościową reakcją łańcuchową polimerazy (qPCR) i sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości (ChIP-seq) stały się metodami wyboru do badania transkrypcji i epigenetycznej regulacji ekspresji genów w różnych tkankach i typach komórek1. Technika ta umożliwia profilowanie całego genomu kowalencyjnych modyfikacji chromatyny, zajętości wariantu histonu i wiązania czynnika transkrypcyjnego2,3.
Podczas gdy wykonywanie ChIP z hodowanych komórek jest dobrze znane, ChIP z tkanek ssaków pozostaje bardziej trudne. Przygotowanie chromatyny do ChIP obejmuje kilka krytycznych etapów, które należy zoptymalizować dla każdej tkanki i typu komórki. Chromatyna może być wytwarzana z lizatów komórkowych hodowanych komórek lub po oczyszczeniu ich jąder. W przypadku tkanek ssaków skuteczna liza, wiązanie formaldehydu i oczyszczanie jąder mają kluczowe znaczenie dla zapewnienia optymalnego odzysku chromatyny. Co więcej, wybór, czy utrwalić jądra przed, czy po ich oczyszczeniu, musi być określony doświadczalnie. Pomimo tych przeszkód, ChIP został z powodzeniem przeprowadzony z tkanek takich jak wątroba, jądra lub mózg4,5,6. W przypadku mięśni szkieletowych szczególnie trudne jest rozerwanie tak odpornej fizycznie tkanki, która wykazuje wysoką zawartość białek strukturalnych, oraz izolacja jej jąder. Biorąc pod uwagę tę specyfikę, protokoły zoptymalizowane pod kątem innych tkanek nie dają zadowalających wyników dla mięśni szkieletowych.
Tutaj opisujemy protokół izolacji chromatyny klasy ChIP z tkanki mięśni szkieletowych myszy, który obejmuje fizyczne uszkodzenie tkanki, utrwalenie formaldehydu, a następnie izolację jąder i sonikację. Skuteczność tej metody w przygotowaniu chromatyny odpowiedniej dla ChIP z tej tkanki wykazano poprzez wykonanie ChIP-qPCR i ChIP-seq dla różnych czynników transkrypcyjnych, polimerazy RNA II i kowalencyjnych modyfikacji histonów7.
Ta nowa technika jest znacznie szybsza niż poprzednio opisany protokół8 obejmujący długie etapy trawienia kolagenazy, podczas których mogą zachodzić zmiany w genomowej lokalizacji czynników transkrypcyjnych i zmiany w ekspresji genów. Szybkość, z jaką jądra są izolowane i utrwalane, sprawia, że opisana tutaj metoda jest szczególnie atrakcyjna do przygotowania chromatyny, która wierniej oddaje natywny stan zajętości genomu. Ponadto, mimo że opisano inne metody izolacji chromatyny lub ekstrakcji białek z tkanki mięśniowej8,9,10 i używane do eksperymentów ChIP-qPCR na wybranych genach, nie zgłoszono żadnych danych ChIP-seq z ich użyciem. Opisana tutaj metoda jest odpowiednia dla modyfikacji czynnika transkrypcyjnego i histonów ChIP-seq, a zatem powinna być również odpowiednia do zastosowań związanych z wychwytywaniem konformacji chromatyny 3/4C lub HiC.

<table><tbody><tr><td>T 25 cyfrowy ULTRA-TURRAX</td><td>T 18 ULTRA-TURRAX</td><td>0009022800</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE SARL</td><td>P7626-25G</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteazy-wolne od EDTA</td><td>Diagnostyka Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Białko G Koraliki sefarozy</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>P-3296</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>P-2308</td><td></td></tr><tr><td>Sitka komórkowe 70um</td><td>Corning BV</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>Sitka komórkowe 40um</td><td>Corning BV</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd EM klasy</td><td>Euromedex</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>Rnaza A</td><td>Fischer Scientific</td><td>12091039</td><td></td></tr><tr><td>Fenol:Chloroform:Alkohol izoamylowy 25:24:1</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>P3803</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>B4287-25G</td><td></td></tr><tr><td>drożdże tRNA</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>R5636</td><td></td></tr><tr><td>Błękit glikogenowy</td><td>AMIBION</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało Pol II ChIP</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9001</td><td></td></tr><tr><td>H3K27ac ChIP</td><td>Aktywny motyw</td><td>39133</td><td></td></tr><tr><td>Tead4 Przeciwciało ChIP</td><td>Aviva Systems Biology</td><td>(ARP38276_P050)</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL</td><td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td><td>I-3021</td><td></td></tr><tr><td>E220 Focused Ultrasonic</td><td>Covaris E220</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Dodatkowe przedmioty</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Loose Dounce</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml i 50 ml Probówki</td><td></td><td></td><td></td>Sokół</tr><tr><td>14 ml Probówki</td><td></td><td></td><td></td>z okrągłym dnem</tr><tr><td>1,5 ml i 2 ml Probówki</td><td></td><td></td><td></td>Eppendorf</tr><tr><td>70 &mu; m oraz 40 &mu; m sitka komórkowe (Corning)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ulepszony protokół immunoprecypitacji chromatyny z mięśni szkieletowych myszy

Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

Opisujemy skuteczny i powtarzalny protokół przygotowania chromatyny z mięśni szkieletowych dorosłych myszy, fizycznie odpornej tkanki o wysokiej zawartości białek strukturalnych. Wypreparowane mięśnie kończyn dorosłych myszy są fizycznie zakłócane przez mechaniczną homogenizację lub kombinację mielenia i dozdzierania w hipotonicznym buforze przed utrwaleniem formaldehydu w lizacie komórkowym. Utrwalone jądra są oczyszczane przez dalsze cykle mechanicznej homogenizacji lub douncji i sekwencyjnej filtracji w celu usunięcia resztek komórkowych. Oczyszczone jądra mogą być sonikowane natychmiast lub na późniejszym etapie po zamrożeniu. Chromatyna może być skutecznie sonikowana i nadaje się do eksperymentów immunoprecypitacji chromatyny, co ilustrują profile uzyskane dla czynników transkrypcyjnych, polimerazy RNA II i kowalencyjnych modyfikacji histonów. Zdarzenia wiązania wykrywane przy użyciu chromatyny przygotowanej za pomocą tego protokołu to głównie te, które zachodzą w jądrach włókien mięśniowych pomimo obecności chromatyny z innych komórek satelitarnych i śródbłonka związanych z włóknami. Protokół ten jest zatem dostosowany do badania regulacji genów w mięśniach szkieletowych dorosłej myszy.

Aby wyizolować jądra, przeprowadziliśmy homogenizację mechaniczną wyciętej i posiekanej tkanki mięśniowej przez 15 lub 45 s, przy prędkościach 18 000 i 22 000 rpm (patrz Tabela materiałów). we wszystkich warunkach udało się oddzielić jądra od resztek tkankowych, jednak optymalną wydajność uzyskano przy zastosowaniu niższej prędkości (Rysunek 1A-B). Jądra można było również przygotować poprzez douncowanie przez 3–5 min (<stron...

Przedstawiono nowy protokół przygotowania chromatyny z mięśni szkieletowych dorosłej myszy, przystosowany do badania regulacji genów we włóknach mięśniowych przez immunoprecypitację chromatyny.

Ulepszony protokół immunoprecypitacji chromatyny z mięśni szkieletowych myszy

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie chromatyny z mięśni szkieletowych dorosłej myszy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące regulacji genów i włókien mięśni szkieletowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona przygotowanie chromatyny klasy ChIP z mięśni szkieletowych myszy.Tkanka odporna fizycznie o wysokiej zawartości białek strukturalnych. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy staraliśmy się scharakteryzować mechanizmy molekularne leżące u podstaw atrofii mięśni w użyciu glukoartykulowym, co wymaga identyfikacji receptorów glukoartykulacyjnych, miejsc wiążących DNA we włóknach mięśni szkieletowych myszy. Procedurę zademonstruje Shilpy Joshi, post-doc z naszego laboratorium.Aby rozpocząć tę procedurę, odzyskaj zamrożone lub świeżo wycięte mięśnie kończyn tylnych. Następnie zmiel mięśnie w dwumililitrowej probówce, zawierającej jeden mililitr lodowatego buforu hipotonicznego do jednorodnego przygotowania małych kawałków, używając cienkich nożyczek. Następnie pozostaw rurkę wstrząśniętą na mieszadle stołowym w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć do 10 minut.Następnie przenieś wypreparowaną tkankę do 14-mililitrowej probówki okrągłodennej zawierającej cztery mililitry zimnego buforu hipotonicznego. Homogenizuj zmieloną tkankę za pomocą mechanicznego homogenizatora tkanek przez 15 do 30 sekund. Następnie przenieś homogenat do 15-mililitrowej probówki.Dodaj zimny bufor hipotoniczny, aby uzyskać 10 mililitrów próbki i utrwal homogenat przed przystąpieniem do następnej myszy. W tej procedurze dodaj formaldehyd do próbki, aby uzyskać 1% stężenie końcowe. A następnie wstrząsaj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Następnie dodaj glicynę, aby uzyskać końcowe stężenie 0,125 mola w każdej probówce, aby zatrzymać utrwalanie. I wstrząsaj przez pięć do 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie homogenizuj utrwalony lizat, używając luźnego odbicia.Następnie przenieś go do 15-mililitrowej probówki i wiruj przy 1000 g przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza, aby uzyskać jądra i szczątki komórkowe. Po pięciu minutach usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach świeżego buforu hipotonicznego. Przefiltruj lizat przez sitko o średnicy 70 mikrometrów do 50-mililitrowej probówki.Za pomocą końcówki pipety umyj filtr jednym mililitrem zimnego buforu hipotonicznego. Następnie należy ponownie przefiltrować filtrat przez sitko o długości 40 mikrometrów. Następnie przenieś filtrat do 15-mililitrowej probówki.I wirować przy 1000 g przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza, aby uzyskać pastylkę jądrową. Po odrzuceniu supernatantu użyj jednego mililitra buforu hipotonicznego do zebrania trzech granulek i przeniesienia do probówki o pojemności od 1,5 do dwóch mililitrów. Wirować przy 1000 g przez pięć minut.Następnie oceń objętość osadu jądrowego przez porównanie z probówkami zawierającymi znaną objętość cieczy i ponownie zawiesić go w buforze sonicznym do trzech do czterech razy większą od upakowanej objętości jądra. Następnie sonikować zawiesinę przez 10 do 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, używając sonikatora. Odwirować sonifikowaną próbkę i przenieść supernatant chromatyny do świeżej probówki o pojemności 1,5 mililitra.Aby usunąć sieciowanie, weź 30 mikrolitrów chromatyny w 1,5-mililitrowej probówce i dodaj 20 mikrolitrów pięciomolowego chlorku sodu i 450 mikrolitrów wody. Uzupełnij objętość do 500 mikrolitrów i inkubuj w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia wykonaj zabieg z jednym mikrolitrem Proteinazy K, 10 mikrolitrami dwóch tri molowych o pH 6,8 i 10 mikrolitrami 0,5 molowego EDTA przez godzinę w temperaturze 42 stopni Celsjusza.Następnie wykonaj zwykłą ekstrakcję chloroformem fenolowo-chloroformowym i wytrącaj DNA jedną objętością octanu sodu i dwiema objętościami 100% etanolu przez jedną godzinę w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza lub przez noc w temperaturze ujemnej 20 stopni Celsjusza. Następnie osadzać DNA przez odwirowanie w temperaturze 13 500 g przez 15 minut. Zdekantować supernatant i dokładnie umyć osad zimnym 70% etanolem i ponownie odwirować przez pięć minut.Następnie zdekantować supernatant i wysuszyć granulkę na powietrzu. Następnie ponownie zawiesić osad w pierwotnej objętości bufora tris HCl EDTA. Zmierz stężenie DNA w spektrofotometrze za pomocą absorbentów o długości 260 nanometrów, 280 nanometrach.Następnie odpipetuj od 500 do 1000 nanogramów DNA razem z drabinką wielkości DNA na oddzielnych pasach 1,5% żelu agarozowego. I wykonaj elektroforezę, aby ocenić wielkość fragmentu chromatyny. Aby zoptymalizować homogenizację, homogenizację prowadzono przez 15 sekund lub 45 sekund przy dwóch prędkościach, 18 000 i 22 000 obr./min.W każdych warunkach jądra można było oddzielić od szczątków tkanki, ale wydajność była optymalna przy mniejszej prędkości. Jądra można również przygotować, zanurzając je przez trzy do pięciu minut. Jednak homogenizacja mechaniczna jest metodą z wyboru, ponieważ optymalną wydajność jąder można osiągnąć w ciągu zaledwie 15 sekund, co pozwala na znaczne zyski czasu, zwłaszcza jeśli trzeba przetworzyć wiele próbek.Korzystając z tego protokołu, można wyizolować do 2,7 razy od 10 do siedmiu jąder z 500 miligramów tkanki, aby wygenerować 100 mikrogramów chromatyny. Tak przygotowana chromatyna daje czyste, wysokiej jakości wyniki w eksperymentach sekwencjonowania ChIP. Ilustruje to wysoki poziom acetylowanego K27 histonu H3 i polimerazy RNA 2 w locus Desmonda wyrażonym w mięśniach.Swoistość dla włókien mięśniowych jest pokazana przez niski lub brak sygnału w loci Pecam1 i Vcam1, które nie są wyrażane w mięśniach. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby prawidłowo zanurzyć sondę homogenizatora w próbce, aby uniknąć spienienia, wyczyścić sondę między próbkami i zoptymalizować fragmentację chromatyny. Tak przygotowana chromatyna została z powodzeniem wykorzystana ze względu na ChIP do mapowania zajętości czynników transkrypcyjnych w całym genomie i powinna być również odpowiednia do technik wychwytywania chromatyny.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę do badań w dziedzinie genomiki, mających na celu zbadanie regulacji genów w mięśniach szkieletowych myszy. Procedura może być również stosowana do mięśni szczurów i biopsji od ludzi. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak stosować homogenizację mechaniczną, a następnie oczyszczanie jąder utrwalonych formaldehydem w celu przygotowania chromatyny z mięśni szkieletowych do immunoprecypitacji.Nie zapominaj, że praca z formaldehydem, fenolem, chloroformem i proteinazą K może być niebezpieczna. Należy podjąć środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i okularów. Czynności związane z tymi odczynnikami należy wykonywać pod maską.

improved-protocol-for-chromatin-immunoprecipitation-from-mouse

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Przedstawiamy metodę immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) służącą do identyfikacji oddziaływań czynników przy genach specyficznych tkankowo podczas lub po rozpoczęciu ekspresji genów specyficznych tkankowo w tkance embrionalnej myszy. Protokół ten powinien znaleźć szerokie zastosowanie w badaniach nad aktywacją genów specyficznych tkankowo zachodzącą podczas prawidłowego rozwoju embrionalnego.

Analiza immunoprecypitacji chromatyny dla genów specyficznych tkankowo z wykorzystaniem embrionów myszy we wczesnym stadium rozwoju

Opisujemy solidną metodę immunoprecypitacji chromatyny przy użyciu pierwotnych limfocytów T. Metoda opiera się na standardowych podejściach, ale wykorzystuje określony zestaw warunków i odczynników, które poprawiają wydajność dla ograniczonej liczby komórek. Co ważne, przedstawiono szczegółowy opis fazy analizy danych.

Wydajna immunoprecypitacja chromatyny przy użyciu ograniczonych ilości biomasy

Ta praca opisuje protokół immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) przy użyciu dojrzałej linii mysich komórek T. Protokół ten jest odpowiedni do badania rozkładu określonych znaczników histonowych w określonych miejscach promotora lub w całym genomie.

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) w liniach mysich limfocytów T

Prezentujemy protokół oparty na filtracji do izolowania wysokiej jakości jąder z usieciowanych mięśni szkieletowych myszy, w którym usunęliśmy potrzebę ultrawirowania, dzięki czemu jest to łatwe do zastosowania. Pokazujemy, że chromatyna przygotowana z jąder nadaje się do badań immunoprecypitacji chromatyny i prawdopodobnego sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny.

Oparta na filtracji metoda przygotowania wysokiej jakości jąder z usieciowanych mięśni szkieletowych do immunoprecypitacji chromatyny

Prezentujemy skuteczną i powtarzalną metodę izolacji i hodowli nerwowych komórek progenitorowych z embrionalnej i postnatalnej tkanki mózgowej do immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) histonu 3 lizyny 79 dimetylacji (H3K79me2) - znacznika histonowego znajdującego się w domenie globularnej histonu 3.

Izolacja i hodowla progenitorów nerwowych, a następnie immunoprecypitacja chromatyny znacznika dimetylacji histonu 3 lizyny 79

Tutaj opisujemy protokół immunoprecypitacji chromatyny zmodyfikowanych histonów z pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecypitowane DNA jest następnie wykorzystywane do ilościowego PCR w celu zbadania obfitości i lokalizacji modyfikacji potranslacyjnych histonów w całym genomie.

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) modyfikacji histonów z Saccharomyces cerevisiae

Tutaj opisujemy protokół efektywnej immunoprecypitacji chromatyny (ChIP), a następnie wysokoprzepustowego sekwencjonowania DNA (ChIP-seq) brunatnej tkanki tłuszczowej (BAT) wyizolowanej od myszy. Protokół ten nadaje się zarówno do mapowania modyfikacji histonów, jak i badania lokalizacji w całym genomie białek niehistonowych będących przedmiotem zainteresowania in vivo.

Immunoprecypitacja chromatyny mysiej brunatnej tkanki tłuszczowej

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) jest potężnym narzędziem do zrozumienia molekularnych mechanizmów regulacji genów. Metoda ta wiąże się jednak z trudnościami w uzyskaniu powtarzalnej fragmentacji chromatyny przez mechaniczne ścinanie. W tym miejscu przedstawiamy ulepszony protokół testu ChIP z wykorzystaniem trawienia enzymatycznego.

Test immunoprecypitacji chromatyny z wykorzystaniem nukleaz mikrokokowych w komórkach ssaków

Ten protokół skupia się na przygotowaniu chromatyny z zamrożonych tkanek i nadaje się do sieciowania immunoprecypitacji chromatyny (X-ChIP), a następnie analizy ilościowej PCR (X-ChIP-qPCR) lub sekwencjonowania nowej generacji (X-ChIP-seq).

Ekstrakcja chromatyny z zamrożonej chimerycznej tkanki wątroby do analizy immunoprecypitacji chromatyny

Prezentowany tutaj jest skuteczny protokół do izolacji komórek satelitarnych mięśni kończyn myszy aktywowanym fluorescencyjnie (FACS), przystosowany do badania regulacji transkrypcji we włóknach mięśniowych poprzez rozszczepienie pod tarczami i uwolnienie za pomocą nukleazy (CUT&amp;RUN).

Wydajny protokół do analizy CUT&RUN mysich komórek satelitarnych izolowanych od FACS

Badacze nowi w dziedzinie epigenetyki uznają CUT&amp;Tag za znacznie łatwiejszą alternatywę dla testów ChIP. Projekt CUT&amp;Tag przyniósł ogromne korzyści badaniom epigenetycznym na rzadkich i pierwotnych populacjach komórek, uzyskując wysokiej jakości dane z bardzo niewielu komórek. Protokół ten opisuje wykonywanie testów H3K4me1 CUT&amp;Tag na mysich mioblastach wyizolowanych z mięśni kończyn tylnych myszy.

Wykorzystanie testu rozszczepienia pod tarczami i znakowania (CUT&Tag) w badaniach mioblastów myszy

Poznaj ulepszony protokół immunoprecypitacji chromatyny z mięśni szkieletowych myszy. Ta metoda umożliwia przygotowanie chromatyny klasy ChIP z trudnej tkanki mięśniowej, wspierając badania regulacji ekspresji genów i mechanizmów zaniku mięśni.

Ulepszony protokół immunoprecypitacji chromatyny z mięśni szkieletowych myszy

Przeglądaj więcej filmów