Przyleganie bakterii do powierzchni roślin mierzone w laboratorium

Ogólnym celem tej procedury jest obserwacja miary wiązania bakterii z powierzchniami roślin. Metoda ta może odpowiedzieć na ważne pytania zarówno w patologii roślin, jak i w bezpieczeństwie żywności. W szczególności może odpowiedzieć na pytania dotyczące tego, w jaki sposób bakterie wiążą się z powierzchniami roślin i jak można je usunąć.

Główną zaletą tej techniki jest to, że jest łatwa, szybka i niedroga. Aby przygotować sadzonki uprawiane w wodzie, umieść niewielką liczbę nasion w szklanej zlewce o pojemności 30, 50, 100 lub 150 mililitrów. Tutaj używane są nasiona pomidorów.

Przykryj nasiona 80% etanolem i krótko zamieszaj. Następnie pozwól nasionom moczyć się przez minutę. Odlej etanol i zanurz nasiona w roztworze 50% komercyjnego wybielacza i 0,1% Triton X-100 oraz wody z kranu.

Pozwól nasionom moczyć się przez 20 minut lub dłużej, jeśli nasiona są duże, jak nasiona fasoli. Odlej mieszankę wybielacza i umyj nasiona trzy razy sterylną wodą, pozwalając nasionom moczyć się w wodzie przez jedną minutę przy każdym myciu. Wlej nasiona i niewielką ilość wody do sterylnej szalki Petriego i inkubuj nasiona w ciemności, aż sadzonki osiągną pożądany rozmiar, od jednego centymetra do 10 centymetrów.

Aby przygotować nasiona lub sadzonki wyhodowane w piasku, po wysterylizowaniu nasion i materiałów nasadzeniowych należy zaszczepić nasiona lub sadzonki bakteriami zgodnie z protokołem tekstowym. Za pomocą sterylnego szklanego pręta zrób płytką dziurę w piasku na tyle głęboką, aby umieścić nasiona pod powierzchnią. Umieść nasiona w dołku i przykryj je cienką warstwą piasku.

Następnie użyj folii uszczelniającej, aby uszczelnić górną część pojemnika, aby zapobiec utracie wody i przedostawaniu się dodatkowych drobnoustrojów. Uprawiaj rośliny w laboratorium pod światłem lub w szklarni w temperaturze i długości dnia odpowiedniej dla gatunku i odmiany rośliny. Posadź sadzonki w piasku.

Użyj sterylnego szklanego pręta, aby zrobić otwór. Następnie za pomocą sterylnego szydełka ze stali nierdzewnej ostrożnie wprowadź korzeń do otworu i użyj piasku do wypełnienia boków otworu. Po inkubacji roślin z bakteriami zgodnie z protokołem tekstowym należy przygotować próbkę do mikroskopii, umieszczając ją w kropli wody lub pożywce inkubacyjnej na szkiełku mikroskopowym i bezpośrednio ją obserwować.

Jeśli nie ma widocznych wolnych bakterii, mogło dojść do obumarcia bakteryjnego lub związania się bakterii z pojemnikiem, w którym przeprowadzono inkubację. Umyć próbkę w wodzie lub pożywce inkubacyjnej, umieszczając ją w fiolce z płynem i delikatnie odwracając fiolkę. Następnie umieść próbkę na szkiełku mikroskopowym w świeżym płynie do obserwacji.

Aby zamontować próbkę, użyj zwykłego szkiełka nakrywkowego. Jeśli próbka jest gruba i tworzy wybrzuszenie, dodaj ciecz i próbkę do dołka prasy, nałóż szkiełko nakrywkowe, które ma pierścień z gumy lub tworzywa sztucznego wokół krawędzi. Umieść szkiełko na górze i delikatnie dociśnij, aby uszczelnić szkiełko nakrywkowe do szkiełka.

Odwróć szkiełko, aby zbadać próbkę. Alternatywnie użyj szkiełka do liczenia glonów i szkiełka nakrywkowego w podobny sposób i oglądaj w powiększeniu nie większym niż 20. Aby określić liczbę żywotnych bakterii znalezionych w roślinach rosnących w piasku, zacznij od usunięcia materiału uszczelniającego z góry i dołu pojemnika.

Umieść pojemnik na kawałku sterylnego papieru i delikatnie uderz pojemnikiem o powierzchnię, aby poluzować piasek, a następnie delikatnie podnieś piasek z rośliną z pojemnika. Gdy cylinder piasku i roślina są wolne na papierze, rozłup piasek na środku, aby odsłonić korzeń rośliny. W razie potrzeby pobierz próbki piasku z okolic krawędzi pojemnika, a także z okolic korzenia.

Może to być przydatne do określenia rozprzestrzeniania się, akumulacji i wzrostu bakterii. Podnieś korzeń i usuń piasek i bakterie, które są luźno przylegające, zanurzając korzeń w odmierzonej objętości wody lub bufora i delikatnie potrząsając. Określ liczbę żywotnych komórek bakterii w otrzymanej zawiesinie, posiewając ją na odpowiednich podłożach, takich jak agar luria.

Reprezentuje to liczbę bakterii luźno związanych z korzeniem. Na koniec usuń ściśle związane bakterie za pomocą sonikacji i określ ich liczbę. Ten wykres pokazuje wpływ dwóch różnych mutacji celulozy minus na zdolność bakterii do kolonizacji korzeni pomidora.

Chociaż odchylenia standardowe niektórych pomiarów wynosiły nawet 0,9 logarytmu o podstawie 10, zmniejszenie wiązania celulozy minus mutanty jest wyraźnie widoczne. W tym eksperymencie zmierzono wiązanie z kiełkami lucerny dzikiego typu E.Coli 0157:H7 u mutantów niezdolnych do wytwarzania różnych egzopolisacharydów. W obu szczepach produkcja kwasu poli-beta one six glucuronowego (PGA) wydawała się w największym stopniu przyczyniać się do wiązania patogennych bakterii E. coli z powierzchniami roślin.

Kwas kolanowy również odgrywał znaczącą rolę w wiązaniu. W tym przypadku dwa szczepy bakterii, które nie są w stanie związać się z powierzchnią roślin, zostały zaprojektowane tak, aby wytwarzać PGA, aby określić, czy jest to wystarczające, aby spowodować wiązanie bakterii z korzeniami pomidora. W przypadku A.tumefaciens A1045 PGA spowodował indywidualne wiązanie bakterii z powierzchnią korzenia.

Z drugiej strony, S.meliloti wiązały się w duże skupiska, w których tylko kilka bakterii było bezpośrednio przyczepionych do korzenia, a większość bakterii była przyczepiona do innych bakterii. Po opanowaniu technikę tę można wykonać w czasie krótszym niż jedna godzina na wstępną konfigurację, plus czas inkubacji i od 10 minut do jednej godziny czasu oceniania, w zależności od próbki. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że bakterie mogą przyklejać się do prawie każdej powierzchni.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak obserwować wiązanie bakterii z powierzchniami roślin. Określ, w którym miejscu rośliny wiążą się bakterie i określ liczbę związanych bakterii. Nie zapominaj, że jeśli przeprowadzasz te procedury z ludzkimi patogenami, procedura może być bardzo niebezpieczna i zawsze należy zachować środki ostrożności, takie jak praca w kapturze zabezpieczającym i noszenie rękawiczek.