Name: Charakterystyka rozszerzeń błon komórkowych i badanie ich roli w dynamice adhezji komórek nowotworowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Poznaj metodę ilościowej analizy rozszerzeń błon komórkowych i ich wpływu na adhezję w komórkach nowotworowych. Badanie wykorzystuje komórki raka kory nadnerczy do oceny roli białka DKK3 w formowaniu lobopodiów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Fundacja Grantu Ohse sfinansowała tę pracę.

1. Charakterystyka rozszerzenia komórki
<ol>
	<li>Utrzymuj komórki SW-13, SW-Neo i SW-DKK3 w standardowym nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37,0 °C i 5% CO2 w zmodyfikowanym pożywce Eagle firmy Dulbecco uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą i 10 000 U/ml penicyliny i streptomycyny (oznaczonej jako "pożywka wzrostowa").
	<ol>
		<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru i umieść 5,000 komórek na dołku dla linii SW-13, SW-Neo i SW-DKK3 na oddzielnych płytkach 6-dołkowych i hoduj przez noc w pożywce wzrostowej na sterylnych szklanych szkiełkach nakrywkowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po całonocnym wzroście, dla każdej studzienki, odessać pożywkę wzrostową, umyć komórki 1 ml ciepłej soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), a następnie utrwalić komórki 1 ml 3,7% formaldehydu przez 10 minut.</li>
	<li>Odessać formaldehyd i zabarwić komórki w każdym dołku 1 ml 0,05% fioletu krystalicznego przez 30 minut. Zmyć nadmiar barwnika za pomocą trzech płukań 1 ml wody dejonizowanej. 
	UWAGA: W zależności od poziomu wchłaniania barwnika może być konieczne kilka dodatkowych prań w celu usunięcia przebarwień tła w celu ułatwienia wizualizacji komórek.
	<ol>
		<li>Za pomocą szczypiec z cienką końcówką wyjmij szkiełka nakrywkowe i połóż je stroną zadrukowaną do dołu na oznakowanym szkiełku podstawowym z kroplą przezroczystego odczynnika montażowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pod mikroskopem świetlnym losowo wybierz 20 widoków nienakładających się komórek z każdego szkiełka nakrywkowego do testu przedłużania komórek.
	<ol>
		<li>Zrób mikrofotografie w 400-krotnym powiększeniu każdego pola widzenia. Bezpośrednio policz liczbę każdego typu rozszerzenia dla każdej z 20 reprezentatywnych komórek. 
		UWAGA: W związku z tym należy zbadać 20 izolowanych komórek dla każdego badanego stanu, aby zapewnić wiarygodne wyniki. Filopodia zdefiniowano za pomocą rozszerzeń komórkowych o podstawie 5 mikronów lub mniejszej i pojedynczym wierzchołku. Lobopodia zdefiniowano za pomocą przedłużeń komórkowych o podstawie o długości od 5 do 20 mikronów, zawierających przedłużenia z wieloma wierzchołkami. Blaszki zdefiniowano za pomocą przedłużeń komórek o długości większej niż 20 mikronów i z wierzchołkami lub bez. W zależności od badanego typu ogniwa, rozmiary przedłużeń ogniw mogą się różnić i mogą wymagać doprecyzowania parametrów identyfikacyjnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ średnią liczbę każdego przedłużenia komórki w każdym typie komórki (tj. SW-13, SW-Neo, SW-DDK) w 6 badanych studzienkach.</li>
	<li>Korzystając z testu statystycznego jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA), porównaj różnice w średnim odsetku rozszerzeń błony komórkowej między różnymi typami komórek testowych.</li>
</ol>
2. Test adhezji
<ol>
	<li>Utrzymuj komórki SW-13, SW-Neo i SW-DKK3 w standardowym nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37,0 °C i 5% CO2 w podłożu wzrostowym.
	<ol>
		<li>Za pomocą hemocytometru policz i umieść 100 000 komórek SW-13, SW-Neo i SW-DKK3 na studzienku na oddzielnych 6-dołkowych płytkach i hoduj przez noc w pożywce wzrostowej.</li>
		<li>Wysiewaj 6-dołkowe płytki dla każdego badanego typu komórek, używając jednej płytki dla każdego z 6 wyznaczonych punktów czasowych badanych poniżej. 
		UWAGA: Punkty czasowe mogą się różnić dla różnych typów komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po całonocnej inkubacji umyj komórki ciepłym PBS, a następnie dodaj 0,5 ml 1x nieenzymatycznego roztworu dysocjacji komórek do każdej studzienki.
	<ol>
		<li>Zakręć płytką, aby rozprowadzić roztwór dysocjacji komórek. Odessać wyznaczoną płytkę w określonych punktach czasowych (tj. 1, 2, 3, 5, 10 i 15 minut), a następnie trzykrotnie przemyć 1 ml ciepłego roztworu PBS.</li>
		<li>Pomiędzy praniami delikatnie postukaj w płytki, aby odłączyć luźno przymocowane komórki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odessać pozostały PBS i przymocować pozostałe komórki do płytki za pomocą 1 ml 3,7% formaldehydu przez 10 minut.</li>
	<li>Zabarwić komórki 1 ml 0,05% fioletu krystalicznego przez 30 minut, a następnie zmyć nadmiar barwnika 1 ml wody dejonizowanej. Miareczkowanie płukania w celu ułatwienia wizualizacji komórek. 
	UWAGA: W zależności od poziomu wchłaniania barwnika może być konieczne kilka dodatkowych płukań, aby ułatwić wizualizację komórek.</li>
	<li>Używając mikroskopu świetlnego przy 100-krotnym powiększeniu, policz pozostałe przyłączone komórki w każdym dołku dla każdej płytki. 
	UWAGA: Używanie przezroczystych linijek lub zaznaczanie cienkich prowadnic pisaków na spodniej stronie płytki pomoże uniknąć wielokrotnego liczenia tych samych komórek.</li>
	<li>Określ średnią liczbę przyłączonych komórek na studzienkę dla każdej płytki.</li>
	<li>Porównaj szybkość odłączania komórek między komórkami SW-13, SW-Neo i SW-DDK3 w danym okresie czasu za pomocą dwukierunkowego testu statystycznego ANOVA.</li>
</ol>

<ol><li>Libe, R., Fratticci, A., Bertherat, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenocortical+cancer%3A+pathophysiology+and+clinical+management%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine-related+cancer%22%5BJournal%5D)">Adrenocortical cancer: pathophysiology and clinical management.</a> Endocrine-related cancer. 14 (1), 13-28 (2007).</li>
<li>Veeck, J., Dahl, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+Wnt+pathway+in+cancer%3A+the+emerging+role+of+Dickkopf-3%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Targeting the Wnt pathway in cancer: the emerging role of Dickkopf-3.</a> Biochimica et biophysica acta. 1825 (1), 18-28 (2012).</li>
<li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+migration+in+morphogenesis%2C+regeneration+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (7), 445-457 (2009).</li>
<li>Jacquemet, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-type+calcium+channels+regulate+filopodia+stability+and+cancer+cell+invasion+downstream+of+integrin+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">L-type calcium channels regulate filopodia stability and cancer cell invasion downstream of integrin signalling.</a> Nat Commun. 7, 13297(2016).</li>
<li>Machesky, L. M., Li, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fascin%3A+Invasive+filopodia+promoting+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Fascin: Invasive filopodia promoting metastasis.</a> Commun Integr Biol. 3 (3), 263-270 (2010).</li>
<li>Petrie, R. J., Harlin, H. M., Korsak, L. I., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+the+nuclear+piston+mechanism+of+3D+migration+in+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Activating the nuclear piston mechanism of 3D migration in tumor cells.</a> J Cell Biol. 216 (1), 93-100 (2017).</li>
<li>Korah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+silencing+of+RASSF1A+deregulates+cytoskeleton+and+promotes+malignant+behavior+of+adrenocortical+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cancer%22%5BJournal%5D)">Epigenetic silencing of RASSF1A deregulates cytoskeleton and promotes malignant behavior of adrenocortical carcinoma.</a> Molecular cancer. 12, 87(2013).</li>
<li>Cheng, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+FOXO1-mediated+dedifferentiation+blocking+role+for+DKK3+in+adrenocortical+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cancer%22%5BJournal%5D)">A novel FOXO1-mediated dedifferentiation blocking role for DKK3 in adrenocortical carcinogenesis.</a> BMC cancer. 17 (1), 164(2017).</li>
<li>Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+source+software+for+quantification+of+cell+migration%2C+protrusions%2C+and+fluorescence+intensities%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities.</a> J Cell Biol. 209 (1), 163-180 (2015).</li>
<li>Cliffe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+3D+analysis+of+complex+single+border+cell+behaviors+in+coordinated+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Quantitative 3D analysis of complex single border cell behaviors in coordinated collective cell migration.</a> Nat Commun. 8, 14905(2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisujemy ilościową metodę in vitro do łatwego charakteryzowania rozszerzeń komórek, z niewielką liczbą pułapek i wiarygodną odtwarzalnością, którą można zastosować w różnych warunkach testowych. Co więcej, proste, mierzalne testy adhezji i/lub ruchliwości mogą być wykonywane jednocześnie w celu skorelowania potencjalnego znaczenia funkcjonalnego obserwowanych zmian w rozszerzeniach błony komórkowej.
Jednak te metody mogą wiązać się z pewnymi potencjalnymi ograniczeniami...

Dysregulowana sygnalizacja WNT odgrywa kluczową rolę w nowotworach kory nadnerczy1. Metody zastosowane w tym badaniu badają, czy wyciszenie DKK3, negatywnego regulatora sygnalizacji WNT, stanowi zdarzenie dedyferencjacji w korze nadnerczy i sprzyja powstawaniu guza w kontekście zmian w repertuarze rozszerzenia komórki. DKK3 jest glikoproteiną wydzielaną przez 38 kDa z N-końcowym peptydem sygnałowym, a wcześniejsze badania wykazały, że jej wymuszona ekspresja powodowała zatrzymanie cyklu komórkowego, hamowała agresywne złośliwe zachowanie i odwracała przejście nabłonkowo-mezenchymalne2.
Na złośliwe zachowanie raka kory nadnerczy (ACC) i innych nowotworów częściowo wpływa zdolność komórek nowotworowych do interakcji z otaczającymi powierzchniami, w tym z macierzą zewnątrzkomórkową, co z kolei ułatwia inwazję i migrację komórek nowotworowych3. Rola określonych rozszerzeń błon komórkowych w progresji raka jest coraz częściej wykazywana w różnych kontekstach, głównie poprzez tworzenie filopodiów. Na przykład stwierdzono, że nadekspresja kanałów wapniowych typu L indukuje powstawanie filopodiów i sprzyja inwazji komórek nowotworowych4. Podobnie, faszyna, białko wiążące aktynę, minimalnie wyrażane w normalnej tkance, jest również nadeksprymowane w komórkach rakowych w związku z tworzeniem filopodiów5. Tworzenie lobopodiów umożliwia niezłośliwym fibroblastom skuteczną migrację przez macierz zewnątrzkomórkową, jednak wykazano, że komórki włókniakomięsaka polegają na aktywności metaloproteinazy zamiast lobopodiów, aby ułatwić migrację i inwazję komórek6. Wykazaliśmy, że supresory nowotworów, w tym rodzina domen asocjacyjnych Ras 1 izoforma A (RASSF1A) i DKK3, mogą zmieniać elementy cytoszkieletu i promować tworzenie lamellipodiów oraz hamować właściwości inwazyjne7,8.
W związku z tym, kluczowe jest scharakteryzowanie efektów genów zaangażowanych w kancerogenezę i ich związku ze zmianami w rozszerzeniu błony komórkowej, szczególnie oceniając tworzenie filopodiów, lobopodiów i lamellipodiów w warunkach testowych. Obecne najnowocześniejsze techniki obejmują stosowanie coraz bardziej wyrafinowanych metod mikroskopowych, znakowania fluorescencyjnego i/lub złożonych algorytmów komputerowych do pozyskiwania i interpretacji danych. Chociaż metody te dostarczają nowych i potężnych narzędzi analitycznych, ich złożoność ogranicza ich powszechne zastosowanie i zdolność adaptacji w eksperymentach biologii komórki. Co więcej, dokładna kwantyfikacja i obserwacja zmian w morfologii wydłużenia komórki nie jest zwykle mierzona9,10. W przeciwieństwie do tego, wprowadzamy tutaj technikę, która dokładnie określa ilościowo zmiany w wydłużeniu komórek przy użyciu standardowych technik mikroskopowych i łatwo adaptowalnych metod in vitro. Metody te określają również ilościowo każdy typ rozszerzenia komórki jednocześnie dla każdej analizowanej komórki i określają ogólne zmiany w repertuarze wydłużania błony komórkowej. Pokazujemy również, w jaki sposób te zmiany mogą odnosić się do właściwości adhezji komórek.
Jako eksperymentalny przykład, użyjemy wcześniej utworzonej linii komórkowej SW-13, oznaczonej jako SW-DDK3, która została stabilnie transfekowana wektorami plazmidowymi pCMV6-Entry/DKK3 i konstytutywnie wykazuje nadekspresję DKK3, czynnika różnicującego w nadnerczach. Nietransfekowane komórki SW-13 i komórki SW-13 stabilnie transfekowane pustym wektorem (pCMV6-Entry), oznaczone SW-Neo, będą służyć jako eksperymentalne kontrole.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>ThermoFisher</td><td>11965-092</td><td>Uzupełniony płodową surowicą bydlęcą oraz penicyliną i streptomycyną</td></tr><tr><td>Roztwór soli fizjologicznej buforowanej fosforanem Deulbeco</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>1X, stosowany bezpośrednio</td></tr><tr><td>3,7% formaldehydu&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>Rozcieńczony roztwór podstawowy</td></tr><tr><td>0,05% fioletu krystalicznego&nbsp;</td><td>Harleco</td><td>192-12</td><td>Rozcieńczony roztwór podstawowy</td></tr><tr><td>Woda dejonizowana</td><td>NA</td><td></td><td>NA NA</td></tr><tr><td>Mikroskop z 400-krotnym powiększeniem&nbsp;</td><td>NA</td><td></td><td>NA</td></tr><tr><td>Płytki 6-dołkowe</td><td>Corning</td><td>353046</td><td>NA</td></tr><tr><td>Roztwór do dysocjacji komórek nieenzymatyczny 1X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5914&nbsp;</td><td>1X roztwór, stosowany bezpośrednio</td></tr></tbody></table>

charakterystyka rozszerzeń błon komórkowych i badanie ich roli w dynamice adhezji komórek nowotworowych

Characterization of Cell Membrane Extensions and Studying Their Roles in Cancer Cell Adhesion Dynamics

Repertuar przedłużania błony komórkowej moduluje różne złośliwe zachowania komórek nowotworowych, w tym ich adhezyjne i migracyjne potencjały. Zdolność do dokładnej klasyfikacji i ilościowego określenia wydłużenia komórek oraz pomiaru wpływu na zdolność adhezyjną komórki ma kluczowe znaczenie dla określenia, w jaki sposób zdarzenia sygnalizacji komórkowej wpływają na zachowanie i agresywność komórek nowotworowych. W tym miejscu opisujemy projekt in vitro i zastosowanie metody kwantyfikacji wydłużania komórek w połączeniu z testem zdolności adhezyjnej w ustalonym modelu in vitro raka kory nadnerczy (ACC). W szczególności testujemy wpływ DKK3, domniemanego supresora nowotworu i czynnika proróżnicującego, na fenotyp wydłużenia błony linii komórkowej ACC, SW-13. Proponujemy, aby testy te zapewniły stosunkowo proste, wiarygodne i łatwe do zinterpretowania wskaźniki do pomiaru tych cech w różnych warunkach eksperymentalnych.

Wykorzystując powyższe testy, in vitro zbadano wpływ nadekspresji DKK3 na morfologię wydłużenia komórek oraz właściwości adhezyjne komórek w ustalonej linii komórkowej ACC SW-13. Komórki z nadekspresją DKK3 wygenerowano poprzez stabilną transfekcję komórek SW-13 wektorami plazmidowymi pCMV6-Entry/DKK3 z tagiem Myc-DDK, które oznaczono jako SW-DKK3. Analogicznie, jako kontrolę transfekcji i pasażowania, stworzono komórki stabilnie transfekowane pustym wektorem pCMV6-Entry, zdefini...

To badanie pokazuje użyteczność i łatwość ilościowego pomiaru wydłużenia błony komórkowej oraz jego korelację ze zdolnością adhezyjną komórek. Jako reprezentatywny przykład pokazujemy tutaj, że białko 3 związane z Dickkopfem (DKK3) sprzyja zwiększonemu tworzeniu lobopodiów i adhezji komórek w komórkach raka kory nadnerczy in vitro.

Charakterystyka rozszerzeń błon komórkowych i badanie ich roli w dynamice adhezji komórek nowotworowych

The cell membrane&#39;s extension repertoire modulates various malignant behaviors of cancer cells, including their adhesive and migratory potentials. The ...

Ogólnym celem jest określenie wpływu zmian eksperymentalnych na repertuar wydłużania komórek i jego związek z funkcją adhezji komórek w raku. Metoda ta może pomóc w zidentyfikowaniu kluczowych ról repertuaru wydłużania błony komórkowej w modulowaniu zachowania komórek, takich jak adhezja komórek, ruchliwość i inwazja. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest stosunkowo prosta do wykonania i można ją łatwo dostosować do różnych warunków eksperymentalnych.Implikacje tej techniki rozciągają się na naszą terapię lub diagnostykę miejscowo zaawansowanych lub przerzutowych nowotworów, ponieważ pomaga ona dokładnie określić ilościowo zmiany w repertuarze rozszerzenia komórek związane ze zmianami w komórkach nowotworowych w zakresie adhezji i zdolności inwazyjnych. Może być również stosowany w innych systemach, takich jak regulacja kanałów jonowych, o których wiadomo, że odgrywają ważną rolę w tworzeniu przedłużenia komórek i prawidłowych procesach fizjologicznych. Wizualna demonstracja i rejestracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ liczenie etapów wydłużania komórek jest trudne do nauczenia ze względu na subtelności ich pojawiania się.Dzień przed obrazowaniem policz komórki SW 13, SW Neo i SW DKK3 wyhodowane w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięcioprocentowym dwutlenku węgla za pomocą hemocytometru. Umieść sterylne szklane szkiełka nakrywkowe w indywidualnych dołkach składających się z trzech sześciodołkowych płytek. Użyj oddzielnej płytki dla każdej linii komórkowej i umieść trzy linie komórkowe w gęstości 5 000 komórek na studzienkę na tych sześciu płytkach.Umieść komórki w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procentach dwutlenku węgla na noc. Następnego dnia z każdej studzienki odessać podłoże wzrostowe. Następnie umyj komórki w jednym mililitrze ciepłego PBS.Następnie dodaj jeden mililitr 3,7 procent formaldehydu do każdej studzienki, aby utrwalić komórki. Pozostaw komórki w utrwalaczu na 10 minut. Po zakończeniu utrwalania odessać formaldehyd.Dodaj jeden mililitr 0,05 procent fioletu krystalicznego do każdej studzienki, aby zabarwić komórki przez 30 minut. Następnie usuń nadmiar plamy, myjąc komórki jednym mililitrem wody dejonizowanej na studzienkę trzy razy. Następnie umieść kroplę przezroczystego odczynnika montażowego na oznaczonym szkiełku podstawowym.Następnie, za pomocą szczypiec z cienką końcówką, delikatnie wyjmij szkiełka nakrywkowe i połóż je stroną zadrukowaną do dołu na odczynnikach do montażu. Po zamontowaniu wszystkich poplamionych szkiełek nakrywkowych na szkiełkach podstawowych, pod mikroskopem świetlnym wybierz 20 losowych widoków nienakładających się komórek z każdego szkiełka nakrywkowego. Zrób mikrofotografie o powiększeniu 400 dla każdego pola widzenia.Następnie obserwuj i policz liczbę typów rozszerzeń w każdej z 20 reprezentatywnych komórek. Skorzystaj z definicji i protokołu tekstowego, aby pokierować klasyfikacją przedłużenia błony jako filopodia, lobopodia lub lamellipodia. Podczas pierwszego zliczania typów rozszerzeń komórek pomocne może być zachowanie obrazu referencyjnego dostępnego do przeglądu.Jeśli to możliwe, liczenie w sposób zaślepiony w odniesieniu do ich próbek eksperymentalnych zapewni dodatkowy obiektywizm. Określ średnią liczbę rozszerzeń każdego typu na komórkę w każdej z trzech badanych linii komórkowych. Użyj jednokierunkowej anovy do przetestowania różnicy w średnim procencie rozszerzeń błony komórkowej między różnymi typami komórek, która jest statystycznie istotna.Dzień przed badaniem, za pomocą hemocytometru, należy policzyć komórki SW 13, SW Neo i SW DKK3. Umieść te komórki w gęstości 100 000 komórek na studzienkę na sześciu płytkach dołkowych, używając jednej płytki dla każdego z sześciu wyznaczonych punktów czasowych, które będą badane. Umieść komórki w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procentach dwutlenku węgla na noc.Następnego dnia wyjąć płytkę z inkubatora i raz umyć komórki ciepłym PBS. Następnie dodaj 0,5 mililitra nieenzymatycznego roztworu do dysocjacji komórek o pojedynczej mocy do każdej studzienki. Delikatnie obracaj płytki, aby równomiernie rozprowadzić dodany roztwór.Inkubować płytki z roztworem przez określony czas. Zassać wyznaczoną płytkę na końcu każdego punktu czasowego. Wkrótce po każdej aspiracji umyj komórki jednym mililitrem ciepłego PBS.Następnie delikatnie postukaj w płytkę, aby odczepić luźno przymocowane komórki. Powtórz pranie wraz z przerywanym stukaniem jeszcze dwa razy. Na koniec odessaj pozostały PBS i utrwal komórki, które pozostały na płytce, jednym mililitrem 3,7 procent formaldehydu.Po zakończeniu utrwalania odessać formaldehyd. Następnie dodaj jeden mililitr 0,05 procent fioletu krystalicznego do każdej studzienki, aby zabarwić komórki. Po zakończeniu barwienia usuń nadmiar plamy, myjąc komórki trzykrotnie jednym mililitrem wody dejonizowanej na studzienkę.Używając mikroskopu świetlnego przy powiększeniu 100, policz pozostałe dołączone komórki w każdym dołku dla każdej płytki. Następnie określ procent komórek, które pozostały odłączone w różnych punktach czasowych dla trzech testowanych linii komórkowych. Korzystając z dwukierunkowej analizy, test różnic i szybkości odklejania komórek między trzema liniami komórkowymi jest statystycznie istotny.Komórki kontrolne SW 13 i SW Neo barwione fioletem krystalicznym tworzyły głównie filopodia i lamellipodia. W przeciwieństwie do tego, komórki eksprymujące DKK3 tworzyły więcej lobopodiów z prawie całkowitym brakiem lamellipodiów i bardzo małą liczbą filopodiów. Należy również zwrócić uwagę na różnice w polaryzacji między komórkami eksprymującymi DKK3 a liniami komórek kontrolnych.Wykres przedstawia proporcję różnych rozszerzeń komórek w trzech badanych liniach komórkowych. Należy zauważyć znacznie wyższy odsetek lobopodiów w komórkach eksprymujących DKK3. Wykresy liniowe pokazują procent komórek, które pozostały przyczepione do płytki po potraktowaniu roztworem dysocjacyjnym dla punktów czasowych wskazanych na osi X.We wszystkich punktach czasowych do 10 minut komórki wykazujące ekspresję DKK3 wykazywały znacznie wyższą siłę przyłączania komórek w porównaniu z komórkami kontrolnymi. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu jednego do dwóch dni, w zależności od konfiguracji eksperymentalnej, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o ocenie, w jaki sposób zmiany w morfologii wydłużenia komórek wpływają na zdolność adhezyjną.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak dokładnie określić ilościowo rozszerzenia komórek w odniesieniu do zmian w charakterystyce adhezji komórek rakowych. Powodzenia i dziękuję za oglądanie.

characterization-cell-membrane-extensions-studying-their-roles-cancer

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Niniejszy artykuł opisuje technikę in vitro służącą do monitorowania naciekania komórek nowotworowych przez monowarstwę komórek śródbłonka. Dane są pozyskiwane w czasie rzeczywistym jako funkcja zmian impedancji na powierzchni elektrod znajdujących się na dnie studzienki.

Technika oparta na pomiarze impedancji elektrycznej w czasie rzeczywistym do pomiaru inwazji monowarstwy komórek śródbłonka przez komórki nowotworowe

Opisano metodę przygotowania trójwymiarowej macierzy składającej się z kolagenu typu I oraz pierwotnych ludzkich fibroblastów. Ten żel organotypowy służy jako przydatny substrat do oceny inwazyjnej migracji komórek, ponieważ naśladuje podstawowe cechy stromy tkanki i nadaje się do wielu form mikroskopii.

Organotypowy test z kolagenem typu I: elastyczna platforma do oceny zachowania komórek w kontekście trójwymiarowym

Modele inwazji komórek nowotworowych do trójwymiarowej macierzy zewnątrzkomórkowej lepiej odzwierciedlają sytuację in vivo niż dwuwymiarowe testy motylości. Dzięki zastosowaniu testów inwazji do macierzy w połączeniu z obrazowaniem konfokalnym komórek znakowanych fluorescencyjnie można uzyskać szczegółowe informacje na temat trybów inwazji oraz odrębnego wkładu komórek prowadzących i podążających.

Modelowanie i obrazowanie trójwymiarowej zbiorowej inwazji komórek

Ten film opisuje technikę badania cytoszkieletu i ogniskowych zrostów w pierwotnych komórkach ludzkiego raka jelita grubego, aby zrozumieć jego zmiany w zależności od sztywności podłoża. Ta hodowla komórek rakowych na miękkich i twardych podłożach umożliwia różne dalsze pomiary biofizyczne w celu prognozowania raka.

Test organizacji cytoszkieletu i adhezji ogniskowej: metoda oparta na immunofluorescencji do badania adhezji komórek i rozprzestrzeniania się na podłożach

Ten artykuł przedstawia metodę fluorescencyjnego znakowania kolagenu, która może być dalej wykorzystywana zarówno do obrazowania na żywo, jak i do obrazowania na żywo kultur komórkowych 3D. Zapewniamy również zoptymalizowany protokół wizualizacji endogennych białek cytoszkieletu komórek hodowanych w środowiskach 3D.

Odkrywanie organizacji cytoszkieletu inwazyjnych komórek nowotworowych w 3D

Procesy rządzące inwazją raka pęcherza moczowego stanowią okazję do rozwoju biomarkerów i terapii. Poniżej przedstawiamy model inwazji raka pęcherza moczowego, który obejmuje hodowlę 3D sferoid guza, obrazowanie poklatkowe i mikroskopię konfokalną. Technika ta jest przydatna do definiowania cech procesu inwazyjnego oraz do badań przesiewowych środków terapeutycznych.

System hodowli komórkowych 3D do badania inwazji i oceny terapii w raku pęcherza moczowego

Ta metoda jest przydatna do ilościowego określania wczesnej dynamiki adhezji komórkowej i rozprzestrzeniania się komórek zależnych od zakotwiczenia na fibronektynie. Ponadto test ten może być wykorzystany do zbadania wpływu zmienionej homeostazy redoks na rozprzestrzenianie się komórek i/lub wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe związane z adhezją komórek.

Badanie dynamiki adhezji komórkowej i rozprzestrzeniania się komórek nabłonka na fibronektynie podczas stresu oksydacyjnego

Artykuł opisuje ilościowe określenie 1) wielkości i liczby zrostów ogniskowych oraz 2) wskaźnika kształtu komórki i jego rozkładu na podstawie obrazów konfokalnych zlewających się monowarstw komórek MCF7.

Kwantyfikacja obszaru adhezji komórka-substrat i rozkładu kształtu komórki w monowarstwach komórek MCF7

W tym protokole prezentujemy eksperymentalne procedury testu rozprzestrzeniania się komórek, który opiera się na mikroskopii żywych komórek. Dostarczamy narzędzie obliczeniowe typu open source do bezstronnej segmentacji komórek znakowanych fluorescencyjnie i ilościowej analizy dynamiki lamellipodiów podczas rozprzestrzeniania się komórek.

Analiza ilościowa dynamiki krawędzi komórek podczas rozprzestrzeniania się komórek

Ten protokół przedstawia eksperymentalne procedury przeprowadzania testu śladu adhezyjnego w celu zobrazowania zdarzeń adhezji podczas szybkiej adhezji toczenia komórek.

Obrazowanie adhezji molekularnej w walcowaniu komórek za pomocą testu śladu adhezyjnego

Ten protokół ma na celu zmierzenie parametrów dynamicznych (wypukłości, retrakcje, falbany) wypukłości na krawędzi komórek rozsiewających.

Pomiar dynamiki wypukłości krawędzi komórki podczas rozprzestrzeniania się za pomocą mikroskopii żywych komórek

Poznaj metodę ilościowej analizy rozszerzeń błon komórkowych i ich wpływu na adhezję w komórkach nowotworowych. Badanie wykorzystuje komórki raka kory nadnerczy do oceny roli białka DKK3 w formowaniu lobopodiów.

Charakterystyka rozszerzeń błon komórkowych i badanie ich roli w dynamice adhezji komórek nowotworowych

Przeglądaj więcej filmów