Charakterystyka rozszerzeń błon komórkowych i badanie ich roli w dynamice adhezji komórek nowotworowych
26 marca 2018
To badanie pokazuje użyteczność i łatwość ilościowego pomiaru wydłużenia błony komórkowej oraz jego korelację ze zdolnością adhezyjną komórek. Jako reprezentatywny przykład pokazujemy tutaj, że białko 3 związane z Dickkopfem (DKK3) sprzyja zwiększonemu tworzeniu lobopodiów i adhezji komórek w komórkach raka kory nadnerczy in vitro.
Ogólnym celem jest określenie wpływu zmian eksperymentalnych na repertuar wydłużania komórek i jego związek z funkcją adhezji komórek w raku. Metoda ta może pomóc w zidentyfikowaniu kluczowych ról repertuaru wydłużania błony komórkowej w modulowaniu zachowania komórek, takich jak adhezja komórek, ruchliwość i inwazja. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest stosunkowo prosta do wykonania i można ją łatwo dostosować do różnych warunków eksperymentalnych.
Implikacje tej techniki rozciągają się na naszą terapię lub diagnostykę miejscowo zaawansowanych lub przerzutowych nowotworów, ponieważ pomaga ona dokładnie określić ilościowo zmiany w repertuarze rozszerzenia komórek związane ze zmianami w komórkach nowotworowych w zakresie adhezji i zdolności inwazyjnych. Może być również stosowany w innych systemach, takich jak regulacja kanałów jonowych, o których wiadomo, że odgrywają ważną rolę w tworzeniu przedłużenia komórek i prawidłowych procesach fizjologicznych. Wizualna demonstracja i rejestracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ liczenie etapów wydłużania komórek jest trudne do nauczenia ze względu na subtelności ich pojawiania się.
Dzień przed obrazowaniem policz komórki SW 13, SW Neo i SW DKK3 wyhodowane w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięcioprocentowym dwutlenku węgla za pomocą hemocytometru. Umieść sterylne szklane szkiełka nakrywkowe w indywidualnych dołkach składających się z trzech sześciodołkowych płytek. Użyj oddzielnej płytki dla każdej linii komórkowej i umieść trzy linie komórkowe w gęstości 5 000 komórek na studzienkę na tych sześciu płytkach.
Umieść komórki w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procentach dwutlenku węgla na noc. Następnego dnia z każdej studzienki odessać podłoże wzrostowe. Następnie umyj komórki w jednym mililitrze ciepłego PBS.
Następnie dodaj jeden mililitr 3,7 procent formaldehydu do każdej studzienki, aby utrwalić komórki. Pozostaw komórki w utrwalaczu na 10 minut. Po zakończeniu utrwalania odessać formaldehyd.
Dodaj jeden mililitr 0,05 procent fioletu krystalicznego do każdej studzienki, aby zabarwić komórki przez 30 minut. Następnie usuń nadmiar plamy, myjąc komórki jednym mililitrem wody dejonizowanej na studzienkę trzy razy. Następnie umieść kroplę przezroczystego odczynnika montażowego na oznaczonym szkiełku podstawowym.
Następnie, za pomocą szczypiec z cienką końcówką, delikatnie wyjmij szkiełka nakrywkowe i połóż je stroną zadrukowaną do dołu na odczynnikach do montażu. Po zamontowaniu wszystkich poplamionych szkiełek nakrywkowych na szkiełkach podstawowych, pod mikroskopem świetlnym wybierz 20 losowych widoków nienakładających się komórek z każdego szkiełka nakrywkowego. Zrób mikrofotografie o powiększeniu 400 dla każdego pola widzenia.
Następnie obserwuj i policz liczbę typów rozszerzeń w każdej z 20 reprezentatywnych komórek. Skorzystaj z definicji i protokołu tekstowego, aby pokierować klasyfikacją przedłużenia błony jako filopodia, lobopodia lub lamellipodia. Podczas pierwszego zliczania typów rozszerzeń komórek pomocne może być zachowanie obrazu referencyjnego dostępnego do przeglądu.
Jeśli to możliwe, liczenie w sposób zaślepiony w odniesieniu do ich próbek eksperymentalnych zapewni dodatkowy obiektywizm. Określ średnią liczbę rozszerzeń każdego typu na komórkę w każdej z trzech badanych linii komórkowych. Użyj jednokierunkowej anovy do przetestowania różnicy w średnim procencie rozszerzeń błony komórkowej między różnymi typami komórek, która jest statystycznie istotna.
Dzień przed badaniem, za pomocą hemocytometru, należy policzyć komórki SW 13, SW Neo i SW DKK3. Umieść te komórki w gęstości 100 000 komórek na studzienkę na sześciu płytkach dołkowych, używając jednej płytki dla każdego z sześciu wyznaczonych punktów czasowych, które będą badane. Umieść komórki w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procentach dwutlenku węgla na noc.
Następnego dnia wyjąć płytkę z inkubatora i raz umyć komórki ciepłym PBS. Następnie dodaj 0,5 mililitra nieenzymatycznego roztworu do dysocjacji komórek o pojedynczej mocy do każdej studzienki. Delikatnie obracaj płytki, aby równomiernie rozprowadzić dodany roztwór.
Inkubować płytki z roztworem przez określony czas. Zassać wyznaczoną płytkę na końcu każdego punktu czasowego. Wkrótce po każdej aspiracji umyj komórki jednym mililitrem ciepłego PBS.
Następnie delikatnie postukaj w płytkę, aby odczepić luźno przymocowane komórki. Powtórz pranie wraz z przerywanym stukaniem jeszcze dwa razy. Na koniec odessaj pozostały PBS i utrwal komórki, które pozostały na płytce, jednym mililitrem 3,7 procent formaldehydu.
Po zakończeniu utrwalania odessać formaldehyd. Następnie dodaj jeden mililitr 0,05 procent fioletu krystalicznego do każdej studzienki, aby zabarwić komórki. Po zakończeniu barwienia usuń nadmiar plamy, myjąc komórki trzykrotnie jednym mililitrem wody dejonizowanej na studzienkę.
Używając mikroskopu świetlnego przy powiększeniu 100, policz pozostałe dołączone komórki w każdym dołku dla każdej płytki. Następnie określ procent komórek, które pozostały odłączone w różnych punktach czasowych dla trzech testowanych linii komórkowych. Korzystając z dwukierunkowej analizy, test różnic i szybkości odklejania komórek między trzema liniami komórkowymi jest statystycznie istotny.
Komórki kontrolne SW 13 i SW Neo barwione fioletem krystalicznym tworzyły głównie filopodia i lamellipodia. W przeciwieństwie do tego, komórki eksprymujące DKK3 tworzyły więcej lobopodiów z prawie całkowitym brakiem lamellipodiów i bardzo małą liczbą filopodiów. Należy również zwrócić uwagę na różnice w polaryzacji między komórkami eksprymującymi DKK3 a liniami komórek kontrolnych.
Wykres przedstawia proporcję różnych rozszerzeń komórek w trzech badanych liniach komórkowych. Należy zauważyć znacznie wyższy odsetek lobopodiów w komórkach eksprymujących DKK3. Wykresy liniowe pokazują procent komórek, które pozostały przyczepione do płytki po potraktowaniu roztworem dysocjacyjnym dla punktów czasowych wskazanych na osi X.
We wszystkich punktach czasowych do 10 minut komórki wykazujące ekspresję DKK3 wykazywały znacznie wyższą siłę przyłączania komórek w porównaniu z komórkami kontrolnymi. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu jednego do dwóch dni, w zależności od konfiguracji eksperymentalnej, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o ocenie, w jaki sposób zmiany w morfologii wydłużenia komórek wpływają na zdolność adhezyjną.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak dokładnie określić ilościowo rozszerzenia komórek w odniesieniu do zmian w charakterystyce adhezji komórek rakowych. Powodzenia i dziękuję za oglądanie.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje związek między wypustkami błony komórkowej a adhezją komórek w komórkach nowotworowych. W szczególności wykazano, w jaki sposób białko Dickkopf-related protein 3 (DKK3) zwiększa tworzenie lobopodiów oraz przyległość komórek w liniach komórkowych raka kory nadnerczy in vitro.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Badania nad rakiem
- Mechanizmy adhezji komórkowej
Wstęp
- Wypustki błony komórkowej odgrywają kluczową rolę w zachowaniu komórek.
- Zrozumienie natury tych wypustek może dostarczyć wiedzy na temat ruchliwości i inwazyjności komórek nowotworowych.
- Techniki pomiarów ilościowych są niezbędne do badania zachowania komórek.
- Znane jest, że DKK3 wpływa na właściwości adhezyjne komórek.
Cel badania
- Ocena wpływu wypustek błony komórkowej na adhezję w komórkach nowotworowych.
- Ocena roli DKK3 w promowaniu tworzenia lobopodiów.
- Opracowanie metody ilościowego pomiaru wypustek komórkowych i adhezji.
Zastosowane metody
- Ilościowy pomiar wypustek błony komórkowej.
- Eksperymenty in vitro z wykorzystaniem komórek raka kory nadnerczy.
- Analiza korelacji między tworzeniem się lobopodiów a adhezją komórek.
- Demonstracje wizualne wspomagające zrozumienie techniki pomiarowej.
Główne wyniki
- DKK3 znacząco zwiększa tworzenie lobopodiów w komórkach nowotworowych.
- Wraz ze zwiększeniem liczby wypustek błonowych zaobserwowano wzrost adhezji komórkowej.
- Opracowana metoda jest prosta i możliwa do dostosowania do różnych warunków eksperymentalnych.
- Analiza ilościowa pomaga w zrozumieniu zachowania komórek nowotworowych.
Wnioski
- Wypustki błony komórkowej mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia zachowania komórek nowotworowych.
- DKK3 odgrywa istotną rolę w promowaniu adhezji komórkowej poprzez lobopodia.
- Tę technikę można zastosować w innych obszarach badawczych, w tym w regulacji kanałów jonowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia badaczom z obszaru biofarmacji ilościowe powiązanie fenotypów wydłużenia błony komórkowej komórek nowotworowych z funkcjonalnymi efektami adhezji, zapewniając mechanistyczny odczyt do walidacji celów w procesie odkrywania leków onkologicznych. Poprzez korelację powstawania lobopodiów ze zwiększoną siłą przylegania komórek, test ten zwiększa pewność prognostyczną przy ocenie modulatorów zachowania komórek, takich jak DKK3 lub powiązane szlaki sygnałowe. Podejście to oferuje skalowalną i powtarzalną platformę do ograniczania ryzyka związanego z wczesnymi hipotezami dotyczącymi mechanizmów przerzutowania i inwazji.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezy terapeutyczne poprzez ilościowe określenie, w jaki sposób specyficzne zmiany molekularne wpływają na repertuar wysunięć błonowych związanych z adhezją i ruchliwością komórek rakowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ślepy, obiektywny system klasyfikacji filopodiów, lobopodiów i lamelipodiów, aby zredukować błąd obserwatora w przesiewowych badaniach fenotypowych.
- Wartość prognostyczna: Umożliwia mechanistyczną minimalizację ryzyka poprzez powiązanie fenotypów wysunięć z funkcjonalnymi testami adhezji, co wspiera decyzje typu go/no-go w priorytetyzacji celów terapeutycznych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Generuje zestandaryzowane, ilościowe wyniki (liczba typów wypustek i procenty adhezji) odpowiednie dla przepływów pracy w wysokoprzepustowym przesiewaniu wysokotreściowym (high-content screening).
- Powtarzalność: Wykorzystuje określone protokoły utrwalania, barwienia i obrazowania, aby zapewnić spójne wyniki w różnych warunkach eksperymentalnych i punktach czasowych.
- Użyteczność platformy: Możliwość adaptacji do różnych modeli nowotworowych i czynników zaburzających, co umożliwia ponowne wykorzystanie w projektach badawczych ukierunkowanych na szlaki adhezji lub motywności komórek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Bezpośrednio modeluje zdolności adhezyjne i inwazyjne w ugruntowanym systemie in vitro dla raka nadnerczy, który jest istotnym klinicznie typem nowotworu.
- Ciągłość translacyjna: Łączy zaburzenia molekularne (np. ekspresję DKK3) ze zmianami fenotypowymi w zakresie wypustek błonowych i funkcjonalnej adhezji, co wspiera walidację celów zgodnych z biomarkerami.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera podejmowanie decyzji przedklinicznych, dostarczając statystycznie istotnych, ilościowych mierników (poprzez jednoczynnikową i dwuczynnikową analizę ANOVA) w odniesieniu do proporcji wypustek i szybkości odrywania.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w proces wczesnego odkrywania leków, wspierając walidację celu poprzez screening fenotypowy oraz umożliwiając badania translacyjne w modelach przedklinicznych dzięki powiązaniu efektorów molekularnych z zachowaniami związanymi z adhezją.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez kwantyfikację tego, w jaki sposób zmiany eksperymentalne (np. nadekspresja DKK3) zmieniają fenotypy wysunięć błonowych i korelują ze zmianami w adhezji funkcjonalnej.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowych do analizy, ilościowych wyników dotyczących typów wysunięć i siły przyczepności komórek, co umożliwia wiarygodną ocenę związków lub perturbacji genetycznych.
- Analityka: Wykorzystuje testy statystyczne (jednoczynnikową analizę wariancji ANOVA dla proporcji wysunięć, dwuczynnikową analizę wariancji ANOVA dla szybkości odrywania), aby określić istotne różnice między warunkami, pomagając w analizie porównawczej.
- Badania translacyjne: Łączy mechanizmy molekularne z wynikami fenotypowymi w systemie istotnym dla przebiegu choroby, zapewniając ciągłość od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Zaprojektowane jako prosta, adaptowalna technika możliwa do zastosowania w wielu liniach komórkowych i układach eksperymentalnych, co sprzyja standaryzacji i użyteczności w różnych projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną walidacji celu poprzez mechanistyczne powiązanie fenotypów rozszerzenia błony z funkcją adhezji komórek rakowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki ślepym próbom liczenia, zdefiniowanym protokołom barwienia oraz walidacji statystycznej.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji go/no-go poprzez redukcję niejednoznaczności biologicznej w wczesnej fazie oceny celu, co zwiększa efektywność kapitałową.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o ilościowe, powtarzalne dane łączące efektory molekularne z zachowaniami złośliwymi związanymi z adhezją.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w hodowli komórkowej, mikroskopii oraz klasyfikacji morfologicznej wypustek błonowych.
- Zależność od mikroskopii świetlnej i sprzętu do rejestracji obrazu w celu wizualizacji przy powiększeniu 400x oraz oceny adhezji przy 100x.
- Konieczność standaryzacji w zespołach badawczych w celu przeprowadzenia ślepego liczenia oraz spójnego stosowania definicji wypustek (filopodia, lobopodia, lamellipodia).
- Rozważania dotyczące adaptacji obejmują różne linie komórkowe, czasy inkubacji oraz stężenia roztworów dysocjujących, przy jednoczesnym zachowaniu integralności protokołu.
- Ograniczenia praktyczne obejmują subiektywizm w klasyfikacji wypustek bez odpowiedniego przeszkolenia i obrazowania referencyjnego, zgodnie z materiałami źródłowymi.
