Name: Ukierunkowane na miejsce unieruchomienie białka morfogenetycznego kości 2 na powierzchniach stałych za pomocą chemii kliknięć (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Poznaj metodę ukierunkowanego unieruchomienia wariantu BMP2 na rusztowaniach za pomocą chemii kliknięć. To podejście zmniejsza dawkę białka potrzebną do skutecznego gojenia kości i minimalizuje działania niepożądane.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Dr. M. Rubini (Konstancja, Niemcy) za dostarczenie plazmidu kodującego pirolizylo-tRNA oraz za dostarczenie syntezy pRSFduet-pyrtRNAkodującej odpowiadającą mu syntetazę aminoacylo-tRNA.

1. Produkcja wariantu BMP2 BMP2-K3Plk
<ol>
	<li>Klonowanie BMP2-K3Plk metodą mutagenezy ukierunkowanej na miejsce przy użyciu PCR12
	<ol>
		<li>Amplifikować ludzki dojrzały BMP2 (hmBMP2) z wektora p25N-hmBMP2 (patrz Tabela materiałów) za pomocą startera do przodu (5' GACCAGGACATATGGCTCAAGCCTAGCACAAACAGC 3') i startera wstecznego (5' CCAGGAGGATCCTTAGCGACACCCACAACCCT 3') wprowadzając bursztynowy kodon stop (TAG) w pozycji pierwszej lizyny dojrzałej części BMP2. Przeprowadź reakcję PCR, używając 33,5 μlH2O, 10 μL mieszaniny reakcyjnej PCR, 1,5 μL 10 μM roztworu podstawowego dNTP, 1,5 μL startera doprowadzającego (10 pmol/μL), 1,5 μL startera odwrotnego (10 pmol/μL), 1 μL p25N-hmBMP2 (10 ng/μL) i 1 μL polimerazy DNA (patrz tabela materiałów) w termocyklerze (denaturacja w temperaturze 95 °C przez 5 min, 30 cykli denaturacji w temperaturze 95 °C przez 1 minutę, wyżarzania w temperaturze 60 °C przez 1 minutę, wydłużenia w temperaturze 72 °C przez 1 minutę i końcowego przedłużenia w temperaturze 72 °C przez 10 minut).</li>
		<li>Oczyść produkt PCR za pomocą dostępnego w handlu zestawu zgodnie z zaleceniami producenta (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Produkt PCR z enzymem restrykcyjnym NdeI trawić w temperaturze 37 °C przez 45 minut, używając 16 μlH2O, 3 μl buforu wytrawiającego, 10 μl DNA (20 ng/μl) i 1 μl enzymu restrykcyjnego. Enzym należy dezaktywować termicznie w temperaturze 65 °C przez 5 minut. Produkt PCR należy roztrawić enzymem restrykcyjnym BamHI w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę przy użyciu 16 μlH2O, 3 μl buforu wytrawiającego, 10 μl DNA (20 ng/μl) i 1 μl enzymu restrykcyjnego. Enzym dezaktywowany termicznie w temperaturze 80 °C przez 5 min.</li>
		<li>Trawić wektor pET11a-pyrtRNA za pomocą NdeI w temperaturze 37 °C przez 2 godziny i 45 minut, używając 16 μlH2O, 3 μl buforu wytrawiającego, 10 μl DNA (20 ng/μl) i 1 μl enzymu restrykcyjnego. Podgrzewać w temperaturze 65 °C przez 5 min. Trawić wektor pET11a-pyrtRNA za pomocą BamHI w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę przy użyciu 16 μlH2O, 3 μl buforu wytrawiającego, 10 μl DNA (20 ng/μl) i 1 μl enzymu restrykcyjnego. Dezaktywacja termiczna w temperaturze 80 °C przez 5 min.</li>
		<li>Oddzielić strawiony wektor od niestrawionego wektora i pozostałości po trawieniu za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym (0,8% agarozy, 60 min przy 100 V). Zwiąż strawioną wstawkę BMP2-K3TAG z przetrawionym szkieletem pET11a-pyrtRNA w temperaturze pokojowej (RT) przez 2 godziny przy użyciu 100 ng szkieletu pET11a-pyrtRNA i 34,5 ng wkładki BMP2-K3TAG (stosunek molowy 1:3). Mieszanina reakcyjna zawiera szkielet DNA i insert, 2 μl buforu ligazy, 1 μl ligazy DNA iH2Odo całkowitej objętości 20 μL.</li>
		<li>Wykonaj kotransformację syntezy pET11a-pyrtRNA-BMP2-K3Plk i pSRF-duet-pyrtRNAsynth w bakteriach BL21(DE3):
		<ol>
			<li>Dodać 50 ng każdego plazmidu do bakterii, umieścić mieszaninę na lodzie na 30 minut, szok termiczny w temperaturze 42 °C przez 50 s, umieścić na lodzie na 5 minut, dodać 500 μl bulionu lizogenicznego (LB) do mieszaniny i wstrząsać z prędkością 300 obr./min przez 60 min.</li>
			<li>Rozprowadzić 100 μl mieszaniny bakteryjnej na wstępnie podgrzanych płytkach kanamycyny (50 μg/ml)/ampicyliny (100 μg/ml) i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekspresja i oczyszczanie BMP2-K3Plk13,14
	<ol>
		<li>Rozmnażać pojedynczą kolonię przez noc w 50 ml pożywki LB z 50 μg/ml kanamycyny i 100 μg/ml ampicyliny w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Rozcieńczyć kultury na noc w stosunku 1:20 w 800 ml pożywki Terrific Bulth (TB) uzupełnionej 50 μg/ml kanamycyny i 100 μg/ml ampicyliny i rosnąć w temperaturze 37 °C, aż do osiągnięcia OD600 0,7. Dodać propargylo-L-lizynę do końcowego stężenia 10 mM. Pobrać 100 μl próbki z hodowli przed indukcją izopropylu β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG).</li>
		<li>Indukować ekspresję genów przez dodanie IPTG do końcowego stężenia 1 mM. Hodować kulturę w temperaturze 37 °C przez 16 godzin w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 180 obr./min. Pobrać 100 μl próbki z hodowli.</li>
		<li>Odwirować całą kulturę przy 9000 x g przez 30 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad bakteryjny w 30 ml buforu TBSE (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)) z 1:1000 (v/v) 2-merkaptoetanolem (świeżo dodanym). 
		Uwaga: Przenoś 2-merkaptoetanol pod wyciągiem. Unikać kontaktu ze skórą i oczami. Unikać wdychania oparów lub mgły. Wykonać wszystkie etapy ponownego zawieszania za pomocą zawierających 2-merkaptoetanol pod wyciągiem.</li>
		<li>Zważyć pustą zlewkę wirówkową i przenieść zawieszony osad do pustej zlewki. Wirować przy 6 360 x g przez 20 min. Odrzucić supernatant i zważyć zlewkę razem z osadem. Odejmij masę pustej zlewki, aby obliczyć wagę granulki. 
		UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Zawiesić granulat w temperaturze -20 °C w krótkim okresie lub w temperaturze -80 °C w długim okresie. Po wznowieniu protokołu rozmrozić granulkę w RT.</li>
		<li>Zawiesić osad w buforze STE (10 mM Tris pH 8,0; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA, 375 mM sacharozy; 1:1000 (v/v) 2-merkaptoetanol (świeżo dodany)). Użyj 200 ml buforu STE na każde 10 g osadu.</li>
		<li>Sonizacja zawieszenia na lodzie (10 min z impulsem 40 s, hamowanie 20 s i 30% amplituda). Wirować przy 6 360 x g przez 20 min. Odrzucić sklarowany osad i zważyć osad. Powtórz kroki sonikacji i wirowania 4 razy.</li>
		<li>Zawiesić osad w 100 ml buforu TBS (10 mM Tris, 150 mM NaCl). Wirować przy 6 360 x g przez 20 min. Odrzucić supernatant i zważyć osad.</li>
		<li>Zawiesić osad w buforze nukleazy (100 mM Tris, 1 mM EDTA, 3 mM MgCl2) ze świeżo dodaną nukleazą o stężeniu 80 U/ml (np. benzonazą) przy użyciu 10 ml / g osadu. Zawiesinę inkubować przez noc w temperaturze pokojowej na płycie mieszającej (30 obr./min).</li>
		<li>Dodać bufor Triton (60 mM EDTA, 1,5 M NaCl, 6% (v/v) 4-(1,1,3,3-tetrametylobutylo)fenylo-polietylenoglikol) do zawiesiny. Objętość buforu Triton, który ma zostać dodany, odpowiada części zawiesiny o objętości 0,5. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej (bez mieszania). Wirować przy 6 360 x g przez 20 min. Odrzucić sklarowany osad i zważyć osad.</li>
		<li>Zawiesić osad w buforze TE (100 mM Tris, 20 mM EDTA) za pomocą 8 ml/g osadu. Wirować przy 6 360 x g przez 20 min. Odrzucić sklarowany osad i zważyć osad.</li>
		<li>Zawiesić osad, dodając 4 ml / g 25 mM NaAc pH 5,0 i 5 ml / g 6 M GuCl z 1 mM ditiotreitolem (DTT) (świeżo dodanym). Inkubować zawiesinę przez noc w temperaturze 4 °C na płytce mieszającej (30 obr./min).</li>
		<li>Wirować przy 75 500 x g przez 20 min. Supernatant zawiera teraz niesfałdowane monomeryczne białko BMP2. Zebrać supernatant i zagęścić ten ekstrakt do 20 OD/ml za pomocą membrany o masie cząsteczkowej 3 kDa (MWCO) w komórce zagęszczającej (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Dodać skoncentrowane monomery w pojedynczych kroplach do buforu Renaturation (2 M LiCl, 50 mM Tris, 25 mM CHAPS, 5 mM EDTA, 1 mM dwusiarczku glutationu (GSSG), 2 mM glutationu (GSH)) mieszając (30 obr./min). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 120 godzin w ciemności. 
		UWAGA: W tym okresie inkubacji następuje ponowne składanie. Rozwiązanie, począwszy od tego etapu, zawiera złożony dimeryk BMP2-K3Plk.</li>
		<li>Dostosować pH roztworu do 3,0 za pomocą stężonego HCl. Dializować roztwór w stosunku do 1 mM HCl. Zagęścić dializowany roztwór za pomocą membrany odcięcia masy cząsteczkowej 10 kDa (MWCO) w komórce zagęszczającej.</li>
		<li>Zrównoważyć roztwór, dodając bufor A (20 mM NaAc, 30% izopropanolu). Dodać objętość buforu A odpowiadającą 30% objętości roztworu. Odwirować roztwór o stężeniu 4700 x g przez 15 minut.</li>
		<li>Zrównoważyć kolumnę do wymiany jonowej w systemie szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC)15 ze 150 ml buforu A. Załadować roztwór białka na zrównoważoną kolumnę. Frakcje elutyczne należy eluować za pomocą gradientu liniowego buforu B (20 mM NaAc, 30% izopropanolu, 2 M NaCl) za pomocą 100 ml buforu B. Zebrać 2 ml frakcji. 
		UWAGA: Skoncentruj białko przed załadowaniem do kolumny zgodnie z całkowitą objętością kolumny. Ostateczna objętość białka powinna wynosić <5% całkowitej objętości kolumny.</li>
		<li>Przeanalizuj 20 μl każdej frakcji za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym SDS (12%) (SDS-PAGE) 16 i Coomassie Brilliant Blue staining17 (patrz Tabela materiałów). 
		UWAGA: Żel SDS-PAGE barwiony na niebiesko Coomassie Brilliant Blue wykazuje frakcje zawierające dimery (26 kDa) oraz frakcje zawierające monomery (13 kDa).</li>
		<li>Pula frakcji zawierających dimery. Dializować pulę dimerów zawierających frakcje przez noc w temperaturze 4 °C w stosunku do 1 mM HCl (objętość 5 litrów). Zagęścić produkt końcowy za pomocą zagęszczającego filtra odśrodkowego o natężeniu 10 kDa (patrz Tabela materiałów). Analiza produktu końcowego za pomocą elektroforezy żelowej z poliakryloamidu (12%) SDS (SDS-PAGE) i barwienia Coomassie Brilliant Blue. 
		UWAGA: Pasmo na żelu SDS-PAGE barwionym na niebiesko Coomassie Brilliant Blue powinno pokazywać tylko jedno pasmo przy 26 kDa. Jest to końcowy produkt BMP2-K3Plk.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Optymalizacja warunków cykloaddycji alkinowo-azydkowej (CuAAC) katalizowanej miedzią (I)
<ol>
	<li>Wpływ askorbinianu sodu (NaAsc) i siarczanu miedzi (II) (CuSO4 ) na BMP2 typu dzikiego (BMP2-WT)
	<ol>
		<li>Inkubować 20 μM BMP2-WT z różnymi stosunkami NaAsc do CuSO4. Użyć 0,5 mM NaAsc i 0,5 mM CuSO4 (stężenie początkowe) w objętości 50 μl. Postępuj zgodnie z następującymi stosunkami NaAsc do CuSO4: (1:1), (1,7:1), (10:1), (20:1), utrzymując stężenie CuSO4 na stałym poziomie 0,5 mM i odpowiednio dostosowując stężenie NaAsc. Przeprowadzić reakcję wH2Ona mieszalniku obrotowym (20 obr./min) przez noc w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przygotować zredukowane próbki, dodając bufor ładujący zawierający 5% 2-merkaptoetanolu i inkubować próbkę w temperaturze 95 °C przez 6 minut. Analizować zredukowane i niezredukowane próbki za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym SDS (12%) (SDS-PAGE) i barwienia Coomassie Brilliant Blue. Barwione żele SDS-PAGE Coomasie wykazują pasma w zakresie od 13 kDa (warunki zredukowane) do 26 kDa i wyższą masę cząsteczkową (warunki niezredukowane).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wpływ tris(3-hydroksypropylotriolilometylometylo)aminy (THPTA) na reakcję CuAAC
	<ol>
		<li>Inkubować 20 μM BMP2-K3Plk z różnymi stosunkami THPTA do CuSO4. Użyj 5 mM NaAsc i 200 μM 3-Azido-7-hydroksykumaryny (utrzymuj NaAsc i 3-Azido-7-hydroksykumarynę na stałym poziomie). Jako stężenia wyjściowe należy użyć 50 μM THPTA i 0,5 mMCuSO4. Stosować różne proporcje THPTA do CuSO4: (7:1); (10:1); (12:1); (15:1); (20:1). Przeprowadzić reakcję wH2O(50 μL objętości całkowitej) przez 24 godziny w temperaturze pokojowej na mieszalniku obrotowym (20 obr./min).</li>
		<li>Po sprzężeniu 3-azydo-7-hydroksykumaryna staje się barwnikiem fluorescencyjnym. Przygotuj próbki w warunkach zredukowanych i niezredukowanych i przeanalizuj je za pomocą SDS-PAGE. Wizualizuj żele pod kanałem wzbudzenia o określonej długości fali dla 3-azydo-7-hydroksykumaryny (λabs = 404 nm; λem = 477 nm).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Technika kowalencyjnego sprzężenia BMP2-K3Plk z azydkowymi funkcjonalizowanymi kulkami agarozowymi
<ol>
	<li>Inkubować 20 μM BMP2-K3Plk lub BMP2-WT (stosowanych jako kontrola ujemna) z 20 μl kulek agarozowych aktywowanych azydkiem w całkowitej objętości 500 μL w buforze reakcyjnym (0,1 M HEPES pH 7,0, 3,9 M mocznik, 50 μM CuSO4, 250 μM THPTA, 5 mM askorbinianu sodu) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej na mieszalniku obrotowym (20 obr./min). Zatrzymaj reakcję, dodając 5 mM EDTA (stężenie końcowe).</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut na mieszalniku obrotowym (20 obr./min). Odwirować próbki o masie 20 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Zebrać supernatanty.</li>
	<li>Przepłukać osad zawierający kulki trzykrotnie 1 000 μl buforu HBS500 (50 mM HEPES, 500 mM NaCl), trzy razy 1 000 μl 4 M MgCl2 i dwa razy 1 000 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Na każdym etapie płukania odwirować przy 20 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej i zebrać supernatanty. Przechowywać sprzężone kulki w 1 000 μl PBS w temperaturze 4 °C. 
	Ostrzeżenie: Nie naruszaj granulki kulki podczas usuwania supernatantu.</li>
</ol>
4. Walidacja obecności i aktywności biologicznej unieruchomionego BMP2-K3Plk przy użyciu teksańskiego receptora BMP znakowanego czerwono I A Ektodomena (BMPR-IA EC )
<ol>
	<li>Inkubować 50 μl kulek funkcjonalizowanych BMP2-K3Plk z 1 μM BMPR-IAEC znakowanego czerwienią Texas Red ze 150 μl buforu HBS500 (50 mM HEPES, 500 mM NaCl) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę na mieszalniku obrotowym (20 obr./min).</li>
	<li>Odwirować kulki o stężeniu 20 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant. Umyj kulki 1000 μl buforu HBS500. Powtórz krok prania dodatkowo 3 razy. Wirować przy 20 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej po każdym etapie mycia.</li>
	<li>Zawiesić kulki w 500 μl PBS i odpipetować 50 μl na szkiełku podstawowym. Ustaw filtr mikroskopu między 561 a 594 nm. Wykryj funkcjonalizowane kulki Texas Red–BMPR-IAEC–BMP2-K3Plk za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i rób zdjęcia.</li>
</ol>
5. Pomiar ekspresji fosfatazy alkalicznej (ALP) w celu udowodnienia in vitro bioaktywności wytworzonego BMP2-K3Plk przed i po reakcji sprzęgania.
<ol>
	<li>Test fosfatazy alkalicznej (ALP)
	<ol>
		<li>Hodowla promyoblastycznych komórek C2C12 (ATCC CRL-172) w zmodyfikowanej pożywce Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco z 10% płodową surowicą cielęcą (FCS), 100 U/ml penicyliny G i 100 μg/ml streptomycyny w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze przy 5% CO2 .</li>
		<li>Umieść komórki C2C12 o gęstości 3 × 104 komórek/dołek do 96-dołkowej mikropłytki. Pozwól komórkom przyczepić się na noc. Usunąć pożywkę i inkubować komórki C2C12 w obecności 0,5-200 nM BMP2-WT lub BMP2-K3Plk w 100 μl/basenik DMEM (2% FCS, 100 U/ml penicyliny G i 100 μg/ml streptomycyny) w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze przy 5% CO2 przez 72 godziny.</li>
		<li>Usunąć pożywkę i przemyć komórki 100 μl PBS na studzienkę. Lizować komórki w RT przez 1 godzinę ze 100 μl/studzienkę buforu do lizy (1% NP-40, 0,1 M glicyny, pH 9,6, 1 mM MgCl2, 1 mM ZnCl2) na płytce wytrząsającej (220 obr./min).</li>
		<li>Dodać 100 μl/basenik buforu ALP (0,1 M glicyny, pH 9,6, 1 mM MgCl2, 1 mM ZnCl2) z 1 mg/ml p-nitrofenylofosforanu (świeżo dodanego) do lizatu komórkowego.</li>
		<li>Zmierz absorpcję przy 405 nm w czytniku wielopłytkowym po dodaniu buforu ALP i co 5 minut, aż do zakończenia opracowywania koloru. Wygeneruj krzywe odpowiedzi na dawkę i wartości EC50 przy użyciu modelu logistycznego, y = A2 + (A1-A 2)/(1 + (x/x0)p).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie fosfatazą alkaliczną (ALP) 
	<ol>
		<li>Hodowla promyoblastycznych komórek C2C12 (ATCC CRL-172) w zmodyfikowanym pożywce Eagle (DMEM) firmy Dulbecco z 10% płodową surowicą cielęcą (FCS), 100 U/ml penicyliny G i 100 μg/ml streptomycyny w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze przy 5% CO2 .</li>
		<li>Nasiona komórek C2C12 o gęstości 3 × 104 komórek/dołek w 96-dołkowej mikropłytce. Pozwól komórkom przyczepić się na noc. Usuń pożywkę i dodaj 20 μl/dołek koralików sprzężonych z BMP2-K3Plk. Koraliki sprzężone BMP2-K3Plk znajdują się w 1000 μl zawiesiny PBS.</li>
		<li>Przygotować roztwór 0,4% agarozy o niskiej temperaturze topnienia w DMEM. Rozpuść w kuchence mikrofalowej (600 W przez 3 minuty) i pozostaw do ostygnięcia w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C do czasu użycia.</li>
		<li>Dodaj 20 μl 0,4% agarozy o niskiej temperaturze topnienia do każdej studzienki (przykrywającej kulki i komórki). Wirować przy 2000 x g przez 5 minut w temperaturze 20 °C. Dodać 80 μl DMEM (2% FCS, 100 U/ml penicyliny G i 100 μg/ml streptomycyny) i inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze przy 5% CO2 przez 72 godziny.</li>
		<li>Usuń pożywkę, uważając, aby nie oderwać zestalonej 0,4% agarozy. Dodać 100 μl/basenik 1-stopniowego roztworu substratu NBT/BCIP (nitro-niebieski chlorek tetrazolu, sól 5-bromo-4-chloro-3'-indolifosforanu p-toluidyny).</li>
		<li>Analizuj barwienie fosfatazą alkaliczną za pomocą mikroskopii świetlnej natychmiast po tym, jak fioletowe zabarwienie stanie się widoczne. Użyj mikroskopii jasnego pola i rób zdjęcia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Giannoudis, P. V., Dinopoulos, H., Tsiridis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+substitutes%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Injury%22%5BJournal%5D)">Bone substitutes: An update.</a> Injury. 36, Suppl 3. S20-S27 (2005).</li>
<li>Oryan, A., Alidadi, S., Moshiri, A., Bigham-Sadegh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+proteins%3A+A+powerful+osteoinductive+compound+with+non-negligible+side+effects+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Biofactors%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic proteins: A powerful osteoinductive compound with non-negligible side effects and limitations.</a> Biofactors. 40 (5), 459-481 (2014).</li>
<li>Luginbuehl, V., Meinel, L., Merkle, H. P., Gander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+delivery+of+growth+factors+for+bone+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharm+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Localized delivery of growth factors for bone repair.</a> Eur J Pharm Biopharm. 58 (2), 197-208 (2004).</li>
<li>Haidar, Z. S., Hamdy, R. C., Tabrizian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+recombinant+bone+morphogenetic+proteins+for+bone+regeneration+and+repair.+Part+A%3A+Current+challenges+in+BMP+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Lett%22%5BJournal%5D)">Delivery of recombinant bone morphogenetic proteins for bone regeneration and repair. Part A: Current challenges in BMP delivery.</a> Biotechnol Lett. 31 (12), 1817-1824 (2009).</li>
<li>Hollinger, J. O., Uludag, H., Winn, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+release+emphasizing+recombinant+human+bone+morphogenetic+protein-2%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Sustained release emphasizing recombinant human bone morphogenetic protein-2.</a> Adv Drug Deliv Rev. 31 (3), 303-318 (1998).</li>
<li>Uludag, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implantation+of+recombinant+human+bone+morphogenetic+proteins+with+biomaterial+carriers%3A+A+correlation+between+protein+pharmacokinetics+and+osteoinduction+in+the+rat+ectopic+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res%22%5BJournal%5D)">Implantation of recombinant human bone morphogenetic proteins with biomaterial carriers: A correlation between protein pharmacokinetics and osteoinduction in the rat ectopic model.</a> J Biomed Mater Res. 50 (2), 227-238 (2000).</li>
<li>Uludag, H., Golden, J., Palmer, R., Wozney, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinated+bone+morphogenetic+protein-2%3A+In+vivo+and+in+vitro+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Biotinated bone morphogenetic protein-2: In vivo and in vitro activity.</a> Biotechnol Bioeng. 65 (6), 668-672 (1999).</li>
<li>Aono, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+ectopic+bone-inducing+activity+of+bone+morphogenetic+protein-4%2F7+heterodimer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Potent ectopic bone-inducing activity of bone morphogenetic protein-4/7 heterodimer.</a> Biochem Biophys Res Commun. 210 (3), 670-677 (1995).</li>
<li>Suzuki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+hydrogel+linked+with+synthetic+oligopeptide+derived+from+BMP-2+allows+ectopic+osteoinduction+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res%22%5BJournal%5D)">Alginate hydrogel linked with synthetic oligopeptide derived from BMP-2 allows ectopic osteoinduction in vivo.</a> J Biomed Mater Res. 50 (3), 405-409 (2000).</li>
<li>Knaus, P., Sebald, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperativity+of+binding+epitopes+and+receptor+chains+in+the+BMP%2FTGFbeta+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cooperativity of binding epitopes and receptor chains in the BMP/TGFbeta superfamily.</a> Biol Chem. 382 (8), 1189-1195 (2001).</li>
<li>Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+genetic+code%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">Expanding the genetic code.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 225-249 (2006).</li>
<li>Costa, G. L., Weiner, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+PCR+site-directed+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Rapid PCR site-directed mutagenesis.</a> CSH Protoc. 2006 (1), (2006).</li>
<li>Kirsch, T., Nickel, J., Sebald, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+recombinant+BMP+receptor+IA+ectodomain+and+its+2%3A1+complex+with+BMP-2%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Isolation of recombinant BMP receptor IA ectodomain and its 2:1 complex with BMP-2.</a> FEBS Lett. 468 (2-3), 215-219 (2000).</li>
<li>Tabisz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+immobilization+of+BMP-2%3A+Two+approaches+for+the+production+of+innovative+osteoinductive+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Site-directed immobilization of BMP-2: Two approaches for the production of innovative osteoinductive scaffolds.</a> Biomacromolecules. 18 (3), 695-708 (2017).</li>
<li>Duong-Ly, K. C., Gabelli, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+ion+exchange+chromatography+to+purify+a+recombinantly+expressed+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Using ion exchange chromatography to purify a recombinantly expressed protein.</a> Methods Enzymol. 541, 95-103 (2014).</li>
<li>Brunelle, J. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-dimensional+SDS-polyacrylamide+gel+electrophoresis+%281D+SDS-PAGE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE).</a> Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).</li>
<li>Brunelle, J. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coomassie+blue+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Coomassie blue staining.</a> Methods Enzymol. 541, 161-167 (2014).</li>
<li>Kirsch, T., Nickel, J., Sebald, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP-2+antagonists+emerge+from+alterations+in+the+low-affinity+binding+epitope+for+receptor+BMPR-II%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">BMP-2 antagonists emerge from alterations in the low-affinity binding epitope for receptor BMPR-II.</a> EMBO J. 19 (13), 3314-3324 (2000).</li>
<li>Hein, J. E., Fokin, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copper-catalyzed+azide-alkyne+cycloaddition+%28CuAAC%29+and+beyond%3A+new+reactivity+of+copper%28I%29+acetylides%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">Copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) and beyond: new reactivity of copper(I) acetylides.</a> Chem Soc Rev. 39 (4), 1302-1315 (2010).</li>
<li>Alborzinia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+kinetics+analysis+of+BMP2+uptake+into+cells+and+its+modulation+by+BMP+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantitative kinetics analysis of BMP2 uptake into cells and its modulation by BMP antagonists.</a> J Cell Sci. 126 (Pt 1), 117-127 (2013).</li>
<li>Paarmann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin-dependent+endocytosis+of+Bone+Morphogenetic+Protein2+%28BMP2%29+and+its+receptors+is+dispensable+for+the+initiation+of+Smad+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamin-dependent endocytosis of Bone Morphogenetic Protein2 (BMP2) and its receptors is dispensable for the initiation of Smad signaling.</a> Int J Biochem Cell Biol. 76, 51-63 (2016).</li>
<li>Pohl, T. L., Boergermann, J. H., Schwaerzer, G. K., Knaus, P., Cavalcanti-Adam, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+immobilization+of+bone+morphogenetic+protein+2+via+a+self-assembled+monolayer+formation+induces+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Surface immobilization of bone morphogenetic protein 2 via a self-assembled monolayer formation induces cell differentiation.</a> Acta Biomater. 8 (2), 772-780 (2012).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Generowanie znakowanych wariantów białek poprzez genetyczną ekspansję kodonów pozwala na wprowadzenie różnych nienaturalnych analogów aminokwasów, głównie w dowolnej pozycji pierwotnej sekwencji białka. W przypadku BMP, takich jak BMP2, powszechne znaczniki, takie jak znacznik 6-histydyny (His), mogą być wprowadzane tylko N-końcowy, ponieważ C-końcowy koniec białka jest zakopany w trzeciorzędowej strukturze białka, a zatem nie jest dostępny z zewnątrz. W innych pozycjach rozmiar wprowadzonego znacznika może z dużym prawd...

Ostatecznym celem inżynierii tkanki kostnej i regeneracji kości jest przezwyciężenie wad i ograniczeń występujących podczas powszechnego leczenia złamań bez zrostu. Auto- lub allotransplantacje są obecnie stosowane głównie jako strategie terapeutyczne, mimo że obie mają kilka wad. Idealny przeszczep kostny powinien indukować osteogenezę poprzez osteoindukcję, a także osteokondukcję, prowadząc do osteointegracji przeszczepu z kością. W dzisiejszych czasach tylko autotransplantacja jest uważana za "złoty standard", ponieważ zapewnia wszystkie cechy idealnego przeszczepu kostnego. Niestety, wiąże się to również z ważnymi negatywnymi aspektami, takimi jak długi czas operacji i drugie miejsce urazu, które zwykle pociąga za sobą więcej powikłań (np. przewlekły ból, powstawanie krwiaków, infekcje, defekty kosmetyczne itp.). Z drugiej strony przeszczepy allogeniczne mają nieoptymalne cechy dla wszystkich ogólnych aspektów1. W ciągu ostatnich kilku lat udoskonalono alternatywne technologie przeszczepów kostnych w celu wytworzenia rusztowań, które są osteoindukcyjne, osteokondukcyjne, biokompatybilne i bioresorbowalne. Ponieważ wiele biomateriałów nie wykazuje wszystkich tych cech osteogennych, różne czynniki wzrostu, głównie BMP2 i BMP7, zostały włączone w celu poprawy potencjału osteogennego danego rusztowania2.
Jako podstawowe kryterium, takie systemy dostarczania czynnika wzrostu powinny zapewniać kontrolowane uwalnianie dawki w czasie, aby ułatwić podstawowe zdarzenia, takie jak rekrutacja i przyłączanie komórek, wrastanie komórek i angiogeneza. Jednak BMP, jak również inne osteogenne czynniki wzrostu, były powszechnie unieruchamiane niekowalencyjnie3. Techniki uwięzienia i adsorpcji wymagają użycia ponadfizjologicznych ilości białka ze względu na początkowe uwolnienie impulsowe, co prowadzi do poważnych niekorzystnych warunków in vivo, zwykle wpływając na otaczające tkanki poprzez indukowanie przerostu kości, osteolizy, obrzęku i stanu zapalnego4. W ten sposób zatrzymanie czynników wzrostu w miejscu porodu przez dłuższy czas można osiągnąć za pomocą metod immobilizacji kowalencyjnej. Chemicznie modyfikowane BMP2 (sukcynyla5, acetylowane6 lub biotynylowane7), zmodyfikowane heterodimery8, lub oligopeptydy pochodzące z BMP29 zostały zaprojektowane i wykorzystane w celu przezwyciężenia ograniczeń związanych z wchłanianiem. Jednak aktywność biologiczna tych konstruktów nie jest przewidywalna, ponieważ układ potencjalnie hamuje wiązanie unieruchomionego liganda z receptorami komórkowymi. Jak wykazano wcześniej, ważne jest, aby wszystkie cztery łańcuchy receptorowe biorące udział w tworzeniu aktywowanych kompleksów ligand-receptor oddziaływały z unieruchomionym BMP2, aby w pełni aktywować wszystkie kaskady sygnalizacyjne w dół10.
Aby przezwyciężyć problemy związane z niejednorodnym wynikiem produktu z ograniczeniami w zakresie bioaktywności, stabilności i biodostępności unieruchomionego czynnika, zaprojektowaliśmy wariant BMP zdolny do kowalencyjnego wiązania rusztowań w sposób skierowany na miejsce. Ten wariant, określany jako BMP2-K3Plk, zawiera sztuczny aminokwas, który został wprowadzony przez genetyczną ekspansję kodonu11. Wariant ten został z powodzeniem powiązany z rusztowaniami przy użyciu strategii sprzężenia kowalencyjnego przy jednoczesnym zachowaniu jego aktywności biologicznej.

<table><tbody><tr><td><mocny>Materiał</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-stopniowy NBT/BCIP</td><td>Thermo Fisher</td><td>34042</td><td>Dodaj roztwór do komórek</td></tr><tr><td>3-Azido-7-hydroksykumaryna</td><td>BaseClick</td><td>BCFA-047-1</td><td>Substancja chemiczna stosowana w reakcji kliknięcia</td></tr><tr><td>Agaroza o niskiej temperaturze topnienia</td><td>Biozym</td><td>840101</td><td>Agaroza do testu ALP&nbsp;</td></tr><tr><td>Koraliki agarozy azydkowej</td><td>Jena Bioscience</td><td>CLK-1038-2</td><td>Koraliki używane do reakcji</td></tr><tr><td>BamHI (enzym Fast Digest)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FD0054</td><td>Enzym restrykcyjny</td></tr><tr><td>receptor BMP IA (BMPR-IAEC)</td><td></td>-<td>---</td> <td>Wyprodukowano w naszym laboratorium</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue G-250 Dye</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20279</td><td>Substancja chemiczna stosowana do barwienia Coomassie na błękit brylantowy SDS PAGE</td></tr><tr><td>Siarczan miedzi (II) bezwodny (CuSO4)</td><td>Alfa Aesar</td><td>A13986</td><td>Substancja chemiczna stosowana w reakcji kliknięcia</td></tr><tr><td>Polimeraza DNA i bufor reakcyjny&nbsp;</td><td>Kapabiosystems</td><td>KK2102</td><td>KAPA Zestaw HiFi PCR</td></tr><tr><td>Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium (DMEM) GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>61965-026</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>E5134-1kg</td><td>Substancja chemiczna stosowana do zatrzymania reakcji kliknięcia</td></tr><tr><td>Izopropyl &szlig;-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>2316.5</td><td>Indukcja bakterii (stężenie końcowe 1mM)&nbsp;</td></tr><tr><td>NdeI (enzym szybko trawiony)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ER0581</td><td>Enzym restrykcyjny</td></tr><tr><td>aktywowany przez NHS technologie Texas Red</td><td>Life</td><td>T6134</td><td>sprzężony z receptorem</td></tr><tr><td>P-fosforan nitrofenylu</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>N4645-1G</td><td>Fosfataza alkaliczna</td></tr><tr><td>p25N-hmBMP2&nbsp;</td><td>-</td><td>---</td> <td>Plazmid uprzejmie dostarczony przez Waltera Sebalda do J. Nickel</td></tr><tr><td>pET11a-pyrtRNA-</td><td>-</td><td>--</td> <td>Dostarczony przez Katedrę Farmacji i Biofarmacji, Uniwersytet w Wuerzburgu</td></tr><tr><td>propargylo-L-lizyna (Plk)</td> <td>--</td><td>--</td> <td>Dostarczony przez Katedrę Farmacji i Biofarmacji, Uniwersytet w Wuerzburgu</td></tr><tr><td>pSRFduet-pyrtRNAsynth</td><td>--</td><td>--</td><td>Dostarczone przez Katedrę Farmacji i Biofarmacji, Uniwersytet w Wuerzburgu</td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu</td><td>Qiagen Qiagen</td><td>28704</td><td>Zestaw do oczyszczania</td></tr><tr><td>żelu Qiagen PCR Zestaw do oczyszczania</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>PCR&nbsp;</td></tr><tr><td>L-askorbinian sodu</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>A7631-100G</td><td>Substancja chemiczna stosowana w reakcji kliknięcia</td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4</td><td>ThermoScientific</td><td>EL0011</td><td>Ligacja&nbsp;</td></tr><tr><td>tris(3-hydroksypropylotriazolylo)amina (THPTA)</td><td>BaseClick</td><td>BCMI-006-100</td><td>Substancja chemiczna stosowana w reakcji</td></tr><tr><td>kliknięcia Glikol 4-(1,1,3,3-Tetrametylobutylo)fenylo-polietylenowy</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>X100-1L</td><td>Triton X 100&nbsp;</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon komora koncentracyjna 400 ml&nbsp;</td><td>Merck KGaA</td><td>UFSC40001</td><td>Jednostka zagęszczająca</td></tr><tr><td>Filtry odśrodkowe Amicon Ultra-15 Merck</td><td>KGaA</td><td>UFC901024</td><td>Koncentratorowa jednostka odśrodkowa</td></tr><tr><td>&Auml; KTA avant FPLC</td><td>&Auml; KTA-</td><td>-</td><td>Maszyna FPLC</td></tr><tr><td>Avanti J-26XP</td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>393124</td><td>Wirówka do hodowli bakterii</td></tr><tr><td>Inkubator do wytrząsania bakterii</td><td>Infors HT</td><td></td><td>Inkubator do wytrząsania do hodowli bakterii</td></tr><tr><td>FluorChem Q system</td><td>proteinsimple</td> <td>-</td> <td>System obrazowania i analizy dla SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Fluorescencyjny miscroskop</td><td>Keyence</td><td>BZ-9000 (BIOREVO)</td><td></td></tr><tr><td>Fractogel&reg; EMD SO3- (M)</td><td>Merck KGaA</td><td>116882</td><td>Materiał kolumny do chromatografii jonowymiennej</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR&reg; &nbsp; Płytki 96-dołkowe</td><td>Sigma</td><td>M5811-40EA</td><td>96-dołkowe płytki do hodowli komórkowych (test ALP)</td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge X1R</td><td>ThermoScientific</td><td>-</td><td>-Wirówka</td></tr><tr><td>M-20 Wirnik do mikropłytek wahadłowych</td><td>ThermoScientific</td><td>75003624</td><td>Rotor do mikrowirówki do płytki podczas barwienia ALP</td></tr><tr><td>Mikrowirówka - 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>-</td><td>-Wirówka</td></tr><tr><td>OriginPro 9.1 G&nbsp;</td><td>OriginLab</td> <td>-</td> <td>oprogramowanie do analizy statycznej danych z testów ALP</td></tr><tr><td>Szkiełka polisynowe Preparaty</td><td>mikroskopowe</td><td>ThermoScientific</td><td>10143265</td></tr><tr><td>Rotor JA-10</td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>--</td><td>wirnik do wirówki Avanti J-26XP</td></tr><tr><td>Rotor JLA 8.1</td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>--</td><td>wirnik do wirówki Avanti J-26XP</td></tr><tr><td>Rotor JA 25.50</td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>--</td><td>wirnik do wirówki Avanti J-26XP</td></tr><tr><td>Tecan nieskończony czytnik wielopłytkowy M200</td><td>Tecan Deutschland GmbH</td><td>--</td><td>Czytnik wielopłytkowy do testu ALP</td></tr><tr><td>Termocykler - Labcycler Gradient</td><td>SensoQuest GmbH</td><td>--</td><td>PCR</td></tr><tr><td>TxRed - filtr mikroskopowy</td><td>Keyence</td><td></td><td>Filtr do mikroskopu fluorescencyjnego&nbsp;</td></tr><tr><td>Ultrafiltracja krążki z regenerowanej celulozy 3 kDa</td><td>Merck KGaA</td><td>PLBC04310</td><td>stosowane z komórką zagęszczającą amicon 400ml</td></tr><tr><td>Ultrafiltracja krążki z regenerowanej celulozy 10 kDa</td><td>Merck KGaA</td><td>PLGC04310</td><td>stosowane z amikonową kuwetą 400ml</td></tr></tbody></table>

ukierunkowane na miejsce unieruchomienie białka morfogenetycznego kości 2 na powierzchniach stałych za pomocą chemii kliknięć

Site-Directed Immobilization of Bone Morphogenetic Protein 2 to Solid Surfaces by Click Chemistry

Różne strategie terapeutyczne w leczeniu niegojących się defektów kości długich były intensywnie badane. Obecnie stosowane terapie mają kilka ograniczeń, które doprowadziły do stosowania biomateriałów w połączeniu z osteogennymi czynnikami wzrostu, takimi jak białka morfogenetyczne kości (BMP). Powszechnie stosowane metody wchłaniania lub kapsułkowania wymagają ponadfizjologicznych ilości BMP2, co zwykle skutkuje tak zwanym początkowym efektem uwalniania, który wywołuje kilka poważnych niepożądanych skutków ubocznych. Możliwą strategią przezwyciężenia tych problemów byłoby kowalencyjne sprzężenie białka z rusztowaniem. Co więcej, sprzężenie powinno być przeprowadzane w sposób specyficzny dla danego miejsca, aby zagwarantować powtarzalny wynik produktu. W związku z tym stworzyliśmy wariant BMP2, w którym sztuczny aminokwas (propargylo-L-lizyna) został wprowadzony do dojrzałej części białka BMP2 poprzez ekspansję użycia kodonów (BMP2-K3Plk). BMP2-K3Plk sprzężono z funkcjonalizowanymi kulkami za pomocą katalizowanej miedzią cykloaddycji azydkowo-alkinowej (CuAAC). Aktywność biologiczna sprzężonego BMP2-K3Plk została udowodniona in vitro, a aktywność osteogenna kulek funkcjonalizowanych BMP2-K3Plk została udowodniona w testach komórkowych. Funkcjonalizowane kulki w kontakcie z komórkami C2C12 były w stanie indukować ekspresję fosfatazy alkalicznej (ALP) w lokalnie ograniczonej odległości od kulki. W ten sposób dzięki tej technice można wytwarzać funkcjonalizowane rusztowania, które mogą wyzwalać różnicowanie komórek w kierunku linii osteogennej. Dodatkowo, niższe dawki BMP2 są wystarczające ze względu na kontrolowaną orientację sprzężonego BMP2 skierowanego do miejsca. Dzięki tej metodzie BMP są zawsze wystawione na działanie swoich receptorów na powierzchni komórki w odpowiedniej orientacji, co nie ma miejsca, jeśli czynniki są sprzężone za pomocą technik sprzęgania bez ukierunkowania na miejsce. Wynik produktu jest wysoce kontrolowany, a tym samym prowadzi do uzyskania materiałów o jednorodnych właściwościach, co poprawia ich przydatność do naprawy ubytków kostnych o krytycznych rozmiarach.

W niniejszym artykule opisujemy metodę kowalencyjnego sprzęgania nowego wariantu BMP2, BMP2-K3Plk, z dostępnymi komercyjnie kuleczkami agarozowymi funkcjonalizowanymi azydem (Rysunek 1). Bioaktywność otrzymanego wariantu BMP2-K3Plk została zweryfikowana poprzez indukcję ekspresji genu fosfatazy zasadowej (ALP) w komórkach C2C12. Test in vitro wykazuje podobne poziomy ekspresji ALP indukowane przez BMP2 typu dzikiego (BMP2-WT) oraz BMP2-K3Plk (<strong...

Biomateriały domieszkowane białkiem morfogenetycznym kości 2 (BMP2) zostały użyte jako nowa strategia terapeutyczna do leczenia złamań kostnych bez zrostu. Aby przezwyciężyć skutki uboczne wynikające z niekontrolowanego uwalniania czynnika, proponujemy nową strategię bezpośredniego unieruchomienia czynnika, tworząc w ten sposób materiały o ulepszonych zdolnościach osteogennych.

Ukierunkowane na miejsce unieruchomienie białka morfogenetycznego kości 2 na powierzchniach stałych za pomocą chemii kliknięć

Different therapeutic strategies for the treatment of non-healing long bone defects have been intensively investigated. Currently used treatments present ...

Ogólnym celem tego badania jest solidna i powtarzalna produkcja rusztowania osteogennego poprzez ukierunkowane na miejsce i kowalencyjne sprzężenie nowo zaprojektowanego wariantu BMP2 za pomocą chemii kliknięć. Metoda ta może pomóc w przezwyciężeniu problemów związanych z powszechnie stosowanymi technikami leczenia niegojących się ubytków kości długich. Metody wchłaniania lub kapsułkowania wymagają super fizjologicznych ilości BMP2, które wywołują kilka poważnych skutków ubocznych.Główną zaletą tej techniki jest użycie mniejszych ilości nowo zaprojektowanego wariantu BMP2, który jest kowalencyjnie połączony z rusztowaniami w sposób skierowany na bok. Rozmnażaj pojedynczą kolonię przez noc w 50 mililitrach pożywki LB z 50 mikrogramami na mililitr kanamycyny i 100 mikrogramami na mililitr ampicyliny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Rozcieńczyć nocne kultury od jednego do 20 do 800 mililitrów wspaniałej pożywki bulionowej uzupełnionej 50 mikrogramami na mililitr kanamycyny i 100 mikrogramami na mililitr ampicyliny.Hoduj kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż do osiągnięcia gęstości optycznej 0,7 nanometra przy 600 nanometrach. Następnie dodaj propofol L-Lycine do końcowego stężenia 10 milimolów. Indukować ekspresję genów przez dodanie IPTG do końcowego stężenia jednego milimola.Hoduj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 godzin w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 180 obr./min. Po inkubacji odwirować całą kulturę z prędkością 9 000 g przez 30 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad bakteryjny w 30 mililitrach buforu TBSE.Zważyć pustą zlewkę wirówkową i przenieść ponownie zawieszony osad do pustej zlewki. Następnie odwirować ponownie zawieszony osad w ilości 6, 360 razy g przez 20 minut. Odrzucić supernatant i zważyć zlewkę razem z osadem.Odejmij masę pustej zlewki, aby obliczyć wagę osadu. Następnie ponownie zawiesić osad w buforze STE. Użyj 200 mililitrów buforu STE na każde 10 gramów granulatu.Sonikować zawiesinę na lodzie przed odwirowaniem przy 6, 360 razy g przez 20 minut. Odrzucić sklarowany osad i zważyć osad. Po czterokrotnym powtórzeniu etapów sonikacji i wirowania, ponownie zawiesić osad w 100 mililitrach buforu TBS.Wirować przy 6, 360 razy g przez 20 minut. Następnie odrzucić supernatant i zważyć osad. Ponownie zawiesić osad w buforze nukleazy ze świeżo dodaną nukleazą, używając 10 mililitrów na gram osadu.Zawiesinę inkubować przez noc w temperaturze pokojowej na płytce mieszającej z prędkością 30 obr./min. Następnego dnia dodać Triton Buffer do zawiesiny. Objętość Triton Buffer do dodania odpowiada części zawiesiny o objętości 0,5.Po inkubacji przez 10 minut w temperaturze pokojowej odwirować zawiesinę w temperaturze 6, 360 razy g przez 20 minut. Odrzucić sklarowany osad i zważyć osad. Następnie ponownie zawiesić pastylkę w buforze TE, używając ośmiu mililitrów na gram granulki.Po odwirowaniu jak poprzednio, wyrzucić supernatant i zważyć osad. Teraz ponownie zawiesić osad, dodając cztery mililitry na gram 25-milimolowego akcynianu sodu, PH5 i pięć mililitrów na gram sześciomolowego chlorku guanidyny z jednym milimolowym DTT. Zawiesinę inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza na płytce mieszającej.Po odwirowaniu w temperaturze 75, 500 razy g przez 20 minut, supernatant zawiera niesfałdowane, monomeryczne białko BMP2. Zebrać supernatant i stężyć ten ekstrakt do gęstości optycznej na mililitr 20 za pomocą membrany odcinającej o masie cząsteczkowej trzech kilodaltonów w komórce zagęszczającej. Dodaj skoncentrowane monomery w pojedynczych kroplach do buforu renaturacyjnego, mieszając.Następnie inkubuj roztwór w temperaturze pokojowej przez 120 godzin w ciemności. Dostosować pH roztworu do 3,0 za pomocą stężonego kwasu solnego przed dializowaniem roztworu z jednym milimolowym kwasem solnym. Zagęścić dializowany roztwór za pomocą membrany odcinającej o masie cząsteczkowej 10 kilodaltonów w komórce zagęszczającej.Następnie załaduj roztwór białka na zrównoważoną kolumnę, rozcieńczyć frakcje za pomocą gradientu liniowego buforu B, zbierając dwie frakcje mililitrowe. Przeanalizuj 20 mikrolitrów każdej frakcji za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym SDS, a następnie barwienia Coomassie Brilliant Blue w celu określenia frakcji zawierających monomery i frakcji zawierających dimery. Następnie wyciągnij dimer zawierający ułamki.Dializuj pulę dimerów zawierających frakcje przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza przeciwko pięciu litrom jednego milimolowego kwasu solnego. Zagęścić produkt za pomocą 10-kilodaltonowego koncentratującego filtra odśrodkowego przed analizą produktu końcowego za pomocą SDS-PAGE i barwienia Coomassie Brilliant Blue. Połączyć 20 mikromoli typu BMP2-K3Plk lub BMP2-while, który jest stosowany jako kontrola ujemna, z 20 mikrolitrami kulek agarozowych aktywowanych azydkiem w buforze reakcyjnym o łącznej objętości 500 mikrolitrów.Inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej na obracającej się mieszaninie z prędkością 20 obr./min. Zatrzymaj reakcję, dodając końcowe stężenie pięciu milimolowych EDTA. Inkubować roztwór w temperaturze pokojowej przez 15 minut na mieszalniku obrotowym z prędkością 20 obr./min.Następnie odwirować próbki o masie 20 000 g przez jedną minutę w temperaturze pokojowej i zebrać supernatanty. Następnie przemyj granulat zawierający kulki 1 000 mikrolitrów buforu HBS 500. Odwirować próbkę o masie 20 000 g przez jedną minutę w temperaturze pokojowej i zebrać supernatant.Powtórzyć tę procedurę przemywania jeszcze dwa razy z buforem HBS 500, trzy razy z czterema molowymi chlorkami magnezu i dwa razy z PBS, za każdym razem zbierając supernatant. Przechowuj sprzężone koraliki w 1 000 mikrolitrach PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wykonać test ALP zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Aby przeprowadzić barwienie ALP, należy wyhodować promyoblastyczne komórki C2C12 w DMEM z 10% płodową surowicą cielęcą, a także 100 jednostkami na mililitr penicyliny G i streptomycyny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej atmosferze przy 5% dwutlenku węgla. Podawaj komórki C2C12 o gęstości 30 000 komórek na studzienkę w 96-dołkowej mikropłytce. Po pozostawieniu komórek na noc, usuń pożywkę i dodaj 20 mikrolitrów na dołek sprzężonych kulek PMB2-K3PLK.Następnie dodaj 20 mikrolitrów 0,4% agarozy o niskiej temperaturze topnienia do każdej studzienki. Odwirować 96-dołkową mikropłytkę w temperaturze 2 000 g przez pięć minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Następnie dodaj 80 mikrolitrów tego samego podłoża.Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej atmosferze przy 5% dwutlenku węgla przez 72 godziny. Po inkubacji usuń pożywkę, uważając, aby nie oderwać zestalonej 0,4% agarozy. Dodaj 100 mikrolitrów na studzienkę jednoetapowego roztworu podprostego MBT-BCIP.Analizuj barwienie alkalicznym fosfatydatem za pomocą mikroskopii świetlnej natychmiast po tym, jak purpurowe zabarwienie stanie się widoczne. Użyj mikroskopii jasnego pola i rób zdjęcia. Bioaktywność nowo wyprodukowanego wariantu BMP2-K3Plk jest walidowana przez indukcję ekspresji genu fosfatazy alkalicznej w komórkach C2C12.Test in vitro wykazuje podobne poziomy ekspresji genów fosfatazy alkalicznej indukowane przez typ BMP2 lub BMP2-K3Plk. Koraliki pokryte BMP2-K3Plk poprzez katalizowaną przez katalizowaną addycję cyklo azydku azydu dawały fluorescencje podczas inkubacji z oznakowaną domeną ekologiczną receptora BMP 1A. Wiązanie receptora BMP 1A z BMP2-K3Plk potwierdza zachowanie bioaktywności po sprzężeniu.Bioaktywność funkcjonalizowanych kulek BMP2-K3Plk została udowodniona za pomocą barwienia za pośrednictwem ALP. Barwienie wystąpiło tylko w tych komórkach, które miały bezpośredni kontakt z funkcjonalizowanymi kulkami BMP2-K3Plk, co potwierdza, że białko jest rzeczywiście kowalencyjnie połączone z kulkami, a nie tylko wchłaniane. Gdyby białko zostało uwolnione w sytuacji wchłonięcia, zaobserwowano by bardziej rozproszone barwienie na większych odległościach, jak pokazano tutaj w przypadku barwienia fosfatazą alkaliczną po traktowaniu rozpuszczalnym BMP2-K2Plk.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyrażać i wytwarzać biologicznie aktywne białka przez ekspansję genetyczną oraz jak kowalencyjnie łączyć fikcyjne białko z mikrosferami za pomocą reakcji chemicznej kliknięcia. Generowanie wariancji białka poprzez ekspansję genetyczną pozwala w zasadzie na wprowadzenie sztucznego aminokwasu w dowolnej pozycji pierwotnej sekwencji białka. Wprowadzenie mutacji do sekwencji BMP2 może wpłynąć na wydajność ponownego fałdowania, a także może zmienić parametry białka.Produkcja BMP2-K3Plk wymagała modyfikacji ustalonej metody wyrażania while typu BMP2. Otrzymany BMP2-K3Plk wykazywał aktywność biologiczną porównywalną do białka typu while. Nasze podejście do kowalencyjnego sprzężenia wariantu BMP2 z azyrycznymi fikcyjnymi kulkami agarozy za pomocą chemii kliknięć może być zrealizowane z wysoką wydajnością, co skutkuje fikcyjnymi kulkami, co pozwala na genetyczne zróżnicowanie in vitro.Musi być zapewniona standardowa ochrona zgodnie z dobrą praktyką laboratoryjną.

site-directed-immobilization-bone-morphogenetic-protein-2-to-solid

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

W niniejszym artykule opisujemy sposób uzyskiwania przebiegów FRET z pojedynczych cząsteczek DNA unieruchomionych na powierzchni przy użyciu zautomatyzowanego konfokalnego mikroskopu skanującego.

Zautomatyzowany system do pomiarów fluorescencji pojedynczych cząsteczek dla unieruchomionych na powierzchni biomolekuł

W celu zidentyfikowania sekwencji peptydowych celujących w kość wykorzystano bibliotekę displayu fagowego. Celem badania było sprawdzenie wpływu tych peptydów na różnicowanie komórek mezenchymalnych oraz określenie ich oddziaływania na regenerację kości.

Peptydy z biblioteki phage display modulują ekspresję genów w komórkach mezenchymalnych i potęgują osteogenezę w jedokortykalnych defektach kostnych

Prezentujemy metodę szybkiego, odwracalnego unieruchamiania małych cząsteczek i funkcjonalizowanych zespołów nanocząstek do badań powierzchniowego rezonansu plazmonów (SPR), wykorzystując sekwencyjną bioortogonalną chemię cykloaddycji na chipie i wychwytywanie przeciwciała-antygen.

Mikroprzepływowa reakcja wychwytywania-cykloaddycji w układzie scalonym w celu odwracalnego unieruchomienia małych cząsteczek lub struktur wieloskładnikowych do zastosowań w biosensorach

Opisujemy metodę skutecznego unieruchamiania BMP-2 na powierzchniach. Nasze podejście opiera się na tworzeniu samoorganizującej się monowarstwy w celu uzyskania kowalencyjnego wiązania BMP-2 poprzez jego wolne reszty aminowe. Ta metoda jest użytecznym narzędziem do badania sygnalizacji na błonie komórkowej.

Kowalencyjne wiązanie BMP-2 na powierzchniach przy użyciu samoorganizującego się podejścia monowarstwowego

Substraty do hodowli komórkowych funkcjonalizowane mikroskalowymi wzorcami biologicznych ligandów mają ogromną użyteczność w dziedzinie inżynierii tkankowej. W tym miejscu demonstrujemy wszechstronną i zautomatyzowaną produkcję substratów do kultur tkankowych za pomocą wielu, mikrowzorcowych szczotek z poli(glikolu etylenowego) prezentujących ortogonalną chemię, która umożliwia przestrzennie precyzyjną i specyficzną dla miejsca immobilizację ligandów biologicznych.

Wytwarzanie złożonych substratów kulturowych przy użyciu zrobotyzowanego drukowania mikrokontaktowego (R-μCP) i sekwencyjnej substytucji nukleofilowej

Przedstawiono ogólny proces tworzenia krok po kroku szablonu przypominającego kość z zaprojektowanymi mikrokanałami. Wysokie zdolności absorpcyjne i retencyjne matrycy wykazują działanie kapilarne za pośrednictwem mikrokanałów.

Charakterystyczne działanie kapilarne przez mikrokanały w matrycach przypominających kości może poprawić rekrutację komórek w celu przywrócenia dużego ubytku kostnego

Samoorganizujące się kompleksy polielektrolitowe (PEC) wykonane z heparyny i protaminy zostały osadzone na kulkach alginianowych, aby uwięzić i regulować uwalnianie osteogennych czynników wzrostu. Ta strategia dostarczania umożliwia 20-krotne zmniejszenie dawki BMP-2 w zastosowaniach związanych z usztywnieniem kręgosłupa. Niniejszy artykuł ilustruje korzyści płynące z zastosowania PEC i jego wytwarzanie.

Kompleks polielektrolitowy do dostarczania osteogennego czynnika wzrostu w domenie wiążącej heparynę

W tej metodzie, używamy technik fotopolimeryzacji i chemii kliknięć do tworzenia wzorów białkowych lub peptydowych na powierzchni hydrożeli glikolu polietylenowego (PEG), dostarczając unieruchomionych sygnałów bioaktywnych do badania odpowiedzi komórkowych in vitro.

Wzorowanie bioaktywnych białek lub peptydów na hydrożelu przy użyciu fotochemii do zastosowań biologicznych

Opisujemy prostą procedurę litograficzną do unieruchamiania cząsteczek DNA o długości genu na powierzchni, która może być użyta do przeprowadzenia eksperymentów z ekspresją genów na biochipach bez komórek.

Funkcjonalne powierzchniowe unieruchomienie genów za pomocą wieloetapowej litografii przemieszczenia nici

Tutaj prezentujemy protokoły analizy przebudowy kości w ramach platformy lab-on-a-chip. Wydrukowane w 3D mechaniczne urządzenie ładujące można sparować z platformą w celu wywołania mechanostransdukcji osteocytów poprzez deformację macierzy komórkowej. Platforma może być również wykorzystana do ilościowego określenia funkcjonalnych wyników przebudowy kości na podstawie osteoklastów i osteoblastów (resorpcja/tworzenie).

Platforma lab-on-a-chip do stymulacji mechanotransdukcji osteocytów i analizy funkcjonalnych wyników przebudowy kości

Ten protokół opisuje technikę druku 3D polegającą na wytwarzaniu struktur przypominających kości poprzez umieszczanie tuszu fosforanu wapnia w granulowanym podłożu na bazie żelatyny. Wydrukowane analogi kości są osadzane w dowolnym kształcie, z elastycznością umożliwiającą bezpośrednie zbieranie odcisku lub sieciowanie w żywej macierzy komórkowej w celu uzyskania konstruktów wielofazowych.

Ceramiczny biodruk dookólny w zawiesinach komórkowych do wytwarzania analogów kostnych

Poznaj metodę ukierunkowanego unieruchomienia wariantu BMP2 na rusztowaniach za pomocą chemii kliknięć. To podejście zmniejsza dawkę białka potrzebną do skutecznego gojenia kości i minimalizuje działania niepożądane.

Ukierunkowane na miejsce unieruchomienie białka morfogenetycznego kości 2 na powierzchniach stałych za pomocą chemii kliknięć

Przeglądaj więcej filmów