Wizualna detekcja wielu kwasów nukleinowych w układzie kapilarnym
November 15th, 2017
Ten protokół opisuje produkcję małej, gotowej do użycia kasety, która może być zastosowana do wizualnego wykrywania wielu kwasów nukleinowych w jednym, łatwym w obsłudze teście. W tym podejściu wykorzystano matrycę kapilarną do multipleksu i wysoce skutecznego wykrywania celów GMO.
Ogólnym celem tej procedury jest wyprodukowanie małej, gotowej do użycia kasety, która może być stosowana do wizualnego wykrywania wielu kwasów nukleinowych w jednym, łatwym w obsłudze teście. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie wykrywania multipleksów kwasów nukleinowych, takie jak organizmy modyfikowane genetycznie lub wykrywanie GMO. Aby oczyścić naczynia włosowate, załóż strój laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice chroniące przed chemikaliami.
Umieść naczynia włosowate w zlewce. Oczyść naczynia włosowate 30 mililitrami acetonu przez pięć minut, aby usunąć materię organiczną. A następnie umyj naczynia włosowate wodą dejonizowaną.
Następnie przygotuj roztwór piranii, wlewając do zlewki około dziesięciu mililitrów nadtlenku wodoru. Następnie dodaj 30 mililitrów kwasu siarkowego do nadtlenku wodoru, powoli wstrząsając, aby zapobiec przegrzaniu. Upewnij się, że roztwór całkowicie zakrywa naczynia włosowate przez co najmniej 30 minut.
Następnie zmyj roztwór piranii dużą ilością wody. Umyj naczynia włosowate etanolem i wodą dejonizowaną przez pięć minut każdy. Wysuszyć naczynia włosowate w suszarce.
Następnie zważ odczynniki bazowe PDMS i przekładniowe w stosunku jeden do jednego w 50-mililitrowej probówce. Zazwyczaj miesza się pięć gramów bazy elastomerowej z pięcioma gramami utwardzacza elastomerowego. Dokładnie mieszaj mieszaninę przez około pięć minut za pomocą szklanej pałeczki.
Umieść zlewkę z PDMS w próżniowym słoiku dzwonowym na trzydzieści minut w celu odgazowania. Następnie powoli wlej PDMS do cylindra formy ze stali nierdzewnej. Pozostaw PDMS do utwardzenia przez trzy godziny w suszarce w temperaturze 60 stopni Celsjusza.
Po utwardzeniu PDMS usuń formę, wyciągając formę za pomocą cylindra. Wyjmij PDMS z cylindra, przecinając margines formy skalpelem. Umyj PDMS trzykrotnie etanolem i wodą dejonizowaną.
Następnie wysuszyć podporę PDMS azotem. Potraktuj dolną powierzchnię podpory PDMS jako hydrofobową, mocząc podporę PDMS w super hydrofobowej powłoce na jedną sekundę. Następnie susz przez dziesięć minut w temperaturze pokojowej.
Następnie włóż oczyszczone czteromilimetrowe kapilary do otworów wspornika PDMS, pozostawiając punkt zerowy pięć milimetrów kapilar poza górną powierzchnią wspornika PDMS. Upewnij się, że końce naczyń włosowatych znajdują się na tym samym poziomie. Aby potraktować zewnętrzną powierzchnię kapilar i górną powierzchnię podpory PDMS jako hydrofobową, dodaj 15 mikrolitrów super hydrofobowej powłoki na wierzch powierzchni podpory PDMS.
Wysuszyć na powietrzu super hydrofobowy zmodyfikowany układ kapilarny. Następnie dodaj jeden punkt sześć mikrolitrów mieszaniny utrwalającej podkład z jednego zestawu podkładów, aby wypełnić jedną odpowiednią kapilarnę układu kapilarnego zgodnie z wcześniej zaprojektowaną kolejnością. Zakotwiczyć tablicę w przezroczystej studzience na standardowej 96-dołkowej płytce z płaskim dnem i suszyć tablicę w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez co najmniej dwie godziny.
Aby zmontować kasetę, umieść adapter ładujący na górze zakotwiczonej tablicy. Upewnij się, że miska adaptera zakrywa tylko odsłonięte części wszystkich dziesięciu naczyń włosowatych. Aby przygotować mieszaninę reakcyjną LAMP, dodaj odczynniki do mieszaniny zgodnie z protokołem tekstowym i wiruj mieszaninę reakcyjną przez pięć sekund po dodaniu kalcyny.
Delikatnie odwróć probówkę dwadzieścia razy po dodaniu polimerazy Bst. Śladowe ilości DNA, które istnieją w środowisku, można wyeliminować, czyszcząc je wcześniej jednym molem na litr kwasu solnego przed przekazaniem mieszanki LAMP. Zassać 20 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej LAMP za pomocą standardowej końcówki o pojemności 100 mikrolitrów.
Włóż końcówkę do wlotu adaptera ładowania, aby ją zablokować. Delikatnie wstrzyknąć mieszaninę reakcyjną do naczynia adaptera. Mieszanina reakcyjna szybko wypełni naczynie, a następnie automatycznie załaduje naczynia włosowate za pomocą siły kapilarnej.
Wyjmij adapter z końcówką zamka i uszczelnij studzienkę przezroczystą folią uszczelniającą kompatybilną z PCR. Następnie inkubuj układ kapilarny w inkubatorze w temperaturze 63 stopni Celsjusza przez godzinę. Aby uzyskać obrazy emisji fluorescencji, użyj latarki UV, aby wzbudzić zdysocjowaną kalcynację do wyemitowania fluorescencji.
Przechwytuj obrazy z górnej części układu kapilarnego za pomocą aparatu cyfrowego lub smartfona. Podczas robienia zdjęcia upewnij się, że aparat jest maksymalnie przybliżony na obszar naczyń włosowatych, aby uzyskać wysokiej jakości, wyraźne obrazy. Następnie otwórz obraz za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.
A następnie wybierz obraz, pleśń, skalę szarości, tak i obraz, pleśń, 16-bitowy, tak. Wybierz plik, zapisz jako, format, TIFF, aby przekonwertować obraz na 16-bitowy format TIFF. Aby wyodrębnić wartość intensywności fluorescencji, otwórz oprogramowanie do analizy mikromacierzy.
Przeciągnij 16-bitowy obraz w formacie TIFF do interfejsu oprogramowania, a następnie wybierz długość fali 532 nanometry i kolor zielony, aby wyświetlić obraz. Następnie utwórz nowy blok, aby zlokalizować sygnał fluorescencyjny z naczyń włosowatych. Wybierz narzędzia, nowe bloki, a następnie umieść liczbę kolumn i wierszy jako jeden do jednego i dwa do pięciu w interfejsach bloków i funkcji osobno.
Kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz model obiektów. Następnie dostosuj położenie i średnicę, aby pasowały do obszaru fluorescencji naczyń włosowatych. Wybierz opcję Analizuj, aby wyodrębnić wartość intensywności fluorescencji.
Na koniec wybierz plik, zapisz ustawienia jako, aby zapisać dokumenty bloku. Następnie wybierz, zarchiwizuj, zapisz wyniki, aby zapisać wyniki intensywności fluorescencji. Poniżej przedstawiono układ układu kapilarnego.
Kapilary od pierwszej do ósmej, poprzedzone zestawami starterów LAMP. Kapilary dziewiąte i dziesiąte reprezentują dwa, brak kontroli startera. Pokazane tutaj jest zdjęcie fluorescencyjne do wykrywania genetycznie zmodyfikowanej kukurydzy, MON863, gdzie zielony kolor reprezentuje dodatnie wzmocnienie LAMP.
Udana amplifikacja, przedstawiona tylko w oczekiwanych naczyniach włosowatych pierwszej, szóstej, siódmej i ósmej, bez zanieczyszczenia wśród ślepych naczyń włosowatych. To fluorescencyjne zdjęcie służy do wykrywania mieszanki GMO. Kolor zielony oznaczał dodatnie wzmocnienie LAMP.
Udana amplifikacja wykazała się tylko w oczekiwanych naczyniach włosowatych jeden, czwarty, piąty, szósty, siódmy i ósmy bez zanieczyszczenia wśród ślepych naczyń włosowatych. Pokazane tutaj zdjęcie fluorescencyjne służy do wykrywania kukurydzy niemodyfikowanej genetycznie, z zielonym kolorem prezentującym dodatnie wzmocnienie LAMP. Udana amplifikacja wykazała się tylko w oczekiwanej ósemce kapilary i bez zanieczyszczenia wśród ślepych naczyń włosowatych.
Po opanowaniu tej procedury wykrywania można ją wykonać w ciągu pięciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wytworzyć kasetę kapilarną w celu wykrywania wielu kwasów nukleinowych.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje wytwarzanie małej, gotowej do użycia kasetki do wizualnego wykrywania wielu kwasów nukleinowych w jednym, łatwym do obsługi teście. Ta metoda jest szczególnie przydatna do wykrywania genetycznie zmodyfikowanych organizmów (GMO) za pomocą układu kapiilarnego do wielokrotnego wykrywania.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Biotechnologia
- Biologia molekularna
- Inżynieria genetyczna
Tło
- Wykrywanie wielu kwasów nukleinowych jest kluczowe w różnych dziedzinach.
- Genetycznie zmodyfikowane organizmy (GMO) stanowią znaczące wyzwania w zakresie bezpieczeństwa żywności.
- Potrzebne są efektywne metody wykrywania do szybkich analiz.
- Układy kapiilarne mogą poprawić możliwości wielokrotnego wykrywania.
Cel badania
- Opracowanie przyjaznej dla użytkownika kasetki do wykrywania kwasów nukleinowych.
- Poprawa efektywności wykrywania GMO.
- Ułatwienie badań nad wielokrotnym wykrywaniem kwasów nukleinowych.
Stosowane metody
- Wytwarzanie małej kasetki do wykrywania kwasów nukleinowych.
- Użycie układów kapiilarnych do wielokrotnego wykrywania.
- Czyszczenie kapiilar acetonem i wodą dejonizowaną.
- Metodach wizualnego wykrywania dla łatwości użytkowania.
Główne wyniki
- Kaseta pozwala na jednoczesne wykrywanie wielu kwasów nukleinowych.
- Układy kapiilarne poprawiają efektywność procesu wykrywania.
- Metoda jest prosta i przyjazna dla użytkownika.
- Potencjalne zastosowania w wykrywaniu GMO i innych dziedzinach.
Wnioski
- Ten protokół zapewnia nowatorskie podejście do wykrywania kwasów nukleinowych.
- Opracowany zestaw jest skuteczny do wielokrotnego testowania.
- Przyszłymi badaniami można rozszerzyć jego zastosowania w biotechnologii.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This platform enables multiplex nucleic acid detection in a single cassette, supporting high-throughput screening needs in GMO testing and microbial monitoring. By combining capillary array technology with LAMP amplification, it reduces assay complexity and resource requirements while maintaining specificity and sensitivity. The visual readout via UV illumination allows rapid, instrument-free results, aligning with decentralized testing demands in biopharma and agricultural biotechnology workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables simultaneous interrogation of multiple genetic targets for hypothesis testing in pathway analysis.
- Operational Value: Reduces reagent consumption and hands-on time through capillary-force-driven sample loading.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides standardized, isolated reaction chambers for reproducible amplification across targets.
- Operational Value: Supports parallel processing of up to eight assays with internal controls for assay validation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates detection of genetically modified elements in complex matrices, supporting GMO safety assessment.
- Operational Value: Enables field-deployable testing with minimal equipment, suitable for process monitoring in biomanufacturing.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to preclinical workflows where rapid nucleic acid profiling informs target selection and assay readiness.
- Discovery Biology: Allows parallel testing of gene variants or constructs to clarify functional roles in biological pathways.
- Screening: Generates quantitative fluorescence intensity data for hit confirmation and cross-capillary comparison.
- Analytics: Outputs enable signal threshold setting and contamination assessment via blank capillary controls.
- Translational Research: Supports continuity from target identification to preclinical validation through consistent nucleic acid readouts.
- Enterprise Reuse: Cassette design allows reuse across multiple nucleic acid panels with reconfiguration of primer sets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in multiplex assays by minimizing cross-talk and false positives.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized capillary preparation and isolated reaction volumes.
- Strategic Value: Reduces time-to-result for critical decision points in GMO detection and microbial monitoring.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on simultaneous multi-parameter readouts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surface treatment and capillary array assembly for hydrophobic/hydrophilic patterning.
- Depends on access to vacuum degassing and thermal curing equipment for PDMS microfluidic fabrication.
- Necessitates standardization of primer fixation protocols across capillary arrays for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when extending beyond eight targets due to capillary array limitations.
- Relies on user training for consistent UV excitation and image capture to ensure fluorescence quantification accuracy.
