Name: Elastyczny pomiar reporterów bioluminescencyjnych za pomocą zautomatyzowanego podłużnego obrazowania lucyferazy zoptymalizowanego pod kątem gazu i temperatury rejestratora (ALLIGATOR) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Poznaj metodę automatycznego obrazowania lucyferazy ALLIGATOR do długoterminowego monitorowania ekspresji genów w komórkach hodowlanych. System umożliwia rejestrację bioluminescencji przy zmiennych warunkach gazowych i temperaturowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Cairn Research za współpracę z nami przy rozwoju tego systemu, w szczególności Markowi Hensonowi, Jeremy'emu Grahamowi i Joao Correi. Dziękujemy również Davidowi Qualishowi i Akhileshowi Reddy'emu za cenną dyskusję podczas fazy projektowania, a także Peterowi Laskeyowi (dawniej z Hamamatsu) za wypożyczenie kamery demonstracyjnej oraz Davidowi Wongowi za jego krytyczny wkład w rękopis.

<ol><li>Morgan, L. W., Greene, A. V., Bell-Pedersen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+and+light-induced+expression+of+luciferase+in+Neurospora+crassa%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet.+and+Biol%22%5BJournal%5D)">Circadian and light-induced expression of luciferase in Neurospora crassa.</a> Fungal Genet. and Biol. 38 (3), 327-332 (2003).</li>
<li>Millar, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Circadian+Phenotype+Based+on+Firefly+Luciferase+Expression+in+Transgenic+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Online%22%5BJournal%5D)">A Novel Circadian Phenotype Based on Firefly Luciferase Expression in Transgenic Plants.</a> Plant Cell Online. 4 (9), 1075-1087 (1992).</li>
<li>Yu, W., Hardin, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Firefly+Luciferase+Activity+Assays+to+Monitor+Circadian+Molecular+Rhythms+In+Vivo+and+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Circadian+Rhythms%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Use of Firefly Luciferase Activity Assays to Monitor Circadian Molecular Rhythms In Vivo and In Vitro.</a> Circadian Rhythms: Methods and Protocols. , 465-480 (2007).</li>
<li>Yoo, S. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PERIOD2%3A%3ALUCIFERASE+real-time+reporting+of+circadian+dynamics+reveals+persistent+circadian+oscillations+in+mouse+peripheral+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues.</a> Proc Natl Acad Sci. 101 (15), 5339-5346 (2004).</li>
<li>Buhr, D. E., Yoo, S. -H., Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+as+a+universal+resetting+cue+for+mammalian+circadian+oscillators%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Temperature as a universal resetting cue for mammalian circadian oscillators.</a> Science. 330 (6002), 379-385 (2010).</li>
<li>Brown, S. A., Zumbrunn, G., Fleury-Olela, F., Preitner, N., Schibler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhythms+of+mammalian+body+temperature+can+sustain+peripheral+circadian+clocks%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Rhythms of mammalian body temperature can sustain peripheral circadian clocks.</a> Current Biology. 12 (18), 1574-1583 (2002).</li>
<li>Balsalobre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resetting+of+circadian+time+in+peripheral+tissues+by+glucocorticoid+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resetting of circadian time in peripheral tissues by glucocorticoid signaling.</a> Science. 289 (5488), 2344-2347 (2000).</li>
<li>Balsalobre, A., Marcacci, L., Schibler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+signaling+pathways+elicit+circadian+gene+expression+in+cultured+Rat-1+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol.+CB%22%5BJournal%5D)">Multiple signaling pathways elicit circadian gene expression in cultured Rat-1 fibroblasts.</a> Curr. Biol. CB. 10 (20), 1291-1294 (2000).</li>
<li>Hastings, M. H., Reddy, A. B., McMahon, D. G., Maywood, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+circadian+mechanisms+in+the+suprachiasmatic+nucleus+by+transgenesis+and+biolistic+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Analysis of circadian mechanisms in the suprachiasmatic nucleus by transgenesis and biolistic transfection.</a> Methods Enzymol. 393, 579-592 (2005).</li>
<li>Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Ba Barres,, Hell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NS21%3A+re-defined+and+modified+supplement+B27+for+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures.</a> J. Neurosci Methods. 171 (2), 239-247 (2008).</li>
<li>Feeney, K. A., Putker, M., Brancaccio, M., ONeill, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-depth+Characterization+of+Firefly+Luciferase+as+a+Reporter+of+Circadian+Gene+Expression+in+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Rhythms%22%5BJournal%5D)">In-depth Characterization of Firefly Luciferase as a Reporter of Circadian Gene Expression in Mammalian Cells.</a> J. Biol. Rhythms. 31 (6), 540-550 (2016).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Hirota, T., Lewis, W. G., Liu, A. C., Lee, J. W., Schultz, P. G., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+biology+approach+reveals+period+shortening+of+the+mammalian+circadian+clock+by+specific+inhibition+of+GSK-3beta%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">A chemical biology approach reveals period shortening of the mammalian circadian clock by specific inhibition of GSK-3beta.</a> Proc Natl Acad Sci. 105 (52), 20746-20751 (2008).</li>
<li>Meng, Q., Maywood, E. S., Bechtold, D. A., Lu, W., Li, J., Gibbs, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entrainment+of+disrupted+circadian+behavior+through+inhibition+of+casein+kinase+1+%28+CK1+%29+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Entrainment of disrupted circadian behavior through inhibition of casein kinase 1 ( CK1 ) enzymes.</a> Proc Natl Acad Sci. 1, 1-6 (2010).</li>
<li>Khabirova, E., Chen, K. -F., O'Neill, J. S., Crowther, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flyglow%3A+Single-fly+observations+of+simultaneous+molecular+and+behavioural+circadian+oscillations+in+controls+and+an+Alzheimer%27s+model%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Flyglow: Single-fly observations of simultaneous molecular and behavioural circadian oscillations in controls and an Alzheimer's model.</a> Sci. Rep. 6, 33759(2016).</li>
</ol>

Nie występuje konflikt interesów.

Opisany tutaj protokół dotyczy hodowli komórek ssaków, zarówno w warunkach perfuzji, jak i statycznych. Jednak ALLIGATOR można łatwo dostosować do innych systemów modelowych. Rzeczywiście, wykazano już, że stanowi doskonałą platformę do jednoczesnego monitorowania lokomocji, snu i rytmów ekspresji genów obwodowych u Drosophila melanogaster utrzymywanych w ciągłej ciemności15. Należy również zauważyć, że w zależności od zastosowania odpowiednie mogą być typy kamer inne niż wymienione tutaj. Przewidujemy, że przy odpowiednich filtrach zmodyfikowana wersja obecnej konfiguracji może być zasadniczo używana do ilościowego oznaczania fluorescencji.
Jedynymi zastosowaniami, dla których ALLIGATOR może nie być odpowiedni, są te, dla których wymagana jest szczególnie wysoka rozdzielczość przestrzenna, takie jak obrazowanie czasoprzestrzennej organizacji ekspresji PER2::LUC w organotypowych wycinkach jądra nadskrzyżowaniowego ssaków lub innych małych wycinkach tkanki.
ALIGATOR umożliwia przeprowadzenie wielu eksperymentów, które do tej pory nie były łatwo osiągalne przy użyciu konwencjonalnych technik nagrywania. W porównaniu z obecnymi metodami pomiaru bioluminescencji, ALLIGATOR zapewnia większą elastyczność zarówno w zakresie rodzaju naczynia do hodowli komórkowej lub szkiełka, które można zastosować, warunków podłoża zewnętrznego, czułości i procesowości.
Jest to szczególnie istotne w czasach, gdy następuje odejście od standardowych modeli hodowli komórkowych 2D na rzecz 3D organoidów i systemów hodowli przepływowych. W związku z tym oczekuje się, że ALLIGATOR zapewni elastyczną metodę, za pomocą której bioluminescencja może być mierzona przez wiele dni i tygodni w szerokim zakresie warunków.

Wykorzystanie lucyferazy jako reporterów ekspresji genów i aktywności białek stało się popularną techniką w badaniach biologii molekularnej i komórkowej. Jest to prawdą w dziedzinie okołodobowej, gdzie kinetyka syntezy lucyferazy świetlików i inaktywacji katalitycznej jest szczególnie dobrze dostosowana do zgłaszania podłużnych zmian w ekspresji genów, które zachodzą w ciągu około 24-godzinnego cyklu okołodobowego. W związku z tym lucyferazy są wykorzystywane jako reporter okołodobowy w szerokim zakresie organizmów, w tym grzybów, roślin, much i ssaków1,2,3,4.
Podczas ilościowego określania ekspresji genów okołodobowych in vitro, powszechnie używa się lampy fotopowielacza (PMT) do rejestrowania sygnału bioluminescencyjnego. Pomiary oparte na PMT mają jednak ograniczoną elastyczność, zwykle są ograniczone do wcześniej określonego rozmiaru talerza lub naczynia. Nie jest również możliwe zebranie żadnych informacji przestrzennych z próbek monitorowanych za pomocą PMT, co może prowadzić do utraty informacji podczas obrazowania próbek, które wykazują przestrzenną zmienność ekspresji lucyferazy. Ponadto, ponieważ PMT i związana z nim elektronika są podatne na awarie pod wpływem wilgotnego środowiska standardowego inkubatora do hodowli komórkowych, podłużny zapis lucyferazy za pomocą PMT jest zawsze wykonywany w inkubatorach nienawilżanych. W związku z tym szalki do hodowli komórkowych muszą być szczelnie zamknięte, aby zapobiec utracie wilgoci w wyniku parowania, a zatem pożywki hodowlane muszą być buforowane kwasem 3-(N-morfolino)propanosulfonowym (MOPS) lub kwasem 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowym (HEPES), a nie systemem buforowym CO2/wodorowęglan, który działa in vivo i jest rutynowo stosowany w hodowlach tkankowych ssaków.
W wyniku tych ograniczeń, pomiar bioluminescencji za pomocą PMT zazwyczaj nakłada ścisłe ograniczenia na warunki, w których komórki są utrzymywane podczas eksperymentów. Aby przezwyciężyć te problemy, a także zwiększyć zakres możliwych warunków eksperymentalnych, używamy standardowego inkubatora do hodowli tkankowych CO2/N2 170 L, który został dostosowany poprzez dodanie chłodzonej wodą kamery EMCCD z urządzeniem do namnażania elektronów z optyką przeciwmgielną i cyfrową kontrolą temperatury i poziomu gazów. Zostało to nazwane Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas and Temperature-Optimized Recorder (ALLIGATOR). ALLIGATOR pozwala na znaczne zwiększenie elastyczności obrazowania bioluminescencyjnego, zarówno w przypadku wysokoprzepustowego obrazowania standardowych płytek do hodowli tkankowych (do 6 x 96- lub 384-dołkowych płytek jednocześnie), jak i w przypadku niestandardowych systemów hodowli tkankowych, takich jak perfuzje komórek hodowanych w urządzeniach mikroprzepływowych. Przyrząd ten pozwala również na obrazowanie w wilgotnych warunkach i ze zmienną kontrolą ciśnienia parcjalnego CO2 i O2 oraz temperatury.
Poniższy protokół opisuje metodę bioluminescencyjnego zapisu systemów hodowli komórek i tkanek ssaków za pomocą ALLIGATORA (zwanego dalej 'inkubatorem bioluminescencji'). Należy jednak zauważyć, że system ten doskonale nadaje się do obrazowania bioluminescencyjnego, a także, z pewnymi modyfikacjami, obrazowania fluorescencyjnego, w wielu innych systemach i kontekstach biologicznych.

<table><tbody><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Hyclon FetalClone III Serum</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30109.03</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże neuropodstawowe</td><td>Thermofisher</td><td>21103049</td><td>podłoże podstawowe</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>A4919</td><td></td></tr><tr><td>Katalaza</td><td>Sigma</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>Glutation</td><td>Sigma</td><td>G6013</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>I1882</td><td></td></tr><tr><td>Dysmutaza ponadtlenkowa</td><td>Sigma</td><td>S5395</td><td></td></tr><tr><td>Holotransferyna</td><td>Calbiochem</td><td>616424</td><td></td></tr><tr><td>T3 (trijodo-L-tyronina</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>L-karnityna</td><td>Sigma</td><td>C7518</td><td></td></tr><tr><td>Etanoloamina</td><td>Sigma</td><td>E9508</td><td></td></tr><tr><td>D (+)-galaktoza</td><td>Sigma</td><td>G0625</td><td></td></tr><tr><td>Putrescyna</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Selenin sodu</td><td>Sigma</td><td>S9133</td><td></td></tr><tr><td>Kortykosteron</td><td>Sigma</td><td>C2505</td><td></td></tr><tr><td>Kwas linolowy</td><td>Sigma</td><td>L1012</td><td></td></tr><tr><td>Kwas linolenowy</td><td>Sigma</td><td>L2376</td><td></td></tr><tr><td>Kwas liponowy</td><td>Sigma</td><td>T1395</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Octan retinolu</td><td>Sigma</td><td>R7882</td><td></td></tr><tr><td>Retinol, wszystko trans</td><td>Sigma</td><td>95144</td><td></td></tr><tr><td>D,L-alfa-tokoferol</td><td>Sigma</td><td>95240</td><td></td></tr><tr><td>D,octan L-alfa-tokoferolu</td><td>Sigma</td><td>T3001</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór wodorowęglanu sodu</td><td>Sigma</td><td>S8761-100ML</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator penicylina-streptomycyna</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Galaxy 170R&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>CO17301001</td><td></td></tr><tr><td>Luciferin</td><td>Biosynth</td><td>L-8220</td><td></td></tr><tr><td>D -(+)-Roztwór glukozy</td><td>Sigma</td><td>G8644-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DMEM w proszku</td><td>Sigma</td><td>D5030</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>PHG0007</td><td></td></tr><tr><td>1 mm ID silikonowa rurka&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>19-4692-01</td><td></td></tr><tr><td>Złącze kolankowe</td><td>luer Ibidi</td><td>10802</td><td></td></tr><tr><td>Złączki męskie</td><td>luer Ibidi</td><td>10826</td><td></td></tr><tr><td>Złączki żeńskie luer</td><td>Ibidi</td><td>10825</td><td></td></tr><tr><td>&micro;-slide luer I 0,6</td><td>Ibidi</td><td>80196</td><td></td></tr><tr><td>BD plastipak 20ml strzykawka</td><td>Becton Dickinson</td><td>300613</td><td></td></tr><tr><td>1mm Rurki ID ETFE</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1142-38</td><td></td></tr><tr><td>PF670462</td><td>Suplement Sigma</td><td>SML0795</td><td></td></tr><tr><td>B27 (50x)</td><td>Kamera ThermoFisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>iXon Ultra EMCCD</td><td>Andor</td><td>iXon 888</td><td></td></tr><tr><td>Fidżi</td><td>ImageJ</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Prism 7.0</td><td>Oprogramowanie Graphpad</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Trypan niebieski</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Podkładka izotermiczna Deltaphase</td><td>Braintree Scientific</td><td>39DP</td><td></td></tr><tr><td>Podgrzewany filtr o neutralnej gęstości&nbsp;</td><td>Cairn Research</td><td>Pozycja</td><td></td>niestandardowa</tr><tr><td>Osmomat 030</td><td>Gonotech Wycofano</td> ze <td>sprzedaży</td><td></td></tr><tr><td>300 mOsmol/kg standard kalibracji</td><td>Gonotech</td><td>30.9.0020</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie pomiarowe</td><td>Gonotech</td><td>30.9.0010</td><td></td></tr><tr><td>Cylinder skupiający</td><td>Cairn Research</td><td>Pozycja niestandardowa</td> NE-1600 <td></td></tr><tr><td>programowalna pompa strzykawkowa</td><td>Pump Systems inc. </td><td>NE-1600</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Andor Solis</td><td>Andor</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr></tbody></table>

elastyczny pomiar reporterów bioluminescencyjnych za pomocą zautomatyzowanego podłużnego obrazowania lucyferazy zoptymalizowanego pod kątem gazu i temperatury rejestratora (alligator)

Flexible Measurement of Bioluminescent Reporters Using an Automated Longitudinal Luciferase Imaging Gas- and Temperature-optimized Recorder (ALLIGATOR)

Oparte na lucyferazie reportery ekspresji genów komórkowych są powszechnie używane zarówno do badań podłużnych, jak i końcowych aktywności biologicznej. Na przykład w badaniach nad rytmami okołodobowymi fuzje genów zegarowych z lucyferazy świetlików powodują powstanie silnych rytmów w bioluminescencji komórkowej, które utrzymują się przez wiele dni. Ograniczenia techniczne związane z lampami fotopowielającymi (PMT) lub konwencjonalnymi metodami ilościowego oznaczania bioluminescencji opartymi na mikroskopii zazwyczaj wymagały, aby komórki i tkanki były utrzymywane w zupełnie niefizjologicznych warunkach podczas rejestracji, z kompromisem między czułością a przepustowością. W tym miejscu informujemy o udoskonaleniu wcześniejszych metod, które umożliwiają długoterminowe obrazowanie bioluminescencyjne z wysoką czułością i przepustowością, które obsługuje szeroki zakres warunków hodowli, w tym zmienną kontrolę gazu i wilgotności, i które akceptuje wiele różnych płytek i szalek do hodowli tkankowych. Ten zautomatyzowany podłużny rejestrator obrazowania lucyferazy zoptymalizowany pod kątem gazu i temperatury (ALLIGATOR) umożliwia również obserwację przestrzennych zmian w ekspresji lucyferazy w monowarstwie komórki lub tkance, których nie można łatwo zaobserwować tradycyjnymi metodami. Podkreślamy, w jaki sposób ALLIGATOR zapewnia znacznie większą elastyczność w wykrywaniu aktywności lucyferazy w porównaniu z istniejącymi metodami.

Niniejszy artykuł przedstawia protokół obrazowania bioluminescencyjnego komórek ssaków z wykorzystaniem inkubatora bioluminescencyjnego ALLIGATOR. Technika ta zapewnia elastyczność w zakresie konfiguracji fizycznej oraz warunków zewnątrzkomórkowych podczas obrazowania systemów bioluminescencyjnych. Metody zarówno dla prostej statycznej hodowli tkankowej (Rycina 1, Wideo uzupełniające 1) oraz perfuzyjną hodowlę komórkową (Rycina 2, Film uzupełniający 2) zostały opisane, jednak za pomocą tego systemu można obrazować wiele innych układów. Wszystkie dane poddano ilościowej analizie zgodnie z metodami opisanymi w sekcji 7.
Rysunek 1A przedstawia przykładowe nagranie bioluminescencji z 6 płytek 96-dołkowych zawierających fibroblasty PER2::LUC4. Najzewnętrzne dołki nie zawierają komórek, ponieważ nie były one wymagane w tym doświadczeniu. Komórki zostały poddane różnicowej synchronizacji temperaturą, w której poddano je albo cyklowi temperaturowemu 12 h w 32 °C, a następnie 12 h w 37 °C przez 72 h, albo odwrotnej sekwencji (12 h w 37 °C, a następnie 12 h w 32 °C przez 72 h), przed utrzymaniem ich w stałej temperaturze 37 °C podczas rejestracji. Ekspozycje trwające 60 min wykonywano co godzinę. Dwa z tych warunków zostały ilościowo określone na Rysunku 1B.
Rysunek 2A przedstawia schemat ustawienia systemu do hodowli tkanek perfundowanych. Składa się on z dwóch szkiełek z kanałami połączonych rurkami. Pożywka jest tłoczona przez komórki za pomocą pompy strzykawkowej. Pierwsze z tych szkiełek pełni rolę przepuszczalnej dla gazów pułapki na pęcherzyki powietrza (szkiełko buforowe) i nie zawiera komórek, natomiast drugie zawiera komórki, z których rejestrowano bioluminescencję. Reprezentatywny film z rejestracji z tego systemu przedstawiono na Rysunku 2B. Naświetlania 15 min wykonywano co 15 min. W tym układzie komórki utrzymywano albo w standardowych warunkach perfuzji, albo w obecności inhibitora kinazy kazeinowej PF670462, o którym wcześniej wykazano, że wydłuża on okres okopodobowy i zmniejsza amplitudę rytmów ekspresji genów zegarowych w hodowlanych komórkach ssaków14. Wpływ na ekspresję PER2::LUC przedstawiono na Rysunku 2C (górny panel) w zestawieniu z komórkami traktowanymi taką samą koncentracją leku w standardowych warunkach statycznej hodowli komórkowej pokazanymi na Rysunku 2C (dolny panel), a ilościowe określenie okresu przedstawiono na Rysunku 2D. Wynika z tego jasno, że traktowanie PF670462 wpływa na ekspresję PER2::LUC w obu zestawach warunków. Jednakże, podczas gdy komórki traktowane PF670462 w warunkach perfuzji wykazują wydłużenie okresu o około 3 h (3 ±0,9 h), komórki w warunkach statycznych traktowane lekiem wykazują znacznie większe wydłużenie okresu do wartości &gt;48 h. Można to dopasować za pomocą tłumionej cosinusoïdy, jak opisano w Sekcji 7 (test F dla nadmiarowej sumy kwadratów w stosunku do linii prostej, p &lt;0,0001). Co ciekawe, wielkość wydłużenia okresu podczas perfuzji jest znacznie bliższa tej obserwowanej in vivo14.
<img alt="Wynik testu bioluminescencji; ekspresja PER2::LUC; wykres przebiegu w czasie; cykle temperatury 32°C-37°C." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56623/56623fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Przykład danych. (A) Przykładowy kadr z filmu przedstawiający bioluminescencję unieśmiertelnionych komórek PER2::LUC w 6 płytkach 96-dołkowych w inkubatorze do bioluminescencji. Doilki podlegające kwantyfikacji zostały zaznaczone na żółto w Supplementary Video 1. (B) Kwantyfikacja bioluminescencji z panelu A. Dwa zestawy po 3 płytek z komórkami zostały zsynchronizowane za pomocą cykli temperatury (12 h w 32 °C; 12 h w 37°C), które były względem siebie antyfazowe, aby uzyskać przeciwstawne fazy ekspresji białka PER2 (n = 6, średnia ± SEM). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56623/56623fig1v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat systemu perfuzyjnego, wyniki luminescencji, wykres zależny od czasu oraz analiza na wykresie słupkowym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56623/56623fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Perfusja z zastosowaniem inhibitorów CK1δ. (A) Schemat systemu perfuzyjnego. (B) Przykładowy kadr wideo z rejestracji bioluminescencji komórek PER2::LUC podczas perfuzji. Żółtym kolorem zaznaczono przykładowy obszar kwantyfikacji. (C) Kwantyfikacja bioluminescencji fibroblastów PER2::LUC podczas perfuzji oraz w warunkach statycznych, z dodatkiem i bez 3 µM inhibitora CK1 PF670462 (n = 3, średnia ± SEM). Bioluminescencję znormalizowano do wartości minimalnej i maksymalnej. (D) Analiza okresu (dwukierunkowa analiza wariancji ANOVA, wielokrotny test porównawczy Holma-Sidaka). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56623/56623fig2v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponent</td>
			<td>Końcowe stężenie pożywki (μM)</td>
			<td>Roztwór stokowy (mg/ml)</td>
			<td>Do 400 ml NS21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumina wołowa</td>
			<td>37</td>
			<td>-</td>
			<td>50 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Katalaza</td>
			<td>0.01</td>
			<td>-</td>
			<td>50 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutation</td>
			<td>3.2</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulina</td>
			<td>0.6</td>
			<td>10</td>
			<td>8 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dysmutaza ponadtlenkowa</td>
			<td>0.077</td>
			<td>-</td>
			<td>50 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holo-transferyna</td>
			<td>0.062</td>
			<td>-</td>
			<td>100 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T3 (trijodotyronina L)*</td>
			<td>0.0026</td>
			<td>2</td>
			<td>20 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-karnityna</td>
			<td>12</td>
			<td>-</td>
			<td>40 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etanoloamina</td>
			<td>16</td>
			<td>ciecz (1 g/ml)</td>
			<td>20 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D(+)-galaktoza</td>
			<td>83</td>
			<td>-</td>
			<td>300 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Putresceyna</td>
			<td>183</td>
			<td>-</td>
			<td>322 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selenian sodu</td>
			<td>0.083</td>
			<td>1</td>
			<td>280 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kortykosteron</td>
			<td>0.058</td>
			<td>2</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwas linolowy</td>
			<td>3.5</td>
			<td>100</td>
			<td>0,2 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwas linolenowy</td>
			<td>3.5</td>
			<td>100</td>
			<td>0,2 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwas liponowy</td>
			<td>0.2</td>
			<td>4.7</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Progesteron</td>
			<td>0.02</td>
			<td>3.2</td>
			<td>0,04 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octan retinolu</td>
			<td>0.2</td>
			<td>20</td>
			<td>0,1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinol, całkowicie trans</td>
			<td>0.3</td>
			<td>10</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D,L-alfa-tokoferol</td>
			<td>2.3</td>
			<td>100</td>
			<td>0,2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>octan D,L-α-tokoferolu</td>
			<td>2.1</td>
			<td>100</td>
			<td>0,2 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Przygotowanie NS21.
Wideo uzupełniające 1: Przykładowy film przedstawiający bioluminescencję w płytkach wielodołkowych. Przykładowy kadr z filmu przedstawiający bioluminescencję unieśmiertelnionych komórek PER2::LUC w 6 płytkach 96-dołkowych w inkubatorze do bioluminescencji. Doilki przeznaczone do kwantyfikacji są zaznaczone na żółto. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56623/Video_1A_Revision-1.avi">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Film uzupełniający 2: Przykładowy zrzut ekranu z nagrania bioluminescencji z komórek PER2::LUC w warunkach perfuzji. Przykładowy obszar kwantyfikacji zaznaczono na żółto. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56623/Video_2B_Revision-1.avi">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Genetycznie kodowana lucyferazy jest popularnym nieinwazyjnym raportem ekspresji genów. Zastosowanie zautomatyzowanego rejestratora ALLIGATOR do obrazowania podłużnego lucyferazy pod kątem gazu i temperatury umożliwia rejestrację podłużną komórek bioluminescencyjnych w szerokim zakresie warunków. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób ALLIGATOR może być stosowany w kontekście badań nad rytmami okołodobowymi.

Elastyczny pomiar reporterów bioluminescencyjnych za pomocą zautomatyzowanego podłużnego obrazowania lucyferazy zoptymalizowanego pod kątem gazu i temperatury rejestratora (ALLIGATOR)

Luciferase-based reporters of cellular gene expression are in widespread use for both longitudinal and end-point assays of biological activity. In ...

Ogólnym celem tego systemu jest umożliwienie łatwej obserwacji reporterów bioluminescencyjnych w szerokim zakresie warunków zewnątrzkomórkowych, w tym przy stałej perfuzji pożywki. Metoda ta może być stosowana do obserwacji bioluminescencji podłużnej z hodowanych komórek i tkanek. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na nagrywanie z komórek w różnych warunkach mediów zewnątrzkomórkowych i gazów, co nie jest możliwe w większości istniejących systemów.Chociaż tutaj demonstrujemy tę technikę w kontekście eksperymentów z rytmem okołodobowym, można ją łatwo zastosować do innych systemów, które wymagają rejestracji bioluminescencyjnej lub fluorescencyjnej w skalach czasowych od dni do tygodni. Aby rozpocząć procedurę, wysiewaj hodowane komórki na szalkach lub płytkach do hodowli tkankowych. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż monowarstwy osiągną 100% zbieżności.Bezpośrednio przed eksperymentem użyj sterowanego komputerowo inkubatora rowerowego, aby zmieniać temperaturę między 32 a 37 stopni Celsjusza co 12 godzin przez co najmniej 72 godziny, aby zsynchronizować rytmy komórkowe. Solidna synchronizacja komórkowych oscylacji okołodobowych zarówno w obrębie kultur, jak i między nimi ma kluczowe znaczenie dla odtwarzalności eksperymentalnej. Osiągamy to, stosując dzienne cykle temperatury przed każdym nagraniem, które synchronizują komórki, naśladując rytmy temperatury ciała.Alternatywnie, synchronizacja farmakologiczna może być również dość skuteczna. Następnie połącz 8,3 grama proszku DMEM o wysokiej zawartości glukozy z 900 mililitrami ultraczystej wody. Mieszaj roztwór przez 30 minut, aby całkowicie rozpuścić proszek.Następnie dodaj do roztworu 50 mililitrów 100 gramów na litr roztworu glukozy, 20 mililitrów pH 7,6, jeden molowy roztwór MOPS i 10 mililitrów 100-krotnego roztworu streptomycyny penicyliny. Mieszaj mieszaninę przez 10 minut. Następnie dodaj 4,7 mililitra 7,5% roztworu wodorowęglanu sodu i mieszaj mieszaninę przez kolejne pięć minut.Użyj kwasu solnego lub wodorotlenku sodu, aby dostosować pH do 7,6 w temperaturze pokojowej. Dodaj ultraczystą wodę do roztworu, aby uzyskać końcową objętość jednego litra. Przefiltrować roztwór przez sterylny filtr o średnicy 0,22 mikrometra do sterylnej kolby.Przefiltrowaną pożywkę podstawową należy przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Bezpośrednio przed wykonaniem eksperymentu uzupełnij żądaną ilość podłoża podstawowego 10% surowicy, dwoma milimolowymi GlutaMAX, 2%NS21 i jednym milimolowym lucyferyną. Przepuść powstały czynnik roboczy przez sterylny filtr o średnicy 0,22 mikrometra.Użyj pięciomolowego roztworu chlorku sodu, aby dostosować osmolalność podłoża roboczego do 350 miliosmolów. Następnie podgrzej podłoże do 37 stopni Celsjusza w łaźni wodnej. Następnie, aby rozpocząć ustawianie ostrości kamery inkubatora bioluminescencji, odkręć nieprzepuszczalny dla wody podgrzewany filtr o neutralnej gęstości.W oprogramowaniu przyrządu ustaw czas naświetlania na 0.2 sekundy, a czas cyklu kinetycznego na 0.3 sekundy. Sprawdź, czy wzmocnienie zwielokrotniające elektrony jest wyłączone, a następnie zamknij okno konfiguracji i rozpocznij nagrywanie wideo. Użyj cylindra ostrości, aby obrócić obiektyw aparatu, aż elementy testowe na odpowiedniej półce na próbki będą wyraźnie ostre.Następnie zatrzymaj nagrywanie wideo. Wymień filtr o neutralnej gęstości i wyjmij elementy testowe. Następnie użyj panelu sterowania z przodu inkubatora bioluminescencyjnego, aby ustawić żądane poziomy tlenu, dwutlenku węgla i temperatury dla eksperymentu.W przypadku eksperymentu z nawilżaniem napełnij tackę na wodę u podstawy inkubatora. Usunąć komórki z inkubatora do hodowli tkankowych i zastąpić pożywkę hodowlaną wstępnie podgrzaną pożywką roboczą. W przypadku eksperymentów nawilżanych przy użyciu małych objętości należy uszczelnić płytki folią lub taśmą przepuszczającą gaz.Umieść płytki w inkubatorze bioluminescencyjnym. Zamknij inkubator i zamocuj pokrywę drzwi, aby wykluczyć światło z systemu. Następnie w oprogramowaniu przyrządu ustaw tryb akwizycji na kinetyczny.Ustaw żądany czas ekspozycji. Ustaw akumulacje na jeden, długość serii kinetycznej na żądaną liczbę cykli akwizycji, a czas cyklu kinetycznego na żądany interwał obrazowania. Ustaw prędkość zmiany biegów na 4,33 mikrosekundy, wzmocnienie o jeden i wzmocnienie EM o żądany poziom.Następnie ustaw typ pliku automatycznego zapisywania na sif lub tiff. Nazwij plik automatycznego zapisywania i ustaw jego ścieżkę. Ustaw typ pliku buforowania na sif lub tiff.Nazwij stos plików i ustaw jego ścieżkę do pliku. Zamknij okno konfiguracji i rozpocznij rejestrowanie danych. Po zakończeniu zbierania danych zaimportuj uzyskany stos obrazów do oprogramowania do przetwarzania obrazu.Dostosuj jasność i kontrast, aby uzyskać optymalne view bioluminescencji. Następnie wybierz interesujące Cię obszary i wyeksportuj średni sygnał dla wybranych obszarów. Skopiuj dane do oprogramowania analitycznego w celu dalszego przetwarzania.Aby rozpocząć eksperyment, należy zasiać komórki na jednokanałowych szkiełkach z łącznikami Luer i głębokością kanału 0,6 lub 0,8 milimetra. Hoduj i porywaj komórki. Przygotować i ogrzać pożywkę perfuzyjną DMEM o niskiej zawartości glukozy, buforowaną wodorowęglanem.Następnie wytnij pięć dwucentymetrowych odcinków silikonowych rurek o średnicy wewnętrznej jednego milimetra. Wytnij 1,2-metrowe, 10-centymetrowe i 30-centymetrowe rurki z etylenu tetrafluoroetylenu o średnicy wewnętrznej jednego milimetra. Wysterylizuj rurkę 70% etanolem i przepłucz rurkę sterylnym PBS.Użyj wysterylizowanej rurki silikonowej, aby połączyć 1.2-metrową rurkę ETFE ze sterylnym żeńskim złączem Luer i sterylnym złączem kolankowym Luer. Użyj tego zestawu, aby podłączyć strzykawkę z medium perfuzyjnym do pustego szkiełka z kanałem Luer. Następnie zastąp pożywkę do hodowli komórkowych wstępnie podgrzaną pożywką perfuzyjną.Napełnij 20-mililitrową sterylną strzykawkę wstępnie podgrzanym podłożem perfuzyjnym. Zamontuj 10-centymetrową rurkę ETFE ze złączami Luer za pomocą silikonowej rurki i podłącz rurkę do suwaka. Przepłukać od trzech do pięciu mililitrów medium perfuzyjnego przez rurkę i szkiełko kanałowe.Następnie dopasuj 30-centymetrową rurkę ETFE do prowadnicy kanałowej zawierającej ogniwa. Podłącz wolny koniec 10-centymetrowej rurki ETFE do drugiego końca suwaka kanału komórkowego, aby utworzyć kompletny system perfuzyjny. Przepłucz jeden mililitr pożywki perfuzyjnej przez rurki i szkiełka, aby wykluczyć pęcherzyki powietrza.Przetransportować system perfuzyjny do inkubatora bioluminescencyjnego. Zamocuj strzykawkę wypełnioną medium perfuzyjnym w pompie strzykawkowej, uważając, aby nie odłączyć rurki. Użyj pompy strzykawkowej, aby przepłukać jeden mililitr pożywki perfuzyjnej przez system perfuzyjny.Wprowadź średnicę strzykawki na pompie i ustaw natężenie przepływu na 50 mikrolitrów na godzinę. Bardzo ważne jest, aby na początku eksperymentu w systemie perfuzyjnym nie było pęcherzyków, ponieważ mogą one zakłócić sygnał bioluminescencji. Uruchom pompę i natychmiast zamknij drzwi inkubatora bioluminescencyjnego.Zamocuj pokrywę drzwi, aby wykluczyć światło z systemu. Zbieraj i analizuj dane zgodnie z opisem dla statycznych kultur tkankowych. Sześć płytek fibroblastów PER2 LUC porwano za pomocą dziennych cykli temperatury i zobrazowano za pomocą inkubatora bioluminescencyjnego.Przeanalizowano obrazy z wybranych odwiertów i określono ilościowo wynik bioluminescencji. Komórki PER2 LUC zostały również zobrazowane w warunkach perfuzji, aby ocenić wpływ inhibitora kinazy kazeinowej na ekspresję PER2 LUC. Wyniki porównano z komórkami, którym podawano to samo stężenie inhibitora w warunkach statycznych, co wykazało znacznie większe wydłużenie okresu w warunkach statycznych.Stwierdzono, że wielkość wydłużającego się okresu w warunkach perfuzji jest zbliżona do obserwowanej in vivo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonywać eksperymenty bioluminescencji zarówno statycznej, jak i perfuzyjnej za pomocą ALLIGATORA.

flexible-measurement-bioluminescent-reporters-using-an-automated

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszej pracy opisujemy procedury badania zmian w ekspresji genów indukowanej fagocytozą z wykorzystaniem podejścia opartego na genach reporterowych lucyferazy, stosując system Dual-GloTM Luciferase Assay System firmy Promega.

Badanie biogenezy błon za pomocą testu z genem reporterowym opartym na lucyferazie

Opisano metody obrazowania bioluminescencyjnego infekcji bakteryjnych u żywych zwierząt. Patogeny są modyfikowane w celu ekspresji lucyferazy, co umożliwia optyczne obrazowanie całego ciała w celu wykrycia infekcji u żywych zwierząt. Modele zwierzęce mogą zostać zainfekowane patogenami wykazującymi ekspresję lucyferazy, a wynikający z tego przebieg choroby może być wizualizowany w czasie rzeczywistym za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego.

Wykorzystanie lucyferazy do obrazowania infekcji bakteryjnych u myszy

W niniejszej pracy opisujemy metody konstruowania, wizualizacji i kwantyfikacji reakcji bioluminescencyjnych enzymów lucyferazy świetlikowej oraz renilla, wykazujących ekspresję w komórkach przerzutowego raka piersi podczas ich wzrostu i przerzutowania in vivo.

In vivo dwusubstratowe obrazowanie bioluminescencyjne

Zegary okołodobowe funkcjonują w obrębie poszczególnych komórek, tzn. są autonomiczne komórkowo. W niniejszej pracy opisujemy metody tworzenia autonomicznych komórkowo modeli zegara z wykorzystaniem nieinwazyjnej technologii bioluminescencji w czasie rzeczywistym opartej na lucyferazie. Komórki reporterowe stanowią praktyczne, funkcjonalne systemy modelowe do badania biologii okołodobowej.

Monitorowanie komórkowych autonomicznych rytmów okołodobowych ekspresji genów z wykorzystaniem reporterów bioluminescencyjnych lucyferazy

Niniejszy artykuł opisuje podawanie myszom bakterii z markerem lux oraz późniejszą analizę in vivo z wykorzystaniem obrazowania bioluminescencyjnego IVIS.

Obrazowanie bakterii bioluminescencyjnych In vivo

Film demonstruje test lucyferazy używany do ilościowego oznaczania białek znakowanych lucyferazy. W teście wykorzystuje zmodyfikowany enzym lucyferazy składający się z dużego fragmentu, który wiąże się z małym fragmentem, który jest sprzężony z interesującym białkiem. Związane podjednostki tworzą aktywny enzym, który w obecności substratu uwalnia sygnał luminescencyjny. Sygnał ten jest następnie oznaczany ilościowo za pomocą luminometru.

Test lucyferazy: wysokoprzepustowy test do pomiaru sygnałów luminescencyjnych przy użyciu zaprojektowanych bioreporterów opartych na systemie nanolucyferazy

Komórki ssaków wyrażające kasetę genu bioluminescencji bakteryjnej (luksy) wytwarzają światło autonomicznie. Wykazano, że uzyskana dynamika bioluminescencyjna po ekspozycji chemicznej odzwierciedla wpływ leczenia na wzrost i metabolizm komórek, dzięki czemu komórki te są niedrogim, ciągłym narzędziem do badań przesiewowych toksyczności w czasie rzeczywistym, które można łatwo dostosować do automatyzacji o wysokiej przepustowości.

Autonomicznie bioluminescencyjne komórki ssaków do ciągłego monitorowania cytotoksyczności w czasie rzeczywistym

Tutaj prezentujemy nowatorskie podejście do obrazowania Ca2+ za pomocą bioluminescencyjnego reportera. Podejście to wykorzystuje stopiony konstrukt GFP-aequorin, który wiąże się z Ca2+ i emituje światło, eliminując potrzebę wzbudzenia światła. Co istotne, metoda ta pozwala na długie, ciągłe obrazowanie, dostęp do głębokich struktur mózgu i wysoką rozdzielczość czasową.

In vivo (in vivo) Funkcjonalne obrazowanie mózgu oparte na bioluminescencyjnym wskaźniku wapnia GFP-aequorin

Bakterie bioluminescencyjne regulują produkcję światła za pomocą różnych mechanizmów, takich jak quorum sensing. Ta nowatorska metoda pozwala na badanie in situ bioluminescencji i korelacji emisji światła z gęstością komórek. Sztuczny bioluminescencyjny system Escherichia coli pozwala na scharakteryzowanie operonów luksów, białek Lux i ich wzajemnych oddziaływań.

In Situ Pomiar i korelacja gęstości komórek i emisji światła bakterii bioluminescencyjnych

Neuronalne komórki macierzyste/progenitorowe wykazują różną dynamikę ekspresji komponentów sygnalizacyjnych Notch, które prowadzą do różnych wyników zdarzeń komórkowych. Taką dynamiczną ekspresję można ujawnić poprzez monitorowanie w czasie rzeczywistym, a nie przez analizę statyczną, przy użyciu bardzo czułego systemu obrazowania bioluminescencyjnego, który umożliwia wizualizację szybkich zmian w ekspresji genów.

Obrazowanie bioluminescencyjne w czasie rzeczywistym dynamiki sygnalizacji Notch podczas neurogenezy myszy

Rytmy okołodobowe, które istnieją w większości organizmów, regulują czasową organizację organoidów biologicznych processes. 3D ostatnio pojawiły się jako fizjologicznie istotny model in vitro. Protokół ten opisuje zastosowanie bioluminescencyjnych reporterów do obserwacji rytmów okołodobowych w organoidach, umożliwiając badania in vitro rytmów okołodobowych w układach wielokomórkowych.

Monitorowanie oscylacji okołodobowych za pomocą reportera bioluminescencji w organoidach

Poznaj metodę automatycznego obrazowania lucyferazy ALLIGATOR do długoterminowego monitorowania ekspresji genów w komórkach hodowlanych. System umożliwia rejestrację bioluminescencji przy zmiennych warunkach gazowych i temperaturowych.

Elastyczny pomiar reporterów bioluminescencyjnych za pomocą zautomatyzowanego podłużnego obrazowania lucyferazy zoptymalizowanego pod kątem gazu i temperatury rejestratora (ALLIGATOR) (Wideo) | JoVE Journal

Elastyczny pomiar reporterów bioluminescencyjnych za pomocą zautomatyzowanego podłużnego obrazowania lucyferazy zoptymalizowanego pod kątem gazu i temperatury rejestratora (ALLIGATOR)

Przeglądaj więcej filmów