Name: In vivo (in vivo) Ocena EPR pH, pO2, stanu redoks oraz stężeń fosforanów i glutationu w mikrośrodowisku guza (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Poznaj technologię EPR do nieinwazyjnej oceny mikrośrodowiska guza w modelach raka piersi u myszy. Ta metoda dostarcza ilościowych danych na temat utlenowania tkanek i stanu metabolicznego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez granty NIH CA194013, CA192064 i U54GM104942. WVCTSI jest dopuszczony do rozruchu przez VVK, AB i TDE. Autorzy dziękują dr M. Gencheva i K. Steinbergerowi za pomoc w przeprowadzeniu eksperymentów ilustracyjnych. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentują one oficjalne poglądy NIH.

<ol><li>Siemann, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSiemann%2C+DW+%22Tumor+Microenvironment%22">Tumor Microenvironment</a>. , John Wiley & Sons Ltd.,. Chichester, UK; Hoboken, NJ, USA. (2011).</li>
<li>Tatum, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia%3A+importance+in+tumor+biology%2C+noninvasive+measurement+by+imaging%2C+and+value+of+its+measurement+in+the+management+of+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Radiat+Biol%22%5BJournal%5D)">Hypoxia: importance in tumor biology, noninvasive measurement by imaging, and value of its measurement in the management of cancer therapy.</a> Int J Radiat Biol. 82 (10), 699-757 (2006).</li>
<li>Brahimi-Horn, M. C., Chiche, J., Pouyssegur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+signalling+controls+metabolic+demand%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Hypoxia signalling controls metabolic demand.</a> Curr Opin Cell Biol. 19 (2), 223-229 (2007).</li>
<li>Haulica, A., Ababei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+glycolytic+activity+in+the+erythrocytes+of+animals+with+chronic+experimental+hypoxia+and+with+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasma%22%5BJournal%5D)">Comparative study of glycolytic activity in the erythrocytes of animals with chronic experimental hypoxia and with tumours.</a> Neoplasma. 21 (1), 29-35 (1974).</li>
<li>Matsumoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mapping+of+tumor+redox+status+by+magnetic+resonance+imaging+using+nitroxides+as+redox-sensitive+contrast+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">High-resolution mapping of tumor redox status by magnetic resonance imaging using nitroxides as redox-sensitive contrast agents.</a> Clin Cancer Res. 12 (8), 2455-2462 (2006).</li>
<li>Estrela, J. M., Ortega, A., Obrador, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+in+cancer+biology+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Clin+Lab+Sci%22%5BJournal%5D)">Glutathione in cancer biology and therapy.</a> Crit Rev Clin Lab Sci. 43 (2), 143-181 (2006).</li>
<li>Voegtlin, C., Thompson, J. W. <a target="_blank" href="http://www.jbc.org/content/70/3/801.full.pdf">Glutathione content of tumor animals.</a> J. Biol. Chem. 70, 801-806 (1926).</li>
<li>Bobko, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstitial+Inorganic+Phosphate+as+a+Tumor+Microenvironment+Marker+for+Tumor+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Interstitial Inorganic Phosphate as a Tumor Microenvironment Marker for Tumor Progression.</a> Sci Rep. 7, 41233(2017).</li>
<li>Gillies, R. J., Raghunand, N., Garcia-Martin, M. L., Gatenby, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH+imaging.+A+review+of+pH+measurement+methods+and+applications+in+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Eng+Med+Biol+Mag%22%5BJournal%5D)">pH imaging. A review of pH measurement methods and applications in cancers.</a> IEEE Eng Med Biol Mag. 23 (5), 57-64 (2004).</li>
<li>Gade, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intratumoral+convection%3A+pressure-dependent+enhancement+in+chemotherapeutic+delivery+to+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Imaging intratumoral convection: pressure-dependent enhancement in chemotherapeutic delivery to solid tumors.</a> Clin Cancer Res. 15 (1), 247-255 (2009).</li>
<li>Bobko, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+monitoring+of+pH%2C+redox+status%2C+and+glutathione+using+L-band+EPR+for+assessment+of+therapeutic+effectiveness+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Magn+Reson+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors.</a> Magn Reson Med. 67, 1827-1836 (2012).</li>
<li>Dhimitruka, I., Bobko, A. A., Eubank, T. D., Komarov, D. A., Khramtsov, V. V. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja401572r">Phosphonated Trityl Probe for Concurrent In Vivo Tissue Oxygen and pH Monitoring Using EPR-based Techniques.</a> JACS. 135, 5904-5910 (2013).</li>
<li>Pandian, R. P., Parinandi, N. L., Ilangovan, G., Zweier, J. L., Kuppusamy, P. Novel particulate spin probe for targeted determination of oxygen in cells and tissues. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPandian%2C+RP+%22Free+Radic+Biol+Med%22">Free Radic Biol Med</a>. 35 (9), 1138-1148 (2003).</li>
<li>Bobko, A. A., Evans, J., Denko, N. C., Khramtsov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+Longitudinal+EPR+Monitoring+of+Tissue+Oxygenation%2C+Acidosis%2C+and+Reducing+Capacity+in+Mouse+Xenograft+Tumor+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Concurrent Longitudinal EPR Monitoring of Tissue Oxygenation, Acidosis, and Reducing Capacity in Mouse Xenograft Tumor Models.</a> Cell Biochem Biophys. 75, 247-253 (2017).</li>
<li>Khramtsov, V. V., Yelinova, V. I., Glazachev Yu, I., Reznikov, V. A., Zimmer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+determination+and+reversible+modification+of+thiols+using+imidazolidine+biradical+disulfide+label%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem+Biophys+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative determination and reversible modification of thiols using imidazolidine biradical disulfide label.</a> J Biochem Biophys Methods. 35 (2), 115-128 (1997).</li>
<li>Roshchupkina, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+EPR+measurement+of+glutathione+in+tumor-bearing+mice+using+improved+disulfide+biradical+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Rad.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo EPR measurement of glutathione in tumor-bearing mice using improved disulfide biradical probe.</a> Free Rad. Biol. Med. 45, 312-320 (2008).</li>
<li>Hicks, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKhramtsov%2C+VV+%22Stable+Radicals%3A+Fundamentals+and+Applied+Aspects+of+Odd-Electron+Compounds%22">Stable Radicals: Fundamentals and Applied Aspects of Odd-Electron Compounds</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. 537-566 (2010).</li>
<li>Bobko, A. A., Dhimitruka, I., Zweier, J. L., Khramtsov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fourier+Transform+EPR+of+Trityl+Radicals+for+Multifunctional+Assessment+of+Chemical+Microenvironment%29%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Edit%22%5BJournal%5D)">Fourier Transform EPR of Trityl Radicals for Multifunctional Assessment of Chemical Microenvironment).</a> Angew. Chem. Int. Edit. 53, 2735-2738 (2014).</li>
<li>Martin, M. L., Martin, G. J., Delpuech, J. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMartin%2C+ML+%22Practical+NMR+spectroscopy%22">Practical NMR spectroscopy</a>. , Heyden. (1980).</li>
<li>Lin, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+to+malignancy+in+the+polyoma+middle+T+oncoprotein+mouse+breast+cancer+model+provides+a+reliable+model+for+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Progression to malignancy in the polyoma middle T oncoprotein mouse breast cancer model provides a reliable model for human diseases.</a> Am J Pathol. 163 (5), 2113-2126 (2003).</li>
<li>Eubank, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte+macrophage+colony-stimulating+factor+inhibits+breast+cancer+growth+and+metastasis+by+invoking+an+anti-angiogenic+program+in+tumor-educated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Granulocyte macrophage colony-stimulating factor inhibits breast cancer growth and metastasis by invoking an anti-angiogenic program in tumor-educated macrophages.</a> Cancer Res. 69 (5), 2133-2140 (2009).</li>
<li>Khramtsov, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+determination+of+SH+groups+in+low-+and+high-molecular-weight+compounds+by+an+electron+spin+resonance+method%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Quantitative determination of SH groups in low- and high-molecular-weight compounds by an electron spin resonance method.</a> Anal Biochem. 182 (1), 58-63 (1989).</li>
<li>Komarov, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+paramagnetic+resonance+monitoring+of+ischemia-induced+myocardial+oxygen+depletion+and+acidosis+in+isolated+rat+hearts+using+soluble+paramagnetic+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Magnetic+Resonance+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Electron paramagnetic resonance monitoring of ischemia-induced myocardial oxygen depletion and acidosis in isolated rat hearts using soluble paramagnetic probes.</a> Magnetic Resonance in Medicine. 68 (2), 649-655 (2012).</li>
<li>Song, Y. G., Liu, Y. P., Liu, W. B., Villamena, F. A., Zweier, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+binding+of+the+Finland+trityl+radical+with+bovine+serum+albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Rsc+Advances%22%5BJournal%5D)">Characterization of the binding of the Finland trityl radical with bovine serum albumin.</a> Rsc Advances. 4 (88), 47649-47656 (2014).</li>
<li>Khramtsov, V. V., Bobko, A. A., Tseytlin, M., Driesschaert, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exchange+Phenomena+in+the+Electron+Paramagnetic+Resonance+Spectra+of+the+Nitroxyl+and+Trityl+Radicals%3A+Multifunctional+Spectroscopy+and+Imaging+of+Local+Chemical+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Analyt.+Chem%22%5BJournal%5D)">Exchange Phenomena in the Electron Paramagnetic Resonance Spectra of the Nitroxyl and Trityl Radicals: Multifunctional Spectroscopy and Imaging of Local Chemical Microenvironment.</a> Analyt. Chem. 89 (9), 4758-4771 (2017).</li>
<li>Samouilov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Proton-Electron+Double-Resonance+Imaging+of+Extracellular+Tumor+pH+Using+an+Advanced+Nitroxide+Probe%5BTitle%5D)+AND+%22Analyt.+Chem%22%5BJournal%5D)">In Vivo Proton-Electron Double-Resonance Imaging of Extracellular Tumor pH Using an Advanced Nitroxide Probe.</a> Analyt. Chem. 86 (2), 1045-1052 (2014).</li>
<li>Goodwin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tumour+extracellular+pH+monitoring+using+electron+paramagnetic+resonance%3A+the+effect+of+X-ray+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+Biomed%22%5BJournal%5D)">In vivo tumour extracellular pH monitoring using electron paramagnetic resonance: the effect of X-ray irradiation.</a> NMR Biomed. 27 (4), 453-458 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawione metody pozwalają na nieinwazyjną ocenę in vivo krytycznych parametrów substancji chemicznej TME, tj. pO2, pH, stanu redoks oraz stężeń śródmiąższowego Pi i wewnątrzkomórkowego GSH. Techniki rezonansu magnetycznego, takie jak rezonans magnetyczny i niskopolowy EPR, są metodami z wyboru do nieinwazyjnego profilowania in vivo tych parametrów TME. Rezonans magnetyczny wizualizuje struktury anatomiczne, ale brakuje mu czułości funkcjonalnej. W przeciwieństwie do rezonansu ma...

Coraz większego znaczenia przypisuje się kluczowej roli mikrośrodowiska guza (TME) w progresji nowotworów i ich terapii1. Wśród ważnych parametrów fizjologicznych TME w guzach litych dobrze udokumentowane są: hipoksja tkankowa2, kwasica3,4, wysoka zdolność redukcyjna5, podwyżone stężenia wewnątrzkomórkowego GSH6,7 oraz śródmiąższowy Pi8. Nieinwazyjne oceny in vivo pO2, pH, Pi, GSH oraz stanu redox dostarczają unikalnych informacji o procesach biologicznych w TME i pomagają w rozwoju narzędzi do badań przedklinicznych leków przeciwnowotworowych oraz strategii terapeutycznych celujących w TME. Odpowiednia głębokość penetracji tkanek przez fale radiowe w obrazowaniu rezonansem magnetycznym (MRI) oraz technikach opartych na EPR niskopolowym sprawia, że są one najwłaściwszymi metodami do nieinwazyjnej oceny tych parametrów TME. MRI opiera się głównie na obrazowaniu protonów wody i jest powszechnie stosowane w warunkach klinicznych w celu uzyskania rozdzielczości anatomicznej, jednak brakuje mu rozdzielczości funkcjonalnej. Pomiary jądrowego rezonansu magnetycznego fosforu-31 (31P-NMR) stężenia pozakomórkowego Pi i pH, oparte na sygnale z endogennego fosforanu, są potencjalnie atrakcyjne dla charakterystyki TME, ale zazwyczaj są maskowane przez kilkukrotnie wyższe stężenia Pi wewnątrzkomórkowego9,10. W przeciwieństwie do tego, pomiary EPR opierają się na spektroskopii i obrazowaniu specjalnie zaprojektowanych sond paramagnetycznych, aby zapewnić rozdzielczość funkcjonalną. Należy zauważyć, że egzogenne sondy EPR mają przewagę nad egzogennymi sondami NMR ze względu na znacznie wyższą czułość wewnętrzną EPR oraz brak endogennych sygnałów tła EPR. Niedawne opracowanie dwufunkcyjnej sondy nitroksylowej do pomiaru pH i redox11 oraz wielofunkcyjnej sondy trytylowej12&#160;stwarzają bezprecedensowe możliwości jednoczesnych pomiarów in vivo kilku parametrów TME i analizy ich korelacji, niezależnie od rozkładu sondy i czasu pomiaru. Z naszej wiedzy nie istnieją inne dostępne metody pozwalające na jednoczesną ocenę in vivo fizjologicznie ważnych chemicznych parametrów TME u żywych osobników, takich jak pO2, pHe, Pi, redox i GSH.
Sondy do In vivo Pomiary funkcjonalne:
Rysunek 1 przedstawia struktury chemiczne sond paramagnetycznych wykorzystywanych do badania parametrów TME, obejmujące sondy cząsteczkowe i rozpuszczalne. Wysoka czułość funkcjonalna, stabilność w żywej tkance oraz minimalna toksyczność to niektóre z zalet, dzięki którym sondy cząsteczkowe są preferowane nad sondami rozpuszczalnymi w oksymetrii EPR in vivo. Na przykład sondy cząsteczkowe charakteryzują się dłuższym czasem retencji w miejscu implantacji tkankowej w porównaniu z sondami rozpuszczalnymi, co umożliwia podłużny pomiar pO2 w tkance przez kilka tygodni. Z drugiej strony, sondy rozpuszczalne przewyższają sondy cząsteczkowe, zapewniając pomiary o rozdzielczości przestrzennej przy użyciu technik obrazowania opartych na EPR, a także umożliwiając jednoczesne analizy wielu parametrów funkcjonalnych (pO2, pH, Pi, potencjału redoks i GSH).
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56624/56624fig1.jpg" /> 
Rycina 1Struktury chemiczne sond paramagnetycznych wykorzystywanych w teście oceny mikrośrodowiska guza (TME). Obejmuje to frakcję cząsteczkową pO2 sonda, LiNc-BuO (R = -O(CH2)3CH3), oraz sondy rozpuszczalne: dwufunkcyjna sonda pH i redox, NR; sonda wrażliwa na GSH, RSSR; oraz wielofunkcyjna pO2, sonda pH i Pi przestrzeni pozakomórkowej&#160;mikrośrodowisko, sonda HOPE. Synteza tych sond została opisana w podanych materiałach referencyjnych. 11,12. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56624/56624fig1large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td>Spektrometr EPR w paśmie L</td><td>Magnettech, Niemcy</td><td></td><td>Spektrometr elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) w paśmie L (1,2 GHz) do zbierania widm in vitro i in vivo cząsteczek paramagnetycznych</td></tr><tr><td>&nbsp; Temperatura i Kontroler gazu&nbsp;</td><td>Noxygen, Niemcy</td><td></td><td>Temperatura & Sterownik gazu przeznaczony do kontroli i regulacji temperatury oraz składu gazu&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GSH (L-Glutation zredukowany)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>MMTV-PyMT&nbsp; myszy</td><td>w domu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Mysie komórki raka piersi Met-1</td><td>W domu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>myszy typu dzikiego C57Bl/6&nbsp;</td><td>Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik wykluczający błękit trypanowy&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Ohmeda Fluotec 3&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Izofluran (IsoFlo)</td><td>Abbott Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy</td><td>sigma-Aldrich</td><td>S07051</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek</td><td>sodu sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oksydaza glukozowa</td><td>sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lauda Circulator E100</td><td>Lauda-Brikmann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH-metr Orion</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonda LiNc-BuO</td><td>W domu</td><td></td><td>Sonda Octa-n-butoksy-naftalocyjaninowa została zsyntetyzowana zgodnie z sondą nr ref. 13</td></tr><tr><td>NR</td><td>W domu</td><td></td><td>Sonda nitroksydowa została zsyntetyzowana zgodnie z nr ref. 11</td></tr><tr><td>Sonda RSSR</td><td>W domu</td><td></td><td>Sonda dwunitroksydowa została zsyntetyzowana zgodnie z ref 15</td></tr><tr><td>HOPE sonda</td><td>W domu</td><td></td><td>Monofoshonowana sonda triarylometylowa została zsyntetyzowana zgodnie z ref 12</td></tr></tbody></table>

in vivo (in vivo) ocena epr ph, po2, stanu redoks oraz stężeń fosforanów i glutationu w mikrośrodowisku guza

In Vivo EPR Assessment of pH, pO2, Redox Status, and Concentrations of Phosphate and Glutathione in the Tumor Microenvironment

Ten protokół demonstruje zdolność technik opartych na niskopolowym rezonansie paramagnetycznym elektronów (EPR) w połączeniu z funkcjonalnymi sondami paramagnetycznymi do dostarczania ilościowych informacji na temat chemicznego mikrośrodowiska guza (TME), w tym pO2, pH, statusu redoks, stężenia śródmiąższowego fosforanu nieorganicznego (Pi) i wewnątrzkomórkowego glutationu (GSH). W szczególności zastosowanie niedawno opracowanej rozpuszczalnej, wielofunkcyjnej sondy trytylowej zapewnia niezrównane możliwości jednoczesnych pomiarów in vivo pH, pO2 i Pi w przestrzeni Extracellular (sonda HOPE). Pomiary trzech parametrów za pomocą jednej sondy pozwalają na analizę ich korelacji niezależnie od rozkładu sondy i czasu pomiarów.

Ocena tkankowego pO2 z wykorzystaniem sond LiNc-BuO:
Stosując procedurę opisaną w kroku 1.1, przeprowadziliśmy kalibrację świeżo przygotowanej zawiesiny mikrokryształów LiNc-BuO. Rysunek 2 przedstawia typową zależność szerokości linii sondy LiNc-BuO od stężenia tlenu, a także przykładowe widma EP...

Rezonans paramagnetyczny elektronów o niskim polu (pasmo L, 1,2 GHz) przy użyciu rozpuszczalnych sond nitroksylowych i trytylowych jest demonstrowany do oceny fizjologicznie ważnych parametrów w mikrośrodowisku guza w mysich modelach raka piersi.

In vivo (in vivo) Ocena EPR pH, pO2, stanu redoks oraz stężeń fosforanów i glutationu w mikrośrodowisku guza

This protocol demonstrates the capability of low-field electron paramagnetic resonance (EPR)-based techniques in combination with functional paramagnetic ...

Ogólnym celem tej technologii paramagnetycznego rezonansu elektronowego in vivo jest ilościowa i nieinwazyjna ocena fizjologicznie istotnych parametrów lokalnego mikrośrodowiska tkanek w warunkach przedklinicznych w zwierzęcych modelach raka. Technika ta opiera się na połączeniu APR w polu fluoroskopowym ze specjalnie zaprojektowanymi funkcjonalnymi sondami paramagnetycznymi w celu dostarczenia ilościowych informacji na temat natlenienia tkanek jako CDT w stanie doku, a także śródmiąższowych fosforanów organicznych i stężeń międzykomórkowych. Ta nieinwazyjna technika zapewnia unikalny wgląd w świat mikrośrodowiska guza i regenezy guza oraz może przyczynić się do przyszłego racjonalnego projektowania terapii przeciwnowotworowych ukierunkowanych na mikrośrodowisko nowotworowe.Zastosowanie tej techniki rozciąga się w kierunku korelacji mózgu między parametrami zastosowania wielofunkcyjnych sond APR. W ten sposób zapewniamy dodatkowy wgląd w podstawowe mechanizmy biologiczne. Oprócz mnie i Andreya, procedurę zademonstrują Marieta Gencheva i dr Benoit Driesschaert oraz doktorantka Kayla Steinberger z IMMR Center.Aby przygotować sondę wrażliwą na cząstki stałe, najpierw zważ 60 miligramów mikrokryształów. W celu kalibracji czułości tlenu zawiesić mikrokryształy w trzech mililitrach zmodyfikowanego podłoża Dolbeckas. Sonikuj przez pięć minut, na lodzie, za pomocą sonografu sondy o częstotliwości 20 kiloherców, używając siedmiu watów mocy w pięciomililitrowej szklanej rurce z okrągłym dnem.Następnie umieść jeden mililitr sonikowanych mikrokryształów w szklanej probówce w resignatorze cewki powierzchniowej spektrometru EPR w paśmie L. Uzyskaj widma EPR fal ciągłych w temperaturze fizjologicznej 37 stopni Celsjusza i stężeniach tlenu wynoszących zero, jeden, dwa, cztery, osiem i 20,9 procent. Aby przygotować dwufunkcyjną sondę pH i redoks, rozpuść 6,34 miligrama sondy w jednym mililitrze roztworu soli fizjologicznej.Dostosuj pH do 7,2 za pomocą małych dodatków kwasu solnego lub wodorotlenku sodu za pomocą pH-metru. Aby przeprowadzić kalibrację pH sondy nitroksydowej, najpierw dodaj 0,1 mililitra roztworu podstawowego sondy do 0,9 mililitra dwumilimolowego buforu fosforanu sodu, 150 milimolowego chlorku sodu. Następnie miareczkować otrzymany jednomilimolowy roztwór sondy z przydziałami kwasu solnego lub wodorotlenku sodu do wymaganego pH za pomocą pH-metru.Zarejestrować widma EPR próbek w 1,5-mililitrowych probówkach wirówkowych za pomocą spektrometru EPR w paśmie L. Aby przygotować czułą sondę RSSR GSH, rozpuść 4,05 miligrama sondy w jednym mililitrze roztworu DMSO. Następnie określ wartość stałej szybkości reakcji RSSR z GSH.Aby to zrobić, najpierw dodaj 20 mikrolitrów roztworu podstawowego RSSR do 0,98 mililitra jednego milimolowego buforu fosforanowego o pH 7,2, 150 milimolowego chlorku sodu, aby uzyskać 0,2 milimolowy roztwór sondy RSSR. Następnie wymieszaj równe objętości 0,2 milimolowego roztworu RSSR w jednym z roztworów GSH, aby uzyskać końcowe stężenie sondy na 0,1 milimola i GSH na 0,5, jeden lub 2,5 milimola. Natychmiast po zmieszaniu roztworu RSSR i GSH umieścić próbkę w resignatorze EPR i rejestrować widma EPR co 12 sekund przez 10 minut.Następnie należy obliczyć kinetykę wzrostu monorodnikowej amplitudy widmowej dla wielofunkcyjnej sondy HOPE do oceny pH tlenu i liczby Pi. Rozpuść 10,7 miligrama sondy w jednym mililitrze roztworu soli fizjologicznej i dostosuj pH do 7,4. Następnie dodaj 20 mikrolitrów przygotowanego roztworu podstawowego do 0,98 mililitra roztworu soli fizjologicznej, aby uzyskać 0,2 milimolowy roztwór sondy.W celu kalibracji pH sondy miareczkować 0,2 milimola roztworu sondy przez dodanie niewielkiej objętości wodorotlenku sodu lub kwasu solnego, tak aby końcowe rozcieńczenie próbki było mniejsze niż 1%Uzyskać widma EPR przy pośrednim pH, jak opisano w protokole tekstowym. W celu kalibracji sondy czułości tlenu należy uzyskać widma EPR sondy przy różnych stężeniach tlenu, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. W celu kalibracji liczby Pi sondy należy uzyskać widma EPR sondy przy różnych stężeniach fosforanów.Użyj roztworu rodnikowego o wartości pH zbliżonej do PKA i miareczkuj go różnymi stężeniami fosforanów. Utrzymuj temperaturę i skład gazu jak poprzednio. W przypadku modelu guza MET1 do internalizacji sondy cząstek stałych do komórek MET1, dodaj 100 mikrolitrów sonikowanej zawiesiny do kolby T75 z 10 mililitrami pożywki hodowlanej zawierającej komórki MET1.Wszystkie zabiegi odbywają się w komorze bezpieczeństwa biologicznego, a pożywka zawiera penicylinę i streptomycynę, aby zminimalizować potencjalne zakażenie. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 72 godziny lub do momentu, gdy osiągną około 80% konfluencji. Odessać pożywkę i umyć komórki pięciokrotnie 10 mililitrami PBS.Odłącz komórki za pomocą pięciu mililitrów tripsonu EDTA. Po zebraniu komórek i odwirowaniu jak poprzednio, wybarwić próbkę komórek barwnikiem wykluczającym, aby określić żywotność i ilość komórek. Zawiesić komórki w stężeniu miliona komórek na 100 mikrolitrów w minimalnym DMEM.Za pomocą strzykawki insulinowej powoli wstrzyknij 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej zawierającej zinternalizowane mikrokryształy do poduszek tłuszczowych sutka numer cztery ośmiotygodniowej samicy myszy typu dzikiego, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Monitoruj inicjację i wzrost guza. W przypadku pomiarów spektroskopowych EPR znieczulić myszy poprzez wdychanie mieszaniny izofloranu powietrza za pomocą urządzenia do znieczulenia, jak opisano w protokole tekstowym.Wykonaj pomiary funkcjonalne za pomocą spektrometru EPR w paśmie L, umieszczając resignator cewki powierzchniowej na normalnym gruczole sutkowym lub guzie sutka. Przejdź do strojenia spektrometru. W przypadku sond rozpuszczalnych widma EPR należy uzyskać natychmiast po wstrzyknięciu sondy przez pięć do 10 minut.Widma EPR należy pobierać z wszczepionej sondy cząstek stałych przez pięć do 10 minut przez kilka tygodni po implantacji. Na koniec przeanalizuj widma EPR i sondy zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Czułość spektralna EPR sondy LiNc-BuO na tlen jest pokazana tutaj.Widmo EPR mierzono przy 0% pO2 i 37 stopniach Celsjusza. Pokazano reprezentatywne zależności szerokości linii widma EPR zawiesiny sondy od ciśnienia parcjalnego tlenu. Szerokość linii zwiększa się liniowo wraz z pO2.Widmo mierzone w tkance guza sutka znieczulonej samicy myszy odpowiada częściowemu zawartości tlenu w tkance wynoszącej 7,5 milimetra rtęci. Widma EPR w paśmie L roztworu sondy NR uzyskano w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy różnych poziomach pH. Zależności od obserwowanej stałej rozszczepienia nadsubtelnego na pH są wykreślane i dopasowywane do wzorcowej krzywej miareczkowania.Pokazano tutaj wielofunkcyjną ocenę mikrośrodowiska guza łączącą wrażliwą na tlen sondę LiNc-BuO w dwufunkcyjnej sondzie pH w sondzie redoks NR. Obserwowane widmo trypletowe NR jest nakładane na pojedynczą linię EPR sondy LiNc-BuO osadzonej w guzie. Przedstawiono tutaj ocenę in vivo EPR stężeń glutationu w tkance wewnątrzkomórkowej.Przedstawiono kinetykę monorodnikowej zmiany intensywności widma peek mierzonej za pomocą EPR w paśmie L w guzie sutka w normalnym gruczole sutkowym myszy FVBN bezpośrednio po dotissualnym wstrzyknięciu sondy RSSR. Szybsza kinetyka odzwierciedla wyższe stężenie GSH w tkance nowotworowej. Technika ta pomaga badaczom w dziedzinie badań nad rakiem, oferując niezrównaną możliwość wykonywania in vivo fizjologicznych parametrów mikrośrodowiska guza i transpotencjału transmisji.Czułość sond zgodnie z poprzednimi procedurami wymaga specjalistycznej wiedzy z zakresu chemii syntetycznej i ma kluczowe znaczenie dla prezentacji. Nasze centrum poinformowało o trudnościach związanych z tą technologią i o współpracą z witrynami.

in-vivo-epr-assessment-ph-po2-redox-status-concentrations-phosphate

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Obrazowanie bioluminescencyjne aktywności czynnika indukowanego hipoksją-1α jest stosowane do monitorowania rozwoju hipoksji guza wewnątrzczaszkowego w mysim modelu przerzutów raka piersi do mózgu.

In vivo obrazowanie bioluminescencyjne dynamiki niedotlenienia guza w przerzutach raka piersi do mózgu w modelu mysim

Tutaj, monitorowanie metabolizmu komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym, w połączeniu z modelem przerzutów in vivo błony kosmówkowo-omocznikowej (CAM) zarodka kurczaka, są wykorzystywane do oceny nowych celów/środków przeciwnowotworowych pod kątem ich zdolności do uwrażliwiania komórek nowotworowych na chemoterapeutyki uszkadzające DNA.

Ocena skuteczności uczulenia na leki przeciwnowotworowe in vitro i in vivo

Nowa metoda elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR), rapid scan EPR (RS-EPR), została zademonstrowana do przestrzennego obrazowania spektralnego 2D, która jest lepsza od tradycyjnej techniki ciągłej fali (CW) i otwiera nowe możliwości obrazowania in vivo. Wyniki są demonstrowane na częstotliwości 250 MHz, ale technika ta ma zastosowanie na dowolnej częstotliwości.

Szybki skan elektronowy rezonansu paramagnetycznego otwiera nowe możliwości obrazowania fizjologicznie ważnych parametrów in vivo

Ten manuskrypt opisuje rozwój modelu zwierzęcego, który pozwala na bezpośrednie testowanie wpływu niedotlenienia guza na przerzuty i rozszyfrowywanie mechanizmów jego działania. Chociaż opisane tutaj eksperymenty koncentrują się na mięsaku Ewinga, podobne podejście można zastosować do innych typów nowotworów.

In vivo (in vivo) Model do badania wpływu hipoksji na przerzuty nowotworu

Opisujemy nieinwazyjny protokół obrazowania in vivo, który jest uproszczony i opłacalny, wykorzystując L-012, chemiluminescencyjny analog luminolu, do wizualizacji i ilościowego określenia reaktywnych form tlenu (ROS) generowanych w mysim modelu rany wycinającej.

In vivo (in vivo) Obrazowanie reaktywnych form tlenu w mysim modelu rany

Spektroskopia elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) jest jednoznaczną metodą pomiaru wolnych rodników. Zastosowanie selektywnych sond spinowych pozwala na wykrywanie wolnych rodników w różnych przedziałach komórkowych. Przedstawiamy praktyczną, efektywną metodę pobierania próbek biologicznych, która ułatwia obróbkę, przechowywanie i przenoszenie próbek do pomiarów EPR.

Zastosowanie elektronowego rezonansu paramagnetycznego w próbkach biologicznych w temperaturze otoczenia i temperaturze 77 K

Opisujemy dwie metody oceny przejściowej przepuszczalności naczyń krwionośnych związanych z funkcją wejścia do mikrośrodowiska guza (TMEM) i wewnątrznaczynieniem komórek rakowych za pomocą dożylnego wstrzyknięcia dekstranu o wysokiej masie cząsteczkowej (155 kDa) u myszy. Metody te obejmują obrazowanie przyżyciowe u żywych zwierząt oraz analizę tkanek utrwalonych za pomocą immunofluorescencji.

Ocena mikrośrodowiska guza przepuszczalności naczyniowej za pośrednictwem drzwi z przerzutami związanych z rozsiewaniem komórek rakowych za pomocą obrazowania przyżyciowego i analizy tkanek stałych

Opracowaliśmy powtarzalną metodę wizualizacji internalizacji niehydrolizowalnego fluorescencyjnego trifosforanu adenozyny (ATP), substytutu ATP, o wysokiej rozdzielczości komórkowej. Zwalidowaliśmy naszą metodę przy użyciu niezależnych testów in vitro i in vivo - ludzkich linii komórek nowotworowych i myszy z niedoborem odporności ksenoprzeszczepowanych ludzką tkanką nowotworową.

Mikroskopia fluorescencyjna w celu internalizacji ATP za pośrednictwem makropinocytozy w ludzkich komórkach nowotworowych i myszach z ksenoprzeszczepem guza

Opisujemy protokół produkcji, hodowli i wizualizacji ludzkich nowotworów, które dały przerzuty na powierzchnie otrzewnej. Wycięte próbki guza są cięte za pomocą wibratomu i hodowane na przepuszczalnych wkładkach w celu zwiększenia natlenienia i żywotności, a następnie obrazowanie i dalsze analizy przy użyciu mikroskopii konfokalnej i cytometrii przepływowej.

Hodowla i obrazowanie organotypowych wycinków guza rzekomego śluzaka otrzewnej ex vivo z wyciętych próbek guza ludzkiego

Ilościowe mapy tlenowe 3D mysich guzów zostały zobrazowane nieinwazyjnie za pomocą pulsacyjnego rezonansu paramagnetycznego. Ultrasonografia B-mode i Power Doppler zostały wykorzystane do anatomii i struktury naczyniowej. Obrazy z obu modalności nałożono na siebie, umożliwiając wieloparametryczną analizę guza.

Ocena niedotlenienia guza: obrazowanie tlenu in vivo 3D za pomocą elektronowego rezonansu paramagnetycznego

Poznaj technologię EPR do nieinwazyjnej oceny mikrośrodowiska guza w modelach raka piersi u myszy. Ta metoda dostarcza ilościowych danych na temat utlenowania tkanek i stanu metabolicznego.

In vivo (in vivo) Ocena EPR pH, pO₂, stanu redoks oraz stężeń fosforanów i glutationu w mikrośrodowisku guza

Przeglądaj więcej filmów