In vitro Test SUMOylacji do badania aktywności ligazy SUMO E3

Ogólnym celem tego eksperymentu jest zweryfikowanie interesującego białka, które może być SUMOylowane lub jest ligazą SUMO E3. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie SUMOylacji, takie jak identyfikacja ligazy SUMO E3. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją wykorzystać do badania specyficzności ligazy SUMO E3 w stosunku do różnych form SUMO iso.

Procedurę zademonstruje Wan-Shan Young, doktorant z mojego laboratorium. Aby oczyścić znacznik K-bZIP, najpierw inkubuj 10 mililitrów lizatu komórkowego z 50 mikrolitrami kulek magnetycznych znakowanych przeciwciałami w 14-mililitrowej probówce polipropylenowej. Następnie obracaj rurkę z prędkością 50 obrotów na minutę w czterech stopniach Celsjusza przez trzy godziny w mieszalniku do zawiesiny.

Po wychwyceniu białka odwirować próbkę o masie 800 razy g przez 30 sekund w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby ogranulować kulki. Wyrzuć wszystkie oprócz jednego mililitra supernatantu, aby ponownie zawiesić kulki. I przenieś rozpuszczone kulki do 1,5-mililitrowej probówki.

Aby umyć wychwycone białka, umieść probówkę z koralikami na stojaku magnetycznym. Odczekaj około trzech sekund, aż kulki przylgną do bocznych ścianek probówki, a następnie usuń supernatant. Aby umyć kulki, dodaj jeden mililitr buforu do lizy do 1,5-mililitrowej probówki.

Następnie odwróć rurkę dziesięć razy. Następnie umieść 1,5-mililitrową rurkę na stojaku magnetycznym i usuń supernatant, gdy koraliki przylgną do ścianek. Aby ponownie umyć kulki, dodaj jeden mililitr soli fizjologicznej buforowanej fosforanem do 1,5-mililitrowej probówki i odwróć ją dziesięć razy.

Następnie przenieś rurkę do stojaka magnetycznego i usuń supernatant, gdy kulki przymocują się do ścianek bocznych. Aby wymyć białka znakowane K-bZIP z kulek magnetycznych znakowanych przeciwciałami, dodaj 100 mikrolitrów w stężeniu 150 mikrogramów na mililitr oktapeptydu rozcieńczonego w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami w probówce o pojemności 1,5 mililitra. Następnie obracaj rurkę na mieszadle zawiesinowym z prędkością 50 obrotów na minutę przez dziesięć minut w temperaturze pokojowej.

Przenieś rurkę na stojak magnetyczny. A następnie zbierz K-bZIP zawierający supernatant. Następnie, aby przeanalizować oczyszczony znacznik K-bZIP, poddaj od jednego do pięciu mikrolitrów oczyszczonego białka stronie SDS, a następnie barwienie na niebiesko Coomassie.

Obciążyć 0,5, 1 i 2 mikrogramy albuminy surowicy bydlęcej jako wzorce do żelu w celu ilościowego określenia stężenia K-bZIP. Podczas przetwarzania obrazu na obrazie J.Next, rozcieńczyć oczyszczony K-bZIP w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami. Aby osiągnąć końcowe stężenie 100 nanogramów na mikrolitr.

I przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza w małych porcjach. Dodać trzy mikrolitry po 100 nanogramów na mikrolitr oczyszczonego, oznakowanego K-bZIP w reakcji mieszania głównego SUMOylacji in vitro. Następnie delikatnie wymieszaj zawartość mieszanki wzorcowej i inkubuj w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez trzy godziny.

Następnie dodaj 20 mikrolitrów strony 2X SDS z buforem ładującym, aby zatrzymać reakcję. Następnie podgrzewaj próbki w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut, aby zdenaturować białko. Następnie załaduj 20 mikrolitrów próbki na 10% żel do stron SDS.

I uruchom żel pod napięciem 80 woltów przez około 120 minut, aż barwnik dotrze do dna żelu. Po zakończeniu niedowładu elektrycznego odłącz aparat żelowy. I przenieś żel do półsuchego bufora transferowego na pięć minut.

Następnie zanurz membranę PVDF w innym pojemniku wypełnionym metanolem na jedną minutę. Usunąć membranę PVDF z metanolu i zanurzyć w półsuchym buforze transferowym. Następnie delikatnie mieszaj membranę przez pięć minut.

Zdjąć pokrywę zabezpieczającą półsuchego aparatu elektroforetycznego. Wstępnie zwilż bibułę filtracyjną. I przygotuj żelową kanapkę na dnie anody platynowej.

Po zamocowaniu płytki katodowej w pokrywie bezpieczeństwa, uruchom blot przy stałym prądzie 15 V przez 90 minut. Następnie wyłącz zasilanie i wyjmij membranę PVDF po odłączeniu aparatu półsuchego. Teraz zablokuj membranę PVDF buforem blokującym na jedną godzinę w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 30 obrotów na minutę.

Następnie zhybrydyzować membranę PVDF z przeciwciałem anty-p53 i buforem blokującym przez 12 do 16 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza na mieszalniku zawiesinowym z prędkością 30 obrotów na minutę. Następnie wyjmij membranę PVDF i przenieś do pojemnika wypełnionego solą fizjologiczną buforowaną Tris 20 tween 20. Następnie zanurz membranę PVDF w buforowanym trisem soli fizjologicznej 20 na 30 minut na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 45 obrotów na minutę.

Następnie zhybrydyzować membranę PVDF z przeciwciałem anty-króliczym sprzężonym z peroksydazą chrzanową rozcieńczoną w buforze blokującym przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej na mieszalniku zawiesinowym z prędkością 30 obrotów na minutę. Następnie przemyj membranę PVDF trzykrotnie roztworem soli fizjologicznej buforowanym Tris 20 razy. Po umyciu namocz membranę PVDF w buforowanym trisem roztworze soli fizjologicznej 20 na 30 minut na mieszalniku zawiesiny z prędkością 45 obrotów na minutę.

Następnie zastąp soli fizjologicznej buforowaną Tris 20 solą fizjologiczną buforowaną fosforanami. Aby zachować membranę PVDF w temperaturze czterech stopni Celsjusza do 12 godzin. Następnie wymieszaj ulepszone odczynniki substratu chemiluminescencyjnego jeden i dwa w stosunku jeden do jednego.

Następnie wyjmij membranę PVDF z soli fizjologicznej buforowanej fosforanami i krótko osusz kieszeniami na stempel, aby wchłonąć nadmiar wilgoci. Natychmiast dodaj 400 mikrolitrów odczynnika chemiluminescencyjnego na powierzchnię membrany i odczekaj od trzech do pięciu minut. Krótko osusz, aby odsączyć nadmiar odczynnika chemiluminescencyjnego, zapobiegając całkowitemu wyschnięciu membrany.

Użyj systemu obrazowania Luminescent, aby naświetlić plamę. W tym przypadku przeprowadzono analizę immuno blot, aby pokazać stężenie enzymu Ubc9 wymagane do SUMOylacji celów p53. Pokazuje to, że 1/2 i 1/5 stężenia enzymu Ubc9 może w wystarczającym stopniu SUMOylować enzym p53 w teście SUMOylacji in vitro przy użyciu peptydów SUMO 1 i SUMO 2.

Aby przeanalizować SUMOylowany p53, membranę sondowano przeciwciałem anty-p53. Podobną analizę immuno blot przeprowadzono w celu wykazania, że połowa stężenia E1 i 1/10 enzymów Ubc9 jest wymagana do SUMOylacji celu p53 w teście SUMOylacji in vitro przy użyciu peptydów SUMO 1, SUMO 2 i SUMO 3. W tym miejscu błona została wybarwiona Coomassie, aby pokazać oczyszczone białko K-bZIP.

Do ekspresji oczyszczonego K-bZIP użyto systemu ekspresji bakulowirusa, który analizowano na stronie SDS z albuminą surowicy bydlęcej jako standardem dla porównania. Przeprowadzono również dodatkową analizę immunoblot, która wykazała, że przy zwiększaniu stężenia K-bZIP katalizuje on SUMOylację p53 w obecności odpowiednio połowy ilości E1 i 1/10 ilości enzymów Ubc9. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu czterech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Podczas próby wykonania tej procedury należy pamiętać, aby zachować cały odczynnik do testu sumoylacji in vitro na lodzie i wykonać rozcieńczenie seryjne, a nie w jednym gigantycznym rozcieńczeniu. Znajdź tę procedurę, inne metody, takie jak nadekspresja SUMOlygase, mogą być wykonane w celu weryfikacji SUMOylacji in vitro. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się SUMOylacją do zbadania większej ilości SUMOlygazów i potwierdzenia ich mocy specyficzności.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zidentyfikować ligazę SUMO e3 za pomocą testu symulacyjnego in vitro.