4.14: Test TUNEL

Test TUNEL jest najczęściej stosowany do wykrywania komórek ulegających apoptozie, która jest formą zaprogramowanej śmierci komórki. Apoptoza jest ważnym procesem biologicznym podczas rozwoju i utrzymania homeostazy tkanek. Barwienie metodą TUNEL pozwala na wizualizację i kwantyfikację komórek apoptotycznych. Pomaga to naukowcom testować skuteczność nowych metod leczenia zaburzeń, w których apoptoza jest albo zahamowana, jak w przypadku raka, albo wzmocniona, jak w przypadku neurodegeneracji.

Ten film wyjaśni, w jaki sposób test TUNEL może być wykorzystany do oznaczania komórek poddawanych apoptozie, protokołu krok po kroku do wykonywania tej metody w skrawkach tkanki, oraz w jaki sposób naukowcy stosują tę technikę do zrozumienia mechanizmów śmierci komórki.

Zanim zagłębimy się w protokół testu TUNEL, omówmy zasady stojące za tą techniką.

Jedną z wielu charakterystycznych cech apoptozy jest fragmentacja DNA. Jak dochodzi do fragmentacji DNA? Apoptoza jest przeprowadzana przez enzymy zwane kaspazami obecne w cytozolu. Ich podstawową rolą jest rozszczepianie białek w celu rozmontowania komórki. Ponadto kaspazy aktywują enzym zwany DNazą aktywowaną kaspazą lub CAD, odłączając go od inhibitora? ICAD. Aktywowana CAD to endonukleaza, która przemieszcza się do jądra i rozszczepia chromosomalne DNA.

Rozszczepienie DNA ostatecznie powoduje akumulację fragmentów DNA z naciętymi końcami, a test TUNEL fluorescencyjnie znakuje te nacięte końce pofragmentowanego DNA, umożliwiając naukowcom wykrycie apoptozy. Ale jak to się dzieje? W tym celu musisz zrozumieć reakcję TUNEL. TUNEL oznacza końcowe znakowanie końca dUTP za pośrednictwem deoksynukleotydylotransferazy. Dwa główne odczynniki TUNEL to końcowa deoksynukleotydylotransferaza lub TdT i trifosforan deoksyurydyny lub dUTP, które mogą być znakowane fluorescencyjnie w celu ułatwienia wykrywania.

Aby zrozumieć reakcję TUNEL, wróćmy do komórek apoptotycznych z fragmentami DNA. Te nacięte fragmenty mają wolne 3? grupy hydroksylowe. Po dodaniu odczynników TUNEL do próbki zawierającej komórki apoptotyczne, znakowane fluorescencyjnie dUTP przyłączają się do tych 3? grupy hydroksylowe za pomocą enzymu katalizatora TdT. Komórki barwione tą procedurą nazywane są komórkami TUNEL-dodatnimi, które można następnie uwidocznić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Teraz, gdy rozumiesz podstawowe zasady i koncepcje stojące za testem TUNEL, przedstawmy ogólny protokół wykonywania tej techniki w sekcjach tkanek. Główne etapy testu TUNEL obejmują utrwalenie tkanki będącej przedmiotem zainteresowania, przepuszczalność tkanki, dodanie odczynników TUNEL, zatrzymanie reakcji TUNEL i wreszcie analizę.

Po pierwsze, tkanka będąca przedmiotem zainteresowania musi zostać utrwalona w celu zachowania struktur biologicznych. Utrwalanie działa poprzez sieciowanie białek w komórkach. W przypadku testu TUNEL tkanki można utrwalić, dodając je do roztworu zawierającego 4% paraformaldehydu przez 4–24 godziny w temperaturze 4°C. Po utrwaleniu należy dokonać kriosekcji tkanki na cienkie plastry o grubości 10 μm lub mniejszej.

Kolejnym krokiem jest przenikanie, które pozwala odczynnikom takim jak enzym TdT przeniknąć do jądra komórkowego. Permeabilizację skrawków tkanek można przeprowadzić przez dodanie tkanki do roztworu proteinazy K przez 5–15 minut w temperaturze 37°C. Płukać skrawki tkanek solą fizjologiczną buforowaną fosforanami na wytrząsarce orbitalnej przez 15–30 minut w temperaturze pokojowej.

Po przepuszczalności enzym TdT i znakowane fluorescencyjnie dUTP są dodawane do skrawków tkanki wraz z buforem znakującym zawierającym kobalt, który działa jako kofaktor reakcji TUNEL. Mieszaninę reakcyjną TUNEL i wycinek tkankowy inkubuje się razem przez 1–3 godziny w temperaturze 37° C i chronione przed światłem, aby zapobiec blaknięciu fluorescencji.

Po inkubacji do wycinka tkankowego dodaje się bufor zatrzymujący w celu zatrzymania reakcji TUNEL, a po krótkiej inkubacji skrawki przemywa się solą fizjologiczną buforowaną fosforanami. Na koniec skrawki tkanek wybarwione za pomocą znakowanego fluorescencyjnie dUTP są wizualizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i oceniane pod kątem lokalizacji komórek TUNEL dodatnich w danej tkance. Śmierć komórki można określić ilościowo, po prostu licząc procent komórek TUNEL dodatnich w danym wycinku tkanki.

Teraz, gdy już wiesz, jak wykonać test TUNEL w celu wykrycia komórek apoptotycznych, omówmy, w jaki sposób ten test można wykorzystać do odpowiedzi na pytania zadawane przez biologów komórkowych.

Śmierć komórki zachodzi jako normalna część rozwoju w celu rzeźbienia tkanek i struktur oraz eliminacji niepotrzebnych komórek. Dlatego naukowcy zainteresowani tym zjawiskiem badają wpływ prenatalnej ekspozycji na różne substancje na apoptozę podczas rozwoju. W tym przypadku naukowcy byli zainteresowani zbadaniem wpływu prenatalnej ekspozycji na alkohol na rozwój mózgu. Wyniki barwienia TUNEL przeprowadzonego na mózgach płodów wykazały zwiększoną apoptozę w tkankach, które były prenatalnie narażone na działanie alkoholu, w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi.

Naukowcy wykorzystują również test TUNEL do badania apoptozy w odpowiedzi na infekcję bakteryjną. W tym eksperymencie naukowcy opracowali model zapalenia płuc poprzez wstrzyknięcie myszom Pseudomonas aeruginosa, który wywołuje zapalenie płuc. Następnie usunięto tkankę płucną i wykonano barwienie TUNEL w celu zbadania apoptozy w odpowiedzi na infekcję bakteryjną. Wyniki pokazują, że śmierć komórek apoptotycznych wzrosła u myszy narażonych na działanie bakterii w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi.

Wreszcie, barwienie TUNEL może być stosowane na próbkach ludzkich guzów w celu określenia reakcji guza na leki. W tym przykładzie próbki guza pobrano od pacjentów i poddano hodowli ex vivo. Następnie byli leczeni lekami przedklinicznymi i oceniani pod kątem odpowiedzi za pomocą testu TUNEL. Uzyskane dane pokazują, że leczenie lekiem hamującym białko szoku cieplnego 90 znacznie zwiększa apoptozę w tkance nowotworowej.

Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat używania testu TUNEL do wykrywania komórek ulegających apoptozie. W tym filmie omówiono zasady barwienia metodą TUNEL oraz protokół krok po kroku umożliwiający wykonanie testu TUNEL na skrawkach tkanki. Sprawdziliśmy również, w jaki sposób można zastosować tę metodę do zrozumienia zaprogramowanej śmierci komórki podczas rozwoju i choroby. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!