Ulepszony protokół immunoprecypitacji chromatyny z mięśni szkieletowych myszy
6 listopada 2017
Przedstawiono nowy protokół przygotowania chromatyny z mięśni szkieletowych dorosłej myszy, przystosowany do badania regulacji genów we włóknach mięśniowych przez immunoprecypitację chromatyny.
Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie chromatyny z mięśni szkieletowych dorosłej myszy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące regulacji genów i włókien mięśni szkieletowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona przygotowanie chromatyny klasy ChIP z mięśni szkieletowych myszy.
Tkanka odporna fizycznie o wysokiej zawartości białek strukturalnych. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy staraliśmy się scharakteryzować mechanizmy molekularne leżące u podstaw atrofii mięśni w użyciu glukoartykulowym, co wymaga identyfikacji receptorów glukoartykulacyjnych, miejsc wiążących DNA we włóknach mięśni szkieletowych myszy. Procedurę zademonstruje Shilpy Joshi, post-doc z naszego laboratorium.
Aby rozpocząć tę procedurę, odzyskaj zamrożone lub świeżo wycięte mięśnie kończyn tylnych. Następnie zmiel mięśnie w dwumililitrowej probówce, zawierającej jeden mililitr lodowatego buforu hipotonicznego do jednorodnego przygotowania małych kawałków, używając cienkich nożyczek. Następnie pozostaw rurkę wstrząśniętą na mieszadle stołowym w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć do 10 minut.
Następnie przenieś wypreparowaną tkankę do 14-mililitrowej probówki okrągłodennej zawierającej cztery mililitry zimnego buforu hipotonicznego. Homogenizuj zmieloną tkankę za pomocą mechanicznego homogenizatora tkanek przez 15 do 30 sekund. Następnie przenieś homogenat do 15-mililitrowej probówki.
Dodaj zimny bufor hipotoniczny, aby uzyskać 10 mililitrów próbki i utrwal homogenat przed przystąpieniem do następnej myszy. W tej procedurze dodaj formaldehyd do próbki, aby uzyskać 1% stężenie końcowe. A następnie wstrząsaj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
Następnie dodaj glicynę, aby uzyskać końcowe stężenie 0,125 mola w każdej probówce, aby zatrzymać utrwalanie. I wstrząsaj przez pięć do 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie homogenizuj utrwalony lizat, używając luźnego odbicia.
Następnie przenieś go do 15-mililitrowej probówki i wiruj przy 1000 g przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza, aby uzyskać jądra i szczątki komórkowe. Po pięciu minutach usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach świeżego buforu hipotonicznego. Przefiltruj lizat przez sitko o średnicy 70 mikrometrów do 50-mililitrowej probówki.
Za pomocą końcówki pipety umyj filtr jednym mililitrem zimnego buforu hipotonicznego. Następnie należy ponownie przefiltrować filtrat przez sitko o długości 40 mikrometrów. Następnie przenieś filtrat do 15-mililitrowej probówki.
I wirować przy 1000 g przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza, aby uzyskać pastylkę jądrową. Po odrzuceniu supernatantu użyj jednego mililitra buforu hipotonicznego do zebrania trzech granulek i przeniesienia do probówki o pojemności od 1,5 do dwóch mililitrów. Wirować przy 1000 g przez pięć minut.
Następnie oceń objętość osadu jądrowego przez porównanie z probówkami zawierającymi znaną objętość cieczy i ponownie zawiesić go w buforze sonicznym do trzech do czterech razy większą od upakowanej objętości jądra. Następnie sonikować zawiesinę przez 10 do 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, używając sonikatora. Odwirować sonifikowaną próbkę i przenieść supernatant chromatyny do świeżej probówki o pojemności 1,5 mililitra.
Aby usunąć sieciowanie, weź 30 mikrolitrów chromatyny w 1,5-mililitrowej probówce i dodaj 20 mikrolitrów pięciomolowego chlorku sodu i 450 mikrolitrów wody. Uzupełnij objętość do 500 mikrolitrów i inkubuj w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia wykonaj zabieg z jednym mikrolitrem Proteinazy K, 10 mikrolitrami dwóch tri molowych o pH 6,8 i 10 mikrolitrami 0,5 molowego EDTA przez godzinę w temperaturze 42 stopni Celsjusza.
Następnie wykonaj zwykłą ekstrakcję chloroformem fenolowo-chloroformowym i wytrącaj DNA jedną objętością octanu sodu i dwiema objętościami 100% etanolu przez jedną godzinę w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza lub przez noc w temperaturze ujemnej 20 stopni Celsjusza. Następnie osadzać DNA przez odwirowanie w temperaturze 13 500 g przez 15 minut. Zdekantować supernatant i dokładnie umyć osad zimnym 70% etanolem i ponownie odwirować przez pięć minut.
Następnie zdekantować supernatant i wysuszyć granulkę na powietrzu. Następnie ponownie zawiesić osad w pierwotnej objętości bufora tris HCl EDTA. Zmierz stężenie DNA w spektrofotometrze za pomocą absorbentów o długości 260 nanometrów, 280 nanometrach.
Następnie odpipetuj od 500 do 1000 nanogramów DNA razem z drabinką wielkości DNA na oddzielnych pasach 1,5% żelu agarozowego. I wykonaj elektroforezę, aby ocenić wielkość fragmentu chromatyny. Aby zoptymalizować homogenizację, homogenizację prowadzono przez 15 sekund lub 45 sekund przy dwóch prędkościach, 18 000 i 22 000 obr./min.
W każdych warunkach jądra można było oddzielić od szczątków tkanki, ale wydajność była optymalna przy mniejszej prędkości. Jądra można również przygotować, zanurzając je przez trzy do pięciu minut. Jednak homogenizacja mechaniczna jest metodą z wyboru, ponieważ optymalną wydajność jąder można osiągnąć w ciągu zaledwie 15 sekund, co pozwala na znaczne zyski czasu, zwłaszcza jeśli trzeba przetworzyć wiele próbek.
Korzystając z tego protokołu, można wyizolować do 2,7 razy od 10 do siedmiu jąder z 500 miligramów tkanki, aby wygenerować 100 mikrogramów chromatyny. Tak przygotowana chromatyna daje czyste, wysokiej jakości wyniki w eksperymentach sekwencjonowania ChIP. Ilustruje to wysoki poziom acetylowanego K27 histonu H3 i polimerazy RNA 2 w locus Desmonda wyrażonym w mięśniach.
Swoistość dla włókien mięśniowych jest pokazana przez niski lub brak sygnału w loci Pecam1 i Vcam1, które nie są wyrażane w mięśniach. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby prawidłowo zanurzyć sondę homogenizatora w próbce, aby uniknąć spienienia, wyczyścić sondę między próbkami i zoptymalizować fragmentację chromatyny. Tak przygotowana chromatyna została z powodzeniem wykorzystana ze względu na ChIP do mapowania zajętości czynników transkrypcyjnych w całym genomie i powinna być również odpowiednia do technik wychwytywania chromatyny.
Po opracowaniu technika ta utorowała drogę do badań w dziedzinie genomiki, mających na celu zbadanie regulacji genów w mięśniach szkieletowych myszy. Procedura może być również stosowana do mięśni szczurów i biopsji od ludzi. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak stosować homogenizację mechaniczną, a następnie oczyszczanie jąder utrwalonych formaldehydem w celu przygotowania chromatyny z mięśni szkieletowych do immunoprecypitacji.
Nie zapominaj, że praca z formaldehydem, fenolem, chloroformem i proteinazą K może być niebezpieczna. Należy podjąć środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i okularów. Czynności związane z tymi odczynnikami należy wykonywać pod maską.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia nowy protokół przygotowania chromatyny z dorosłego mięśnia szkieletu myszy, specjalnie przystosowany do badania regulacji genów w włóknach mięśniowych poprzez immunoprecypitację chromatyny (ChIP). Metoda radzi sobie z wyzwaniami stawianymi przez oporność fizyczną i zawartość białek strukturalnych tkanki mięśniowej szkieletu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Regulacja genów
- Immunoprecypitacja chromatyny
- Biologia mięśni szkieletu
Tło
- Przygotowanie chromatyny jest kluczowe dla badania regulacji genów.
- Mięsień szkieletowy myszy jest złożoną tkanką o wysokiej zawartości białek strukturalnych.
- Zrozumienie mechanizmów molekularnych w atrofii mięśni jest istotne dla strategii terapeutycznych.
- Identyfikacja miejsc wiązania DNA jest niezbędna do charakteryzacji regulacji genów.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody przygotowania chromatyny nadającej się do ChIP z mięśnia szkieletu myszy.
- Ułatwienie badania regulacji genów w włóknach mięśniowych.
- Zbadanie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw atrofii mięśni.
Stosowane metody
- Przygotowanie chromatyny z dorosłego mięśnia szkieletu myszy.
- Zastosowanie technik immunoprecypitacji chromatyny.
- Charakteryzacja receptorów gluko-artykulowane i miejsc wiązania DNA.
- Demonstracja procedury przez badacza po doktoracie.
Główne wyniki
- Udana przygotowanie chromatyny nadającej się do ChIP z opornej tkanki mięśniowej szkieletu.
- Identyfikacja kluczowych miejsc wiązania DNA istotnych dla regulacji genów mięśniowych.
- Wgląd w mechanizmy molekularne atrofii mięśni.
- Walidacja skuteczności metody dla przyszłych badań.
Wnioski
- Opracowany protokół poprawia badania regulacji genów w mięśniach szkieletu.
- Dostawia cenne narzędzie dla badaczy badających biologię mięśni.
- Przyszłe zastosowania mogą prowadzić do lepszego zrozumienia atrofii mięśni i pokrewnych stanów.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Preparing high-quality chromatin from physically resistant tissues like skeletal muscle remains a bottleneck in epigenetic target validation. This protocol enables reproducible isolation of nuclei and sonication of chromatin suitable for immunoprecipitation, supporting mechanistic de-risking of transcription factor and histone modifier targets in muscle-related disease models. By providing a scalable, standardized approach to ChIP-grade chromatin preparation, it enhances predictive confidence in early discovery workflows focused on skeletal muscle pathophysiology.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional regulation in skeletal muscle fibers to validate targets involved in atrophy and metabolic pathways.
- Operational Value: Delivers consistent chromatin yields from resistant tissue, reducing variability in target engagement assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces ChIP-ready chromatin for high-throughput screening of compounds affecting epigenetic regulators in muscle.
- Operational Value: Standardized nuclei purification and sonication steps support assay reproducibility across laboratories.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates biomarker alignment by mapping histone modifications and transcription factor occupancy in disease-relevant muscle models.
- Operational Value: Enables longitudinal chromatin analysis from frozen tissue, supporting preclinical continuity and target validation across study phases.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum by enabling chromatin preparation for target validation, followed by immunoprecipitation and sequencing to inform lead identification and preclinical assessment of epigenetic modulators in skeletal muscle.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of gene regulatory mechanisms in muscle atrophy and metabolic disease models.
- Screening: Provides standardized chromatin substrate for evaluating compound effects on epigenetic targets.
- Analytics: Generates quantitative ChIP-seq readouts for comparing target binding across conditions.
- Translational Research: Connects discovery-stage epigenetic findings to preclinical validation through consistent chromatin preparation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable nuclei isolation and chromatin preparation platform for skeletal muscle epigenetics programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves target validation confidence by reducing noise from non-muscle cell chromatin in skeletal muscle samples.
- Operational Value: Increases throughput through rapid mechanical homogenization, enabling processing of multiple samples in short timeframes.
- Strategic Value: Supports go/no-go decisions in epigenetic target programs by providing reliable muscle-specific chromatin data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on reproducible epigenetic profiling in disease-relevant tissue.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue homogenization, nuclei isolation, and chromatin handling to avoid degradation.
- Depends on access to sonication equipment optimized for chromatin fragmentation without overheating.
- Necessitates standardized buffer conditions and filtration steps to ensure reproducibility across users and sites.
- Must account for tissue-specific variables such as fiber type and injury status when applying the protocol to disease models.
- Practical limitations include the need for careful optimization of sonication time and temperature to achieve optimal fragment size.
