Name: Wizualna detekcja wielu kwasów nukleinowych w układzie kapilarnym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Naucz się wizualnej detekcji wielu kwasów nukleinowych w układzie kapilarnym do wykrywania GMO. Ta metoda umożliwia szybką, wielokierunkową analizę genetyczną w biotechnologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało częściowo sfinansowane przez National Natural Science Foundation of China Grants (31370813, 3147670, 31670831 i 31600672,), National Transgenic Plant Special Fund (2016ZX08012-003, 2016ZX08012-005), Program for New Century Excellent Talents in University, National Key Research and Development Project of China (2016YFA0500601) oraz China Postdoctoral Science Foundation (2016M591667).

UWAGA: Niniejszy protokół zakłada, że forma ze stali nierdzewnej z kształtem pożądanych mikrokanałów oraz adapter do ładowania zostały już wykonane (pliki 3D są dostępne jako Supplemental Files 1 i 2). Protokół zakłada również, że izolacja DNA roślinnego została już przeprowadzona.
1. Wytwarzanie gotowej do użycia kasety opartej na matrycy kapilarnej
<ol>
	<li>Oczyszczanie formy ze stali nierdzewnej.
	<ol>
		<li>Umyć formę ze stali nierdzewnej detergentem, etanolem i wodą dejonizowaną, aby usunąć potencjalne zanieczyszczenia. Osuszyć formę azotem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Czyszczenie kapilar
	<ol>
		<li>Założyć gogle ochronne, fartuch laboratoryjny i rękawice ochronne do substancji chemicznych.</li>
		<li>Umieścić kapilary w zlewce. Czyścić kapilary w 30 mL acetonu przez 5 min w celu usunięcia materii organicznej, a następnie przemyć kapilary wodą dejonizowaną. 
		Uwaga: Acetonem należy operować w dygestorium.</li>
		<li>Wlać 10 mL H2O2 do zlewki, a następnie dodać 30 mL H2SO4 do H2O2 , powoli wstrząsając, aby zapobiec przegrzaniu. Upewnić się, że roztwór (roztwór piranha) całkowicie pokrywa kapilary przez co najmniej 30 min. 
		Uwaga: Należy zachować ostrożność podczas pracy z roztworem piranha (H2SO4/H2O2 = 3: 1, v/v). W przypadku rozlania roztworu piranha, szybko wypłukać go dużą ilością wody i wytrzeć powierzchnię ręcznikami papierowymi. 
		UWAGA: Dokładne oczyszczenie kapilar jest jednym z kluczowych punktów zapewniających sukces reakcji LAMP. Podczas procesu czyszczenia konieczne jest wstrząsanie cylindrem z kwasem, aby usunąć pęcherzyki powietrza z kapilar; w razie potrzeby czas czyszczenia można wydłużyć.</li>
		<li>Wypłukać roztwór piranha dużą ilością wody. Przemyć kapilary etanolem i wodą dejonizowaną przez 5 min każdą substancją. Osuszyć kapilary w suszarce.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wlewanie polidimetylosiloksanu (PDMS)
	<ol>
		<li>Odmierzyć bazę PDMS i odczyniki utwardzające w stosunku 1:1 do probówki o pojemności 50 mL. Typowo miesza się 5 g bazy elastomerowej z 5 g utwardzacza elastomerowego.</li>
		<li>Dokładnie mieszać mieszaninę przez około 5 min szklaną rurką. Umieścić probówkę z PDMS w dzwonie próżniowym na 30 min w celu odgazowania.</li>
		<li>Powoli wlać PDMS do cylindra formy ze stali nierdzewnej. Pozostawić PDMS do utwardzenia na 3 h w suszarce w temperaturze 60 °C 
		UWAGA: Należy uważać, aby podczas wlewania PDMS nie powstały pęcherzyki powietrza. Po wylaniu PDMS pozostawić go na 5 min w celu naturalnego usunięcia pęcherzyków z PDMS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuwanie formy z PDMS
	<ol>
		<li>Po utwardzeniu PDMS, usunąć formę, wyciągając ją wraz z cylindrem. Wyjąć PDMS z cylindra, odcinając margines formy skalpelem.</li>
		<li>Przemyć PDMS trzykrotnie etanolem i wodą dejonizowaną. Osuszyć podłoże z PDMS azotem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przetraktować dolną powierzchnię podłoża z PDMS, aby stała się hydrofobowa. Namoczyć podłoże z PDMS w powłoce superhydrofobowej przez 1 s. Suszyć przez 10 min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wprowadzanie kapilary do podłoża z PDMS
	<ol>
		<li>Wprowadzić oczyszczone kapilary 4 mm do otworów w podłożu z PDMS, pozostawiając 0,5 mm kapilar poza górną powierzchnią podłoża z PDMS. Upewnić się, że końce kapilar znajdują się na tym samym poziomie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przetraktowanie zewnętrznej powierzchni kapilar oraz górnej powierzchni podłoża z PDMS w celu nadania im właściwości hydrofobowych.
	<ol>
		<li>Nanieść 15 µL powłoki superhydrofobowej na górną powierzchnię podłoża z PDMS. Należy zauważyć, że powłoka natychmiast rozprzestrzenia się po całej górnej powierzchni (w tym na górnej powierzchni podłoża z PDMS i zewnętrznych powierzchniach wystających części kapilar) dzięki siłom kapilarnym.</li>
		<li>Osuszyć na powietrzu zmodyfikowaną superhydrofobowo macierz kapilarną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mocowanie starterów w macierzy kapilarnej
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór starterów. Odważyć 0,65 g chitosan (wzór cząsteczkowy: (C6H11NO4)n) i rozpuścić w 50 mL wody dejonizowanej, dostosowując pH do 4,5-5,5 za pomocą kwasu octowego, aby uzyskać stężenie chitosan 1,3%. Przygotować mieszaninę składników starterów zgodnie z Tabelą 1. Startery znajdują się w Tabeli uzupełniającej 1.</li>
		<li>Dodać 1,6 µL mieszaniny jednego zestawu starterów, aby wypełnić jedną odpowiadającą kapilarę macierzy kapilarnej zgodnie z wcześniej zaprojektowaną kolejnością. 
		UWAGA: Pozostałe dwie puste kapilary zostały wyznaczone jako kontrole negatywne.</li>
		<li>Zakotwiczyć macierz w przezroczystym dołku standardowej płytki 96-dołkowej z płaskim dnem i suszyć macierz w temperaturze 60 °C przez co najmniej 2 h.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Składniki mieszaniny do unieruchamiania starterów LAMP (stężenie początkowe)</td>
			<td >Objętość (μL)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ddH2O</td>
			<td >17.0</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chitozan (1.3%)</td>
			<td >1.0</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >startery FIP/BIP (20 μM)</td>
			<td >2.0/2.0</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >startery LoopF/LoopB (20 μM)</td>
			<td >1.0/1.0</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >startery F3/B3 (20 μM)</td>
			<td >0.5/0.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Objętość całkowita</td>
			<td >25.0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Składniki odczynników do unieruchamiania starterów LAMP. Składniki mieszaniny do unieruchamiania starterów LAMP wymieniono w lewej kolumnie tabeli, a objętość każdego składnika w kolumnie prawej.
<ol start="9">
	<li>Zmontuj kasetę w następujący sposób. Umieść adapter do ładowania na górze zakotwiczonej macierzy. Upewnij się, że wgłębienie adaptera zakrywa odsłonięte części wszystkich dziesięciu kapilar (zob. Rysunek 1).</li>
</ol>
<img alt="Układ mikroprzepływowego urządzenia PDMS, etapy wykonania i schemat integracji kapilar do użytku laboratoryjnego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56597/56597fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Wykonanie i montaż kasety. (a) Forma ze stali nierdzewnej i podkładka z PDMS. Forma składa się z 3 części: cylindra, płyty blokującej i płyty z filarami. (b) Schemat wykonania podkładki z PDMS i montażu kasety kapilarnej. Cały proces składa się z 5 etapów: 1. wylewanie PDMS, 2. usuwanie formy, 3. wkładanie kapilar i powlekanie powierzchni, 4. mocowanie primera oraz 5. zakotwiczenie kasety. 1. Wlej PDMS do cylindra formy; 2. Wypchnij płytę blokującą, aby usunąć formę z podkładki z PDMS; 3. Powlecz dolną powierzchnię podkładki z PDMS, a następnie włóż kapilary do podkładki z PDMS, na koniec powlecz górną powierzchnię podkładki z PDMS i odsłonięte kapilary. Gruba niebieska linia oznacza powłokę superhydrofobową; 4. Załaduj zestaw primerów do poszczególnych kapilar; 5. Zakotwicz macierz kapilarną w pojedynczej płytce 96-dołkowej i zamontuj na niej adapter do ładowania próbek. Szczegóły opisano w krokach protokołu 1.1 - 1.9. <a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56597/56597fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
2. Wydajność reakcji LAMP w układzie kapilarnym
<ol>
	<li>Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej
	<ol>
		<li>Przygotować mieszaninę reakcyjną LAMP zgodnie z tabelą 2.</li>
		<li>Dodawać odczynniki do mieszaniny w wybranej kolejności, zgodnie z tabelą 2, a po dodaniu kalceiny wymieszać mieszaninę reakcyjną na wirówce typu vortex przez 5 s. Po dodaniu polimerazy Bst ostrożnie odwrócić probówkę 20 razy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponenty LAMP (stężenie początkowe)</td>
			<td>Objętość (μL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O2O</td>
			<td>11.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO₄4 (100 mM)</td>
			<td>2.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP (25 mM)</td>
			<td>1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaina (5 M)</td>
			<td>4.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor (10x)</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kalceina (1,25 mM)</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl₂2 (25 mM)</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bst polimeraza (8 j./μL)</td>
			<td>1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA roślinny (10 ng/μL)</td>
			<td>1.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objętość całkowita</td>
			<td>25.0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Układ reakcyjny dla capillary array-LAMP. Składniki układu reakcyjnego capillary array-LAMP wymieniono w lewej kolumnie, a objętość każdego składnika w kolumnie prawej.
<ol start="2">
	<li>Napełnienie odczynnikami i uszczelnienie kasety
	<ol>
		<li>Odpipetować 20 µL mieszaniny reakcyjnej LAMP za pomocą standardowego końcówki 100 µL. Włożyć końcówkę do wlotu adaptera do załadunku, aby ją zablokować. Delikatnie wstrzyknąć mieszaninę reakcyjną do wgłębienia adaptera; mieszanina reakcyjna szybko wypełni wgłębienie, a następnie automatycznie wypełni kapilary dzięki siłom kapilarnym.</li>
		<li>Zdjąć adapter wraz z zablokowaną końcówką i uszczelnić dołek za pomocą przezroczystej folii uszczelniającej kompatybilnej z PCR. 
		UWAGA: Wypełnione zostaną tylko te kapilary, które dotykają mieszaniny reakcyjnej w hydrofilowym wgłębieniu. Należy zatem upewnić się, że górne krawędzie wszystkich kapilar znajdują się na tej samej wysokości (patrz Rysunek 2).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Układ mikromacierzy do nakładania próbek w dołku z płaskim dnem z adapterem; schemat metody analizy DNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56597/56597fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Schemat nakładania próbki przy użyciu adaptera do nakładania. Na zdjęciu przedstawiono proces nakładania na przykładzie niebieskiego roztworu. Należy wprowadzić końcówkę do wlotu, powoli wstrzyknąć próbkę do adaptera, a następnie wyjąć adapter wraz z zablokowaną końcówką. <a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56597/56597fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<ol start="3">
	<li>Inkubować matrycę kapilarnej w inkubatorze w temperaturze 63 °C przez 1 h.</li>
</ol>
3. Odczyt wyników i analiza danych
<ol>
	<li>Nabycie obrazów emisji fluorescencji.
	<ol>
		<li>Zamocuj filtr UV na górnej powierzchni małej, ręcznej latarki UV LED, aby odfiltrować światło widzialne.</li>
		<li>Wzbudź dysocjowaną kalceinę, aby emitowała fluorescencję za pomocą latarki UV. Przejmij obrazy z góry macierzy kapilar za pomocą aparatu cyfrowego lub smartfona.</li>
		<li>Podczas wykonywania zdjęcia upewnij się, że aparat jest maksymalnie przybliżony do obszaru kapilar, aby uzyskać wysokiej jakości, wyraźne obrazy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza wyników
	<ol>
		<li>Otwórz obraz w oprogramowaniu do analizy obrazu, a następnie wybierz „Image&gt;Mold&gt;Grayscale&gt;Yes” oraz „Image&gt;Mold&gt;16bit&gt;Yes”. Wybierz „File&gt;Save as&gt;format&gt;TIFF”, aby przekonwertować obraz na 16-bitowy format TIFF.</li>
		<li>Wyznacz wartość intensywności fluorescencji
		<ol>
			<li>Otwórz oprogramowanie do analizy mikromacierzy. Przeciągnij obraz w formacie 16-bitowym TIFF do interfejsu oprogramowania, a następnie wybierz długość fali „532 nm” i kolor „green” (zielony), aby wyświetlić obraz.</li>
			<li>Utwórz nowy blok, aby zlokalizować sygnał fluorescencji z kapilar. Wybierz „Tools&gt;New blocks” i wprowadź liczbę kolumn i wierszy jako „1;1” oraz „2;5” odpowiednio w interfejsach „blocks” i „features”.</li>
			<li>Kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz model „Features”, a następnie dostosuj położenie i średnicę tak, aby pasowały do obszaru fluorescencji kapilar. Wybierz „Analyze”, aby wyznaczyć wartość intensywności fluorescencji.</li>
			<li>Wybierz „File&gt;save settings as”, aby zapisać dokumenty bloków, oraz „File&gt;save results as”, aby zapisać wyniki intensywności fluorescencji. Oblicz SNR, aby określić, czy reakcja LAMP w kapilarach przebiegła pomyślnie. 
			UWAGA: Sygnały z kapilar uzyskano poprzez rejestrację wartości szarości plamek, a stosunki sygnału do szumu (SNR) zdefiniowano jako stosunki średnich wartości sygnałów pierwszego planu celów do średnich wartości średnich sygnałów pierwszego planu dwóch kontroli negatywnych. Wartość odcięcia (cutoff) dla wyznaczenia sygnałów dodatnich ustalono na SNR &gt;2.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Urdea, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirements+for+high+impact+diagnostics+in+the+developing+world%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Requirements for high impact diagnostics in the developing world.</a> Nature. 444, Suppl 1. 73-79 (2006).</li>
<li>Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point-of-care+diagnostics+for+global+health%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Point-of-care diagnostics for global health.</a> Annu Rev Biomed Eng. 10, 107-144 (2008).</li>
<li>Opota, O., Jaton, K., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+diagnosis+of+bloodstream+infection%3A+towards+molecular+diagnosis+directly+from+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infec%22%5BJournal%5D)">Microbial diagnosis of bloodstream infection: towards molecular diagnosis directly from blood.</a> Clin Microbiol Infec. 21 (4), 323-331 (2015).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MPIC%3A+A+High-Throughput+Analytical+Method+for+Multiple+DNA+Targets%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">MPIC: A High-Throughput Analytical Method for Multiple DNA Targets.</a> Anal Chem. 83 (5), 1579-1586 (2011).</li>
<li>Shao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MACRO%3A+a+combined+microchip-PCR+and+microarray+system+for+high-throughput+monitoring+of+genetically+modified+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">MACRO: a combined microchip-PCR and microarray system for high-throughput monitoring of genetically modified organisms.</a> Anal Chem. 86 (2), 1269-1276 (2014).</li>
<li>Kamle, S., Ali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+modified+crops%3A+detection+strategies+and+biosafety+issues%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Genetically modified crops: detection strategies and biosafety issues.</a> Gene. 522 (2), 123-132 (2013).</li>
<li>Galvin, S., Dolan, A., Cahill, O., Daniels, S., Humphreys, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+monitoring+of+the+hospital+environment%3A+why+and+how%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hosp+Infect%22%5BJournal%5D)">Microbial monitoring of the hospital environment: why and how?</a> J Hosp Infect. 82 (3), 143-151 (2012).</li>
<li>Sciancalepore, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdroplet-based+multiplex+PCR+on+chip+to+detect+foodborne+bacteria+producing+biogenic+amines%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microdroplet-based multiplex PCR on chip to detect foodborne bacteria producing biogenic amines.</a> Food Microbiol. 35 (1), 10-14 (2013).</li>
<li>Saxena, G., Bharagava, R. N., Kaithwas, G., Raj, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+indicators%2C+pathogens+and+methods+for+their+monitoring+in+water+environment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Water+Health%22%5BJournal%5D)">Microbial indicators, pathogens and methods for their monitoring in water environment.</a> J Water Health. 13 (2), 319-339 (2015).</li>
<li>Hopwood, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+Microfluidic+System+for+Rapid+Forensic+DNA+Analysis%3A+Sample+Collection+to+DNA+Profile%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Integrated Microfluidic System for Rapid Forensic DNA Analysis: Sample Collection to DNA Profile.</a> Anal Chem. 82 (16), 6991-6999 (2010).</li>
<li>Estes, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+multiplexed+PCR+on+an+integrated+microfluidic+forensic+platform+for+rapid+DNA+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Optimization of multiplexed PCR on an integrated microfluidic forensic platform for rapid DNA analysis.</a> Analyst. 137 (23), 5510-5519 (2012).</li>
<li>Niemz, A., Ferguson, T. M., Boyle, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point-of-care+nucleic+acid+testing+for+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Point-of-care nucleic acid testing for infectious diseases.</a> Trends Biotechnol. 29 (5), 240-250 (2011).</li>
<li>Peeling, R. W., Mabey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point-of-care+tests+for+diagnosing+infections+in+the+developing+world%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infec%22%5BJournal%5D)">Point-of-care tests for diagnosing infections in the developing world.</a> Clin Microbiol Infec. 16 (8), 1062-1069 (2010).</li>
<li>Perkins, M. D., Kessel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+Ebola+tells+us+about+outbreak+diagnostic+readiness%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">What Ebola tells us about outbreak diagnostic readiness.</a> Nat Biotechnol. 33 (5), 464-469 (2015).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+multiplex+PCR+strategy+for+100-plex+amplification+using+a+hydrophobically+patterned+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A universal multiplex PCR strategy for 100-plex amplification using a hydrophobically patterned microarray.</a> Lab Chip. 11 (21), 3609-3618 (2011).</li>
<li>Notomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification of DNA.</a> Nucleic Acids Res. 28 (12), (2000).</li>
<li>Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+loop-mediated+isothermal+amplification+reaction+by+turbidity+derived+from+magnesium+pyrophosphate+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation.</a> Biochem Biophys Res Commun. 289 (1), 150-154 (2001).</li>
<li>Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29+of+gene+sequences+and+simple+visual+detection+of+products%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products.</a> Nat Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).</li>
<li>Iwamoto, T., Sonobe, T., Hayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+for+direct+detection+of+Mycobacterium+tuberculosis+complex%2C+M-avium%2C+and+M-intracellulare+in+sputum+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification for direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex, M-avium, and M-intracellulare in sputum samples.</a> J Clin Microbiol. 41 (6), 2616-2622 (2003).</li>
<li>Goto, M., Honda, E., Ogura, A., Nomoto, A., Hanaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+detection+of+loop-mediated+isothermal+amplification+reaction+by+using+hydroxy+naphthol+blue%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Colorimetric detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by using hydroxy naphthol blue.</a> Biotechniques. 46 (3), 167-172 (2009).</li>
<li>Iseki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+multiplex+loop-mediated+isothermal+amplification+%28mLAMP%29+method+for+the+simultaneous+detection+of+bovine+Babesia+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of a multiplex loop-mediated isothermal amplification (mLAMP) method for the simultaneous detection of bovine Babesia parasites.</a> J Microbiol Methods. 71 (3), 281-287 (2007).</li>
<li>Liang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+loop-mediated+isothermal+amplification+detection+by+sequence-based+barcodes+coupled+with+nicking+endonuclease-mediated+pyrosequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiplex loop-mediated isothermal amplification detection by sequence-based barcodes coupled with nicking endonuclease-mediated pyrosequencing.</a> Anal Chem. 84 (8), 3758-3763 (2012).</li>
<li>Shao, Y., Zhu, S., Jin, C., Chen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+multiplex+loop-mediated+isothermal+amplification-RFLP+%28mLAMP-RFLP%29+to+detect+Salmonella+spp.+and+Shigella+spp.+in+milk%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development of multiplex loop-mediated isothermal amplification-RFLP (mLAMP-RFLP) to detect Salmonella spp. and Shigella spp. in milk.</a> Int J Food Microbiol. 148 (2), 75-79 (2011).</li>
<li>Fang, X., Chen, H., Yu, S., Jiang, X., Kong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+viruses+accurately+by+a+multiplex+microfluidic+loop-mediated+isothermal+amplification+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Predicting viruses accurately by a multiplex microfluidic loop-mediated isothermal amplification chip.</a> Anal Chem. 83 (3), 690-695 (2011).</li>
<li>Stedtfeld, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-Z%3A+a+device+for+point+of+care+genetic+testing+using+a+smartphone%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Gene-Z: a device for point of care genetic testing using a smartphone.</a> Lab Chip. 12 (8), 1454-1462 (2012).</li>
<li>Liu, D., Liang, G., Zhang, Q., Chen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Mycobacterium+tuberculosis+using+a+capillary-array+microsystem+with+integrated+DNA+extraction%2C+loop-mediated+isothermal+amplification%2C+and+fluorescence+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Detection of Mycobacterium tuberculosis using a capillary-array microsystem with integrated DNA extraction, loop-mediated isothermal amplification, and fluorescence detection.</a> Anal Chem. 85 (9), 4698-4704 (2013).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point-of-Care+Multiplexed+Assays+of+Nucleic+Acids+Using+Microcapillary-based+Loop-Mediated+Isothermal+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Point-of-Care Multiplexed Assays of Nucleic Acids Using Microcapillary-based Loop-Mediated Isothermal Amplification.</a> Anal Chem. 86 (14), 7057-7062 (2014).</li>
<li>Shao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+detection+of+multiple+genetically+modified+organisms+in+a+capillary+array%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Visual detection of multiple genetically modified organisms in a capillary array.</a> Lab Chip. 17 (3), 521-529 (2017).</li>
<li>Lizardi, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+detection+and+single-moledule+counting+using+isothermal+rolling-circle+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutation detection and single-moledule counting using isothermal rolling-circle amplification.</a> Nat Genet. , (1998).</li>
<li>Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L., Armes, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+detection+using+recombination+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA detection using recombination proteins.</a> Plos Biol. 4 (7), 1115-1121 (2006).</li>
<li>Opota, O., Jaton, K., Greub, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+diagnosis+of+bloodstream+infection%3A+towards+molecular+diagnosis+directly+from+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Microbial diagnosis of bloodstream infection: towards molecular diagnosis directly from blood.</a> Clin Microbiol Infect. 21 (4), 323-331 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zademonstrowana tutaj platforma CALM, która łączy technologię LAMP z układem kapilarnym, umożliwia jednoczesne wykrywanie wielu celów genowych związanych z GMO w jednym, wysoce skutecznym i łatwym w obsłudze teście.
Aby skutecznie przeprowadzić reakcje multipleksowe LAMP w kasecie, należy zwrócić uwagę na trzy krytyczne punkty. Po pierwsze, osiągnięcie tej samej wysokości górnej strony naczyń włosowatych oraz hydrofilowego i hydrofobowego wzoru układu kapilarnego ma kluczowe znaczenie dla jedn...

Niedrogie, szybkie i łatwe w użyciu systemy do jednoczesnego wykrywania wielu kwasów nukleinowych są pilnie potrzebne w szerokim zakresie dziedzin, takich jak diagnostyka kliniczna1,2,3, GMO detection4,5,6, monitorowanie mikrobiologiczne7,8,9, forensic analysis10,11, a zwłaszcza testy przyłóżkowe (POCTs), gdzie zasoby są zwykle ograniczone12,13,14.
Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR), w tym jej metody pochodne real-time PCR i multiplex PCR, jest najczęściej stosowaną techniką wykrywania w tych dziedzinach. Jednak metody te zazwyczaj wykrywają tylko jeden cel w jednym teście15 i wymagają elektryczności oraz zaawansowanego profesjonalnego sprzętu.
Inną obiecującą technologią wykrywania kwasów nukleinowych jest amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli (LAMP), która została po raz pierwszy opisana w 200016. LAMP to wysokowydajna metoda wykrywania DNA. Teoretycznie może amplifikować od 1 kopii do 109 kopii amplikonów w ciągu jednej godziny, a wszystko to wykonywane w stałej temperaturze (tj. między 60 - 65 °C). Udana amplifikacja wytworzy dużą ilość nierozpuszczalnego produktu ubocznego pirofosforanu i spowoduje zmianę zmętnienia17, które można bezpośrednio zaobserwować gołym okiem. Zmianę koloru można również zaobserwować poprzez dodanie jonów metali lub barwników fluorescencyjnych, takich jak Calcein18, Nucleic acid dye19 i hydroksylowo-naftol blue20. Ze względu na zalety wysokiej czułości i wygody obsługi, LAMP jest szeroko stosowany w wykrywaniu kwasów nukleinowych.
Obecnie istnieją głównie dwie strategie dla multipleksowych testów LAMP. Jednym z nich jest wykonanie wielu testów LAMP poprzez posiadanie wielu zestawów starterów LAMP w jednej probówce21,22,23. Jednak mnogość i wydajność wzmocnienia byłyby ograniczone przez wewnętrzną interferencję i konkurencję między różnymi zestawami starterów. Co więcej, identyfikacja różnych produktów LAMP w tej samej reakcji może być trudna. Inna strategia opiera się na izolacji fizycznej. Różne zestawy starterów zostały wyizolowane do poszczególnych zminiaturyzowanych komór, a następnie przeprowadzono jednocześnie wiele reakcji LAMP24,25. Podejścia te, które na ogół opierają się na chipach mikroprzepływowych, stanowią potencjalne rozwiązanie dla wysokoprzepustowych reakcji LAMP. Jednak produkcja chipów i wstępne powlekanie multipleksowe zestawów podkładów jest skomplikowane, co może zwiększyć koszty i zmniejszyć powtarzalność.
Ostatnio, kilka badań opisało przeprowadzanie reakcji LAMP w naczyniach włosowatych w celu ominięcia skomplikowanego wytwarzania chipów mikroprzepływowych i osiągnięto niskie koszty wykrywania26,27. Jednak w odniesieniu do analizy wysokoprzepustowej, kapilary te są podobne do miniaturowych wersji probówek paskowych do PCR, ponieważ próbki i odczynniki reakcyjne (w tym różne zestawy starterów) muszą być indywidualnie przygotowane i dostarczone do różnych jednostek reakcyjnych w kapilarach. Aby uzyskać analizę równoległą i multipleksową, wymagane jest dodatkowe wyposażenie, na przykład wielokanałowa pompa strzykawkowa, do równoległego ładowania próbek lub odczynników.
Aby przezwyciężyć ograniczenia związane z obecnymi metodami multipleksowego wykrywania kwasów nukleinowych, opracowaliśmy zminiaturyzowaną platformę, która łączy technologię wizualną LAMP z układem kapilarnym. Ta platforma jest wielokierunkowa, kompaktowa, tania i łatwa w obsłudze28. W tym miejscu opisujemy szczegóły dotyczące wytwarzania układu kapilarnego i przeprowadzania reakcji LAMP w układzie. Opisany tutaj protokół został ustandaryzowany przy użyciu wykrywania organizmów modyfikowanych genetycznie (GMO) jako modelu. Co ważne, protokół ten może być również stosowany w wysokoprzepustowym wykrywaniu innych celów kwasów nukleinowych.

<table><tbody><tr><td>UltraEverDry (powłoka superhydrofobowa)</td> <td>UltraTech</td><td>4001</td><td>dostawca: Exiron chemistry (CHINA) CO., LTD.</td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>8332557</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza Bst</td><td>New England BioLabs</td><td>M0275L</td><td></td></tr><tr><td>betaina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0300-1VL</td><td></td></tr><tr><td>kalceina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0875-5G</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MKBP0495V</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>New England BioLabs</td><td>B1003S</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Shanghai Sangon</td><td>B804BA0022</td><td></td></tr><tr><td>chitozan</td><td>Shanghai Sangon</td><td>LJ0805S309J</td><td></td></tr><tr><td>oprogramowanie Photoshop 7.0</td><td>Adobe Systems Inc., CA, USA</td><td></td><td>Analiza obrazu</td></tr><tr><td>GenePix Pro 6.1</td><td>Molecular Devices, CA, USA</td><td></td><td>Oprogramowanie do analizy mikromacierzy</td></tr><tr><td>AutoCAD</td><td>Adobe Systems Inc.</td><td></td><td>Oprogramowanie do budowy 3D</td></tr><tr><td>Filtr UV (ZWB2)</td><td>YXSodawca</td><td></td> materiałów <td>: taobao</td></tr></tbody></table>

wizualna detekcja wielu kwasów nukleinowych w układzie kapilarnym

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Metodologie wykrywania wielu kwasów nukleinowych w jednym, łatwym w obsłudze teście są pilnie potrzebne w diagnostyce chorób, monitorowaniu mikroorganizmów, wykrywaniu organizmów modyfikowanych genetycznie (GMO) i analizie kryminalistycznej. Wcześniej opisaliśmy platformę o nazwie CALM (Capillary Array-based Loop-mediated isothermal amplification for Multiplex visual detection of nucleic acids). W tym miejscu opisujemy ulepszone procesy produkcji i wydajności dla tej platformy. W tym przypadku stosujemy małą, gotową do użycia kasetę zmontowaną za pomocą macierzy kapilarnej do multipleksowej wizualnej detekcji kwasów nukleinowych. Układ kapilarny jest wstępnie obrabiany do hydrofobowego i hydrofilowego wzoru przed utrwaleniem w kapilarach zestawów starterów do amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP). Po zamontowaniu adaptera ładującego, mieszanina reakcyjna LAMP jest ładowana i izolowana do każdej kapilary, dzięki sile kapilarnej, przez pojedynczy etap pipetowania. Reakcje LAMP zachodzą równolegle w naczyniach włosowatych. Wyniki są wizualnie odczytywane przez oświetlenie ręczną latarką UV. Za pomocą tej platformy demonstrujemy monitorowanie 8 często pojawiających się pierwiastków i genów w próbkach GMO z wysoką swoistością i czułością. Podsumowując, opisana w niniejszym dokumencie platforma ma na celu ułatwienie wykrywania wielu kwasów nukleinowych. Wierzymy, że znajdzie szerokie zastosowanie w dziedzinach, w których wymagana jest wysokoprzepustowa analiza kwasów nukleinowych.

W tej metodzie ważne jest zapobieganie kontaminacji krzyżowej między różnymi kapilarami podczas ładowania próbek. W tym celu zastosowano chitosan, który umożliwia zatrzymanie starterów w poszczególnych kapilarach. Aby sprawdzić skuteczność tego rozwiązania, w kasecie kapilarnej unieruchomiono zestaw starterów ADH1 (endogenny gen referencyjny kukurydzy) w układzie „T” i „U”, co przedstawiono na Rysunku 3a. Zgodnie z oczekiwan...

Ten protokół opisuje produkcję małej, gotowej do użycia kasety, która może być zastosowana do wizualnego wykrywania wielu kwasów nukleinowych w jednym, łatwym w obsłudze teście. W tym podejściu wykorzystano matrycę kapilarną do multipleksu i wysoce skutecznego wykrywania celów GMO.

Wizualna detekcja wielu kwasów nukleinowych w układzie kapilarnym

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

Ogólnym celem tej procedury jest wyprodukowanie małej, gotowej do użycia kasety, która może być stosowana do wizualnego wykrywania wielu kwasów nukleinowych w jednym, łatwym w obsłudze teście. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie wykrywania multipleksów kwasów nukleinowych, takie jak organizmy modyfikowane genetycznie lub wykrywanie GMO. Aby oczyścić naczynia włosowate, załóż strój laboratoryjny, okulary ochronne i rękawice chroniące przed chemikaliami.Umieść naczynia włosowate w zlewce. Oczyść naczynia włosowate 30 mililitrami acetonu przez pięć minut, aby usunąć materię organiczną. A następnie umyj naczynia włosowate wodą dejonizowaną.Następnie przygotuj roztwór piranii, wlewając do zlewki około dziesięciu mililitrów nadtlenku wodoru. Następnie dodaj 30 mililitrów kwasu siarkowego do nadtlenku wodoru, powoli wstrząsając, aby zapobiec przegrzaniu. Upewnij się, że roztwór całkowicie zakrywa naczynia włosowate przez co najmniej 30 minut.Następnie zmyj roztwór piranii dużą ilością wody. Umyj naczynia włosowate etanolem i wodą dejonizowaną przez pięć minut każdy. Wysuszyć naczynia włosowate w suszarce.Następnie zważ odczynniki bazowe PDMS i przekładniowe w stosunku jeden do jednego w 50-mililitrowej probówce. Zazwyczaj miesza się pięć gramów bazy elastomerowej z pięcioma gramami utwardzacza elastomerowego. Dokładnie mieszaj mieszaninę przez około pięć minut za pomocą szklanej pałeczki.Umieść zlewkę z PDMS w próżniowym słoiku dzwonowym na trzydzieści minut w celu odgazowania. Następnie powoli wlej PDMS do cylindra formy ze stali nierdzewnej. Pozostaw PDMS do utwardzenia przez trzy godziny w suszarce w temperaturze 60 stopni Celsjusza.Po utwardzeniu PDMS usuń formę, wyciągając formę za pomocą cylindra. Wyjmij PDMS z cylindra, przecinając margines formy skalpelem. Umyj PDMS trzykrotnie etanolem i wodą dejonizowaną.Następnie wysuszyć podporę PDMS azotem. Potraktuj dolną powierzchnię podpory PDMS jako hydrofobową, mocząc podporę PDMS w super hydrofobowej powłoce na jedną sekundę. Następnie susz przez dziesięć minut w temperaturze pokojowej.Następnie włóż oczyszczone czteromilimetrowe kapilary do otworów wspornika PDMS, pozostawiając punkt zerowy pięć milimetrów kapilar poza górną powierzchnią wspornika PDMS. Upewnij się, że końce naczyń włosowatych znajdują się na tym samym poziomie. Aby potraktować zewnętrzną powierzchnię kapilar i górną powierzchnię podpory PDMS jako hydrofobową, dodaj 15 mikrolitrów super hydrofobowej powłoki na wierzch powierzchni podpory PDMS.Wysuszyć na powietrzu super hydrofobowy zmodyfikowany układ kapilarny. Następnie dodaj jeden punkt sześć mikrolitrów mieszaniny utrwalającej podkład z jednego zestawu podkładów, aby wypełnić jedną odpowiednią kapilarnę układu kapilarnego zgodnie z wcześniej zaprojektowaną kolejnością. Zakotwiczyć tablicę w przezroczystej studzience na standardowej 96-dołkowej płytce z płaskim dnem i suszyć tablicę w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez co najmniej dwie godziny.Aby zmontować kasetę, umieść adapter ładujący na górze zakotwiczonej tablicy. Upewnij się, że miska adaptera zakrywa tylko odsłonięte części wszystkich dziesięciu naczyń włosowatych. Aby przygotować mieszaninę reakcyjną LAMP, dodaj odczynniki do mieszaniny zgodnie z protokołem tekstowym i wiruj mieszaninę reakcyjną przez pięć sekund po dodaniu kalcyny.Delikatnie odwróć probówkę dwadzieścia razy po dodaniu polimerazy Bst. Śladowe ilości DNA, które istnieją w środowisku, można wyeliminować, czyszcząc je wcześniej jednym molem na litr kwasu solnego przed przekazaniem mieszanki LAMP. Zassać 20 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej LAMP za pomocą standardowej końcówki o pojemności 100 mikrolitrów.Włóż końcówkę do wlotu adaptera ładowania, aby ją zablokować. Delikatnie wstrzyknąć mieszaninę reakcyjną do naczynia adaptera. Mieszanina reakcyjna szybko wypełni naczynie, a następnie automatycznie załaduje naczynia włosowate za pomocą siły kapilarnej.Wyjmij adapter z końcówką zamka i uszczelnij studzienkę przezroczystą folią uszczelniającą kompatybilną z PCR. Następnie inkubuj układ kapilarny w inkubatorze w temperaturze 63 stopni Celsjusza przez godzinę. Aby uzyskać obrazy emisji fluorescencji, użyj latarki UV, aby wzbudzić zdysocjowaną kalcynację do wyemitowania fluorescencji.Przechwytuj obrazy z górnej części układu kapilarnego za pomocą aparatu cyfrowego lub smartfona. Podczas robienia zdjęcia upewnij się, że aparat jest maksymalnie przybliżony na obszar naczyń włosowatych, aby uzyskać wysokiej jakości, wyraźne obrazy. Następnie otwórz obraz za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.A następnie wybierz obraz, pleśń, skalę szarości, tak i obraz, pleśń, 16-bitowy, tak. Wybierz plik, zapisz jako, format, TIFF, aby przekonwertować obraz na 16-bitowy format TIFF. Aby wyodrębnić wartość intensywności fluorescencji, otwórz oprogramowanie do analizy mikromacierzy.Przeciągnij 16-bitowy obraz w formacie TIFF do interfejsu oprogramowania, a następnie wybierz długość fali 532 nanometry i kolor zielony, aby wyświetlić obraz. Następnie utwórz nowy blok, aby zlokalizować sygnał fluorescencyjny z naczyń włosowatych. Wybierz narzędzia, nowe bloki, a następnie umieść liczbę kolumn i wierszy jako jeden do jednego i dwa do pięciu w interfejsach bloków i funkcji osobno.Kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz model obiektów. Następnie dostosuj położenie i średnicę, aby pasowały do obszaru fluorescencji naczyń włosowatych. Wybierz opcję Analizuj, aby wyodrębnić wartość intensywności fluorescencji.Na koniec wybierz plik, zapisz ustawienia jako, aby zapisać dokumenty bloku. Następnie wybierz, zarchiwizuj, zapisz wyniki, aby zapisać wyniki intensywności fluorescencji. Poniżej przedstawiono układ układu kapilarnego.Kapilary od pierwszej do ósmej, poprzedzone zestawami starterów LAMP. Kapilary dziewiąte i dziesiąte reprezentują dwa, brak kontroli startera. Pokazane tutaj jest zdjęcie fluorescencyjne do wykrywania genetycznie zmodyfikowanej kukurydzy, MON863, gdzie zielony kolor reprezentuje dodatnie wzmocnienie LAMP.Udana amplifikacja, przedstawiona tylko w oczekiwanych naczyniach włosowatych pierwszej, szóstej, siódmej i ósmej, bez zanieczyszczenia wśród ślepych naczyń włosowatych. To fluorescencyjne zdjęcie służy do wykrywania mieszanki GMO. Kolor zielony oznaczał dodatnie wzmocnienie LAMP.Udana amplifikacja wykazała się tylko w oczekiwanych naczyniach włosowatych jeden, czwarty, piąty, szósty, siódmy i ósmy bez zanieczyszczenia wśród ślepych naczyń włosowatych. Pokazane tutaj zdjęcie fluorescencyjne służy do wykrywania kukurydzy niemodyfikowanej genetycznie, z zielonym kolorem prezentującym dodatnie wzmocnienie LAMP. Udana amplifikacja wykazała się tylko w oczekiwanej ósemce kapilary i bez zanieczyszczenia wśród ślepych naczyń włosowatych.Po opanowaniu tej procedury wykrywania można ją wykonać w ciągu pięciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wytworzyć kasetę kapilarną w celu wykrywania wielu kwasów nukleinowych.

visual-detection-of-multiple-nucleic-acids-in-a-capillary-array

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Technologia detekcji kolorymetrycznej ampliPHOX jest przedstawiona jako niedroga alternatywa dla detekcji fluorescencyjnej w macierzach mikroukładów. W oparciu o fotopolimeryzację, ampliPHOX wytwarza stałe polimerowe plamki widoczne gołym okiem w zaledwie kilka minut. Wyniki są następnie obrazowane i automatycznie interpretowane za pomocą prostego, a zarazem wydajnego pakietu oprogramowania.

Kolorymetryczna detekcja ampliPHOX na mikrotablicy DNA do wykrywania grypy

W tym filmie analizujemy rozkład wielkości bezkomórkowego DNA lub fragmentów cfDNA za pomocą automatycznej elektroforezy kapilarnej. Technika ta pomaga uzyskać wgląd w profil fragmentów DNA uwalnianych przez komórki nowotworowe podczas apoptozy.

Zautomatyzowana analiza rozkładu wielkości fragmentów cfDNA oparta na elektroforezie kapilarnej: metoda oparta na mikroprocesorze DNA do badania rozkładu wielkości fragmentów DNA wyizolowanych z płynów biologicznych

Ten film opisuje technikę elektroforezy kapilarnej do analizy fluorescencyjnie znakowanych amplikonów PCR uzyskanych z różnych próbek na podstawie ich wielkości. Generuje wzór migracyjny, który określa długości par zasad fragmentów za pomocą znakowanego barwnika fluorescencyjnego w każdym fragmencie.

Elektroforeza kapilarna: technika analizy znakowanych fluorescencyjnie amplikonów reakcji łańcuchowej polimerazy

Ten film demonstruje technologię drukowanej macierzy glikanowej do analizy krążących przeciwciał anty-glikanowych w surowicy myszy. Przeciwciała w surowicy oddziałują ze specyficznymi glikanami na chipie, co potwierdza się za pomocą barwienia immunologicznego, a następnie skanowania fluorescencyjnego.

Wykrywanie krążących przeciwciał anty-glikanowych za pomocą drukowanej matrycy glikanów

Prezentujemy mikroprzepływowy biochip elektrochemiczny do wykrywania hybrydyzacji DNA. Po funkcjonalizacji sondy ssDNA bada się swoistość, czułość i granicę wykrywalności za pomocą komplementarnych i niekomplementarnych celów ssDNA. Wyniki ilustrują wpływ zdarzeń hybrydyzacji DNA na układ elektrochemiczny, przy granicy wykrywalności wynoszącej 3,8 nM.

Mikroprzepływowy biochip elektrochemiczny do bezznacznikowej analizy hybrydyzacji DNA

Ten protokół opisuje wytwarzanie wielkoskalowego, multipleksowanego dwuwymiarowego DNA lub matrycy przeciwciał, z potencjalnymi zastosowaniami w badaniach nad sygnalizacją komórkową i wykrywaniem biomarkerów.

Wytwarzanie mikromacierzy przeciwciał z kodami kreskowymi o dużej gęstości pod kontrolą przepływu

Ta praca przedstawia prostą i wizualną metodę wykrywania polimorfizmów wielonukleotydowych na pneumatycznej platformie do manipulacji kropelkami. Dzięki proponowanej metodzie cały eksperyment, w tym manipulacja kropelkami i wykrywanie polimorfizmów wielonukleotydowych, może być przeprowadzony w temperaturze około 23 °C bez pomocy zaawansowanych urządzeń.

Wizualna detekcja kolorymetryczna polimorfizmów wielonukleotydowych na pneumatycznej platformie do manipulacji kropelkami

W tym artykule prezentujemy i omawiamy nowe osiągnięcia w syntezie i zastosowaniach mikromacierzy kwasów nukleinowych wytwarzanych in situ. W szczególności pokazujemy, w jaki sposób protokoły syntezy DNA można rozszerzyć na RNA i jak można wykorzystać mikromacierze do tworzenia pobieralnych bibliotek kwasów nukleinowych.

Mikromacierze DNA i RNA o dużej gęstości - synteza fotolitograficzna, hybrydyzacja i przygotowanie dużych bibliotek kwasów nukleinowych

Prezentowany tutaj jest protokół dla metody obrazowania fluorescencyjnego, multiplex immunofluorescencyjna metodawykrywania DNA, RNA i proteiny (MICDDRP), metoda zdolna do jednoczesnej fluorescencyjnej wizualizacji pojedynczych komórek białka wirusowego i kwasów nukleinowych o różnym typie i nici. Takie podejście można zastosować do różnych systemów.

Obrazowanie fluorescencyjne z multipleksem pojedynczych komórek w celu wizualizacji wirusowych kwasów nukleinowych i białek oraz monitorowania zakażeń HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika i grypy

Nanomaszyny oparte na DNAzyme mogą być używane do wysoce selektywnego i czułego wykrywania kwasów nukleinowych. W artykule opisano szczegółowy protokół projektowania nanomaszyn opartych na DNAzyme z rdzeniem 10-23 przy użyciu wolnego oprogramowania i ich zastosowania w wykrywaniu fragmentu wirusa Epsteina-Barr jako przykładu.

DNAzyme 10-23 - Nanomaszyny do rozpoznawania kwasów nukleinowych

Naucz się wizualnej detekcji wielu kwasów nukleinowych w układzie kapilarnym do wykrywania GMO. Ta metoda umożliwia szybką, wielokierunkową analizę genetyczną w biotechnologii.

Wizualna detekcja wielu kwasów nukleinowych w układzie kapilarnym

Przeglądaj więcej filmów