Wizualna detekcja wielu kwasów nukleinowych w układzie kapilarnym
15 listopada 2017
Ten protokół opisuje produkcję małej, gotowej do użycia kasety, która może być zastosowana do wizualnego wykrywania wielu kwasów nukleinowych w jednym, łatwym w obsłudze teście. W tym podejściu wykorzystano matrycę kapilarną do multipleksu i wysoce skutecznego wykrywania celów GMO.
Ogólnym celem tej procedury jest wyprodukowanie małej, gotowej do użycia kasety, która może być stosowana do wizualnego wykrywania wielu kwasów nukleinowych w jednym, łatwym w obsłudze teście. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie wykrywania multipleksów kwasów nukleinowych, takie jak organizmy modyfikowane genetycznie lub wykrywanie GMO. Aby oczyścić naczynia włosowate, załóż strój laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice chroniące przed chemikaliami.
Umieść naczynia włosowate w zlewce. Oczyść naczynia włosowate 30 mililitrami acetonu przez pięć minut, aby usunąć materię organiczną. A następnie umyj naczynia włosowate wodą dejonizowaną.
Następnie przygotuj roztwór piranii, wlewając do zlewki około dziesięciu mililitrów nadtlenku wodoru. Następnie dodaj 30 mililitrów kwasu siarkowego do nadtlenku wodoru, powoli wstrząsając, aby zapobiec przegrzaniu. Upewnij się, że roztwór całkowicie zakrywa naczynia włosowate przez co najmniej 30 minut.
Następnie zmyj roztwór piranii dużą ilością wody. Umyj naczynia włosowate etanolem i wodą dejonizowaną przez pięć minut każdy. Wysuszyć naczynia włosowate w suszarce.
Następnie zważ odczynniki bazowe PDMS i przekładniowe w stosunku jeden do jednego w 50-mililitrowej probówce. Zazwyczaj miesza się pięć gramów bazy elastomerowej z pięcioma gramami utwardzacza elastomerowego. Dokładnie mieszaj mieszaninę przez około pięć minut za pomocą szklanej pałeczki.
Umieść zlewkę z PDMS w próżniowym słoiku dzwonowym na trzydzieści minut w celu odgazowania. Następnie powoli wlej PDMS do cylindra formy ze stali nierdzewnej. Pozostaw PDMS do utwardzenia przez trzy godziny w suszarce w temperaturze 60 stopni Celsjusza.
Po utwardzeniu PDMS usuń formę, wyciągając formę za pomocą cylindra. Wyjmij PDMS z cylindra, przecinając margines formy skalpelem. Umyj PDMS trzykrotnie etanolem i wodą dejonizowaną.
Następnie wysuszyć podporę PDMS azotem. Potraktuj dolną powierzchnię podpory PDMS jako hydrofobową, mocząc podporę PDMS w super hydrofobowej powłoce na jedną sekundę. Następnie susz przez dziesięć minut w temperaturze pokojowej.
Następnie włóż oczyszczone czteromilimetrowe kapilary do otworów wspornika PDMS, pozostawiając punkt zerowy pięć milimetrów kapilar poza górną powierzchnią wspornika PDMS. Upewnij się, że końce naczyń włosowatych znajdują się na tym samym poziomie. Aby potraktować zewnętrzną powierzchnię kapilar i górną powierzchnię podpory PDMS jako hydrofobową, dodaj 15 mikrolitrów super hydrofobowej powłoki na wierzch powierzchni podpory PDMS.
Wysuszyć na powietrzu super hydrofobowy zmodyfikowany układ kapilarny. Następnie dodaj jeden punkt sześć mikrolitrów mieszaniny utrwalającej podkład z jednego zestawu podkładów, aby wypełnić jedną odpowiednią kapilarnę układu kapilarnego zgodnie z wcześniej zaprojektowaną kolejnością. Zakotwiczyć tablicę w przezroczystej studzience na standardowej 96-dołkowej płytce z płaskim dnem i suszyć tablicę w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez co najmniej dwie godziny.
Aby zmontować kasetę, umieść adapter ładujący na górze zakotwiczonej tablicy. Upewnij się, że miska adaptera zakrywa tylko odsłonięte części wszystkich dziesięciu naczyń włosowatych. Aby przygotować mieszaninę reakcyjną LAMP, dodaj odczynniki do mieszaniny zgodnie z protokołem tekstowym i wiruj mieszaninę reakcyjną przez pięć sekund po dodaniu kalcyny.
Delikatnie odwróć probówkę dwadzieścia razy po dodaniu polimerazy Bst. Śladowe ilości DNA, które istnieją w środowisku, można wyeliminować, czyszcząc je wcześniej jednym molem na litr kwasu solnego przed przekazaniem mieszanki LAMP. Zassać 20 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej LAMP za pomocą standardowej końcówki o pojemności 100 mikrolitrów.
Włóż końcówkę do wlotu adaptera ładowania, aby ją zablokować. Delikatnie wstrzyknąć mieszaninę reakcyjną do naczynia adaptera. Mieszanina reakcyjna szybko wypełni naczynie, a następnie automatycznie załaduje naczynia włosowate za pomocą siły kapilarnej.
Wyjmij adapter z końcówką zamka i uszczelnij studzienkę przezroczystą folią uszczelniającą kompatybilną z PCR. Następnie inkubuj układ kapilarny w inkubatorze w temperaturze 63 stopni Celsjusza przez godzinę. Aby uzyskać obrazy emisji fluorescencji, użyj latarki UV, aby wzbudzić zdysocjowaną kalcynację do wyemitowania fluorescencji.
Przechwytuj obrazy z górnej części układu kapilarnego za pomocą aparatu cyfrowego lub smartfona. Podczas robienia zdjęcia upewnij się, że aparat jest maksymalnie przybliżony na obszar naczyń włosowatych, aby uzyskać wysokiej jakości, wyraźne obrazy. Następnie otwórz obraz za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.
A następnie wybierz obraz, pleśń, skalę szarości, tak i obraz, pleśń, 16-bitowy, tak. Wybierz plik, zapisz jako, format, TIFF, aby przekonwertować obraz na 16-bitowy format TIFF. Aby wyodrębnić wartość intensywności fluorescencji, otwórz oprogramowanie do analizy mikromacierzy.
Przeciągnij 16-bitowy obraz w formacie TIFF do interfejsu oprogramowania, a następnie wybierz długość fali 532 nanometry i kolor zielony, aby wyświetlić obraz. Następnie utwórz nowy blok, aby zlokalizować sygnał fluorescencyjny z naczyń włosowatych. Wybierz narzędzia, nowe bloki, a następnie umieść liczbę kolumn i wierszy jako jeden do jednego i dwa do pięciu w interfejsach bloków i funkcji osobno.
Kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz model obiektów. Następnie dostosuj położenie i średnicę, aby pasowały do obszaru fluorescencji naczyń włosowatych. Wybierz opcję Analizuj, aby wyodrębnić wartość intensywności fluorescencji.
Na koniec wybierz plik, zapisz ustawienia jako, aby zapisać dokumenty bloku. Następnie wybierz, zarchiwizuj, zapisz wyniki, aby zapisać wyniki intensywności fluorescencji. Poniżej przedstawiono układ układu kapilarnego.
Kapilary od pierwszej do ósmej, poprzedzone zestawami starterów LAMP. Kapilary dziewiąte i dziesiąte reprezentują dwa, brak kontroli startera. Pokazane tutaj jest zdjęcie fluorescencyjne do wykrywania genetycznie zmodyfikowanej kukurydzy, MON863, gdzie zielony kolor reprezentuje dodatnie wzmocnienie LAMP.
Udana amplifikacja, przedstawiona tylko w oczekiwanych naczyniach włosowatych pierwszej, szóstej, siódmej i ósmej, bez zanieczyszczenia wśród ślepych naczyń włosowatych. To fluorescencyjne zdjęcie służy do wykrywania mieszanki GMO. Kolor zielony oznaczał dodatnie wzmocnienie LAMP.
Udana amplifikacja wykazała się tylko w oczekiwanych naczyniach włosowatych jeden, czwarty, piąty, szósty, siódmy i ósmy bez zanieczyszczenia wśród ślepych naczyń włosowatych. Pokazane tutaj zdjęcie fluorescencyjne służy do wykrywania kukurydzy niemodyfikowanej genetycznie, z zielonym kolorem prezentującym dodatnie wzmocnienie LAMP. Udana amplifikacja wykazała się tylko w oczekiwanej ósemce kapilary i bez zanieczyszczenia wśród ślepych naczyń włosowatych.
Po opanowaniu tej procedury wykrywania można ją wykonać w ciągu pięciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wytworzyć kasetę kapilarną w celu wykrywania wielu kwasów nukleinowych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje wykonanie niewielkiej, gotowej do użycia kasety do wizualnej detekcji wielu kwasów nukleinowych w ramach jednego, łatwego w obsłudze testu. Metoda ta jest szczególnie użyteczna przy wykrywaniu organizmów modyfikowanych genetycznie (GMO) z wykorzystaniem układu kapilarnego do detekcji multipleksowej.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Biotechnologia
- Biologia molekularna
- Inżynieria genetyczna
Wprowadzenie
- Wykrywanie wielu kwasów nukleinowych jest kluczowe w różnych dziedzinach.
- Organizmy modyfikowane genetycznie (GMO) stanowią istotne wyzwanie w obszarze bezpieczeństwa żywności.
- Do szybkiej analizy niezbędne są wydajne metody detekcji.
- Układy kapilarne mogą zwiększyć możliwości detekcji multipleksowej.
Cel badania
- Opracowanie przyjaznej dla użytkownika kasety do detekcji kwasów nukleinowych.
- Poprawa wydajności detekcji GMO.
- Ułatwienie badań nad multipleksową detekcją kwasów nukleinowych.
Zastosowane metody
- Wytwarzanie małej kasety do detekcji kwasów nukleinowych.
- Zastosowanie macierzy kapilarnych do detekcji multipleksowej.
- Czyszczenie kapilar acetonem i wodą dejonizowaną.
- Metody detekcji wizualnej dla łatwości użytkowania.
Główne wyniki
- Kaseta umożliwia jednoczesną detekcję wielu kwasów nukleinowych.
- Układy kapilarne zwiększają wydajność procesu detekcji.
- Metoda jest prosta i intuicyjna w obsłudze.
- Potencjalne zastosowania w detekcji GMO oraz w innych dziedzinach.
Wnioski
- Niniejszy protokół przedstawia nowatorskie podejście do detekcji kwasów nukleinowych.
- Opracowana kaseta jest skuteczna w testowaniu multipleksowym.
- Przyszłe badania mogą rozszerzyć zakres jej zastosowań w biotechnologii.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Platforma ta umożliwia multipleksową detekcję kwasów nukleinowych w jednej kasecie, wspierając potrzeby wysokoprzepustowego screeningu w testowaniu GMO oraz monitorowaniu drobnoustrojów. Dzięki połączeniu technologii matrycy kapilarnej z amplifikacją LAMP, system redukuje złożoność analizy oraz zapotrzebowanie na zasoby, zachowując przy tym specyficzność i czułość. Wizualny odczyt za pomocą naświetlania promieniowaniem UV pozwala na szybkie uzyskanie wyników bez użycia specjalistycznych urządzeń, co odpowiada zapotrzebowaniu na zdecentralizowane testowanie w procesach biotechnologii biofarmaceutycznej i rolniczej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia jednoczesną analizę wielu celów genetycznych w celu weryfikacji hipotez w analizie szlaków sygnałowych.
- Wartość operacyjna: Redukuje zużycie odczynników oraz czas pracy manualnej dzięki ładowaniu próbek wykorzystującemu siły kapilarne.
Przesiew i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Zapewnia ustandaryzowane, odizolowane komory reakcyjne w celu uzyskania powtarzalnej amplifikacji dla różnych celów.
- Wartość operacyjna: Umożliwia równoległe przetwarzanie do ośmiu analiz z wewnętrznymi kontrolami służącymi do walidacji testów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Ułatwia wykrywanie elementów zmodyfikowanych genetycznie w złożonych matrycach, wspierając ocenę bezpieczeństwa GMO.
- Wartość operacyjna: Umożliwia przeprowadzanie testów w terenie przy minimalnym zapleczu sprzętowym, co jest odpowiednie do monitorowania procesów w bioprodukcji.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w procesy od wczesnego etapu odkrywania do badań przedklinicznych, w których szybkie profilowanie kwasów nukleinowych pozwala na wybór celu i ocenę gotowości testów.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia równoległe testowanie wariantów genów lub konstruktów w celu wyjaśnienia ich ról funkcjonalnych w szlakach biologicznych.
- Przesiewanie: Generuje ilościowe dane dotyczące intensywności fluorescencji w celu potwierdzenia trafień i porównania między kapilarami.
- Analityka: Wyniki umożliwiają ustawienie progu sygnału oraz ocenę zanieczyszczeń za pomocą kontrolnych kapilar pustych.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość od identyfikacji celu do walidacji przedklinicznej dzięki spójnym odczytom kwasów nukleinowych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Konstrukcja kasety pozwala na wielokrotne wykorzystanie w różnych panelach kwasów nukleinowych poprzez rekonfigurację zestawów starterów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w analizach multipleksowych poprzez minimalizację przesłuchów i wyników fałszywie dodatnich.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki standaryzowanemu przygotowaniu kapilar oraz izolowanym objętościom reakcyjnym.
- Wartość strategiczna: Skraca czas uzyskania wyniku w kluczowych punktach decyzyjnych podczas wykrywania GMO i monitorowania mikrobiologicznego.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka na podstawie jednoczesnych odczytów wieloparametrowych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie obróbki powierzchni oraz montażu macierzy kapilarnych w celu tworzenia wzorów hydrofobowo-hydrofilowych.
- Zależy od dostępu do urządzeń do odgazowywania próżniowego i utwardzania termicznego niezbędnych do wytwarzania mikroprzepływowych układów z PDMS.
- Wymaga standaryzacji protokołów unieruchamiania starterów w obrębie macierzy kapilarnych w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Wymaga uwzględnienia modyfikacji przy rozszerzaniu analizy o więcej niż osiem celów ze względu na ograniczenia macierzy kapilarnej.
- Opiera się na przeszkoleniu użytkownika w zakresie spójnego wzbudzania promieniami UV i przechwytywania obrazów, aby zapewnić dokładność ilościowego pomiaru fluorescencji.
