Name: Wytwarzanie dyskryminujących ludzkich przeciwciał monoklonalnych z rzadkich limfocytów B specyficznych dla antygenu B krążących we krwi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 14 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania ludzkich przeciwciał monoklonalnych z krążących limfocytów B. Technika umożliwia izolację rzadkich komórek wiążących antygeny i precyzyjne rozróżnianie pokrewnych antygenów w zastosowaniach immunoterapeutycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Ośrodkowi Cytometrii "CytoCell" (SFR Santé, Biogenouest, Nantes) za fachową pomoc techniczną. Dziękujemy również wszystkim pracownikom zajmującym się produkcją białek rekombinowanych (P2R) oraz platformom IMPACT (INSERM 1232, SFR Santé, Biogenouest, Nantes) za wsparcie techniczne. Dziękujemy Emmanuelowi Scotetowi i Richardowi Breathnachowi za konstruktywne uwagi na temat manuskryptu. Prace te były wspierane finansowo przez projekt IHU-Cesti finansowany przez program rządu francuskiego « Investissements d'Avenir », zarządzany przez Francuską Narodową Agencję Badawczą (ANR) (ANR-10-IBHU-005). Projekt IHU-Cesti jest również wspierany przez Nantes Métropole i Région Pays de la Loire. Praca ta została zrealizowana w ramach programu LabEX IGO wspieranego przez Narodową Agencję Badawczą poprzez inwestycję przyszłego programu ANR-11-LABX-0016-01.

<ol><li>Buss, N. A., Henderson, S. J., McFarlane, M., Shenton, J. M., de Haan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibody+therapeutics%3A+history+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibody therapeutics: history and future.</a> Curr Opin Pharmacol. 12 (5), 615-622 (2012).</li>
<li>Park, J., Kwon, M., Shin, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+checkpoint+inhibitors+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Immune checkpoint inhibitors for cancer treatment.</a> Arch Pharm Res. 39 (11), 1577-1587 (2016).</li>
<li>Pendley, C., Schantz, A., Wagner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogenicity+of+therapeutic+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Immunogenicity of therapeutic monoclonal antibodies.</a> Curr Opin Mol Ther. 5 (2), 172-179 (2003).</li>
<li>Kwakkenbos, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+monoclonal+antibody-producing+B+cell+receptor-positive+human+memory+B+cells+by+genetic+programming%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of stable monoclonal antibody-producing B cell receptor-positive human memory B cells by genetic programming.</a> Nat Med. 16 (1), 123-128 (2010).</li>
<li>Tiller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+monoclonal+antibodies+from+single+human+B+cells+by+single+cell+RT-PCR+and+expression+vector+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning.</a> J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).</li>
<li>Franz, B., May, K. F., Dranoff, G., Wucherpfennig, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+characterization+and+isolation+of+rare+memory+B+cells+with+antigen+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Ex vivo characterization and isolation of rare memory B cells with antigen tetramers.</a> Blood. 118 (2), 348-357 (2011).</li>
<li>Morris, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+human+anti-HIV+gp41+membrane+proximal+region+neutralizing+antibody+by+antigen-specific+single+B+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Isolation of a human anti-HIV gp41 membrane proximal region neutralizing antibody by antigen-specific single B cell sorting.</a> PLoS One. 6 (9), e23532(2011).</li>
<li>Iizuka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cytomegalovirus+%28CMV%29pp65+antigen-specific+human+monoclonal+antibodies+using+single+B+cell-based+antibody+gene+cloning+from+melanoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">Identification of cytomegalovirus (CMV)pp65 antigen-specific human monoclonal antibodies using single B cell-based antibody gene cloning from melanoma patients.</a> Immunol Lett. 135 (1-2), 64-73 (2011).</li>
<li>Ouisse, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-specific+single+B+cell+sorting+and+expression-cloning+from+immunoglobulin+humanized+rats%3A+a+rapid+and+versatile+method+for+the+generation+of+high+affinity+and+discriminative+human+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Antigen-specific single B cell sorting and expression-cloning from immunoglobulin humanized rats: a rapid and versatile method for the generation of high affinity and discriminative human monoclonal antibodies.</a> BMC Biotechnol. 17 (1), 3(2017).</li>
<li>Kerkman, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterisation+of+citrullinated+antigen-specific+B+cells+in+peripheral+blood+of+patients+with+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rheum+Dis%22%5BJournal%5D)">Identification and characterisation of citrullinated antigen-specific B cells in peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis.</a> Ann Rheum Dis. , (2015).</li>
<li>Hamilton, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+Approach+for+Tetramer-Based+Identification+of+Autoantigen-Reactive+B+Cells%3A+Characterization+of+La-+and+snRNP-Reactive+B+Cells+in+Autoimmune+BXD2+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">General Approach for Tetramer-Based Identification of Autoantigen-Reactive B Cells: Characterization of La- and snRNP-Reactive B Cells in Autoimmune BXD2 Mice.</a> J Immunol. 194 (10), 5022-5034 (2015).</li>
<li>Sanjuan Nandin, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+in+vitro+booster+vaccination+to+rapidly+generate+antigen-specific+human+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Novel in vitro booster vaccination to rapidly generate antigen-specific human monoclonal antibodies.</a> J Exp Med. , (2017).</li>
<li>Bowers, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+display+for+the+discovery+and+optimization+of+antibody+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell display for the discovery and optimization of antibody therapeutics.</a> Methods. 65 (1), 44-56 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Proponowany protokół jest potężną metodą wytwarzania ludzkich przeciwciał monoklonalnych bezpośrednio z limfocytów B specyficznych dla Ag krążących we krwi. Łączy w sobie trzy ważne aspekty: (i) zastosowanie wzbogacenia magnetycznego związanego z tetramerem, które umożliwia izolację ex vivo nawet rzadkich limfocytów B wiążących Ag; (ii) strategia bramkowania wykorzystująca trzy tetramery Ag (dwa istotne i jeden nieistotny) znakowane trzema różnymi fluorochromami w celu wyizolowania, za pomocą cytometrii przepływ...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/56508/generation-discriminative-human-monoclonal-antibodies-from-rare">Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood</a>.
The Affiliations section was corrected from:
Marie-Claire Devilder1,2,&#160;M&#233;linda Moyon1,2,&#160;Xavier Saulquin1, Laetitia Gautreau-Rolland1 
1Centre R&#233;gional de Recherche en Canc&#233;rologie et Immunologie Nantes/Angers, INSERM 1232, LabEx IGO, Universit&#233; de Nantes 
2CHU Nantes
to:
Marie-Claire Devilder1,2,3,&#160;M&#233;linda Moyon1,2,3,&#160;Xavier Saulquin1,2, Laetitia Gautreau-Rolland1,2&#160; 
1CRCINA, Inserm, CNRS, Universit&#233; d&#39;Angers, Universit&#233; de Nantes 
2LabEx IGO, &#34;Immunotherapy, Graft, Oncology&#34; 
3CHU, Nantes, France

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/56508/generation-discriminative-human-monoclonal-antibodies-from-rare">Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood</a>

Erratum: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Opisana tutaj metoda pozwala na szybką i wszechstronną produkcję w pełni ludzkich przeciwciał monoklonalnych (mAb) przeciwko pożądanemu antygenowi (Ag). MAb są niezbędnymi narzędziami w wielu podstawowych zastosowaniach badawczych in vitro i in vivo: na przykład cytometria przepływowa, histologia, western-blotting i eksperymenty blokujące. Co więcej, mAb są coraz częściej stosowane w medycynie do leczenia chorób autoimmunologicznych, nowotworów oraz do kontroli odrzucenia przeszczepu1. Na przykład przeciwciała monoklonalne anty-CTLA-4 i anty-PD-1 (lub anty-PD-L1) były ostatnio stosowane jako inhibitory immunologicznych punktów kontrolnych w leczeniu raka2.
Pierwsze mAb były wytwarzane przez hybrydomy wydzielające immunoglobuliny (Ig) uzyskane z komórek śledziony immunizowanych myszy lub szczurów. Jednak silna odpowiedź immunologiczna przeciwko mysim lub szczurzym przeciwciałom monoklonalnym utrudnia ich terapeutyczne zastosowanie u ludzi, ze względu na ich szybki klirens i prawdopodobną indukcję reakcji nadwrażliwości3. Aby rozwiązać ten problem, sekwencje białek zwierzęcych mAb zostały częściowo zastąpione ludzkimi w celu wytworzenia tak zwanych chimerycznych przeciwciał mysich i ludzkich lub humanizowanych. Jednak strategia ta tylko częściowo zmniejsza immunogenność, jednocześnie znacznie zwiększając zarówno koszty, jak i skalę czasową produkcji. Lepszym rozwiązaniem jest generowanie ludzkich mAb bezpośrednio z ludzkich limfocytów B i dostępnych jest kilka strategii w tym zakresie. Jednym z nich jest wykorzystanie fagów lub drożdży. Polega to na wyświetleniu zmiennych domen z kombinatorycznej biblioteki losowych ciężkich i lekkich łańcuchów ludzkiego Ig na fagach lub drożdżach i przeprowadzeniu etapu selekcji przy użyciu określonego antygenu będącego przedmiotem zainteresowania. Główną wadą tej strategii jest to, że łańcuchy ciężkie i lekkie są losowo powiązane, co prowadzi do bardzo dużego wzrostu różnorodności generowanych przeciwciał. Jest mało prawdopodobne, aby uzyskane przeciwciała odpowiadały tym, które powstałyby w wyniku naturalnej odpowiedzi immunologicznej przeciwko określonemu Ag. Co więcej, fałdowanie białek ludzkich i modyfikacje potranslacyjne nie są systematycznie odtwarzane u prokariontów ani nawet u drożdży. Drugą metodą produkcji mAb u ludzi jest unieśmiertelnienie naturalnych ludzkich limfocytów B przez zakażenie wirusem Epsteina-Barr lub ekspresję czynników antyapoptotycznych BCL-6 i BCL-XL4. Jednak metoda ta ma zastosowanie tylko do komórek B pamięci i jest nieefektywna, wymagając badań przesiewowych wielu nieśmiertelnych komórek B wytwarzających mAb w celu zidentyfikowania kilku (jeśli w ogóle) klonów mAb o pożądanej swoistości antygenowej. Metoda ta jest więc zarówno kosztowna, jak i czasochłonna.
Niedawno opisano nowy protokół produkcji ludzkich mAb z izolowanych pojedynczych komórek B5. Opiera się na zoptymalizowanej jednokomórkowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR) do amplifikacji zarówno segmentów kodujących łańcuchy ciężkie, jak i lekkie z pojedynczej posortowanej komórki B. Następnie następuje klonowanie i ekspresja tych segmentów w eukariotycznym systemie ekspresji, co pozwala na rekonstrukcję w pełni ludzkiego mAb. Protokół ten jest z powodzeniem stosowany począwszy od limfocytów B od zaszczepionych dawców. Komórki pobrano kilka tygodni po szczepieniu, aby uzyskać wyższe częstotliwości limfocytów B skierowanych przeciwko pożądanemu Ag, a tym samym ograniczyć czas wymagany do przeprowadzenia badań przesiewowych6. Inne w pełni ludzkie przeciwciała monoklonalne zostały również wyprodukowane od pacjentów zakażonych wirusem HIV+ (ludzki wirus niedoboru odporności)7 i pacjentów z czerniakiem8. Pomimo tych postępów, nadal nie ma dostępnej procedury, która umożliwiałaby izolację komórek B specyficznych dla Ag niezależnie od ich fenotypu pamięci lub częstotliwości.
Opisana tutaj procedura prowadzi do efektywnej izolacji ex vivo krążących ludzkich komórek B na podstawie ich specyficzności BCR, a następnie do produkcji w pełni ludzkich przeciwciał specyficznych dla antygenu w wysokiej wydajności i z krótkim czasem badania. Metoda nie ogranicza się do limfocytów B pamięci lub limfocytów B wydzielających przeciwciała indukowanych po odpowiedzi immunologicznej, ale może być również stosowana do repertuaru ludzkich naiwnych limfocytów B. To, że działa nawet zaczynając od komórek B specyficznych dla Ag obecnych na bardzo niskich częstotliwościach, jest dobrym wskaźnikiem jego skuteczności. Zasada metody jest następująca: komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) są barwione dwoma tetramerami prezentującymi antygen będący przedmiotem zainteresowania, z których każdy jest znakowany innym fluorochromem (np. fikoerytryną (PE) i allofikocyjaniną (APC)), a trzeci tetramer prezentujący blisko spokrewniony antygen sprzężony z trzecim fluorochromem (np., Brillant Violet 421 (BV421)). Aby wzbogacić komórki wiążące antygen, komórki są następnie inkubowane z kulkami pokrytymi anty-PE i anty-APC Abs i sortowane w kolumnach separacji komórek. Frakcja komórkowa PE+ APC+ jest selekcjonowana, barwiona różnymi mAb specyficznymi dla różnych typów komórek PBMC, aby umożliwić identyfikację komórek B, i poddawana sortowaniu komórek metodą cytometrii przepływowej. Limfocyty B, które są PE+ i APC+, ale Brilliant Violet-, są izolowane. Ten krok przeciwselekcjonuje komórki, które nie są komórkami B lub nie wiążą się z tetrameryzowanym antygenem, ale wiążą się z PE lub APC (komórki te będą PE+ APC- lub PE- APC+) lub z nieantygenową częścią użytych tetramerów (komórki te będą BV421+). Limfocyty B, które nie są wysoce specyficzne dla epitopu będącego przedmiotem zainteresowania, są również poddawane kontrselekcji na tym etapie (komórki te również będą BV421+). W ten sposób metoda ta może oczyścić wysoce specyficzne limfocyty B z ekspresją receptorów komórek B (BCR) zdolnych do rozróżniania dwóch bardzo blisko spokrewnionych antygenów. Pojedyncze specyficzne limfocyty B są zbierane w probówkach, a ich amplifikowane PCR Ig cDNA (komplementarne kwasy dezoksyrybonukleinowe) klonowane i wyrażane przez ludzką linię komórkową jako wydzielane mAb IgG.
Jako dowód koncepcji, to badanie opisuje efektywne generowanie ludzkich mAb, które rozpoznają peptyd prezentowany przez cząsteczkę głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy I (MHC-I) i mogą odróżnić ten peptyd od innych peptydów załadowanych na ten sam allel MHC-I. Chociaż poziom złożoności tego Ag jest ważny, metoda ta pozwala (i) na odzysk mAb specyficznych dla Ag z wysoką wydajnością; (ii) wytwarzanie mAb zdolnych do rozróżniania dwóch strukturalnie bliskich Ag. Podejście to może być rozszerzone na zaszczepionych lub zakażonych pacjentów bez żadnej modyfikacji protokołu, a także zostało już z powodzeniem wdrożone w humanizowanym systemie szczurów9. W związku z tym badanie to opisuje wszechstronne i skuteczne podejście do generowania w pełni ludzkich przeciwciał monoklonalnych, które można wykorzystać w badaniach podstawowych i immunoterapii.

<table><tbody><tr><td>Linia komórkowa HEK 293A</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>R70507</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Gibco firmy life technologies</td><td>21969-035</td><td>(+) 4,5g/L D-Glukoze 0,11g/L Pirogronian sodu (-) L-Glutmine</td></tr><tr><td>RPMI medium1640 (1X)</td><td>Gibco firmy life technologies</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>PAA</td><td>K45-001</td><td></td></tr><tr><td>Nutridoma-SP</td><td>Roche</td><td>11011375001</td><td>100X Conc</td></tr><tr><td>PBS-Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (10X) pH 7,4 Ambion</td><td></td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy) 0,5M pH=8</td><td>Invitrogen firmy Life Technologies</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Dominique Dutscher</td><td>S1810-500</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll - separacja limfocytów średnia</td><td>EuroBio</td><td>CMSMSL01-01</td><td>gęstość 1,0777 +/- 0,001</td></tr><tr><td>koniugat streptawidyny R-fikoerytryny</td><td>Invitrogen firmy Life Technologies</td><td>S21388</td><td>klasa premiun 1 mg / ml zawiera 5 mM azydek sodu</td></tr><tr><td>Streptawidyna, koniugat allofikocyjaniny</td><td>Invitrogen firmy thermoFisher scientific</td><td>S32362</td><td>1 mg / ml 2 mM azydek premium klasy</td></tr><tr><td>Fioletowy brylantowy 421 streptawidyna</td><td>Biolegend</td><td>405225</td><td>stężenie: 0,5 mg/ml</td></tr><tr><td>Mikrokulki magnetyczne sprzężone anty-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-801</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokulki magnetyczne sprzężone anty-APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-855</td><td></td></tr><tr><td>Separatory MidiMAC lub QuadroMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302/130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>CD3 BV510 BD horizon</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>563109</td><td>Używane rozcieńczenie 1:20</td></tr><tr><td>CD19 FITC</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>345788</td><td>Stosowane rozcieńczenie 1:20</td></tr><tr><td>CD14 PerCPCy5.5</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>561116</td><td>Stosowane rozcieńczenie 1:50</td></tr><tr><td>CD16 PerCPCy5.5</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>338440</td><td>Używane rozcieńczenie 1:50</td></tr><tr><td>7AAD</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>51-68981E (559925)</td><td>Używane rozcieńczenie 1:1000</td></tr><tr><td>FACS ARIA III Cytometr do sortowania komórek</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-paskowe probówki do PCR</td><td>Axygen</td><td>321-10-061</td><td></td></tr><tr><td>Stojaki na 96 mikroprobówek</td><td>Dominique Dutscher</td><td>45476</td><td></td></tr><tr><td>RNAseOUT Inhibitor rybonukleazy (rekombinowany)</td><td>Invitrogen firmy thermoFisher scientific</td><td>10777-019</td><td>ilość: 5000U (40U / ul)</td></tr> <tr><td>Woda destylowana Bez dnazy / Rnazy</td><td>Gibco</td><td>10977-035</td><td></td></tr><tr><td>Oligod(T)18 mRNA Primer</td><td>New England BioLabs</td><td>S1316S</td><td>5.0 A260unit</td></tr><tr><td>Losowe heksamery</td><td>Invitrogen by thermoFisher scientific</td><td>N8080127</td><td>Ilość: 50uM, 5nmole</td></tr><tr><td>Indeks górny III Odwrotna transkryptaza</td><td>Invitrogen firmy thermoFisher scientific</td><td>18080-044</td><td>Ilość: 10000U (200U/ul)</td></tr><tr><td>GoTaq G2 Flexi DNA Polimeraza</td><td>Promega</td><td>M7805</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Zestaw, klasa biologii molekularnej</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0182</td><td>4*100umol</td></tr><tr><td>5LVH1</td><td>Eurofins</td><td>ACAGGTGCCCACT CCCAGGTGCAG</td><td>Pierwsza runda PCR - Amplifikacja ciężkich łańcuchów - Startery zewnętrzne - Forward Prmers</td></tr><tr><td>5LVH3</td><td>Eurofins</td><td>AAGGTGTCCAGTG TGARGTGCAG</td><td>Pierwsza runda PCR - Amplifikacja ciężkich łańcuchów - Zewnętrzne startery - Forward Prmers</td></tr><tr><td>5LVL4_6</td><td>Eurofins</td><td>CCCAGATGGGTCC TGTCCCAGGTGCAG</td><td>Pierwsza runda PCR - Amplifikacja ciężkich łańcuchów - Zewnętrzne startery - Forward Prmers</td></tr><tr><td>5LVH5</td><td>Eurofins</td><td>CAAGGAGTCTGTT CCGAGGTGCAG</td><td>Pierwsza runda PCR - Amplifikacja ciężkich łańcuchów - Zewnętrzne startery - Forward Prmers</td></tr><tr><td>3HuIgG_const_anti</td><td>Eurofins</td><td>TCTTGTCCACCTT GGTGTTGCT</td><td>Pierwsza runda PCR - Amplifikacja ciężkich łańcuchów - Startery zewnętrzne -Odwrotne startery do ludzkiego Ig- Badanie przesiewowe PCR bakterii</td></tr><tr><td>3CuCH1</td><td>Eurofins</td><td>GGGAATTCTCACA GGAGACGA</td><td>Pierwsza runda PCR - Amplifikacja łańcuchów ciężkich - Startery zewnętrzne -Startery odwrotne dla ludzkiego Ig</td></tr><tr><td>5AgeIVH1_5_7</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC GAGGTGCAGCTGGTGCAG</td><td>Druga runda PCR - Amplifikacja ciężkich łańcuchów - Wewnętrzne startery -Forward startery</td></tr><tr><td>5AgeIVH3</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTGGTGGAG</td><td>Druga runda PCR - Amplifikacja ciężkich łańcuchów - Wewnętrzne startery -Forward startery</td></tr><tr><td>5AgeIVH3_23</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCT GAGGTGCAGCTTGGAG</td><td>Druga runda PCR - Amplifikacja ciężkich łańcuchów - Startery wewnętrzne -Startery do przodu</td></tr><tr><td>5AgeIVH4</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTGCAGGAG</td><td>Druga runda PCR - Amplifikacja ciężkich łańcuchów - Wewnętrzne startery -Startery do przodu</td></tr><tr><td>5AgeIVH4_34</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTGCAGCTACAGCAGTG</td><td>Druga runda PCR - Amplifikacja ciężkich łańcuchów - Wewnętrzne startery -Forward startery</td></tr><tr><td>5AgeIVH1_18</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTTCAGCTGGTGCAG</td><td>Druga runda PCR - Amplifikacja ciężkich łańcuchów - Startery wewnętrzne -Startery do przodu</td></tr><tr><td>5AgeIVH1_24</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTCCAGCTGGTACAG</td><td>Druga runda PCR - Amplifikacja ciężkich łańcuchów - Wewnętrzne startery -Startery do przodu</td></tr><tr><td>5AgeIVH3__9_30_33</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCT GAAGTGCAGCTGGTGGAG</td><td>Druga runda PCR - Amplifikacja ciężkich łańcuchów - Startery wewnętrzne -Startery do przodu</td></tr><tr><td>5AgeIVH6_1</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCC CAGGTACAGCTGCAGCAG</td><td>Druga runda PCR - Amplifikacja ciężkich łańcuchów - Startery wewnętrzne -Startery do przodu</td></tr><tr><td>3SalIJH1_2_4_5</td><td>Eurofins</td><td>TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCAGAG</td><td>Druga runda PCR - Amplifikacja ciężkich łańcuchów - Startery wewnętrzne -Startery odwrotne</td></tr><tr><td>3SalIJH3</td><td>Eurofins</td><td>TGCGAAGTCGACG CTGAAGAGACGGTGACCATTG</td><td>Druga runda PCR - Amplifikacja ciężkich łańcuchów - Startery wewnętrzne -Startery odwrócone</td></tr><tr><td>3SalIJH6</td><td>Eurofins</td><td>TGCGAAGTCGACG CTGAGGAGACGGTGACCGTG</td><td>Druga runda PCR - Amplifikacja ciężkich łańcuchów - Podkłady wewnętrzne -Startery odwrócone</td></tr><tr><td>5' LVk1_2</td><td>Eurofins</td><td>ATGAGGSTCCCYG CTCAGCTGCTGG</td><td>Pierwsza runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich k - Startery zewnętrzne -Startery do przodu</td></tr><tr><td>5'LVk3</td><td>Eurofins</td><td>CTCTTCCTCCTGC TACTCTGGCTCCCAG</td><td>Pierwsza runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich k - Startery zewnętrzne -Startery do przodu</td></tr><tr><td>5'LVk4</td><td>Eurofins</td><td>ATTTCTCTGTTGC TCTGGATCTCTCTG</td><td>Pierwsza runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich k - Startery zewnętrzne -Startery do przodu</td></tr><tr><td>3'Ck543_566</td><td>Eurofins</td><td>GTTTCTCGTAGTC TGCTTTGCTCA</td><td>Pierwsza runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich k - Startery zewnętrzne -Startery odwrócone - Badania przesiewowe PCR pod kątem bakterii</td></tr><tr><td>5'AgeIVk1</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCT GACATCCAGATGACCCAGTC</td><td>Druga runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich k - Startery wewnętrzne -Startery do przodu</td></tr><tr><td>5'AgeIVk1_9_1&ndash; 13</td><td>Eurofins</td><td>TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT</td><td>Druga runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich k - Startery wewnętrzne -Startery do przodu</td></tr><tr><td>5'AgeIVk1D_43_1_8</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTGT GCCATCCGGATGACCCAGTC</td><td>Druga runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich k - Startery wewnętrzne -Startery do przodu</td></tr><tr><td>5'AgeIVk2</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACCCAGAC</td><td>Druga runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich k - Startery wewnętrzne -Startery do przodu</td></tr><tr><td>5'AgeIVk2_28_2_30</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATGGG GATATTGTGATGACTCAGTC</td><td>Druga runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich k - Startery wewnętrzne -Startery do przodu</td></tr><tr><td>5'AgeVk3_11_3D_11</td><td>Eurofins</td><td>TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTC</td><td>Druga runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich k - Startery wewnętrzne -Startery do przodu</td></tr><tr><td>5'AgeVk3_15_3D_15</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCA GAAATAGTGATGACGCAGTC</td><td>Druga runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich k - Startery wewnętrzne -Startery do przodu</td></tr><tr><td>5'AgeVk3_20_3D_20</td><td>Eurofins</td><td>TTGTGCTGCAACCGGTGTAC ATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT</td><td>Druga runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich k - Startery wewnętrzne -Startery do przodu</td></tr><tr><td>5'AgeVk4_1</td><td>Eurofins</td><td>CTGCAACCGGTGTACATTCG GACATCGTGATGACCCAGTC Druga</td><td>runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich k - Startery wewnętrzne -Startery do przodu</td></tr><tr><td>3'BsiWIJk1_2_4</td><td>Eurofins</td><td>GCCACCGTACGTT TGATYTCCACCTTGGTC</td><td>Druga runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich k - Startery wewnętrzne -Startery do przodu</td></tr><tr><td>3'BsiWIJk3</td><td>Eurofins</td><td>GCCACCGTACGTGTT TGATATCCACTTTGGTC</td><td>Druga runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich k - Startery wewnętrzne -Startery do przodu</td></tr><tr><td>3'BsiWIJk5</td><td>Eurofins</td><td>GCCACCGTACGTT TAATCTCCAGTCGTGTC Druga</td><td>runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich k - Startery wewnętrzne -Startery do przodu</td></tr><tr><td>5'LVl1</td><td>Eurofins</td><td>GGTCCTGGGCCCA GTCTGTGCTG</td><td>Pierwsza runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich i lambda; - Startery zewnętrzne -Startery do przodu</td></tr><tr><td>5'LVl2</td><td>Eurofins</td><td>GGTCCTGGCCCA GTCTGCCCTG</td><td>Pierwsza runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich &lambda; - Startery zewnętrzne -Startery do przodu</td></tr><tr><td>5'LVl3</td><td>Eurofins</td><td>GCTCTGTGACCTC CTATGAGCTG</td><td>Pierwsza runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich &lambda; - Startery zewnętrzne -Naprzód startery</td></tr><tr><td>5'LVl4_5</td><td>Eurofins</td><td>GGTCTCTCTCSCA GCYTGTGCTG</td><td>Pierwsza runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich &lambda; - Startery zewnętrzne -Startery do przodu</td></tr><tr><td>5'LVl6</td><td>Eurofins</td><td>GTTCTTGGGCCAA TTTTATGCTG</td><td>Pierwsza runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich &lambda; - Startery zewnętrzne -Startery do przodu</td></tr><tr><td>5'LVl7</td><td>Eurofins</td><td>GGTCCATTCYCA GGCTGTGGTG</td><td>Pierwsza runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich &lambda; - Startery zewnętrzne -Startery do przodu</td></tr><tr><td>5LVl8</td><td>Eurofins</td><td>GAGTGGATTCTCA GACTGTGGTG</td><td>Pierwsza runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich &lambda; - Startery zewnętrzne -Startery do przodu</td></tr><tr><td>3'Cl</td><td>Eurofins</td><td>CACCAGTGTGGCC TTGTTGGCTTG</td><td>Pierwsza runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich &lambda; - Startery zewnętrzne -Naprzód startery</td></tr><tr><td>5'AgeIVl1</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGTGCTGACKCAG</td><td>Druga runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich &lambda; - Startery wewnętrzne -startery forward</td></tr><tr><td>5'AgeIVl2</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCCTGGGCC CAGTCTGCCCTGACTCAG</td><td>Druga runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich &lambda; - Startery wewnętrzne - startery do przodu</td></tr><tr><td>5'AgeIVl3</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCTGTGACC TCCTATGAGCTGACWCAG</td><td>Druga runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich &lambda; - Startery wewnętrzne - startery do przodu</td></tr><tr><td>5'AgeIVl4_5</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTGGGGCTCTCTCS CAGCYTGTGCTGACTCA</td><td>Druga runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich &lambda; - Startery wewnętrzne - startery do przodu</td></tr><tr><td>5'AgeIVl6</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGGGCTTGGGCC AATTTTATGCTGACTCAG</td><td>Druga runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich &lambda; - Startery wewnętrzne - startery do przodu</td></tr><tr><td>5'AgeIVl8</td><td>Eurofins</td><td>CTGCTACCGGTTCCAATTCY CAGRCTGTGGTGACYCAG</td><td>Druga runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich &lambda; - Startery wewnętrzne - startery do przodu</td></tr><tr><td>3'XhoICl</td><td>Eurofins</td><td>CTCCTCACTCGAG GGYGGGAACAGAGTG</td><td>Druga runda PCR - Amplifikacja łańcuchów lekkich i lambda; - Startery wewnętrzne -Startery odwrócone - Badania przesiewowe PCR</td></tr><tr><td>pod kątem bakterii Ab-vec-sense</td><td>Eurofins</td><td>GCTTCGTTAGAAC GCGGCTAC</td><td>Badania przesiewowe PCR bakterii</td></tr><tr><td>QA Agarose-TM, Biologia molekularna Grade</td><td>MP Bio</td><td>AGAH0500</td><td></td></tr><tr><td>NucleoFast 96 PCR Plate</td><td>Macherey Nagel</td><td>743.100.100</td><td></td></tr><tr><td>Enzyme Age I HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3552L</td><td>20000U/ml</td></tr><tr><td>Enzym SalI HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3138L</td><td>20000U/ml</td></tr><tr><td>Enzym Xho I</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146L</td><td>20000U/ml</td></tr><tr><td>Enzym BSIWI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0553L</td><td>10000U/ml</td></tr><tr><td>HCg1 (numer dostępu do Genbank FJ475055)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LCk (numer dostępu do Genbank FJ475056 )</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LCl (akces Genbank numer FJ517647)Ligaza</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>DNA T4</td><td>Invitrogen firmy thermoFisher scientific</td><td>15224.017</td><td>100U (1U/ul)</td></tr><tr><td>2X YT medium</td><td>Sigma</td><td>Aldrich Y1003-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10835242001</td><td></td></tr><tr><td>LB (Luria Bertani) Rosół (Lennox)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3022-250G</td><td></td></tr><tr><td>Nukleospinowy plazmid DNA, RNA i Oczyszczanie białek</td><td>Macherey Nagel</td><td>740588.250</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji DNA Jet PEI</td><td>PolyPlus</td><td>101-40</td><td></td></tr><tr><td>Płaskie dno96-dołkowa płytka</td><td>Falcon</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>V-bottom 96-dołkowa płytka</td><td>Nunc/Thermofisher 055142</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nunc easy 175 cm2</td><td>Kolby Nunc/Thermofisher</td><td>12-562-000</td><td></td></tr><tr><td>ELISA/ELISPOT Bufor powlekający</td><td>eBiosciences</td><td>00-0044-59</td><td></td></tr><tr><td>Nunc maxisorp płaskie dno 96-dołkowe płytki ELISA</td><td>Nunc/Thermofisher</td><td>44-2404-21</td><td>wysokie wiązanie białek</td></tr><tr><td>Anty-ludzkie IgG Ab sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRP)</td><td>BD Pharmingen / BD Biosciences</td><td>55788</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże TMB</td><td>BD Biosciences</td><td>555214</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Sigma</td><td>S0677</td><td></td></tr><tr><td>1 mL-HiTrap białko A kolumna HP</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0402-01</td><td></td></tr><tr><td>&Auml; KTA FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td>18190026</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna Superdex 200 10/300 GL</td> GE <td>Healthcare</td><td>17517501</td><td></td></tr><tr><td>System chromatograficzny NGC Quest 10 Plus</td><td>BioRad</td><td>7880003</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie dyskryminujących ludzkich przeciwciał monoklonalnych z rzadkich limfocytów b specyficznych dla antygenu b krążących we krwi

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Przeciwciała monoklonalne (mAb) są potężnymi narzędziami przydatnymi zarówno w badaniach podstawowych, jak i w biomedycynie. Ich wysoka swoistość jest niezbędna, gdy przeciwciało musi rozróżnić wysoce spokrewnione struktury (np. normalne białko i jego zmutowaną wersję). Obecny sposób generowania takich dyskryminujących mAb obejmuje szeroko zakrojone badania przesiewowe wielu komórek B wytwarzających Ab, co jest zarówno kosztowne, jak i czasochłonne. Proponujemy tutaj szybką i opłacalną metodę generowania dyskryminujących, w pełni ludzkich mAb, zaczynając od ludzkich limfocytów B krążących we krwi. Oryginalność tej strategii wynika z selekcji specyficznych komórek B wiążących antygen w połączeniu z kontrselekcją wszystkich innych komórek, przy użyciu łatwo dostępnych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC). Po wyizolowaniu określonych komórek B, sekwencje cDNA (komplementarny kwas dezoksyrybonukleinowy) kodujące odpowiednie mAb są uzyskiwane przy użyciu technologii jednokomórkowej reakcji łańcuchowej odwrotnej transkrypcji i polimerazy (RT-PCR), a następnie ulegają ekspresji w komórkach ludzkich. W ciągu zaledwie 1 miesiąca możliwe jest wyprodukowanie miligramów wysoce dyskryminujących ludzkich przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko praktycznie każdemu pożądanemu antygenowi naturalnie wykrywanemu przez repertuar limfocytów B.

Wychodząc od PBMC od zdrowych dawców, projekt ten przedstawia generowanie ludzkich przeciwciał monoklonalnych (mAbs), które rozpoznają peptyd Pp65495 (Pp65, pochodzący z ludzkiego cytomegalowirusa) prezentowany przez cząsteczkę głównego kompleksu zgodności tkankowej klasy I (MHC-I) HLA-A*0201 (HLA-A2). Te mAbs potrafią odróżnić ten kompleks od kompleksów reprezentujących inne peptydy załadowane na tę samą cząsteczkę MHC-I.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-pag...

Opisujemy metodę produkcji ludzkich przeciwciał specyficznych dla interesującego nas antygenu, zaczynając od rzadkich limfocytów B krążących w ludzkiej krwi. Wytwarzanie tych naturalnych przeciwciał jest wydajne i szybkie, a uzyskane przeciwciała mogą rozróżniać wysoce spokrewnione antygeny.

Wytwarzanie dyskryminujących ludzkich przeciwciał monoklonalnych z rzadkich limfocytów B specyficznych dla antygenu B krążących we krwi

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Ogólnym celem tej procedury jest wytworzenie w pełni ludzkich przeciwciał monoklonalnych przeciwko pożądanemu antygenowi, począwszy od ludzkich limfocytów B krążących we krwi. Protokół ten umożliwia wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych, które mogą rozróżniać wysoce spokrewnione antygeny. W przypadku niektórych zastosowań, takich jak immunoterapia, precyzyjne ukierunkowanie antygenu może być niezbędne.Zaletą tej techniki jest to, że można ją wykonać zaczynając od krwi zdrowych lub uodpornionych dawców i pozwala na izolację nawet rzadkich limfocytów B wiążących antygen. Chociaż metoda ta jest opisana na podstawie próbek pobranych od ludzi, można ją również zastosować do zwierząt, które mogą być wstępnie uodpornione. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ procedura ta jest w rzeczywistości w dość złożonej strategii wielokrotnego bramkowania analitycznego dyskryminowanych limfocytów B.Zabieg zostanie wykonany przez Melindę. Jest asystentem inżyniera w naszym laboratorium. Najpierw odpipetować 35 mililitrów rozcieńczonej zawiesiny komórek na 15 mililitrach gradientu gęstości w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów.Następnie umieść stożkową rurkę w obracanym wirniku kubełkowym z wyłączonymi hamulcami i odwiruj pod ciśnieniem 1290 razy większym od grawitacji przez 25 minut w temperaturze pokojowej. Następnie, na styku ośrodka gradientu gęstości i warstwy plazmy, ostrożnie odessać warstwę komórki jednojądrzastej i przenieść ją do nowej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Dodaj zawiesinę komórkową do 15-mililitrowej stożkowej probówki i wiruj przy 460-krotności grawitacji przez pięć minut.Następnie ponownie zawieś osad w 200 mikrolitrach soli fizjologicznej buforowanej fosforanem z 2% płodową surowicą bydlęcą. Dodaj sprzężone tetramery do końcowego stężenia 10 mikrogramów na mililitr. Dobrze wymieszaj, a następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut w okapie z przepływem laminarnym, chronionym przed światłem.Następnie dodaj 10 mililitrów lodowatego buforu do separacji komórek do zawiesiny komórek. Odwirować zawiesinę komórkową pod ciśnieniem 460-krotności grawitacji przez pięć minut. Do otrzymanej osadki komórkowej dodać 500 mikrolitrów lodowatego buforu do separacji komórek oraz 50 mikrolitrów dwóch wariantów mikrokulek magnetycznych i inkubować zawiesinę komórek przez 20 minut.Następnie ponownie zawieś osad komórek w lodowatym buforze do separacji komórek. Ostrożnie przenieś zawiesinę komórek na wierzch zrównoważonej kolumny i pozwól jej całkowicie spłynąć. Następnie przepłukać probówkę trzema mililitrami buforu do separacji komórek i przenieść bufor do kolumny.Po trzykrotnym wypłukaniu kolumny wyjmij ją z magnesu i umieść na stożkowej rurze zbiorczej o pojemności 25 mililitrów. Po dodaniu pięciu mililitrów lodowatego buforu separacyjnego na wierzch kolumny, szybko przepłucz komórki z kolumny za pomocą tłoka. Zawiesić osad komórkowy koktajlem przeciwciał anty-ludzkich i 7AAD w łącznej objętości 100 mikrolitrów soli fizjologicznej buforowanej fosforanami z 2% płodową surowicą bydlęcą.Następnie inkubuj komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Następnie użyj cytometru sortowania komórek, aby posortować określone komórki B na poziomie pojedynczej komórki, nie przekraczając 1 000 zdarzeń na sekundę. Następnie zbierz pojedyncze posortowane komórki B do 8-paskowych probówek PCR uprzednio wypełnionych 10 mikrolitrami soli fizjologicznej buforowanej 1X fosforanem i 10 jednostkami inhibitora RNAzy i umieść na stojaku na 96 mikroprobówek.Szybko zamroź probówki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Podgrzewać zamrożone próbki w suchej łaźni utrzymywanej w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez pięć minut w celu lizy komórek. Następnie umieść pasek na lodzie i zacznij tworzyć mieszankę wzorcową do odwrotnej transkrypcji.Po przygotowaniu master-mixu z odwrotną transkrypcją, program poinstruuj termocykler. Pod koniec odwrotnej transkrypcji wykonaj zagnieżdżone PCR w celu amplifikacji genów immunoglobuliny. Zidentyfikuj dodatnie klony, wizualizując na 1,5% żelu agarozowym migrację produktu PCR o długości 500 par zasad dla zmiennych segmentów łańcucha ciężkiego i kodującego oraz produktu PCR o długości 350 par zasad dla segmentów kodujących zmienny łańcuch lekki.Dodaj jeden mikrolitr produktu do klonowania do 45 mikrolitrów elektrokompetentnych komórek TOP10 E. coli. Elektroporacja. Następnie szybko dodaj do komórek 500 mikrolitrów pożywki 2X YT i inkubuj w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Rozprowadź przekształcone bakterie na płytce ampicyliny 2X YT.Następnie inkubuj płytki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie ustaw premiks reakcyjny i dodaj jego 25 mikrolitrów do 8-paskowej probówki PCR trzymanej na lodzie. Następnie użyj sterylnej wykałaczki, aby wybrać kolonie i rozprowadź je na płytce ampicyliny 2X YT.Następnie zanurz wykałaczki w probówce reakcyjnej PCR. Zidentyfikuj dodatnie klony, wizualizując na 1,5% żelu agarozowym migrację produktu PCR o długości 850 par zasad dla wektora łańcucha ciężkiego i produktu PCR o długości 600 par zasad dla wektora łańcucha lekkiego. W dwóch mililitrach pożywki LB zaszczepić cztery dodatnie kolonie.Inkubować inokulat w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc przy 200 obrotach na minutę, wstrząsając. Wysiewaj 15 000 ludzkich embrionalnych komórek nerkowych w 200 mikrolitrach zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium firmy Dulbecco, uzupełnionych 10% płodową surowicą bydlęcą w każdym dołku płaskiej płytki 96-dołkowej na dzień przed transfekcją. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc w 5% dwutlenku węgla.Kotransfekcja komórek przy użyciu liniowego odczynnika do transfekcji pochodnej polietylenu. Rozcieńczyć 0,5 mikrolitra odczynnika do transfekcji DNA 10 mikrolitrami 150 milimolowego chlorku sodu. Następnie rozcieńczyć 0,125 mikrograma każdego zmiennego ciężkiego i lekkiego łańcucha wyrażającego wektory w 10 mikrolitrach 150-milimolowego chlorku sodu.Wirować wszystkie rozcieńczenia przez 10 sekund każde. Następnie wymieszaj wcześniej rozcieńczony odczynnik do transfekcji DNA z 10 mikrolitrami roztworu DNA. Szybko wirować mieszaninę transfekcji DNA przez 15 sekund i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.Dodaj mieszaninę transfekcji DNA kroplami na komórki, a następnie delikatnie zakręć płytką. Wymień pożywkę 16 godzin po transfekcji i hoduj komórki przez pięć dni w pożywce bez surowicy w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie użyj pipety wielokanałowej, aby zassać supernatant i przenieść go do płytki z 96 dołkami z dnem w kształcie litery V.Pokryj każdą studzienkę 96-dołkową płytką ELISA odpowiednim antygenem w temperaturze czterech stopni Celsjusza na noc w 100 mikrolitrach odtworzonego buforu powlekającego ELISA w końcowym stężeniu dwóch mikrogramów na mililitr. Następnie dodać 50 mikrolitrów transfekowanego supernatantu komórkowego do studzienek 96-dołkowej płytki ELISA i inkubować płytkę przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Następnie dodać 100 mikrolitrów przeciwciała przeciw ludzkiej immunoglobuliny G sprzężonego z enzymem peroksydazy chrzanowej w stężeniu jednego mikrograma na mililitr i inkubować studzienkę w temperaturze pokojowej przez godzinę.Na koniec dodaj 50 mikrolitrów substratu chromogennego do studzienki i inkubuj przez kolejne 20 minut. Pod koniec inkubacji odczytaj gęstość optyczną przy 450 nanometrach na spektrofotometrze. Aby wyizolować specyficzne limfocyty B, zastosowano strategię bramkowania, która dyskryminowała receptory eksprymujące komórki B w stosunku do kompleksu HLA-A2 / Pp65.Początkowo komórki były CD19 dodatnie, CD3 ujemne bramkowane. Na koniec komórki wybarwiono zarówno HLA-A2 / Pp65PE, jak i HLA-A2 / Pp65APC, ale nie tetramerami HLA-A2 / MelABV421, bramkowano w celu uzyskania wysoce specyficznych komórek B. Korzystając z tej strategii bramkowania, można wyizolować selektywne komórki B, które mogą różnicować między HLA-A2 / Pp65 a innym pokrewnym kompleksem peptydowym HLA-A2.Następnie, w celu zbadania obecności przeciwciała PC1.02 przeciwko tetramerowi HLA-A2/Pp65, przeprowadzono test ELISA. Na uzyskanym wykresie słupkowym oś y odpowiada optymalnym odczytom gęstości, a oś x odpowiada peptydom HLA-A2. Z testu wynika, że przeciwciało monoklonalne wiąże się z tetramerem HLA-A2/Pp65 w sposób zależny od peptydu i głównego kompleksu zgodności tkankowej.Następnie wykorzystano powierzchniową rezydencję plazminy do zbadania powinowactwa wiązania przeciwciała PC1.02. Następnie uzyskano dane tabelaryczne w celu analizy komórek B specyficznych dla HLA-A2 / Pp65. Wykazano wpływ strategii wykluczania nieswoistych limfocytów B, wydajność amplifikacji genu immunoglobuliny oraz wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych z limfocytów B specyficznych dla HLA-A2 / Pp65.Po opanowaniu, technika obejmująca izolację specyficznych dla antygenów limfocytów B z ludzkiej krwi po produkcję przeciwciał monoklonalnych może być wykonana w ciągu zaledwie jednego miesiąca. Wykonując tę procedurę, pamiętaj, aby przejść od razu z sortowania limfocytów B do RT-PCR bez zatrzymywania się.

generation-discriminative-human-monoclonal-antibodies-from-rare

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje metodę generowania przeciwciał z komórek ssaków poprzez wprowadzenie wektorów plazmidowych z ciężkimi i lekkimi genami łańcuchowymi. Wektory te oddziałują z polietyleneniną i wnikają do komórek, tworząc polipleksy; Później są one przekształcane w pojedyncze białka i składane w kompletne przeciwciała, które są wydzielane do podłoża zewnątrzkomórkowego.

Wytwarzanie rekombinowanych przeciwciał monoklonalnych z kultur komórkowych ssaków

Film demonstruje technikę generowania przeciwciał monoklonalnych z limfocytów B specyficznych dla antygenu. Eukariotyczne wektory ekspresyjne kodujące ciężkie i lekkie łańcuchy przeciwciał, sklonowane z izolowanych komórek B specyficznych dla antygenu, wprowadza się do komórek ssaków za pomocą polipleksów. Po wejściu do komórek wektory te ulegają translacji, a powstałe peptydy o ciężkich i lekkich łańcuchach łączą się w przeciwciała, które są następnie wydzielane przez komórki.

Technika wytwarzania przeciwciał monoklonalnych z limfocytów B specyficznych dla antygenu

Ten artykuł opisuje metodę generowania i rozmnażania klonów ludzkich limfocytów T, które specyficznie reagują na zdefiniowany alloantygen. Protokół ten można dostosować do klonowania ludzkich limfocytów T specyficznych dla różnych ligandów peptyd-MHC.

Wytwarzanie ludzkich limfocytów T specyficznych dla alloantygenu z krwi obwodowej

Synteza ludzkich przeciwciał monoklonalnych jest pierwszym krokiem w badaniach mających na celu rozwikłanie patofizjologicznych mechanizmów odpowiedzi immunologicznej za pośrednictwem autoprzeciwciał. Opracowaliśmy protokół wytwarzania rekombinowanych przeciwciał monoklonalnych ludzkiej immunoglobuliny G (IgG) z komórek B posortowanych krwią, w tym izolację komórek B, klonowanie przeciwciał i syntezę in vitro.

Wytwarzanie rekombinowanych ludzkich przeciwciał monoklonalnych IgG z unieśmiertelnionych sortowanych komórek B

Ludzka krew obwodowa jest powszechnie używana do oceny humoralnej odpowiedzi immunologicznej. W tym miejscu opisano metody izolowania ludzkich limfocytów B z krwi obwodowej, różnicowania ludzkich komórek B w limfocyty B wydzielające przeciwciała (Ab) (ASC) w hodowli oraz liczenia całkowitych IgM- i IgG-ASC za pomocą testu ELISpot.

Izolacja, różnicowanie i kwantyfikacja ludzkich limfocytów B wydzielających przeciwciała z krwi: ELISpot jako funkcjonalny odczyt odporności humoralnej

Przedstawiono zoptymalizowany protokół generowania przeciwciał monoklonalnych opartych na technologii hybrydomy. Myszy uodporniono immunokoniugatem. Komórki śledziony zostały połączone za pomocą PEG i impulsu elektrycznego z nieśmiertelnymi komórkami szpiczaka. Komórki hybrydoma wytwarzające przeciwciała wybrano za pomocą HAT i badania przesiewowego ELISA swoistego dla antygenu.

Wytwarzanie mysich przeciwciał monoklonalnych za pomocą technologii Hybridoma

Opisana jest prosta, ale skuteczna metoda, która wykorzystuje magnetyczne nanocząstki do wykrywania i wzbogacania komórek B reagujących na antygen do analizy funkcjonalnej i fenotypowej.

Wykrywanie i wzbogacanie rzadkich limfocytów B specyficznych dla antygenu w celu analizy fenotypu i funkcji

Ten artykuł zawiera szczegółowy protokół przygotowania i oceny przeciwciał monoklonalnych przeciwko naturalnym produktom do wykorzystania w różnych testach immunologicznych. Procedura ta obejmuje immunizację, fuzję komórek, pośredni kompetycyjny test ELISA do dodatniego badania przesiewowego klonów oraz przygotowanie hybrydoma monoklonalnego. Podano również specyfikacje dotyczące charakterystyki przeciwciał za pomocą analiz MALDI-TOF-MS i ELISA.

Wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych przeciwko produktom naturalnym

Metoda BSelex do identyfikacji i odzyskiwania pojedynczych przeciwciał specyficznych dla antygenu z komórek jednojądrzastych ludzkiej krwi obwodowej łączy cytometrię przepływową z PCR pojedynczych komórek i klonowaniem.

Metoda przesiewowa pojedynczych komórek w celu selekcji i odzyskiwania przeciwciał o pożądanej swoistości ze wzbogaconych populacji komórek B ludzkiej pamięci

Opisujemy tutaj prostą analizę heterogeniczności przedziału mysich komórek odpornościowych B w tkankach otrzewnej, śledziony i szpiku kostnego za pomocą cytometrii przepływowej. Protokół można dostosować i rozszerzyć na inne tkanki myszy.

Charakterystyka cytometrii przepływowej rozwoju mysich komórek B

Poznaj metodę wytwarzania ludzkich przeciwciał monoklonalnych z krążących limfocytów B. Technika umożliwia izolację rzadkich komórek wiążących antygeny i precyzyjne rozróżnianie pokrewnych antygenów w zastosowaniach immunoterapeutycznych.

Wytwarzanie dyskryminujących ludzkich przeciwciał monoklonalnych z rzadkich limfocytów B specyficznych dla antygenu B krążących we krwi (Wideo) | JoVE Journal

Wytwarzanie dyskryminujących ludzkich przeciwciał monoklonalnych z rzadkich limfocytów B specyficznych dla antygenu B krążących we krwi

Przeglądaj więcej filmów