Name: In vitro Test SUMOylacji do badania aktywności ligazy SUMO E3 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Poznaj zmodyfikowany test SUMOylacji in vitro do identyfikacji nowych ligaz SUMO E3 i badania ich specyficzności wobec izoform SUMO. Ta metoda pozwala na szybką weryfikację białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Ministerstwa Nauki i Technologii (MOST, 105-2320-B-010-007-MY3 dla PCC), z National Health Research Institute (NHRI-EX105-10215BC dla PCC), z Ministerstwa Nauki i Technologii (MOST 105-2314-B-400-019 dla HJK) oraz z National Health Research Institute (NHRI MG-105-SP-10, NHRI MG-106-SP-10 dla HJK). Prace te były również częściowo wspierane przez Narodowy Uniwersytet Yang-Ming w zakresie publikacji manuskryptów na PCC. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badań, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub naprawie manuskryptu.

1. Przygotowanie konstrukcji ekspresji bakulowirusa
<ol>
	<li>Oczyść ligazę SUMO E3 K-bZIP, klonując cDNA K-bZIP19 do wektora bakulowirusa o podwójnej ekspresji (patrz tabela materiałów) z N-końcowym znacznikiem epitopu. Odnieśliśmy sukces przy użyciu znacznika oktapeptydu (oznaczonego w całym protokole jako vector-tag-K-bZIP). 
	UWAGA: Matryca DNA do klonowania reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) K-bZIP to odwrotna transkrypcja cDNA z RNA wyizolowanego z komórek TREx F3H3-K-Rta BCBL-1 po leczeniu doksycykliną20.
	<ol>
		<li>Przenieś pełnowymiarowy CDNA19 do wektora podwójnej ekspresji z miejscami klonowania CpoI. CpoTrawię produkt PCR i 1 μg wektora podwójnej ekspresji w temperaturze 37 °C przez 3 h21.</li>
		<li>Oddziel i wyekstrahuj strawione DNA po elektroforezie na 0,8% żelu agarozowym22. Związać wkładkę (K-bZIP) i wektor za pomocą ligazy DNA T4 w temperaturze 16 °C przez 30 minut zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Dodać 5 μl DNA do 50 μl kompetentnych komórek E. coli "A" (patrz tabela materiałów) w probówce o pojemności 1,5 ml. Kładziemy na lodzie na 30 min. Następnie inkubować probówkę o pojemności 1,5 ml w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C przez 45 s i natychmiast umieścić probówkę na lodzie na 3 minuty.</li>
		<li>Dodać 600 μL S.O.C. (0,5% (w/v) ekstraktu drożdżowego, 2% (w/v) tryptonu, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 20 mMMgSO4 i 4% (w/v) glukozy) do probówki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. Następnie odwirować probówkę w temperaturze pokojowej przez 3 minuty przy 600 x g.</li>
		<li>Usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad z 60 μl pożywki Luria-Bertani (LB; 1% (w/v) tryptonu, 0,5% (w/v) ekstraktu drożdżowego i 85 mM NaCl) i rozprowadzić na płytkach agarowych LB zawierających 100 μg/ml ampicyliny. Inkubować płytkę agarową w temperaturze 37 °C przez 16 h23,24.</li>
		<li>Wybierz 1 kolonię do zaszczepienia w pożywce 5 ml LB zawierającej 100 μg/ml ampicyliny i hoduj w temperaturze 37 °C przez 16 godzin z wytrząsaniem 250 obr./min. Następnie wyekstrahuj plazmid, vector-tag-K-bZIP, za pomocą zestawu do ekstrakcji plazmidu zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wygeneruj rekombinowany bakmid zawierający znacznik-K-bZIP poprzez przekształcenie wektora-znacznika-K-bZIP w kompetentne komórki E. coli "B" (patrz Tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Wymieszaj 0,2 μg plazmidu vector-tag-K-bZIP i 100 μl właściwego E. komórki coli "B" w probówce o pojemności 1,5 ml i umieścić na lodzie na 30 minut. Inkubować probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C przez 45 s i natychmiast umieścić probówkę na lodzie na 3 minuty.</li>
		<li>Dodać 900 μl pożywki S.O.C. do probówki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 4 godziny, obracając się z prędkością 50 obr./min. Następnie weź 10 μl pożywki, dodaj dodatkowe 50 μl pożywki S.O.C. do rozprowadzenia na płytkach agarowych LB zawierających 50 μg/ml kanamycyny, 7 μg/ml gentamycyny, 10 μg/ml tetracykliny, 100 μg/ml substratu galaktozydazy i 40 μg/ml izopropylu β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG), i inkubować płytki przez 48 godzin w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Zaszczepić jedną białą kolonię w pożywce o pojemności 5 ml LB zawierającej 50 μg/ml kanamycyny, 7 μg/ml gentamycyny i 10 μg/ml tetracykliny. Inkubować w temperaturze 37 °C z prędkością 250 obr./min, wytrząsając przez 16 godzin.</li>
		<li>Wyizoluj rekombinowany bakmidowy DNA zawierający znacznik K-bZIP, określ ilościowo i ponownie zawiesij w stężeniu 1 μg/μL25.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Generowanie rekombinowanych bakulowirusów wykazujących ekspresję tag-K-bZIP poprzez transfekcję 1 μg rekombinowanego bakmidowego DNA zawierającego tag-K-bZIP do komórek Sf9 w jednym dołku płytki 6-dołkowej.
	<ol>
		<li>Wysiewaj 2 x 106 komórek Sf9 (patrz Tabela materiałów) w 2 ml pożywki Grace's Insect Medium zaopatrzonej w 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% gentamycyny w każdym dołku na 6-dołkowej płytce, a następnie inkubuj w temperaturze 27 °C przez 1 godzinę.</li>
		<li>Utrzymuj hodowlę komórek Sf9 w fazie logarytmicznej komórek Sf9 w pożywce dla owadów Grace zaopatrzonej w 10% FBS, 1% gentamycyny i 1% detergentu C (patrz Tabela Materiałów) w temperaturze 27 °C w zawiesinie orbitalnej przy 140 obr./min. Policz komórki za pomocą hemocytometru i barwienia błękitem trypana; Żywotność komórek powinna przekraczać 95%. Utrzymuj komórki, stosując stosunek subhodowli 1:3 co 2-3 dni (minimalna gęstość ~0,5 x 106 komórek/ml).</li>
		<li>Dodać 2 μl bakmidowego DNA (1 μg/μl) i 98 μl zredukowanej pożywki surowicy (patrz tabela materiałów) do probówki o pojemności 2 ml. Następnie dodać 4 μl odczynnika do transfekcji (patrz Tabela Materiałów) do probówki i dobrze wymieszać. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
		<li>Dodać tę mieszaninę transfekcji (104 μl) do każdej studzienki i inkubować w temperaturze 27 °C przez 12-16 godzin.</li>
		<li>Usuń wyczerpaną pożywkę za pomocą delikatnego zasysania i zastąp ją 2 ml świeżej pożywki dla owadów Grace's Insect Medium zawierającej 10% FBS i 1% gentamycyny. Komórki Sf9 luźno przylegają do powierzchni płytki i nie zostaną naruszone przy delikatnym zasysaniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zebrać rekombinowanego bakulowirusa po transfekcji i amplifikować bakulowirusa w celu uzyskania zapasów o wysokim mianie (P1) do dalszych eksperymentów.
	<ol>
		<li>Po 72 godzinach od zmiany pożywki zeskrobać komórki Sf9 za pomocą sterylnego podnośnika komórek, zebrać supernatant z każdej studzienki do probówki o pojemności 1,5 ml i wirować przez 10 s.</li>
		<li>Wirować w temperaturze 4 °C przez 3 minuty przy 150 x g. Zebrać supernatant jako bakulowirus P0 i podwielokrotność w probówkach o pojemności 1,5 ml (1 ml bakulowirusa w każdej probówce). Przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Wysiew 1 x 107 komórek Sf9 w 10 ml pożywki dla owadów Grace's Insect Medium dostarczanej z 10% FBS i 1% gentamycyny na 10 cm szalce Petriego i inkubuj w temperaturze 27 °C przez 1 godzinę.</li>
		<li>W celu amplifikacji rekombinowanych bakulowirusów wykazujących ekspresję tag-K-bZIP dodać 0,5 ml bakulowirusa P0 do wysianych komórek Sf9 i inkubować w temperaturze 27 °C przez 48 godzin.</li>
		<li>Zebrać supernatant jako bakulowirus P1 w probówce o pojemności 15 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Oczyszczanie K-bZIP
<ol>
	<li>Utrzymuj hodowlę komórek Sf9 w fazie logarytmicznej komórek Sf9 w pożywce dla owadów Grace's Insect Medium dostarczanej z 10% FBS, 1% gentamycyny i 1% detergentu C w temperaturze 27 °C w zawiesinie orbitalnej przy 140 obr./min, jak opisano w kroku 1.3.2.</li>
	<li>W dniu transdukcji dodać 1 ml supernatantu (P1) zawierającego bakulowirusa do 250 ml komórek Sf9 o gęstości 2 x 106 komórek/ml.</li>
	<li>Inkubować komórki Sf9 przez 72 godziny w temperaturze 27 °C na wytrząsarce orbitalnej z wytrząsaniem 140 obr./min, a następnie zbierać przez odwirowanie w temperaturze 2,740 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć supernatant i granulki komórek lizy w 10 ml buforze do lizy (20 mM HEPES pH 7,9, 0,5 M NaCl, 1% detergentu A (patrz tabela materiałów), 2% glicerolu, koktajlu inhibitorów proteazy) i obracać z prędkością 50 obr./min za pomocą mieszadła zawiesinowego w temperaturze 4 °C przez 30 min.</li>
	<li>Odwirować lizat komórkowy przy 15 000 x g przez 15 minut w celu zebrania supernatantu.</li>
	<li>Aby oczyścić znacznik K-bZIP, należy inkubować lizaty komórkowe (10 ml) z 50 μl kulek magnetycznych znakowanych przeciwciałami w probówkach polipropylenowych o pojemności 14 ml i obracać z prędkością 50 obr./min przez 3 godziny w temperaturze 4 °C za pomocą mieszadła zawiesinowego. Po wychwyceniu białka granulki należy osadzać w wirowaniu 800 x g przez 30 s w temperaturze 4 °C. Usunąć większość supernatantu, ponownie zawiesić kulki w pozostałej objętości około 1 ml i przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml w celu przemycia.</li>
	<li>Przemyj wychwycone białko, umieszczając probówkę zawierającą kulki na stojaku magnetycznym i usuń supernatant, gdy kulki magnetyczne całkowicie przylgną do boku probówki.</li>
	<li>Umyj kulki buforem do lizy cztery razy.
	<ol>
		<li>Dodaj 1 ml buforu do lizy do probówek o pojemności 1,5 ml i odwróć probówki 10 razy. Umieścić probówkę o pojemności 1,5 ml na stojaku magnetycznym i usunąć supernatant zgodnie z opisem w ppkt 2.7.</li>
		<li>Powtórz poprzedni krok jeszcze 3 razy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyj kulki jednorazowo solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS).
	<ol>
		<li>Dodaj 1 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1,5 mM KH2PO4) do probówek 1,5 ml i odwróć probówki 10 razy.</li>
		<li>Umieść probówkę o pojemności 1,5 ml na stojaku magnetycznym, a następnie usuń supernatant.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Elute białko tag-K-bZIP z kulek magnetycznych znakowanych przeciwciałami przez dodanie 100 μl oktapeptydu 150 μg/ml rozcieńczonego w PBS do probówki o pojemności 1,5 ml. Obracać rurkę przez 10 minut przy 50 obr./min za pomocą mieszadła zawiesinowego w temperaturze pokojowej. Następnie umieść probówkę z powrotem na stojaku magnetycznym i zbierz supernatant zawierający K-bZIP w czystej probówce o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Przeanalizuj 1-5 μl oczyszczonego białka tag-K-bZIP za pomocą SDS-PAGE, a następnie Coomassie blue staining26. Załadować 2 μg, 1 μg i 0,5 μg próbek albuminy surowicy bydlęcej (BSA) na ten sam żel i użyć go do oznaczania ilościowego za pomocą programu do przetwarzania obrazu, takiego jak ImageJ. Oszacuj stężenie K-bZIP przez porównanie z normami BSA.</li>
	<li>Oczyszczony K-bZIP jest teraz gotowy do użycia w każdym teście SUMOylacji. Rozcieńczyć K-bZIP w PBS do końcowego stężenia 100 ng/μl i przechowywać w małych porcjach w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
3. Test sumoylacyjny
<ol>
	<li>Dodać 3 μl 100 ng/μl oczyszczonego tag-K-bZIP do mieszaniny głównej każdej reakcji sumoylacji in vitro. Składniki mieszanki głównej zawierają 1 μl buforu białkowego, 1x bufor SUMOylacyjny, 0,5 μl białka p53 (0,5 mg/mL), 25 nM enzymu aktywującego E1 (stężenie wyjściowe: 1 μM), 50 nM enzymu sprzężającego E2 (stężenie podstawowe: 10 μM) i 250 nM każdy z peptydów SUMO (SUMO-1, SUMO-2 lub SUMO-3; zawartość magazynowa: 5 μM) do końcowej objętości 17 μl.</li>
	<li>Delikatnie wymieszać zawartość i inkubować reakcję w temperaturze 30 °C przez 3 godziny. Zatrzymać reakcję przez dodanie 20 μL 2x buforu ładującego SDS-PAGE (100 mM Tris-HCL pH 6,8, 4% dodecylosiarczan sodu, 0,2% (w/v) błękit bromofenolowy, 20% (v/v) glicerol i 200 mM β-merkaptoetanolu) i denaturować próbki w temperaturze 95 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Oddziel próbki na SDS-PAGE, przenieś oddzielone białka na błonę PVDF za pomocą półsuchego aparatu do transferu elektroforetycznego i przeanalizuj za pomocą Western blot przy użyciu przeciwciała anty-p53.
	<ol>
		<li>Ustawić aparat żelowy jak w kroku 2.11 i załadować 20 μl próbki do studzienek żelowych.</li>
		<li>Uruchom 10% żel w stałym prądzie o napięciu 80 V przez około 120 minut (do momentu, gdy pasmo barwnika dotrze do dna żelu). Po zakończeniu elektroforezy wyłącz zasilanie.</li>
		<li>Odłączyć aparat żelowy i kasety z żelem, aby wyjąć żel, a następnie umieścić żel w półsuchym buforze transferowym (48 mM Tris-HCl, 39 mM glicyna, 20% metanolu) na 5 minut.</li>
		<li>Weź inny pojemnik i namocz membranę PVDF w metanolu na 1 minutę. Następnie wyjmij PVDF z metanolu i umieść w półsuchym buforze transferowym. Delikatnie mieszaj membranę przez 5 minut.</li>
		<li>Zdjąć pokrywę zabezpieczającą półsuchego aparatu elektroforetycznego.</li>
		<li>Wstępnie zwilż bibułę filtracyjną i przygotuj warstwę żelu na dolnej anodzie platynowej w następujący sposób: bibuła filtracyjna, membrana PVDF, żel i bibuła filtracyjna.</li>
		<li>Zabezpiecz płytkę katodową i osłonę bezpieczeństwa, a następnie uruchom blot przy stałym prądzie 15 V przez 90 minut. Wyłącz zasilanie, odłącz urządzenie półsuche i wyjmij membranę PVDF.</li>
		<li>Blokuj membranę PVDF z buforem blokującym (5% beztłuszczowego mleka w buforze TBST (137 mM NaCl2, 20 mM Tris-HCl, 0,1% detergentu B (patrz tabela materiałów), pH 7,6)) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę z 30 obr./min, wytrząsając wytrząsarką orbitalną.</li>
		<li>Hybrydyzować membranę PVDF z przeciwciałem anty-p53 rozcieńczonym (1:1 000) w buforze blokującym przez 12-16 godzin w temperaturze 4 °C z wytrząsaniem 30 obr./min przy użyciu mieszalnika zawiesinowego.</li>
		<li>Wyjmij membranę PVDF do pojemnika i włóż do TBST. Przepłukać membranę PVDF za pomocą TBST jeszcze dwukrotnie.</li>
		<li>Namocz membranę PVDF w TBST na 30 minut, wstrząsając 45 obr./min wytrząsaniem za pomocą wytrząsarki orbitalnej.</li>
		<li>Hybrydyzować błonę PVDF z przeciwciałem anty-króliczym sprzężonym z peroksydazą chrzanową (HRP) rozcieńczoną (1:4 000) w buforze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem 30 obr./min przy użyciu mieszalnika zawiesinowego.</li>
		<li>Umyć membranę PVDF TBST 3 razy, jak opisano w kroku 3.4.10.</li>
		<li>Namocz membranę PVDF w TBST na 30 minut, wstrząsając 45 obr./min za pomocą mieszadła do zawiesiny. Usunąć TBST i dodać PBS, aby zachować membranę PVDF w temperaturze 4 °C przez okres do 12 godzin.</li>
		<li>Zmieszać odczynnik 1 i 2 (1:1) wzmocnionego substratu chemiluminescencyjnego (substratu ECL) (patrz tabela materiałów). Usuń membranę PVDF z PBS, krótko osusz ręcznikiem papierowym lub lekką wycieraczką, aby wchłonąć nadmiar wilgoci, a następnie natychmiast dodaj 400 μl odczynnika ECL na powierzchnię każdej membrany na 3-5 minut. Usunąć nadmiar odczynnika ECL przez krótkie osuszenie, ale nie dopuścić do całkowitego wyschnięcia membrany.</li>
		<li>Naświetl plamę za pomocą systemu obrazowania luminescencyjnego lub filmu autoradiograficznego27.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bies, J., Markus, J., Wolff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+attachment+of+the+SUMO-1+protein+to+the+negative+regulatory+domain+of+the+c-Myb+transcription+factor+modifies+its+stability+and+transactivation+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Covalent attachment of the SUMO-1 protein to the negative regulatory domain of the c-Myb transcription factor modifies its stability and transactivation capacity.</a> J Biol Chem. 277 (11), 8999-9009 (2002).</li>
<li>Lin, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+SUMO-interacting+motif+in+Daxx+SUMO+modification%2C+subnuclear+localization%2C+and+repression+of+sumoylated+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Role of SUMO-interacting motif in Daxx SUMO modification, subnuclear localization, and repression of sumoylated transcription factors.</a> Mol Cell. 24 (3), 341-354 (2006).</li>
<li>Welsh, M., Jamalpour, M., Zang, G., Akerblom, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+Src+Homology-2+domain+containing+protein+B+%28SHB%29+in+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The role of the Src Homology-2 domain containing protein B (SHB) in beta cells.</a> J Mol Endocrinol. 56 (1), 21-31 (2016).</li>
<li>Huang, W. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+function%2C+and+pathogenesis+of+SHP2+in+developmental+disorders+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Cancer+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Structure, function, and pathogenesis of SHP2 in developmental disorders and tumorigenesis.</a> Curr Cancer Drug Targets. 14 (6), 567-588 (2014).</li>
<li>Perry, J. J., Tainer, J. A., Boddy, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+SIM-ultaneous+role+for+SUMO+and+ubiquitin%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">A SIM-ultaneous role for SUMO and ubiquitin.</a> Trends Biochem Sci. 33 (5), 201-208 (2008).</li>
<li>Sun, H., Leverson, J. D., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+function+of+RNF4+family+proteins+in+eukaryotes%3A+targeting+a+ubiquitin+ligase+to+SUMOylated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Conserved function of RNF4 family proteins in eukaryotes: targeting a ubiquitin ligase to SUMOylated proteins.</a> EMBO J. 26 (18), 4102-4112 (2007).</li>
<li>Ouyang, J., Shi, Y., Valin, A., Xuan, Y., Gill, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+binding+of+CoREST1+to+SUMO-2%2F3+contributes+to+gene-specific+repression+by+the+LSD1%2FCoREST1%2FHDAC+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct binding of CoREST1 to SUMO-2/3 contributes to gene-specific repression by the LSD1/CoREST1/HDAC complex.</a> Mol Cell. 34 (2), 145-154 (2009).</li>
<li>Lyst, M. J., Stancheva, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+SUMO+modification+in+transcriptional+repression+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">A role for SUMO modification in transcriptional repression and activation.</a> Biochem Soc Trans. 35, Pt 6 1389-1392 (2007).</li>
<li>Liu, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modification+by+SUMO-1+stimulates+the+promoters+of+translation+machinery+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Chromatin modification by SUMO-1 stimulates the promoters of translation machinery genes.</a> Nucleic Acids Res. 40 (20), 10172-10186 (2012).</li>
<li>Rosonina, E., Duncan, S. M., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO+functions+in+constitutive+transcription+and+during+activation+of+inducible+genes+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">SUMO functions in constitutive transcription and during activation of inducible genes in yeast.</a> Genes Dev. 24 (12), 1242-1252 (2010).</li>
<li>Chang, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromatin+modification+by+SUMO-2%2F3+but+not+SUMO-1+prevents+the+epigenetic+activation+of+key+immune-related+genes+during+Kaposi%27s+sarcoma+associated+herpesvirus+reactivation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">The chromatin modification by SUMO-2/3 but not SUMO-1 prevents the epigenetic activation of key immune-related genes during Kaposi's sarcoma associated herpesvirus reactivation.</a> BMC Genomics. 14, 824(2013).</li>
<li>Neyret-Kahn, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sumoylation+at+chromatin+governs+coordinated+repression+of+a+transcriptional+program+essential+for+cell+growth+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Sumoylation at chromatin governs coordinated repression of a transcriptional program essential for cell growth and proliferation.</a> Genome Res. 23 (10), 1563-1579 (2013).</li>
<li>Tatham, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+chains+of+SUMO-2+and+SUMO-3+are+conjugated+to+protein+substrates+by+SAE1%2FSAE2+and+Ubc9%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Polymeric chains of SUMO-2 and SUMO-3 are conjugated to protein substrates by SAE1/SAE2 and Ubc9.</a> J Biol Chem. 276 (38), 35368-35374 (2001).</li>
<li>Mattoscio, D., Segre, C. V., Chiocca, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+manipulation+of+cellular+protein+conjugation+pathways%3A+The+SUMO+lesson%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Virol%22%5BJournal%5D)">Viral manipulation of cellular protein conjugation pathways: The SUMO lesson.</a> World J Virol. 2 (2), 79-90 (2013).</li>
<li>Gareau, J. R., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SUMO+pathway%3A+emerging+mechanisms+that+shape+specificity%2C+conjugation+and+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The SUMO pathway: emerging mechanisms that shape specificity, conjugation and recognition.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (12), 861-871 (2010).</li>
<li>Bernier-Villamor, V., Sampson, D. A., Matunis, M. J., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+E2-mediated+SUMO+conjugation+revealed+by+a+complex+between+ubiquitin-conjugating+enzyme+Ubc9+and+RanGAP1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural basis for E2-mediated SUMO conjugation revealed by a complex between ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9 and RanGAP1.</a> Cell. 108 (3), 345-356 (2002).</li>
<li>Knipscheer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubc9+sumoylation+regulates+SUMO+target+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Ubc9 sumoylation regulates SUMO target discrimination.</a> Mol Cell. 31 (3), 371-382 (2008).</li>
<li>Vethantham, V., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+sumoylation+of+recombinant+proteins+and+subsequent+purification+for+use+in+enzymatic+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro sumoylation of recombinant proteins and subsequent purification for use in enzymatic assays.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2009 (1), 5121(2009).</li>
<li>Lin, S. F., Robinson, D. R., Miller, G., Kung, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+encodes+a+bZIP+protein+with+homology+to+BZLF1+of+Epstein-Barr+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus encodes a bZIP protein with homology to BZLF1 of Epstein-Barr virus.</a> J Virol. 73 (3), 1909-1917 (1999).</li>
<li>Yang, W. S., Hsu, H. W., Campbell, M., Cheng, C. Y., Chang, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K-bZIP+Mediated+SUMO-2%2F3+Specific+Modification+on+the+KSHV+Genome+Negatively+Regulates+Lytic+Gene+Expression+and+Viral+Reactivation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">K-bZIP Mediated SUMO-2/3 Specific Modification on the KSHV Genome Negatively Regulates Lytic Gene Expression and Viral Reactivation.</a> PLoS Pathog. 11 (7), 1005051(2015).</li>
<li>Connor, C. D., Metcalf, E., Wrighton, C. J., Harris, T. J., Saunders, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RsrII--a+novel+restriction+endonuclease+with+a+heptanucleotide+recognition+site%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">RsrII--a novel restriction endonuclease with a heptanucleotide recognition site.</a> Nucleic Acids Res. 12 (17), 6701-6708 (1984).</li>
<li>Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+endonuclease+R-EcoRI+fragments+of+DNA+from+lambdoid+bacteriophages+and+other+viruses+by+agarose-gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Analysis of endonuclease R-EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis.</a> J Virol. 14 (5), 1235-1244 (1974).</li>
<li>Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+physiology+in+Luria-Bertani+broth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth.</a> J Bacteriol. 189 (23), 8746-8749 (2007).</li>
<li>Gingold, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Bacterial transformation.</a> Methods Mol Biol. 2, 237-240 (1985).</li>
<li>Brulois, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+manipulation+of+a+new+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+bacterial+artificial+chromosome+clone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Construction and manipulation of a new Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone.</a> J Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Ahmed, S., Holt, M., Riedel, D., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-scale+isolation+of+synaptic+vesicles+from+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Small-scale isolation of synaptic vesicles from mammalian brain.</a> Nat Protoc. 8 (5), 998-1009 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie ujawniają potencjalnych konfliktów interesów.

Opisany tutaj protokół SUMOylacji in vitro jest rutynowo stosowany do ustalenia statusu SUMOylacji zidentyfikowanych substratów Ubc9. Głównym ograniczeniem przy użyciu standardowego protokołu do badania funkcji SUMOylacji ligazy SUMO E3 jest obfitość enzymów aktywujących SUMO E1 i sprzężonych z E2 Ubc9, które maksymalizują koniugację SUMO w systemach in vitro . Biorąc pod uwagę to wyzwanie, uważamy, że miareczkowanie ilości enzymów SUMO E1 i E2 do poziomu, na którym ledwo można wykryć ich aktywność w SU...

Modyfikacja SUMO została początkowo zidentyfikowana jako odwracalna modyfikacja potranslacyjna (PTM), która reguluje stabilność białka1. Oprócz bezpośredniej koniugacji, SUMO może być również przyłączone do białka poprzez oddziaływanie niekowalencyjne przez motywy interakcji SUMO (SIM)2. Podobnie jak w przypadku wiązania fosforylacji tyrozylu przez cząsteczki zawierające domeny homologii Src 2 (SH2) lub domeny wiążące fosfotyrozynę (PTB)3,4, modyfikacja SUMO zapewnia dodatkową platformę interakcji do selektywnej rekrutacji białek efektorowych zawierających SIM5,6. Oprócz regulacji transdukcji sygnału, SUMOylacja czynników transkrypcyjnych i cząsteczki remodelujące chromatynę służą do modulowania ekspresji genów7,8. Badania wzorców SUMOylacji w całym genomie wykazały, że modyfikacja SUMO jest związana z regulacją transkrypcji positive9,10 lub negative10,11,12 regulacja transkrypcji, częściowo ze względu na specyficzność paralogu SUMOylacji.
W komórkach ssaków obecne są trzy główne izoformy SUMO do koniugacji białek; są to SUMO-1 oraz wysoce homologiczne SUMO-2 i SUMO-3 (określane jako SUMO-2/3)13. SUMO jest zwykle sprzężone z resztą lizyny (K) w motywie konsensusu ψKxD/E w białku docelowym. Karta SIM w ligazach SUMO E3 jest odpowiedzialna za specyficzność paralogu14. W przeciwieństwie do szlaków ubikwitynacji zawierających setki ligaz E3, zidentyfikowano tylko kilka ligaz SUMO E315. Ligazy SUMO E3 są definiowane przez właściwości, w tym ich zdolność do (i) wiązania Ubc9, (ii) wiązania ugrupowania SUMO za pośrednictwem domeny SIM oraz (iii) zwiększania transferu SUMO z Ubc9 na substrat. Ligaza E3 nie jest absolutnie wymagana do koniugacji SUMO16, ale zapewnia specyficzność substratu i paralogu SUMO. Ponieważ zwykle tylko niewielka część całkowitego białka substratowego jest modyfikowana przez SUMO, wykrywanie białek SUMOylowanych in vivo jest zawsze wyzwaniem. Dlatego potrzebne są dokładne i powtarzalne testy, aby wyjaśnić dokładną funkcję modyfikacji SUMO.
Test in vitro SUMOylacji, który ocenia zdolność oczyszczonego Ubc9 do katalizowania SUMOylacji białek substratowych, jest dobrze akceptowanym testem do badania modyfikacji SUMO17. Jednak aktywność ligazy SUMO E3 w większości przypadków nie może być wykryta lub może być wykryta tylko za pomocą zmutowanej ligazy SUMO o wysokiej aktywności ligazy SUMO E3 i niskiej specyficzności substratowej według standardowego protokołu ze względu na obecność dużej ilości Ubc918. Ogólny sukces tego testu zależy w dużej mierze od starannego miareczkowania oczyszczonego Ubc9. Opisany tutaj test SUMOylacji in vitro jest zmodyfikowany w stosunku do standardowego protokołu SUMOylacji (patrz Tabela materiałów). Obserwacja zwiększonej globalnej modyfikacji SUMO podczas reaktywacji herpeswirusa związanego z mięsakiem Kaposiego (KSHV) skłoniła nas do zidentyfikowania wirusowej ligazy SUMO E3, która może być odpowiedzialna za regulację w górę SUMOylacji. Po przeprowadzeniu na małą skalę badań przesiewowych białek oddziałujących z ligazą wirusa SUMO E3 K-bZIP, p53 zidentyfikowano jako nowy substrat. W tym protokole szczegółowo pokazujemy w komórkach owadów etapy związane z ekspresją i oczyszczaniem K-bZIP typu dzikiego, wirusowej ligazy SUMO E3 o swoistości SUMO-2/3. Zdolność oczyszczonego K-bZIP do zwiększania SUMOylacji p53, dobrze znanego substratu SUMO, jest oceniana w obecności zmniejszonych ilości enzymów E1 i E2. Korzystając z tego zmodyfikowanego testu SUMOylacji, naukowcy mogą wiarygodnie określić zdolności ligazy SUMO E3 do SUMOylacji nowych lub znanych substratów, co jest podstawowym krokiem w badaniu SUMOylacji białek. Co więcej, metoda ta pomaga zidentyfikować nowe ligazy SUMO E3 o niskiej aktywności ligazy, ale wysokiej specyficzności substratowej.

<table><tbody><tr><td>pFastBac</td><td>Invitrogen</td><td>10359-016</td><td>wektor bakulowirusa o podwójnej ekspresji</td></tr><tr><td>wektor pCR2.1-TOPO wektor</td> produktu <td>Invitrogen</td><td></td><td>PCR</td></tr><tr><td>kompetentna komórka&nbsp; E. coli DH5&alpha;</td><td>Yeastern Biotech</td><td>FYE678-80VL</td><td>kompetentny E. komórki A</td></tr><tr><td>E. coli DH10Bac</td><td>Invitrogen</td><td>10359-016</td><td>kompetentny E. komórki B</td></tr><tr><td>FugeneHD</td><td>Roche</td><td>04709705001</td><td>odczynnik do transfekcji</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985062</td><td>zredukowana pożywka surowicy</td></tr><tr><td>Ligaza T4</td><td>NOWA Anglia BioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>CpoI (RsrII)</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0741</td><td></td></tr><tr><td>Bluo-gal</td><td>Thermo Scientific</td><td>B1690</td><td>substrat galaktozydazy</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758-1G</td><td></td></tr><tr><td>Grace' s Pożywka dla owadów</td><td>Gibco</td><td>11605094</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Thermo Fisher</td><td>15750060</td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9393-25G</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K0254-20ML</td><td></td></tr><tr><td>gentamycyna</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>tetracyklina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>87128-25G</td><td></td></tr><tr><td>LB Bulion</td><td>Merk</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-5KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merk</td><td>1.04936.1000</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136-500G</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>J.T.Baker</td><td>3246-01</td><td></td></tr><tr><td>dodecylosiarczan sodu</td><td>Merk</td><td>1.13760.1000</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0710</td><td></td></tr><tr><td>TRIS (Base)</td><td>J.T.Baker</td><td>4109-06</td><td></td></tr><tr><td>Mleko beztłuszczowe</td><td>Fonterra</td><td></td><td></td></tr><tr><td>glicerol</td><td>J.T.Baker</td><td>2136-01</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Amresco</td><td>0694-1L</td><td>detergent A</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Amresco</td><td>0777-500ML</td><td>detergent B</td></tr><tr><td>Poloxamer 188 roztwór</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5556-100ML</td><td>detergent C</td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy Tabletka koktajlowa</td><td>Roche</td><td>04 693 132 001</td><td></td></tr><tr><td>3x Peptyd flagowy</td><td>Sigma</td><td>F4799</td><td></td></tr><tr><td>anty-FLAG m2 Koraliki magnetyczne</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8823</td><td>koraliki magnetyczne znakowane przeciwciałami</td></tr><tr><td>SUMOlink SUMO-1 Kit</td><td>Active Motif</td><td>40120</td><td>standardowy protokół SUMOylacji&nbsp;</td></tr><tr><td>SUMOlink SUMO-2/3 Kit</td><td>Active Motif</td><td>40220</td><td>standardowy protokół SUMOylacji&nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu QIAquick</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN Plasmid Mini Kit</td><td>Zestaw do ekstrakcji plazmidu</td><td>QIAGEN</td><td>12123</td></tr><tr><td>Rurki polipropylenowe</td><td>Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish</td> Falcon <td>351029</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Podnośnik komórek</td><td>Corning</td><td>CNG3008</td><td></td></tr><tr><td>Końcówka ładująca</td><td>Sorenson BioScience</td><td>28480</td><td></td></tr><tr><td>PVDF</td><td>PerkinElmer</td><td>NEF1002</td><td></td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna</td><td>Bio-Rad</td><td>1703932</td><td></td></tr><tr><td>Mini aparat do żelu do bloczków (Bio-Rad Mini Protean II Cell)</td><td>Bio-Rad</td><td>1658001 EDU</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot SD Półsucha elektroforetyczna komórka transferowa</td><td>Bio-Rad</td><td>1703940</td><td></td></tr><tr><td>Pierce ECL Western Blotting</td><td>Thermo</td><td>32106</td><td>ECL mieszalnik zawiesiny odczynnika</td></tr><tr><td></td><td>Przyrządy laboratoryjne Digisystem&nbsp; Inc.</td>Wytrząsarka orbitalna <td>SM-3000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Kansin instruments Co.</td><td>OS701</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant LAS 4000 obrazowanie biomolekularne</td><td>GE Healthcare</td><td>28955810</td><td></td></tr><tr><td>Sf9</td><td>Thermo Scientific</td><td>B82501</td><td></td></tr><tr>przeciwciało<td>anty-p53</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td> <td>#9282</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-królicze</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934-1ML</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro test sumoylacji do badania aktywności ligazy sumo e3

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

Modyfikacja modyfikatora podobnego do ubikwityny (SUMO) jest ważną modyfikacją potranslacyjną (PTM), która pośredniczy w transdukcji sygnału głównie poprzez modulowanie oddziaływań białko-białko. Podobnie jak modyfikacja ubikwityny, SUMOylacja jest kierowana przez sekwencyjną kaskadę enzymów, w tym enzym aktywujący E1 (SAE1 / SAE2), enzym koniugacyjny E2 (Ubc9) i ligazę E3 (tj. Rodzina PIAS, RanBP2 i Pc2). Jednak w odróżnieniu od ubikwitynacji, ligaza E3 nie jest niezbędna do reakcji, ale zapewnia precyzję i skuteczność koniugacji SUMO. Białka zmodyfikowane przez SUMOylację można zidentyfikować za pomocą testu in vivo poprzez immunoprecypitację z przeciwciałami specyficznymi dla substratu i immunoblotting z przeciwciałami specyficznymi dla SUMO. Jednak wykazanie aktywności ligazy białkowej SUMO E3 wymaga odtworzenia in vitro testów SUMOylacji przy użyciu oczyszczonych enzymów, substratów i białek SUMO. Ponieważ w reakcjach in vitro, zwykle same SAE1/SAE2 i Ubc9, są wystarczające do koniugacji SUMO, wzmocnienie SUMOylacji przez przypuszczalną ligazę E3 nie zawsze jest łatwe do wykrycia. W tym miejscu opisujemy zmodyfikowany protokół SUMOylacji in vitro, który konsekwentnie identyfikuje modyfikację SUMO przy użyciu systemu odtworzonego in vitro. Przedstawiono również krok po kroku protokół oczyszczania katalitycznie aktywnej K-bZIP, wirusowej ligazy SUMO-2/3 E3. Aktywność SUMOylacji oczyszczonego K-bZIP jest pokazana na p53, dobrze znanym celu SUMO. Protokół ten może być stosowany nie tylko do wyjaśnienia nowych ligaz SUMO E3, ale także do ujawnienia ich specyficzności paralogicznej SUMO.

Zgodnie z informacjami dostarczonymi przez producenta, standardowe stężenia enzymów E1 i E2 w teście SUMOylacji wynoszą odpowiednio 50 nM i 50 nM. Minimalna ilość enzymu konjugującego E2 Ubc9 zdolnego do przeprowadzenia SUMOylacji p53 została najpierw określona za pomocą testu SUMOylacji in vitro. Ilość Ubc9 stanowiąca zaledwie jedną piątą ilości stosowanej w standardowym protokole testu SUMOylacji in vitro była w stanie efektywnie przeprowadzić SUMOylację p53 (<strong c...

W przeciwieństwie do ligaz ubikwityny, zidentyfikowano kilka ligaz E3 SUMO. Ten zmodyfikowany protokół SUMOylacji in vitro jest w stanie zidentyfikować nowe ligazy SUMO E3 za pomocą testu rekonstytucji in vitro.

In vitro Test SUMOylacji do badania aktywności ligazy SUMO E3

Small ubiquitin-like modifier (SUMO) modification is an important post-translational modification (PTM) that mediates signal transduction primarily ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest zweryfikowanie interesującego białka, które może być SUMOylowane lub jest ligazą SUMO E3. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie SUMOylacji, takie jak identyfikacja ligazy SUMO E3. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją wykorzystać do badania specyficzności ligazy SUMO E3 w stosunku do różnych form SUMO iso.Procedurę zademonstruje Wan-Shan Young, doktorant z mojego laboratorium. Aby oczyścić znacznik K-bZIP, najpierw inkubuj 10 mililitrów lizatu komórkowego z 50 mikrolitrami kulek magnetycznych znakowanych przeciwciałami w 14-mililitrowej probówce polipropylenowej. Następnie obracaj rurkę z prędkością 50 obrotów na minutę w czterech stopniach Celsjusza przez trzy godziny w mieszalniku do zawiesiny.Po wychwyceniu białka odwirować próbkę o masie 800 razy g przez 30 sekund w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby ogranulować kulki. Wyrzuć wszystkie oprócz jednego mililitra supernatantu, aby ponownie zawiesić kulki. I przenieś rozpuszczone kulki do 1,5-mililitrowej probówki.Aby umyć wychwycone białka, umieść probówkę z koralikami na stojaku magnetycznym. Odczekaj około trzech sekund, aż kulki przylgną do bocznych ścianek probówki, a następnie usuń supernatant. Aby umyć kulki, dodaj jeden mililitr buforu do lizy do 1,5-mililitrowej probówki.Następnie odwróć rurkę dziesięć razy. Następnie umieść 1,5-mililitrową rurkę na stojaku magnetycznym i usuń supernatant, gdy koraliki przylgną do ścianek. Aby ponownie umyć kulki, dodaj jeden mililitr soli fizjologicznej buforowanej fosforanem do 1,5-mililitrowej probówki i odwróć ją dziesięć razy.Następnie przenieś rurkę do stojaka magnetycznego i usuń supernatant, gdy kulki przymocują się do ścianek bocznych. Aby wymyć białka znakowane K-bZIP z kulek magnetycznych znakowanych przeciwciałami, dodaj 100 mikrolitrów w stężeniu 150 mikrogramów na mililitr oktapeptydu rozcieńczonego w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami w probówce o pojemności 1,5 mililitra. Następnie obracaj rurkę na mieszadle zawiesinowym z prędkością 50 obrotów na minutę przez dziesięć minut w temperaturze pokojowej.Przenieś rurkę na stojak magnetyczny. A następnie zbierz K-bZIP zawierający supernatant. Następnie, aby przeanalizować oczyszczony znacznik K-bZIP, poddaj od jednego do pięciu mikrolitrów oczyszczonego białka stronie SDS, a następnie barwienie na niebiesko Coomassie.Obciążyć 0,5, 1 i 2 mikrogramy albuminy surowicy bydlęcej jako wzorce do żelu w celu ilościowego określenia stężenia K-bZIP. Podczas przetwarzania obrazu na obrazie J.Next, rozcieńczyć oczyszczony K-bZIP w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami. Aby osiągnąć końcowe stężenie 100 nanogramów na mikrolitr.I przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w małych porcjach. Dodać trzy mikrolitry po 100 nanogramów na mikrolitr oczyszczonego, oznakowanego K-bZIP w reakcji mieszania głównego SUMOylacji in vitro. Następnie delikatnie wymieszaj zawartość mieszanki wzorcowej i inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez trzy godziny.Następnie dodaj 20 mikrolitrów strony 2X SDS z buforem ładującym, aby zatrzymać reakcję. Następnie podgrzewaj próbki w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut, aby zdenaturować białko. Następnie załaduj 20 mikrolitrów próbki na 10% żel do stron SDS.I uruchom żel pod napięciem 80 woltów przez około 120 minut, aż barwnik dotrze do dna żelu. Po zakończeniu niedowładu elektrycznego odłącz aparat żelowy. I przenieś żel do półsuchego bufora transferowego na pięć minut.Następnie zanurz membranę PVDF w innym pojemniku wypełnionym metanolem na jedną minutę. Usunąć membranę PVDF z metanolu i zanurzyć w półsuchym buforze transferowym. Następnie delikatnie mieszaj membranę przez pięć minut.Zdjąć pokrywę zabezpieczającą półsuchego aparatu elektroforetycznego. Wstępnie zwilż bibułę filtracyjną. I przygotuj żelową kanapkę na dnie anody platynowej.Po zamocowaniu płytki katodowej w pokrywie bezpieczeństwa, uruchom blot przy stałym prądzie 15 V przez 90 minut. Następnie wyłącz zasilanie i wyjmij membranę PVDF po odłączeniu aparatu półsuchego. Teraz zablokuj membranę PVDF buforem blokującym na jedną godzinę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 30 obrotów na minutę.Następnie zhybrydyzować membranę PVDF z przeciwciałem anty-p53 i buforem blokującym przez 12 do 16 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza na mieszalniku zawiesinowym z prędkością 30 obrotów na minutę. Następnie wyjmij membranę PVDF i przenieś do pojemnika wypełnionego solą fizjologiczną buforowaną Tris 20 tween 20. Następnie zanurz membranę PVDF w buforowanym trisem soli fizjologicznej 20 na 30 minut na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 45 obrotów na minutę.Następnie zhybrydyzować membranę PVDF z przeciwciałem anty-króliczym sprzężonym z peroksydazą chrzanową rozcieńczoną w buforze blokującym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej na mieszalniku zawiesinowym z prędkością 30 obrotów na minutę. Następnie przemyj membranę PVDF trzykrotnie roztworem soli fizjologicznej buforowanym Tris 20 razy. Po umyciu namocz membranę PVDF w buforowanym trisem roztworze soli fizjologicznej 20 na 30 minut na mieszalniku zawiesiny z prędkością 45 obrotów na minutę.Następnie zastąp soli fizjologicznej buforowaną Tris 20 solą fizjologiczną buforowaną fosforanami. Aby zachować membranę PVDF w temperaturze czterech stopni Celsjusza do 12 godzin. Następnie wymieszaj ulepszone odczynniki substratu chemiluminescencyjnego jeden i dwa w stosunku jeden do jednego.Następnie wyjmij membranę PVDF z soli fizjologicznej buforowanej fosforanami i krótko osusz kieszeniami na stempel, aby wchłonąć nadmiar wilgoci. Natychmiast dodaj 400 mikrolitrów odczynnika chemiluminescencyjnego na powierzchnię membrany i odczekaj od trzech do pięciu minut. Krótko osusz, aby odsączyć nadmiar odczynnika chemiluminescencyjnego, zapobiegając całkowitemu wyschnięciu membrany.Użyj systemu obrazowania Luminescent, aby naświetlić plamę. W tym przypadku przeprowadzono analizę immuno blot, aby pokazać stężenie enzymu Ubc9 wymagane do SUMOylacji celów p53. Pokazuje to, że 1/2 i 1/5 stężenia enzymu Ubc9 może w wystarczającym stopniu SUMOylować enzym p53 w teście SUMOylacji in vitro przy użyciu peptydów SUMO 1 i SUMO 2.Aby przeanalizować SUMOylowany p53, membranę sondowano przeciwciałem anty-p53. Podobną analizę immuno blot przeprowadzono w celu wykazania, że połowa stężenia E1 i 1/10 enzymów Ubc9 jest wymagana do SUMOylacji celu p53 w teście SUMOylacji in vitro przy użyciu peptydów SUMO 1, SUMO 2 i SUMO 3. W tym miejscu błona została wybarwiona Coomassie, aby pokazać oczyszczone białko K-bZIP.Do ekspresji oczyszczonego K-bZIP użyto systemu ekspresji bakulowirusa, który analizowano na stronie SDS z albuminą surowicy bydlęcej jako standardem dla porównania. Przeprowadzono również dodatkową analizę immunoblot, która wykazała, że przy zwiększaniu stężenia K-bZIP katalizuje on SUMOylację p53 w obecności odpowiednio połowy ilości E1 i 1/10 ilości enzymów Ubc9. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu czterech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.Podczas próby wykonania tej procedury należy pamiętać, aby zachować cały odczynnik do testu sumoylacji in vitro na lodzie i wykonać rozcieńczenie seryjne, a nie w jednym gigantycznym rozcieńczeniu. Znajdź tę procedurę, inne metody, takie jak nadekspresja SUMOlygase, mogą być wykonane w celu weryfikacji SUMOylacji in vitro. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się SUMOylacją do zbadania większej ilości SUMOlygazów i potwierdzenia ich mocy specyficzności.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zidentyfikować ligazę SUMO e3 za pomocą testu symulacyjnego in vitro.

in-vitro-sumoylation-assay-to-study-sumo-e3-ligase-activity

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film demonstruje metodę in vitro do SUMOylacji białek substratowych przy użyciu sekwencyjnej kaskady enzymatycznej. Ponadto status SUMOylacji białka jest identyfikowany za pomocą techniki elektroforezy i immunoblottingu.

Test SUMOylacji: technika in vitro do wykrywania stanu SUMOylacji białek substratowych za pomocą immunoblottingu

Ten manuskrypt opisuje wykrycie sumoilacji i ubikwitynacji białek kinetochorowych, Ndc10 i Ndc80, u pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae.

Technika oczyszczania białek pozwalająca na wykrycie sumoilacji i ubikwitynacji pączkujących białek kinetochoru drożdży Ndc10 i Ndc80

Małe modyfikatory związane z ubikwityną (SUMO) białka są sprzężone z resztami lizyny docelowych białek w celu regulacji różnych procesów komórkowych. W pracy opisano protokół wykrywania SUMOylacji białka siatkówczaka (Rb) w warunkach endogennych i egzogennych w komórkach ludzkich.

In vivo (in vivo) Wykrywanie i analiza sumoylacji białka Rb w komórkach ludzkich

SUMO to niezbędne i wysoce konserwatywne, małe białko modyfikujące podobne do ubikwityny. W tym protokole opisujemy zastosowanie odpornego na stres rekombinowanego białka pułapkującego SUMO (kmUTAG) do wizualizacji natywnych, nieoznakowanych koniugatów SUMO i ich lokalizacji w różnych typach komórek.

Lokalizacja białek modyfikowanych SUMO za pomocą fluorescencyjnych białek pułapkujących sumo

Tutaj prezentujemy protokół wzbogacania, izolowania, identyfikowania i charakteryzowania białek modyfikowanych przez SUMO in vivo, zarówno z ludzkich komórek wątroby, jak i guzów wątroby uzyskanych z mysich modeli raka wątrobowokomórkowego przy użyciu jednostek wiążących SUMO (SUBEs).

Jednostki wiążące SUMO (SUBE) jako narzędzia do wzbogacania, izolacji, identyfikacji i charakterystyki proteomu SUMO w raku wątroby

Celem tego manuskryptu jest przedstawienie zarysu kompleksowych badań biochemicznych i funkcjonalnych ligaz ubikwityny typu E3 typu RING. Ten wieloetapowy potok, ze szczegółowymi protokołami, weryfikuje aktywność enzymatyczną badanego białka i pokazuje, jak powiązać tę aktywność z funkcjonowaniem.

Charakterystyka funkcjonalna ligaz ubikwityny RING-Type E3 in vitro i in planta

Niniejsze badanie dostarcza szczegółowych protokołów testów ubikwitylacji in vitro do analizy aktywności katalitycznej ligazy ubikwityny E3. Rekombinowane białka ulegały ekspresji przy użyciu systemów prokariotycznych, takich jak hodowla Escherichia coli.

In vitro Analiza funkcji ligazy ubikwityny E3

Udostępniamy szczegółowy protokół testu ubikwitylacji specyficznego substratu i ligazy ubikwityny E3 w komórkach ssaków. HEK293T linie komórkowe wykorzystano do nadekspresji białek, poliubikwitylowany substrat oczyszczono z lizatów komórkowych metodą immunoprecypitacji i rozdzielono w SDS-PAGE. Do wizualizacji tej modyfikacji potranslacyjnej wykorzystano immunoblotting.

Ocena ubikwitylacji substratu przez ligazę ubikwityny E3 w lizatach komórek ssaków

Obecny protokół podkreśla zmodyfikowaną metodę wykrywania i ilościowego oznaczania wiązań krzyżowych DNA-białko (DPC) oraz ich modyfikacji potranslacyjnych (PTM), w tym ubikwitylacji, SUMOylacji i ADP-rybozylacji indukowanej przez inhibitory topoizomerazy i formaldehyd, umożliwiając tym samym badanie powstawania i naprawy DPC i ich PTM.

Ilościowe wykrywanie wiązań krzyżowych DNA-białko i ich modyfikacji potranslacyjnych

Ubikwitynacja jest kluczowym regulatorem funkcji białek wewnątrzkomórkowych. Tutaj opisujemy dwie metody lizy komórek do wykrywania poziomów ubikwitynacji białek substratowych w komórkach ssaków oraz porównujemy ich skuteczność w analizie poziomów ubikwitynacji. Nadekspresja białek w HEK293T komórkach została wywołana przejściową transfekcją, a białka ubikwitynowane wykryto analizą western blota.

Porównawcze strategie wykrywania ubiquitynacji w lizatach komórek ssaków z wykorzystaniem SMAD2/SMURF2 jako modelu

Protokół ten opisuje metodę ubikwitynacji Streptococcus pneumoniae przy użyciu lizatu komórek ssaków lub czystego kompleksu enzymów ubikwityny, a następnie leczenie oczyszczonym kompleksem białkowym VCP/p97-UFD1-NPLOC4 w celu oceny aktywności bakteriolitycznej, umożliwiającej badanie efektorów immunologicznych zależnych od ubikwityny.

In vitro Rekonstrukcja ubikwitynacji bakteryjnej i eliminacja pośredniczona przez VCP/p97

Poznaj zmodyfikowany test SUMOylacji in vitro do identyfikacji nowych ligaz SUMO E3 i badania ich specyficzności wobec izoform SUMO. Ta metoda pozwala na szybką weryfikację białek.

In vitro Test SUMOylacji do badania aktywności ligazy SUMO E3

Przeglądaj więcej filmów