Name: Przyleganie bakterii do powierzchni roślin mierzone w laboratorium (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Poznaj metodę pomiaru przylegania bakterii do powierzchni roślin, w tym korzeni i kiełków. Technika ta jest szybka, prosta i ekonomiczna, co czyni ją przydatną w badaniach fitopatologii i bezpieczeństwa żywności.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autor dziękuje Susan Whitfield za przygotowanie figur oraz Camille Martin i Hillary Samagaio za pomoc przy niektórych eksperymentach.

<ol><li>Heaton, J. C., Jones, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+contamination+of+fruit+and+vegetables+and+the+behaviour+of+enteropathogens+in+the+phyllosphere%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microbial contamination of fruit and vegetables and the behaviour of enteropathogens in the phyllosphere: a review.</a> J. Appl. Microbiol. 104, 613-626 (2008).</li>
<li>Beuchat, L. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11932192">Ecological factors influencing survival and growth of human pathogens on raw fruit and vegetables.</a> Microbes Infect. 4, 413-423 (2002).</li>
<li>Berger, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fresh+fruit+and+vegetables+as+vehicles+for+the+transmission+of+human+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fresh fruit and vegetables as vehicles for the transmission of human pathogens.</a> Environ. Microbiol. 12, 2385-2397 (2010).</li>
<li>Lugtenberg, B. J., Chin, A. W. T., Bloemberg, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbe-plant+interactions%3A+principles+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Antonie+Van+Leeuwenhoek%22%5BJournal%5D)">Microbe-plant interactions: principles and mechanisms.</a> Antonie Van Leeuwenhoek. 81, 373-383 (2002).</li>
<li>Preston, G. M., Haubold, B., Rainey, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+genomics+and+adaptation+to+life+on+plants%3A+implications+for+the+evolution+of+pathogenicity+and+symbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bacterial genomics and adaptation to life on plants: implications for the evolution of pathogenicity and symbiosis.</a> Curr. Opin. Microbiol. 1, 589-597 (1998).</li>
<li>Compant, S., Duffy, B., Nowak, J., Clement, C., Barka, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Plant+Growth-Promoting+Bacteria+for+Biocontrol+of+Plant+Diseases%3A+Principles%2C+Mechanisms+of+Action%2C+and+Future+Prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of Plant Growth-Promoting Bacteria for Biocontrol of Plant Diseases: Principles, Mechanisms of Action, and Future Prospects.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 4951-4959 (2005).</li>
<li>Mathews, S. L., Smith, R. B., Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+the+retention+of+pathogenic+Escherichia+coli.+O157+by+sprouts%2C+leaves+and+fruits%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A comparison of the retention of pathogenic Escherichia coli. O157 by sprouts, leaves and fruits.</a> Microb. Biotechnol. 7, 570-579 (2014).</li>
<li>Fuqua, C., Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+studying+bacterial+biofilms+associated+with+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Methods for studying bacterial biofilms associated with plants.</a> Methods Enzymol. 337, 3-18 (2001).</li>
<li>Torres, A. G., Jeter, C., Langley, W., Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+binding+of+Escherchia+coli.O157%3AH7+to+alfalfa%2C+human+epithelial+cells%2C+and+plastic+is+mediated+by+a+variety+of+surface+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Differential binding of Escherchia coli.O157:H7 to alfalfa, human epithelial cells, and plastic is mediated by a variety of surface structures.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 8008-8015 (2005).</li>
<li>Matthysse, A. G., Deora, R., Mishra, M., Torres, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysaccharides+cellulose%2C+poly-beta-1%2C6-n-acetyl-D-glucosamine%2C+and+colanic+acid+are+required+for+optimal+binding+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+strains+to+alfalfa+sprouts+and+K-12+strains+to+plastic+but+not+for+binding+to+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Polysaccharides cellulose, poly-beta-1,6-n-acetyl-D-glucosamine, and colanic acid are required for optimal binding of Escherichia coli O157:H7 strains to alfalfa sprouts and K-12 strains to plastic but not for binding to epithelial cells.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 2384-2390 (2008).</li>
<li>Matthysse, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+cellulose+overproduction+on+binding+and+biofilm+formation+on+roots+by+Agrobacterium+tumefaciens%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">The effect of cellulose overproduction on binding and biofilm formation on roots by Agrobacterium tumefaciens.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 18, 1002-1010 (2005).</li>
<li>Matthysse, A. G., Kijne, J. W. Attachment of Rhizobiaceae to plant cells. <a target="_blank" href="http://www.springer.com/us/book/9780792351801">The Rhizobiaceae</a>. Spaink, H. P., Kondorosi, A., Hooykaas, P. J. J. , Kluwer Academic Press. 235-249 (1998).</li>
<li>Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF01276821">Conditioned medium promotes the attachment of Agrobacterium tumefaciens.strain NT1 to carrot cells.</a> Protoplasma. 183, 131-136 (1994).</li>
<li>Matthysse, A. G., McMahan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+the+Agrobacterium+tumefaciens.+attR+mutation+on+attachment+and+root+colonization+differs+between+legumes+and+other+dicots%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The effect of the Agrobacterium tumefaciens. attR mutation on attachment and root colonization differs between legumes and other dicots.</a> Appl. Environ. Microbiol. 67, 1070-1075 (2001).</li>
<li>Jeter, C., Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+binding+of+diarrheagenic+strains+of+E.+coli.to+plant+surfaces+and+the+role+of+curli+in+the+interaction+of+the+bacteria+with+alfalfa+sprouts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Characterization of the binding of diarrheagenic strains of E. coli.to plant surfaces and the role of curli in the interaction of the bacteria with alfalfa sprouts.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 18, 1235-1242 (2005).</li>
<li>Matthysse, A. G., McMahan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Root+colonization+by+Agrobacterium+tumefaciens+is+reduced+in+cel%2C+attB%2C+attD%2C+and+attR+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Root colonization by Agrobacterium tumefaciens is reduced in cel, attB, attD, and attR mutants.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64, 2341-2345 (1998).</li>
<li>Morton, E. R., Fuqua, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+analyses+of+Agrobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic analyses of Agrobacterium.</a> Curr. Protoc. Microbiol. , Chapter 3 (2012).</li>
<li>Brandl, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+lesions+promote+the+rapid+multiplication+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+on+postharvest+lettuce%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Plant lesions promote the rapid multiplication of Escherichia coli O157:H7 on postharvest lettuce.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 5285-5289 (2008).</li>
<li>Franz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+contamination+of+lettuce+by+GFP-expressing+Escherichia+coli+O157%3AH7+and+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quantification of contamination of lettuce by GFP-expressing Escherichia coli O157:H7 and Salmonella enterica serovar Typhimurium.</a> Food Microbiol. 24, 106-112 (2007).</li>
<li>Morton, E. R., Fuqua, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+maintenance+of+Agrobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Laboratory maintenance of Agrobacterium.</a> Curr. Protoc. Microbiol. , Chapter 1 (2012).</li>
<li>Lugtenberg, B. J., Kravchenko, L. V., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomato+seed+and+root+exudate+sugars%3A+composition%2C+utilization+by+Pseudomonas+biocontrol+strains+and+role+in+rhizosphere+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Tomato seed and root exudate sugars: composition, utilization by Pseudomonas biocontrol strains and role in rhizosphere colonization.</a> Environ. Microbiol. 1, 439-446 (1999).</li>
<li>Murashige, T., Skoog, F. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1399-3054.1962.tb08052.x/abstract">A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures.</a> Physiologia Plantarum. 15, 473-497 (1962).</li>
<li>Danhorn, T., Fuqua, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+by+plant-associated+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation by plant-associated bacteria.</a> Annu. Rev. Microbiol. 61, 401-422 (2007).</li>
<li>Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15639628">Biofilms: the matrix revisited.</a> Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).</li>
<li>O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+formation+as+microbial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilm formation as microbial development.</a> Annu. Rev. Microbiol. 54, 49-79 (2000).</li>
<li>Charkowski, A. O., Barak, J. D., Sarreal, C. Z., Mandrell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+growth+of+Salmonella+enterica+and+Escherichia+coli+O157%3AH7+on+alfalfa+sprouts%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Differences in growth of Salmonella enterica and Escherichia coli O157:H7 on alfalfa sprouts.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 3114-3120 (2002).</li>
<li>Loper, J., Suslow, T., Schroth, M. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/240593829_Lognormal_Distribution_of_Bacterial_Populations_in_the_Rhizosphere">Lognormal distribution of bacterial populations in the rhizosphere.</a> Phytopathology. 74, 1454-1460 (1984).</li>
<li>Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+of+Agrobacterium+to+plant+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Attachment of Agrobacterium to plant surfaces.</a> Front Plant Sci. 5, 252(2014).</li>
<li>Douglas, C. J., Halperin, W., Nester, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+tumefaciens+mutants+affected+in+attachment+to+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium tumefaciens mutants affected in attachment to plant cells.</a> J. Bacteriol. 152, 1265-1275 (1982).</li>
<li>Tomlinson, A. D., Fuqua, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+regulation+of+polar+surface+attachment+in+Agrobacterium+tumefaciens%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and regulation of polar surface attachment in Agrobacterium tumefaciens.</a> Curr. Opin. Microbiol. 12, 708-714 (2009).</li>
<li>Matthysse, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+of+Agrobacterium+to+plant+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Attachment of Agrobacterium to plant surfaces.</a> Front Plant Sci. 5, (2014).</li>
<li>Wright, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endophytic+lifestyle+of+Escherichia+coli+O157%3AH7%3A+quantification+and+internal+localization+in+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">The endophytic lifestyle of Escherichia coli O157:H7: quantification and internal localization in roots.</a> Phytopathology. 103, 333-340 (2013).</li>
<li>Berger, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fresh+fruit+and+vegetables+as+vehicles+for+the+transmission+of+human+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fresh fruit and vegetables as vehicles for the transmission of human pathogens.</a> Environ. Microbiol. 12, 2385-2397 (2010).</li>
<li>Erickson, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internalization+and+Fate+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+in+Leafy+Green+Phyllosphere+Tissue+Using+Various+Spray+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food+Prot%22%5BJournal%5D)">Internalization and Fate of Escherichia coli O157:H7 in Leafy Green Phyllosphere Tissue Using Various Spray Conditions.</a> J. Food Prot. 77, 713-721 (2014).</li>
<li>McKellar, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+different+approaches+for+modeling+Escherichia+coli+O157%3AH7+survival+on+field+lettuce%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of different approaches for modeling Escherichia coli O157:H7 survival on field lettuce.</a> Int. J. Food Microbiol. 184, 75-85 (2014).</li>
<li>Wu, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+the+detection+and+enumeration+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+on+alfalfa+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Factors influencing the detection and enumeration of Escherichia coli O157:H7 on alfalfa seeds.</a> Int. J. Food Microbiol. 71, 93-99 (2001).</li>
</ol>

Autorka oświadcza, że nie ma konkurencyjnych interesów finansowych.

Ważne jest, aby zdawać sobie sprawę ze wszystkich powierzchni, do których mogą przylegać bakterie podczas eksperymentu. W związku z tym bakterie, które są zdolne do wiązania się ze szkłem, mogą być niedoszacowane, jeśli liczenie żywotnych komórek odbywa się za pomocą szklanych probówek i pipet. Jeśli rośliny są uprawiane w agarze lub glebie, a część agaru lub gleby pozostaje na roślinach, bakterie mogą wiązać się z przylegającym materiałem, a nie z roślinami. Z drugiej strony, mycie powierzchni rośliny, szczególnie w przypadku korzeni, może usunąć naturalne powłoki powierzchniowe, takie jak śluz, a tym samym zmienić wyniki testów przylegania.
Ważne jest, aby mieć pewność, że bakterie dodane do mieszaniny inkubacyjnej pozostaną żywe podczas eksperymentu. W związku z tym należy rutynowo przeprowadzać zliczanie żywotnych komórek zarówno wolnych, jak i przyłączonych bakterii. Niektóre terapie lub mutacje bakteryjne mogą zmniejszać tempo wzrostu bakterii lub faktycznie powodować śmierć części populacji bakterii. Żywe i martwe bakterie mogą nie być rozróżnialne w mikroskopie, chyba że zostaną użyte specjalne barwniki. Istnieje przydatny zestaw barwników dla żywych/martwych bakterii, który zależy od wykluczenia barwników z żywych bakterii. Jeśli jednak obecna jest mieszana populacja gatunków bakterii, liczba żywotnych komórek gatunków będących przedmiotem zainteresowania będzie prawdopodobnie najłatwiejszą metodą określenia, czy inkubacja doprowadziła do śmierci bakterii.
Skład podłoża wpłynie na przetrwanie i wzrost bakterii. Wysięk korzeniowy i materiały uwolnione z ran i miejsc skaleczeń zapewnią podłoże do wspierania umiarkowanego wzrostu bakterii. Fosforany, azot i żelazo wydają się być ograniczające w tych warunkach. Kationy dwuwartościowe, takie jak wapń i magnez, mogą wpływać na adhezję. W niektórych przypadkach źródło węgla może wpływać na przyczepność. Znaczenie ma również pH. Ogólnie rzecz biorąc, pH ryzosfery wynosi od 5,5 do 6,5.
Należy zachować ostrożność w stosowaniu bakterii charakteryzujących się opornością na antybiotyki. Najczęściej stosowanymi antybiotykami są ryfampicyna i kwas nalidyksowy. Oporność na te antybiotyki jest na ogół spowodowana mutacjami w genach chromosomowych (odpowiednio polimeraza RNA i gyraza), a zatem nie może być łatwo przeniesiona na inny szczep podczas inkubacji. Ten rodzaj oporności nie powoduje również degradacji ani modyfikacji antybiotyku. Znakowanie bakterii markerem genowym plazmidowym nie jest zalecane, chyba że plazmid nie może zostać przeniesiony na żadną inną bakterię. Oporność na antybiotyki nie może być spowodowana degradacją lub modyfikacją chemiczną antybiotyku, ponieważ bakterie wrażliwe na antybiotyki będą mogły rozwijać się na płytkach z antybiotykiem, jeśli znajdą się w pobliżu opornych bakterii.
Metody opisane w tym artykule są przydatne w przypadku małych prób i/lub eksperymentów, w których próbki muszą być zawarte (na przykład eksperymenty z udziałem ludzkich patogenów). W przypadku dużych rozmiarów próbek (powyżej 100 g materiału lub więcej niż 50 roślin) potrzebne byłyby inne metody lub drastyczna modyfikacja tych metod 10,19,32,19,33,34,35,36. Obecność dużej liczby mikroorganizmów innych niż badane gatunki również może stwarzać poważne problemy. Możliwe rozwiązania obejmują wykorzystanie bakterii oznaczonych opornością na białka fluorescencyjne lub antybiotyki, jak opisano w krokach 6.1.2 i 7.3. Jednakże, gdy interesujące nas bakterie są rzadkimi osobnikami w dużej populacji innych mikroorganizmów, markery te mogą nie być wystarczające, aby umożliwić jednoznaczną ocenę liczby badanych bakterii.
Wszystkie opisane tutaj metody są metodami laboratoryjnymi. Do badań szklarniowych potrzebne byłyby drobne modyfikacje. Bardziej znaczące modyfikacje będą prawdopodobnie wymagane w przypadku badań terenowych, w których drapieżnictwo pierwotniaków, owadów i innych zwierząt oraz zmienność klimatu komplikują zapewnienie określonych warunków dla doświadczeń. W przyszłości metody te mogą zostać rozszerzone o interakcje dwóch lub więcej mikroorganizmów na powierzchni rośliny.

Pomiar wiązania bakterii z powierzchniami roślin stał się ważny w trzech różnych sytuacjach. Pierwszą sytuacją jest badanie przenoszenia ludzkich patogenów na powierzchniach roślin1,2,3. Celem jest zapobieżenie wiązaniu się bakterii lub usunięcie lub zabicie związanych bakterii, a tym samym ograniczenie przenoszenia chorób przez materiał roślinny. Drugą sytuacją jest badanie wiązania patogenów roślinnych z powierzchniami roślin4. Po raz kolejny celem jest zapobieżenie wiązaniu lub usunięcie lub zabicie związanych bakterii, a tym samym ograniczenie choroby. Trzecią sytuacją jest badanie wiązania się bakterii symbiotycznych lub wspomagających wzrost roślin5,6. Celem jest pobudzenie wiązania bakterii, a tym samym zwiększenie zdrowotności roślin i plonów.
Techniki pomiaru wiązania bakterii z powierzchniami roślin opisane w tym artykule są tanie i stosunkowo łatwe do przeprowadzenia. Jedyne wymagania to mikroskop i materiały, które zwykle można znaleźć w laboratorium bakteriologicznym. W przypadku niektórych technik przydatny jest sonikator do kąpieli. Opisane techniki przeznaczone są do eksperymentów wiążących przeprowadzanych przy stosunkowo małych rozmiarach prób. Pomiary wiązania są wykonywane w laboratorium, chociaż możliwe jest zmodyfikowanie niektórych z tych technik do użytku w szklarni lub w terenie.
Te techniki zostały użyte do zmierzenia wiązania bakterii z korzeniami, kiełkami, ściętymi liśćmi, ciętymi owocami i nienaruszonymi pomidorami koktajlowymi w laboratorium7,8,9,10,11,12,13,14, 15. Zostały one również wykorzystane do pomiaru kolonizacji korzeni roślin rosnących w glebie lub piasku w laboratorium16. Techniki te zostały wykorzystane w przypadku wielu gatunków bakterii, w tym Agrobacterium tumefaciens, Sinorhizobium meliloti, Escherichia coli, Salmonella enterica i Pseudomonas fluorescens. Przydatny opis metod oceny interakcji A. tumefaciens z powierzchniami można znaleźć w Morton and Fuqua (2012)17. We wszystkich przypadkach wielkość próby była niewielka, na ogół mniejsza niż 25 - 50 roślin. Opisane techniki są odpowiednie do stosowania w odniesieniu do ludzkich czynników chorobotwórczych, które muszą być przechowywane w sposób zamknięty podczas doświadczeń.

<table><tbody><tr><td>pomocny jest mikroskop świetlny</td>, <td>dowolny</td><td>kontrast fazowy N/A lub optyka Nomarski, do badań z użyciem markerów fluorescencyjnych wymagany jest mikroskop fluorescencyjny.</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nasiona dowolne&nbsp;</td><td>Nie</td> dotyczy <td>zanotuj numer partii nasion i odmianę</td></tr><tr><td>wybielacz</td><td>dowolny</td> sonograf <td>do kąpieli N/A</td><td></td></tr><tr><td></td><td>dowolna firma zajmująca się zaopatrzeniem naukowym</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>agar odżywczy&nbsp;</td><td>Difco&nbsp;</td><td>001-01-8</td><td></td></tr><tr><td>sojton</td><td>Difco&nbsp;</td><td>24360</td><td></td></tr><tr><td>Piasek</td><td>morski Fisher Scientific</td><td>S25</td><td></td></tr><tr><td>piasek</td><td>&nbsp; Uchwyty Sigma-Aldrich</td><td>S9887</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Stuewe & Synowie, Inc.</td><td>Szyszki Ray-Leach</td><td>dostępnych jest wiele różnych rozmiarów, aby dopasować się do rodzaju rośliny, którą chcesz uprawiać</td></tr><tr><td>parafilm</td>, <td>dowolna firma naukowa zajmująca się zaopatrzeniem</td> Sole MS N<td>/A</td><td></td></tr> Parrafina <tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td></td><td>dowolna</td> wirówka <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td></td><td>dowolna firma naukowa</td><td>Nie</td> dotyczy do <td>granulowania większości bakterii tylko mała wirówka o maksymalnej sile 10 000 XG jest potrzebny</td></tr><tr><td>mieszalnik wirowy</td><td>dowolny mikrometr firmy</td><td></td><td></td>naukowej</tr><tr><td></td><td>ACCU-SCOPE Akcesoria</td><td>A3145</td><td></td></tr><tr><td>Cela licząca krokwi Sedgwick</td><td>Hauser Scientific</td><td>HS3800</td><td></td></tr><tr><td>sonda-klips prasowo-uszczelniająca komora inkubatynowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359483</td><td></td></tr><tr><td>ryfampicyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>kwas naladiksowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>n8878</td><td></td></tr><tr><td>Żywa/martwa plama</td><td>Biosondy molekularne In Vitrogen</td><td>L7007</td><td></td></tr></tbody></table>

przyleganie bakterii do powierzchni roślin mierzone w laboratorium

Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory

Ten manuskrypt opisuje metodę pomiaru wiązania bakterii z powierzchniami roślin aksenicznych w mikroskopie świetlnym i za pomocą zliczania żywych komórek. Użyte materiały roślinne to korzenie, kiełki, liście i cięte owoce. Opisane metody są niedrogie, łatwe i odpowiednie dla małych próbek. Wiązanie jest mierzone w laboratorium i można stosować różne podłoża i warunki inkubacji. Wpływ inhibitorów można określić. Można również ocenić sytuacje, które sprzyjają wiązaniu się i je hamują. W niektórych przypadkach możliwe jest rozróżnienie, czy różne warunki zmieniają wiązanie, głównie ze względu na ich wpływ na roślinę, czy na bakterie.

A. tumefaciens kolonizuje powierzchnie korzeni. Aby określić, czy produkcja celulozy przez bakterie odgrywa rolę w kolonizacji korzeni, zbadano wpływ mutacji bakteryjnych uniemożliwiających syntezę celulozy16. Zastosowano techniki opisane w krokach 1.3 i 7.1. Nasiona pomidora poddano sterylizacji powierzchniowej i kiełkowano w wodzie sterylnej. Gdy korzenie osiągnęły długość około 2 cm, zanurzano je w zawiesinie zawierającej 105 bakterii na mL, a następnie sadzono w pasteryzowanym podłożu w pojemnikach. Rośliny uprawiano przez 14 dni w temperaturze 25 °C w cyklu 12 godzin światła i 12 godzin ciemności. Po upływie określonych czasów rośliny wyjmowano z pojemników. Korzenie przemywano i poddawano sonikacji w sonikatorze wanny w celu usunięcia przytwierdzonych bakterii. Liczbę bakterii oznaczano metodą liczby żywych komórek. Rycina 2 przedstawia wpływ dwóch różnych mutacji pozbawionych zdolności wytwarzania celulozy na zdolność bakterii do kolonizacji korzeni pomidora. Mimo że odchylenia standardowe niektórych pomiarów sięgały nawet 0,9 log10 (powszechny problem przy tym typie pomiarów), zmniejszenie przyłączania się mutantów pozbawionych celulozy jest wyraźnie widoczne, co pozwala wnioskować, że produkcja celulozy przez bakterie wspomaga je w kolonizacji korzeni pomidora.
<img alt="Wykres tendencji wzrostu; logarytm średniej vs. dzień; szczepy C58; analiza danych; wyniki badań biologicznych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 2"> 
Rycina 2: Kolonizacja korzeni przez typ dziki oraz mutanty pozbawione celulozy u A. tumefaciens. Log10  całkowitej liczby bakterii na centymetr długości korzenia wyizolowanych z korzeni pomidora zainokulowanych typem dzikim A. tumefaciens szczepem C58 oraz mutantami pozbawionymi celulozy C58:1 i C58:A60. Wykazane liczby są średnimi z co najmniej czterech niezależnych eksperymentów. Słupki oznaczają odchylenia standardowe średnich. Inokulację korzeni przeprowadzono poprzez zanurzenie ich na jedną minutę w zawiesinie zawierającej 105 bakterii na mL. Rośliny hodowano w pojemnikach, a słabo przylegające bakterie usuwano poprzez płukanie korzeni w buforze płuczącym w fiolce szklanej. Silnie przylegające bakterie usuwano za pomocą sonikatora kąpielowego, a uzyskaną zawiesinę posiewano w celu określenia liczby żywych komórek16. Rycina została zmodyfikowana na podstawie danych Matthysse i McMahan. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Zbadano rolę egzopolisacharydów w przyłączaniu się E. coli oraz innych bakterii do kiełków lucerny. Niektóre przypadki występowania biegunek spowodowanych przez E. coli O157:H7 zostały powiązane z zanieczyszczonymi kiełkami lucerny. Przyłączanie się bakterii typu dzikiego oraz mutantów niezdolnych do wytwarzania różnych egzopolisacharydów mierzono za pomocą metod opisanych w krokach 1.1, 5.1 i 7.2. Kiełki lucerny sterylizowano na powierzchni i kiełkowano przez jeden dzień w wodzie sterylnej w temperaturze 25 °C w ciemności. Cztery kiełki z przylegającymi łupinami nasion umieszczono w sterylnych szklankach plastikowych zawierających 5 mL wody. Dodano bakterie hodowane w bulionie Lurii do końcowego stężenia około 5 x 103 na mL. Zainfekowane kiełki inkubowano przez 3 dni w temperaturze 25 °C w ciemności. Kiełki przemywano dwukrotnie 5 mL sterylnej wody w probówce przez intensywne odwracanie, a następnie homogenizowano w buforze do mycia za pomocą napędzanego silnikiem homogenizatora teflonowego szklanego. Wcześniejsze eksperymenty z wykorzystaniem bakterii oznaczonych plazmidem zawierającym gen GFP nie wykazały obecności bakterii wewnętrznych, podczas gdy bakterie powierzchniowe były łatwo obserwowalne. Wyniki przedstawiono w Tabeli 1. Zbadano dwa szczepy E. coli O157:H7. U obu szczepów produkcja poli-β-1,6-glukuronianu (PGA) wydawała się wnosić największy wkład w przyłączanie się patogennych E. coli do powierzchni roślin. Kwas kolowy również odgrywał istotną rolę w przyłączaniu. Choć zmniejszenie przyłączania się u mutantów pozbawionych celulozy było istotne, nie było ono tak duże jak w przypadku dwóch innych polisacharydów.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Wpływ mutacji w genach odpowiedzialnych za produkcję egzopolisacharydów na wiązanie się E. coli O157:H7 z kiełkami i otwartymi łupinami nasion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Odmiana bakterii</td>
			<td rowspan="2">Mutacja lub genotyp (istotny fenotyp)</td>
			<td colspan="2">Log10 liczba bakterii związanych na kiełek lub łupinę nasion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kiełki lucernyb</td>
			<td>Otwarte łupiny nasion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>86-24</td>
			<td>Brak (typ dziki)</td>
			<td>4,7 ± 0,6</td>
			<td>5,6 ± 0,2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8624N</td>
			<td>yhjN (minus celuloza)</td>
			<td>2,9 ± 0,7c</td>
			<td>3,5 ± 0,6c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8624C</td>
			<td>wcaD (minus kwas kolowy)</td>
			<td>1,8 ± 0,7c</td>
			<td>2,4 ± 0,5c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8624P</td>
			<td>pgaC (minus PGA)</td>
			<td>&lt;1,0c</td>
			<td>1,0 ± 1,0c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEC4A</td>
			<td>Brak (typ dziki)</td>
			<td>5,6 ± 0,2</td>
			<td>6,1 ± 0,3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEC4AN</td>
			<td>yhjN (minus celuloza)</td>
			<td>4,8 ± 0,8d</td>
			<td>4,1 ± 0,8d</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEC4AC</td>
			<td>wcaD (minus kwas kolowy)</td>
			<td>3,9 ± 0,5c</td>
			<td>4,8 ± 0,8d</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEC4AP</td>
			<td>pgaC (minus PGA)</td>
			<td>&lt;1,0c</td>
			<td>1,2 ± 0,7c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">a średnia ± odchylenie standardowe co najmniej trzech pomiarów liczby (log10) bakterii związanych po 3 dniach.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">b Kiełki były płukane przed pomiarem.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">c Istotna różnica względem typu dzikiego: P &lt;0,01.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">d Istotna różnica względem typu dzikiego: P &lt;0,05.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Tabela została zmodyfikowana na podstawie pracy Matthysse, Deora, Mishra i Torres10.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Wpływ mutacji w genach odpowiedzialnych za produkcję egzopolisacharydów na przyłączanie się szczepów E. coli O157:H7 do kiełków. Aby określić rolę różnych egzopolisacharydów i lipopolisacharydu w przyłączaniu się patogennych szczepów E. coli O157:H7 do kiełków lucerny, zbadano przyłączanie się zestawu mutantów do kiełków oraz otwartych łupin nasion metodami opisanymi w kroku 6. Wyniki wykazały, że poli-ß-1,6-N-acetylo-D-glukozaamina (PGA) wydaje się być niezbędna do przyłączania się do kiełków, a zarówno celuloza, jak i kwas kolaniczny są wymagane do maksymalnego przywiązania się E. coli O157. Tabela została zmodyfikowana na podstawie danych Matthysse, Deora, Mishra i Torres10.
Aby określić, czy produkcja PGA jest wystarczająca, by spowodować przyłączanie bakterii do powierzchni roślin, wprowadzono plazmid (pMM11) zawierający sklonowany operon kodujący geny niezbędne do produkcji PGA do dwóch różnych bakterii, które normalnie nie potrafią przyłączać się do korzeni pomidora10. A. tumefaciens A1045 to mutant dzikiego szczepu C58, który nie wytwarza cyklicznego-β-1,2-glukanu i nie przyłącza się do powierzchni roślin29. Sinorhizobium meliloti 1021, który tworzy brodawki korzeniowe na lucerni, nie przyłącza się do roślin niemotylkowych, w tym do pomidora12. Techniki opisane w krokach 1.1, 5.1, 6.3 i 7.1 zastosowano w celu ustalenia, czy zdolność do wytwarzania PGA ogólnie zwiększa przyłączanie bakterii do powierzchni korzeni. Nasiona pomidora poddano sterylizacji powierzchniowej i kiełkowano w wodzie sterylnej. Korzenie pokrojono na odcinki długości 1 cm i umieszczono w wodzie sterylnej, a następnie zaszczepiono bakteriami. Ponieważ obie te bakterie rosną w różnym tempie, przyłączanie mierzono w różnych czasach, aby w przybliżeniu wyrównać ilość wzrostu bakterii. Obecność plazmidu pMM11 spowodowała podobny, istotny wzrost liczby przyłączonych bakterii obu gatunków (Tabela 2)10. Istotny wzrost przyłączania zaobserwowano również w mikroskopie świetlnym, jednak sposób przyłączania był zupełnie inny dla obu gatunków (Rycina 3). A. tumefaciens A1045 przyłączał się pojedynczo do powierzchni korzenia. S. meliloti przyłączał się w dużych skupiskach, z których tylko nieliczne bakterie były bezpośrednio połączone z korzeniem, podczas gdy większość bakterii przylegała do innych bakterii. Ten przykład pokazuje, że analiza wyłącznie liczby przyłączonych bakterii bez uwzględnienia obserwacji mikroskopowych może prowadzić do mylącego obrazu wyników eksperymentu. Choć obie metody (liczenie żywych komórek i obserwacje mikroskopowe) wskazują, że plazmid pMM11 zwiększa przyłączanie bakterii do korzeni pomidora, rodzaj tego przyłączania wynikający z produkcji PGA był różny dla obu gatunków bakterii10.
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="3">Wpływ plazmidu pMM11 na przyłączanie bakterii do korzeni pomidora</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Szczep bakterii</td>
			<td>Plazmid</td>
			<td>Liczba bakterii przyłączonych na mm długości korzenia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A. tumefaciens A1045a</td>
			<td>brak</td>
			<td>0,25 x 103 ± 0,25 x 103</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>pBBR1mcs (wektor)</td>
			<td>0,25 x 103 ± 0,25 x 103</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>pMM11 (synteza PGA)</td>
			<td>10 x 103 ± 0,25 x 103</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. meliloti 1021b</td>
			<td>brak</td>
			<td>nie wykryto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>pBBR1mcs (wektor)</td>
			<td>nie wykryto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>pMM11 (synteza PGA)</td>
			<td>50 x 103 ± 5 x 103</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">a Przyłączanie bakterii mierzono po 2 godzinach</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">b Przyłączanie bakterii mierzono po 18 godzinach</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">Tabela została zmodyfikowana z pracy Matthysse, Deora, Mishra i Torres10.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Wpływ plazmidu zawierającego geny syntezy PGA na przyłączanie się A. tumefaciens A1045 oraz S. meliloti 1021 do odcinków korzeni pomidora. Aby zbadać zdolność poli-ß-1,6-N-acetylo-D-glukozyloaminy (PGA) do promowania przyłączania bakterii do korzeni roślin, analizowano wpływ plazmidu nadającego zdolność do wytwarzania PGA (pMM11) na przyłączanie się dwóch szczepów bakterii związanych z roślinami do korzeni pomidora. Żaden ze szczepów nie wykazywał istotnego przyłączania się do korzeni pomidora w przypadku braku plazmidu ani w obecności plazmidu pozbawionego genów kodujących syntezę PGA (pBBR1mcs). Wprowadzenie plazmidu zawierającego geny syntezy PGA zwiększyło przyłączanie się obu typów bakterii. Ponieważ A. tumefaciens rośnie szybciej niż S. meliloti, przyłączanie mierzono po 2 godzinach inkubacji dla A. tumefaciens i po 18 godzinach dla S. meliloti. Zastosowane techniki opisano w kroku 7. Tabela została zmodyfikowana na podstawie pracy Matthysse, Deora, Mishra i Torres10.
<img alt="Obrazy mikrostruktury komórkowej; analiza mikroskopowa włókien włosowych w skali 10 µm, pokazująca szczegóły strukturalne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
Rycina 3: Wpływ plazmidu pMM11 zawierającego geny biosyntezy PGA na wiązanie się A. tumefaciens A1045 oraz S. meliloti 1021 do włosków korzeni pomidora. Wiązanie z włoskami korzeni pomidora: A) A. tumefaciens A1045, B) A. tumefaciens A1045 pMM11, C) S. meliloti 1021 oraz D) S. meliloti 1021 pMM11. Chociaż wzrost wiązania obu gatunków bakterii jest mniej więcej podobny, szczegóły tego wiązania obserwowane w mikroskopie świetlnym są dość różne. Zastosowane techniki opisano w kroku 6. Obraz zmodyfikowano na podstawie pracy Matthysse, Deora, Mishra i Torres10. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego obrazu.</a>
Czasami możliwe jest wykorzystanie wiązania do powierzchni niemieszczących się w kategorii biologicznych, aby ułatwić odróżnienie wkładu bakterii i rośliny w konkretną interakcję. Wykazano, że jednobiegunowy polisacharyd (UPP) A. tumefaciens może pośredniczyć w wiązaniu bakterii do różnorodnych powierzchni zarówno biologicznych, jak i niemieszczących się w kategorii biologicznych30. Obserwowano, że wapń hamuje wiązanie A. tumefaciens do powierzchni roślinnych za pośrednictwem UPP28. Aby określić, czy hamowanie wiązania bakterii do powierzchni roślinnych przez jony wapnia wynika ze skutku działania na bakterie czy na powierzchnię rośliny, zbadano wiązanie bakterii do nici nylonowych. Zastosowano techniki opisane w kroku 8.2. Nasiona pomidora poddano sterylizacji powierzchniowej i wykiełkowano w wodzie, jak opisano w kroku 1. Bakterie hodowano w pożywce minimalnej z sacharozą i dodano do korzeni pomidora lub nici nylonowych w końcowym stężeniu około 105/mL, jak opisano w kroku 5.1. Wpływ dodanego CaCl2 na wiązanie bakterii do korzeni pomidora i nici nylonowych obserwowano pod mikroskopem. Rycina 4 pokazuje podobne hamowanie wiązania przez wapń przy użyciu obu powierzchni, co sugeruje, że działanie wapnia dotyczy przede wszystkim bakterii10.
<img alt="Obraz mikroskopowy strzępek grzybów, skala 10 µm, analiza strukturalna, badanie morfologii komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56599/56599fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4"> 
Rycina 4: Wpływ wapnia na wiązanie się A. tumefaciens z włoskami korzeniowymi pomidora oraz nitkami poliamidowymi. A. tumefaciens hodowano z korzeniami pomidora (A i B) lub z nitkami poliamidowymi (C i D) przez 24 godziny w roztworze zawierającym sól MS rozcieńczoną 1:10 oraz minimalne medium AB rozcieńczone 1:20 z dodatkiem 0,4% sacharozy (A i C) albo w roztworze zawierającym sól MS rozcieńczoną 1:10 oraz minimalne medium AB rozcieńczone 1:20 z dodatkiem 0,4% sacharozy i 60 mM CaCl2 (B i D)31. Dodane CaCl2 hamowało wiązanie bakterii zarówno z korzeniami, jak i z nitkami poliamidowymi, co sugeruje, że inhibicja była przede wszystkim spowodowana wpływem na bakterie, a nie na powierzchnię rośliny. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56599/56599fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Prosta metoda pomiaru i charakteryzowania przyczepności bakterii do roślin, szczególnie korzeni i pędów, jest opisana w tym artykule.

Przyleganie bakterii do powierzchni roślin mierzone w laboratorium

This manuscript describes a method to measure bacterial binding to axenic plant surfaces in the light microscope and through the use of viable cell ...

Ogólnym celem tej procedury jest obserwacja miary wiązania bakterii z powierzchniami roślin. Metoda ta może odpowiedzieć na ważne pytania zarówno w patologii roślin, jak i w bezpieczeństwie żywności. W szczególności może odpowiedzieć na pytania dotyczące tego, w jaki sposób bakterie wiążą się z powierzchniami roślin i jak można je usunąć.Główną zaletą tej techniki jest to, że jest łatwa, szybka i niedroga. Aby przygotować sadzonki uprawiane w wodzie, umieść niewielką liczbę nasion w szklanej zlewce o pojemności 30, 50, 100 lub 150 mililitrów. Tutaj używane są nasiona pomidorów.Przykryj nasiona 80% etanolem i krótko zamieszaj. Następnie pozwól nasionom moczyć się przez minutę. Odlej etanol i zanurz nasiona w roztworze 50% komercyjnego wybielacza i 0,1% Triton X-100 oraz wody z kranu.Pozwól nasionom moczyć się przez 20 minut lub dłużej, jeśli nasiona są duże, jak nasiona fasoli. Odlej mieszankę wybielacza i umyj nasiona trzy razy sterylną wodą, pozwalając nasionom moczyć się w wodzie przez jedną minutę przy każdym myciu. Wlej nasiona i niewielką ilość wody do sterylnej szalki Petriego i inkubuj nasiona w ciemności, aż sadzonki osiągną pożądany rozmiar, od jednego centymetra do 10 centymetrów.Aby przygotować nasiona lub sadzonki wyhodowane w piasku, po wysterylizowaniu nasion i materiałów nasadzeniowych należy zaszczepić nasiona lub sadzonki bakteriami zgodnie z protokołem tekstowym. Za pomocą sterylnego szklanego pręta zrób płytką dziurę w piasku na tyle głęboką, aby umieścić nasiona pod powierzchnią. Umieść nasiona w dołku i przykryj je cienką warstwą piasku.Następnie użyj folii uszczelniającej, aby uszczelnić górną część pojemnika, aby zapobiec utracie wody i przedostawaniu się dodatkowych drobnoustrojów. Uprawiaj rośliny w laboratorium pod światłem lub w szklarni w temperaturze i długości dnia odpowiedniej dla gatunku i odmiany rośliny. Posadź sadzonki w piasku.Użyj sterylnego szklanego pręta, aby zrobić otwór. Następnie za pomocą sterylnego szydełka ze stali nierdzewnej ostrożnie wprowadź korzeń do otworu i użyj piasku do wypełnienia boków otworu. Po inkubacji roślin z bakteriami zgodnie z protokołem tekstowym należy przygotować próbkę do mikroskopii, umieszczając ją w kropli wody lub pożywce inkubacyjnej na szkiełku mikroskopowym i bezpośrednio ją obserwować.Jeśli nie ma widocznych wolnych bakterii, mogło dojść do obumarcia bakteryjnego lub związania się bakterii z pojemnikiem, w którym przeprowadzono inkubację. Umyć próbkę w wodzie lub pożywce inkubacyjnej, umieszczając ją w fiolce z płynem i delikatnie odwracając fiolkę. Następnie umieść próbkę na szkiełku mikroskopowym w świeżym płynie do obserwacji.Aby zamontować próbkę, użyj zwykłego szkiełka nakrywkowego. Jeśli próbka jest gruba i tworzy wybrzuszenie, dodaj ciecz i próbkę do dołka prasy, nałóż szkiełko nakrywkowe, które ma pierścień z gumy lub tworzywa sztucznego wokół krawędzi. Umieść szkiełko na górze i delikatnie dociśnij, aby uszczelnić szkiełko nakrywkowe do szkiełka.Odwróć szkiełko, aby zbadać próbkę. Alternatywnie użyj szkiełka do liczenia glonów i szkiełka nakrywkowego w podobny sposób i oglądaj w powiększeniu nie większym niż 20. Aby określić liczbę żywotnych bakterii znalezionych w roślinach rosnących w piasku, zacznij od usunięcia materiału uszczelniającego z góry i dołu pojemnika.Umieść pojemnik na kawałku sterylnego papieru i delikatnie uderz pojemnikiem o powierzchnię, aby poluzować piasek, a następnie delikatnie podnieś piasek z rośliną z pojemnika. Gdy cylinder piasku i roślina są wolne na papierze, rozłup piasek na środku, aby odsłonić korzeń rośliny. W razie potrzeby pobierz próbki piasku z okolic krawędzi pojemnika, a także z okolic korzenia.Może to być przydatne do określenia rozprzestrzeniania się, akumulacji i wzrostu bakterii. Podnieś korzeń i usuń piasek i bakterie, które są luźno przylegające, zanurzając korzeń w odmierzonej objętości wody lub bufora i delikatnie potrząsając. Określ liczbę żywotnych komórek bakterii w otrzymanej zawiesinie, posiewając ją na odpowiednich podłożach, takich jak agar luria.Reprezentuje to liczbę bakterii luźno związanych z korzeniem. Na koniec usuń ściśle związane bakterie za pomocą sonikacji i określ ich liczbę. Ten wykres pokazuje wpływ dwóch różnych mutacji celulozy minus na zdolność bakterii do kolonizacji korzeni pomidora.Chociaż odchylenia standardowe niektórych pomiarów wynosiły nawet 0,9 logarytmu o podstawie 10, zmniejszenie wiązania celulozy minus mutanty jest wyraźnie widoczne. W tym eksperymencie zmierzono wiązanie z kiełkami lucerny dzikiego typu E.Coli 0157:H7 u mutantów niezdolnych do wytwarzania różnych egzopolisacharydów. W obu szczepach produkcja kwasu poli-beta one six glucuronowego (PGA) wydawała się w największym stopniu przyczyniać się do wiązania patogennych bakterii E. coli z powierzchniami roślin.Kwas kolanowy również odgrywał znaczącą rolę w wiązaniu. W tym przypadku dwa szczepy bakterii, które nie są w stanie związać się z powierzchnią roślin, zostały zaprojektowane tak, aby wytwarzać PGA, aby określić, czy jest to wystarczające, aby spowodować wiązanie bakterii z korzeniami pomidora. W przypadku A.tumefaciens A1045 PGA spowodował indywidualne wiązanie bakterii z powierzchnią korzenia.Z drugiej strony, S.meliloti wiązały się w duże skupiska, w których tylko kilka bakterii było bezpośrednio przyczepionych do korzenia, a większość bakterii była przyczepiona do innych bakterii. Po opanowaniu technikę tę można wykonać w czasie krótszym niż jedna godzina na wstępną konfigurację, plus czas inkubacji i od 10 minut do jednej godziny czasu oceniania, w zależności od próbki. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że bakterie mogą przyklejać się do prawie każdej powierzchni.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak obserwować wiązanie bakterii z powierzchniami roślin. Określ, w którym miejscu rośliny wiążą się bakterie i określ liczbę związanych bakterii. Nie zapominaj, że jeśli przeprowadzasz te procedury z ludzkimi patogenami, procedura może być bardzo niebezpieczna i zawsze należy zachować środki ostrożności, takie jak praca w kapturze zabezpieczającym i noszenie rękawiczek.

adherence-of-bacteria-to-plant-surfaces-measured-in-the-laboratory

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Niniejszy protokół opisuje prosty test adhezji bakteryjnej, polegający na zliczaniu jednostek tworzących kolonie bakterii, które przylgnęły do hodowli komórkowych. Test ten jest wiarygodny, niezależny od badanej adhezyny, a jego liczne modyfikacje są stosowane w większości laboratoriów zajmujących się patogenezą bakteryjną.

In Vitro Analiza Adhezji Bakteryjnej do Komórek Nabłonkowych Ssaków

Podczas procesu infekcji kluczowym etapem jest adhezja patogenów do komórek gospodarza. W większości przypadków etap adhezji ten zachodzi w obecności stresu mechanicznego generowanego przez przepływającą ciecz. Opisujemy technikę, która wprowadza naprężenie ścinające jako istotny parametr w badaniu adhezji bakteryjnej.

Wprowadzenie naprężenia ścinającego w badaniach nad adhezją bakteryjną

Opisano projekt syntetycznego operonu kodującego zarówno aparat sekrecyjny, jak i monomery strukturalne włókien curli. Nadprodukcja tych amyloidów i polimerów adhezyjnych pozwala na mierzalny wzrost adhezji chassis E. coli1. Wyjaśniono proste sposoby wizualizacji i kwantyfikacji adhezji.

Inżynieria bakterii adherentnych poprzez stworzenie pojedynczego syntetycznego operonu curli

Źródło: Matthysse, A. G. Przyleganie bakterii do powierzchni roślin mierzone w laboratorium. J. Vis. Exp. (2018).Ten film pokazuje ocenę przyczepienia bakterii do korzeni roślin za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym. Najpierw montuje się próbki korzeni z sadzonek inkubowanych z bakteriami, aby sprawdzić obecność wolnych bakterii. Następnie próbki są myte, aby usunąć luźno przyczepione bakterie, a następnie ponownie montowane za pomocą odpowiedniego pokrywa, aby zapobiec uszkodzeniom. Na...

Mikroskopowa ocena przyczepienia bakterii do powierzchni korzeni roślin

Źródło: Matthysse, A. G. Przyleganie bakterii do powierzchni roślin mierzone w laboratorium. J. Vis. Exp., (2018)Ten film pokazuje protokół pomiaru kolonizacji korzeni siewek pomidora przez bakterie patogenne typu dzikiego i niedoborowego celulozy. Liczebne ilości gęsto przylegających bakterii wykazują większą przyczepność i tworzenie mikrokolonii przez szczep typu dzikiego, co podkreśla rolę celulozy w stabilnej kolonizacji korzeni.

Ocena kolonizacji korzeni siewek pomidorów przez patogenną bakterię na podstawie liczenia komórek żywotnych

Źródło: Harris, S. L. i in. Monitorowanie kolonizacji bakteryjnej i utrzymania korzeni Arabidopsis thaliana w pływającym systemie hydroponicznym. J. Vis. Exp. (2019)Ten film prezentuje protokół monitorowania kolonizacji bakterii związanych z korzeniami na sadzonkach Arabidopsis thaliana uprawianych w systemie bezglebowym. Po kolonizacji bakterie są usuwane przez sonikację, następnie rozcieńczane, pokładane i inkubowane, tworząc kolonie odzwierciedlające przywiązanie i żywotność bakterii.

Monitorowanie kolonizacji bakteryjnej korzeni Arabidopsis thaliana w bezglebowym systemie

Ten film demonstruje test przylegania bakterii do hodowli komórek nabłonkowych oznaczony GFP w celu zbadania dynamiki interakcji gospodarz-patogen za pomocą obrazowania opartego na mikroskopii fluorescencyjnej.

Wykrywanie przylegania bakterii do komórek gospodarza za pomocą obrazowania fluorescencyjnego

Przyczepienie się bakterii do komórek gospodarza jest kluczowym krokiem podczas kolonizacji i infekcji gospodarza. Protokół ten opisuje wytwarzanie rekombinowanych adhezyn sprzężonych z polimerami jako materiałów biomimetycznych, które umożliwiają analizę udziału poszczególnych adhezyn w tych procesach, niezależnie od innych czynników bakteryjnych.

Materiały biomimetyczne do charakteryzowania interakcji bakteria-gospodarz

Tutaj opisujemy hydroponiczny test wzrostu roślin, aby określić ilościowo obecność gatunków i zobrazować przestrzenne rozmieszczenie bakterii podczas początkowej kolonizacji korzeni roślin i po ich przeniesieniu do różnych środowisk wzrostu.

Monitorowanie kolonizacji i utrzymania kolonizacji bakteryjnej korzeni Arabidopsis thaliana w pływającym systemie hydroponicznym

Wykrywanie interakcji patogenów gospodarz-bakteria na podstawie przestrzegania fenotypu za pomocą wysokoprzepustowego obrazowania fluorescencyjnego wraz z automatycznymi metodami analizy statystycznej umożliwia szybką ocenę potencjalnych interakcji bakteryjnych z komórkami gospodarza.

Zautomatyzowane, wysokowydajne wykrywanie przylegania bakterii do komórek gospodarza

Kolonizacja ryzobakterii wspomagających wzrost roślin (PGPR) w ryzosferze jest niezbędna dla jej efektu stymulującego wzrost. Konieczne jest ujednolicenie metody wykrywania kolonizacji ryzosfery bakteryjnej. W tym miejscu opisujemy powtarzalną metodę ilościowego określania kolonizacji bakteryjnej na powierzchni korzenia.

Pomiar kolonizacji bakteryjnej korzeni Arabidopsis thaliana w warunkach hydroponicznych

Poznaj metodę pomiaru przylegania bakterii do powierzchni roślin, w tym korzeni i kiełków. Technika ta jest szybka, prosta i ekonomiczna, co czyni ją przydatną w badaniach fitopatologii i bezpieczeństwa żywności.

Przyleganie bakterii do powierzchni roślin mierzone w laboratorium

Przeglądaj więcej filmów