Monitorowanie wpływu stresu osmotycznego na pęcherzyki wydzielnicze i egzocytozę

Ogólnym celem tej połączonej metodologii analitycznej jest dostarczenie informacji na temat tego, w jaki sposób pęcherzyki wydzielnicze w komórkach reagują na siłę fizyczną, taką jak zewnątrzkomórkowe ciśnienie osmotyczne, oraz jak dostosowania tych organelli dodatkowo wpływają na proces egzocytozy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii, takie jak: w jaki sposób pęcherzyki wydzielnicze bezpośrednio reagują na zmiany w środowisku zewnątrzkomórkowym lub na leczenie farmakologiczne? Główną zaletą tego podejścia jest monitorowanie bezpośredniego wpływu na zawartość pęcherzyków w żywych komórkach i umiejętność rozróżniania zmian w ich uwalnianiu reh-chemicznie przed i po leczeniu egzocytozy.

Aby uzyskać płaską powierzchnię elektrody dyskowej, umieść elektrodę w uchwycie mikroszlifierki i ukosuj każdą elektrodę z włókna węglowego pod kątem 45 stopni. Następnie zaznacz kapilatę do wykorzystania w przyszłości, jak zlokalizować powierzchnię elektrody dyskowej pod kątem 45 stopni podczas umieszczania elektrody w pobliżu komórek w celu pomiaru egzocytozy. Aby wykonać zapis amperometryczny na pojedynczych komórkach, zamontuj świeżo skośną i przetestowaną mikroelektrodę dyskową z włókna węglowego w uchwycie elektrody stopnia głowicy, który jest używany z potencjostatem.

Przed użyciem należy umieścić każdą mikroelektrodę z włókna węglowego w roztworze testowym w celu monitorowania prądu stanu badania za pomocą woltamperometrii cyklicznej. W przypadku cyklicznego skanowania woltamperometrycznego należy zastosować trójkątny przebieg potencjału od ujemnego 0,2 V do dodatniego 0,8 V na elektrodzie referencyjnej srebro-chlorek srebra o napięciu 100 miliwoltów na sekundę, aby zapewnić dobrą kinetykę reakcji. W celu amperometrycznego zapisu egzocytozy umieścić szalkę Petriego z hodowanymi komórkami chromochłonnymi w buforze izotonicznym pod mikroskopem odwróconym w klatce Faradaya.

Użyj stolika grzewczego mikroskopu, aby utrzymać temperaturę 37 stopni Celsjusza podczas eksperymentów z komórkami. Następnie użyj przyrządu do zaciskania krosowego o niskim poziomie hałasu, aby przyłożyć stały potencjał dodatni 700 miliwoltów do elektrody roboczej. Aby zarejestrować egzocytozę komórek chromochłonnych, zdigitalizuj sygnał przy 10 kilohercach i zastosuj wewnętrzny dolnoprzepustowy filtr Bessela przy dwóch kilohercach, aby przefiltrować zarejestrowany sygnał.

Należy pamiętać, że owalna elektroda dyskowa musi być umieszczona płasko na wierzchu komórek i równolegle do powierzchni szalki Petriego. Ponadto elektrody są fazowane tego samego dnia, co eksperymenty, aby zapewnić czystą powierzchnię elektrody. Aby stymulować egzocytozę komórki, umieść szklaną mikropipetę wypełnioną pięciomilimolowym roztworem chlorku baru w odległości co najmniej 20 mikrometrów od komórki.

Następnie zastosuj pięciosekundowy impuls iniekcyjny pięciomilimolowego roztworu chlorku baru na powierzchni komórki, aby stymulować egzocytozę komórki. Umieścić pipetę macierzystą w roztworze i stymulować egzocytozę komórki, stosując impuls wstrzyknięcia baru, jednocześnie rejestrując stany przejściowe prądu amperometrycznego przez około trzy minuty. Aby porównać odpowiedzi egzocytotyczne w warunkach izotonicznych z warunkami hipertonicznymi, inkubuj komórki przez 10 minut w hipertonicznym roztworze buforowym.

Następnie zastosuj impuls wstrzyknięcia baru, aby pobudzić egzocytozę i wykonaj trzyminutowy zapis amperometryczny. Aby uzyskać odwracalną odpowiedź komórek, należy ponownie inkubować komórki przez 10 minut w izotonicznym roztworze buforowym. Stymuluj komórki, stosując impuls wstrzyknięcia baru i wykonaj trzyminutowy zapis odpowiedzi egzocytotycznej.

Aby wytworzyć elektrody do ilościowych pomiarów wielkości pęcherzyków, należy przygotować elektrodę z włókna węglowego o średnicy pięciu mikrometrów. Pod mikroskopem użyj skalpela, aby przeciąć włókno węglowe, które wystaje ze szklanej końcówki, tak aby pozostało tylko 30 do 100 mikrometrów. Użyj płomienia butanu, aby przygotować trawioną płomieniem końcówkę elektrody z włókna węglowego.

Aby uzyskać równomiernie wytrawioną, cylindryczną końcówkę elektrody, przytrzymaj cylindryczną elektrodę z włókna węglowego podczas jej obracania. I umieść włókno węglowe wystające ze szkła na niebieską krawędź płomienia butanu, aż końcówka węgla zmieni kolor na czerwony. Po wytrawieniu płomieniowym umieść elektrodę pod mikroskopem, aby ocenić końcówkę elektrody.

Rozmiar wytrawionej końcówki elektrody powinien mieć średnicę około 50 do 100 nanometrów. Następnie włóż cylindryczną mikroelektrodę nanokońcówki do roztworu epoksydowego na trzy minuty, a następnie zanurz końcówkę elektrody w roztworze acetonu na 15 sekund. Dzięki temu żywica epoksydowa może uszczelnić potencjalną szczelinę między włóknem węglowym a ścianą kapilary gazu izolacyjnego.

Podczas gdy aceton usuwa żywicę epoksydową z wytrawionej powierzchni elektrody z włókna węglowego. Aby utwardzić żywicę epoksydową, piecz elektrody w piekarniku przez noc w temperaturze 100 stopni Celsjusza. Przed użyciem przetestuj prąd w stanie ustalonym każdej mikroelektrody z włókna węglowego za pomocą cyklicznej woltamperometrii.

Do eksperymentów używaj tylko elektrod, które wykazują prąd plateau około 1,5 do 2,5 nanoampera. W przypadku pomiarów amperometrii wewnątrzkomórkowej umieść komórki pod mikroskopem i użyj tych samych ustawień eksperymentalnych potencjostatu. Zapobiegaj znacznemu fizycznemu uszkodzeniu komórki.

Włóż cylindryczną mikroelektrodę nanotip do ogniwa, dodając delikatną siłę mechaniczną. Tylko tyle, aby przepchnąć elektrodę przez błonę plazmatyczną komórki i do cytoplazmy komórki za pomocą mikromanipulatora. Po włożeniu, z błoną komórkową uszczelnioną wokół cylindrycznej elektrody, rozpocznij amperometryczny zapis in-situ na żywej komórce.

Przy potencjale utleniania przyłożonym do elektrody, pęcherzyki adsorbują się na powierzchni elektrody i stochastycznie pękają. W związku z tym nie ma potrzeby stosowania żadnego bodźca, aby zainicjować ten proces. Aby określić wpływ osmotyczny na wielkość kwanty pęcherzykowej, należy pobrać pomiary cytometrii wewnątrzkomórkowej z grupy komórek, które inkubowano w buforze izotonicznym i hipertonicznym przy użyciu warunków eksperymentalnych.

Wpływ osmolalności zewnątrzkomórkowej na aktywność egzocytozy przedstawiono jako częstość występowania zdarzeń egzocytozy, gdy komórki chromochłonne są stymulowane roztworem baru w warunkach izotonicznych, następnie hipertonicznych, a na końcu izotonicznych. Dane te wskazują na zahamowanie aktywności egzocytozy w komórkach doświadczających stresu osmotycznego, a częściowe odzyskanie można osiągnąć po powrocie komórek do środowiska izotonicznego. Eksperyment kontrolny pokazuje częstość występowania zdarzeń egzocytozy po trzech kolejnych stymulacjach barem w komórkach chromochłonnych w warunkach izotonicznych.

Pokazuje to, że wielokrotna stymulacja barem w ramach czasowych stosowanych w tych eksperymentach powoduje zmniejszenie aktywności egzocytozy poprzez kolejną stymulację komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonywać te uzupełniające metody analityczne, które pozwalają porównać, w jaki sposób zmiany w środowisku zewnątrzkomórkowym wpływają na pęcherzyki wydzielnicze i proces egzocytozy.