Ukierunkowane na miejsce unieruchomienie białka morfogenetycznego kości 2 na powierzchniach stałych za pomocą chemii kliknięć

Ogólnym celem tego badania jest solidna i powtarzalna produkcja rusztowania osteogennego poprzez ukierunkowane na miejsce i kowalencyjne sprzężenie nowo zaprojektowanego wariantu BMP2 za pomocą chemii kliknięć. Metoda ta może pomóc w przezwyciężeniu problemów związanych z powszechnie stosowanymi technikami leczenia niegojących się ubytków kości długich. Metody wchłaniania lub kapsułkowania wymagają super fizjologicznych ilości BMP2, które wywołują kilka poważnych skutków ubocznych.

Główną zaletą tej techniki jest użycie mniejszych ilości nowo zaprojektowanego wariantu BMP2, który jest kowalencyjnie połączony z rusztowaniami w sposób skierowany na bok. Rozmnażaj pojedynczą kolonię przez noc w 50 mililitrach pożywki LB z 50 mikrogramami na mililitr kanamycyny i 100 mikrogramami na mililitr ampicyliny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Rozcieńczyć nocne kultury od jednego do 20 do 800 mililitrów wspaniałej pożywki bulionowej uzupełnionej 50 mikrogramami na mililitr kanamycyny i 100 mikrogramami na mililitr ampicyliny.

Hoduj kultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż do osiągnięcia gęstości optycznej 0,7 nanometra przy 600 nanometrach. Następnie dodaj propofol L-Lycine do końcowego stężenia 10 milimolów. Indukować ekspresję genów przez dodanie IPTG do końcowego stężenia jednego milimola.

Hoduj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 16 godzin w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 180 obr./min. Po inkubacji odwirować całą kulturę z prędkością 9 000 g przez 30 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad bakteryjny w 30 mililitrach buforu TBSE.

Zważyć pustą zlewkę wirówkową i przenieść ponownie zawieszony osad do pustej zlewki. Następnie odwirować ponownie zawieszony osad w ilości 6, 360 razy g przez 20 minut. Odrzucić supernatant i zważyć zlewkę razem z osadem.

Odejmij masę pustej zlewki, aby obliczyć wagę osadu. Następnie ponownie zawiesić osad w buforze STE. Użyj 200 mililitrów buforu STE na każde 10 gramów granulatu.

Sonikować zawiesinę na lodzie przed odwirowaniem przy 6, 360 razy g przez 20 minut. Odrzucić sklarowany osad i zważyć osad. Po czterokrotnym powtórzeniu etapów sonikacji i wirowania, ponownie zawiesić osad w 100 mililitrach buforu TBS.

Wirować przy 6, 360 razy g przez 20 minut. Następnie odrzucić supernatant i zważyć osad. Ponownie zawiesić osad w buforze nukleazy ze świeżo dodaną nukleazą, używając 10 mililitrów na gram osadu.

Zawiesinę inkubować przez noc w temperaturze pokojowej na płytce mieszającej z prędkością 30 obr./min. Następnego dnia dodać Triton Buffer do zawiesiny. Objętość Triton Buffer do dodania odpowiada części zawiesiny o objętości 0,5.

Po inkubacji przez 10 minut w temperaturze pokojowej odwirować zawiesinę w temperaturze 6, 360 razy g przez 20 minut. Odrzucić sklarowany osad i zważyć osad. Następnie ponownie zawiesić pastylkę w buforze TE, używając ośmiu mililitrów na gram granulki.

Po odwirowaniu jak poprzednio, wyrzucić supernatant i zważyć osad. Teraz ponownie zawiesić osad, dodając cztery mililitry na gram 25-milimolowego akcynianu sodu, PH5 i pięć mililitrów na gram sześciomolowego chlorku guanidyny z jednym milimolowym DTT. Zawiesinę inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza na płytce mieszającej.

Po odwirowaniu w temperaturze 75, 500 razy g przez 20 minut, supernatant zawiera niesfałdowane, monomeryczne białko BMP2. Zebrać supernatant i stężyć ten ekstrakt do gęstości optycznej na mililitr 20 za pomocą membrany odcinającej o masie cząsteczkowej trzech kilodaltonów w komórce zagęszczającej. Dodaj skoncentrowane monomery w pojedynczych kroplach do buforu renaturacyjnego, mieszając.

Następnie inkubuj roztwór w temperaturze pokojowej przez 120 godzin w ciemności. Dostosować pH roztworu do 3,0 za pomocą stężonego kwasu solnego przed dializowaniem roztworu z jednym milimolowym kwasem solnym. Zagęścić dializowany roztwór za pomocą membrany odcinającej o masie cząsteczkowej 10 kilodaltonów w komórce zagęszczającej.

Następnie załaduj roztwór białka na zrównoważoną kolumnę, rozcieńczyć frakcje za pomocą gradientu liniowego buforu B, zbierając dwie frakcje mililitrowe. Przeanalizuj 20 mikrolitrów każdej frakcji za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym SDS, a następnie barwienia Coomassie Brilliant Blue w celu określenia frakcji zawierających monomery i frakcji zawierających dimery. Następnie wyciągnij dimer zawierający ułamki.

Dializuj pulę dimerów zawierających frakcje przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza przeciwko pięciu litrom jednego milimolowego kwasu solnego. Zagęścić produkt za pomocą 10-kilodaltonowego koncentratującego filtra odśrodkowego przed analizą produktu końcowego za pomocą SDS-PAGE i barwienia Coomassie Brilliant Blue. Połączyć 20 mikromoli typu BMP2-K3Plk lub BMP2-while, który jest stosowany jako kontrola ujemna, z 20 mikrolitrami kulek agarozowych aktywowanych azydkiem w buforze reakcyjnym o łącznej objętości 500 mikrolitrów.

Inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej na obracającej się mieszaninie z prędkością 20 obr./min. Zatrzymaj reakcję, dodając końcowe stężenie pięciu milimolowych EDTA. Inkubować roztwór w temperaturze pokojowej przez 15 minut na mieszalniku obrotowym z prędkością 20 obr./min.

Następnie odwirować próbki o masie 20 000 g przez jedną minutę w temperaturze pokojowej i zebrać supernatanty. Następnie przemyj granulat zawierający kulki 1 000 mikrolitrów buforu HBS 500. Odwirować próbkę o masie 20 000 g przez jedną minutę w temperaturze pokojowej i zebrać supernatant.

Powtórzyć tę procedurę przemywania jeszcze dwa razy z buforem HBS 500, trzy razy z czterema molowymi chlorkami magnezu i dwa razy z PBS, za każdym razem zbierając supernatant. Przechowuj sprzężone koraliki w 1 000 mikrolitrach PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wykonać test ALP zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Aby przeprowadzić barwienie ALP, należy wyhodować promyoblastyczne komórki C2C12 w DMEM z 10% płodową surowicą cielęcą, a także 100 jednostkami na mililitr penicyliny G i streptomycyny w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej atmosferze przy 5% dwutlenku węgla. Podawaj komórki C2C12 o gęstości 30 000 komórek na studzienkę w 96-dołkowej mikropłytce. Po pozostawieniu komórek na noc, usuń pożywkę i dodaj 20 mikrolitrów na dołek sprzężonych kulek PMB2-K3PLK.

Następnie dodaj 20 mikrolitrów 0,4% agarozy o niskiej temperaturze topnienia do każdej studzienki. Odwirować 96-dołkową mikropłytkę w temperaturze 2 000 g przez pięć minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Następnie dodaj 80 mikrolitrów tego samego podłoża.

Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej atmosferze przy 5% dwutlenku węgla przez 72 godziny. Po inkubacji usuń pożywkę, uważając, aby nie oderwać zestalonej 0,4% agarozy. Dodaj 100 mikrolitrów na studzienkę jednoetapowego roztworu podprostego MBT-BCIP.

Analizuj barwienie alkalicznym fosfatydatem za pomocą mikroskopii świetlnej natychmiast po tym, jak purpurowe zabarwienie stanie się widoczne. Użyj mikroskopii jasnego pola i rób zdjęcia. Bioaktywność nowo wyprodukowanego wariantu BMP2-K3Plk jest walidowana przez indukcję ekspresji genu fosfatazy alkalicznej w komórkach C2C12.

Test in vitro wykazuje podobne poziomy ekspresji genów fosfatazy alkalicznej indukowane przez typ BMP2 lub BMP2-K3Plk. Koraliki pokryte BMP2-K3Plk poprzez katalizowaną przez katalizowaną addycję cyklo azydku azydu dawały fluorescencje podczas inkubacji z oznakowaną domeną ekologiczną receptora BMP 1A. Wiązanie receptora BMP 1A z BMP2-K3Plk potwierdza zachowanie bioaktywności po sprzężeniu.

Bioaktywność funkcjonalizowanych kulek BMP2-K3Plk została udowodniona za pomocą barwienia za pośrednictwem ALP. Barwienie wystąpiło tylko w tych komórkach, które miały bezpośredni kontakt z funkcjonalizowanymi kulkami BMP2-K3Plk, co potwierdza, że białko jest rzeczywiście kowalencyjnie połączone z kulkami, a nie tylko wchłaniane. Gdyby białko zostało uwolnione w sytuacji wchłonięcia, zaobserwowano by bardziej rozproszone barwienie na większych odległościach, jak pokazano tutaj w przypadku barwienia fosfatazą alkaliczną po traktowaniu rozpuszczalnym BMP2-K2Plk.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyrażać i wytwarzać biologicznie aktywne białka przez ekspansję genetyczną oraz jak kowalencyjnie łączyć fikcyjne białko z mikrosferami za pomocą reakcji chemicznej kliknięcia. Generowanie wariancji białka poprzez ekspansję genetyczną pozwala w zasadzie na wprowadzenie sztucznego aminokwasu w dowolnej pozycji pierwotnej sekwencji białka. Wprowadzenie mutacji do sekwencji BMP2 może wpłynąć na wydajność ponownego fałdowania, a także może zmienić parametry białka.

Produkcja BMP2-K3Plk wymagała modyfikacji ustalonej metody wyrażania while typu BMP2. Otrzymany BMP2-K3Plk wykazywał aktywność biologiczną porównywalną do białka typu while. Nasze podejście do kowalencyjnego sprzężenia wariantu BMP2 z azyrycznymi fikcyjnymi kulkami agarozy za pomocą chemii kliknięć może być zrealizowane z wysoką wydajnością, co skutkuje fikcyjnymi kulkami, co pozwala na genetyczne zróżnicowanie in vitro.

Musi być zapewniona standardowa ochrona zgodnie z dobrą praktyką laboratoryjną.