Name: Ustalenie mysiego modelu czystej neuropatii drobnowłóknistej z ultrasilnym agonistą przejściowego potencjału receptora waniloidowego typu 1 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Odkryj model czystej neuropatii drobnowłóknistej u myszy z użyciem resiniferatoksyny RTX. Metoda obejmuje dożylne podanie 50 µg/kg i ocenę behawioralną, umożliwiając badanie mechanizmów bólu neuropatycznego oraz degeneracji włókien nerwowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Ministerstwa Nauki i Technologii (106-2320-B-037-024), Uniwersytetu Medycznego w Kaohsiung (KMU-M106028, KMU-S105034) oraz Aim for the Top Universities Grant (TP105PR15), Uniwersytetu Medycznego w Kaohsiung, Tajwan.

Wszystkie opisane procedury są zgodne z wytycznymi etycznymi dotyczącymi zwierząt laboratoryjnych30, a protokół został zatwierdzony przez Komitet ds. Zwierząt Uniwersytetu Medycznego w Kaohsiung, Kaohsiung, Tajwan.
1. Wywołanie neuropatii RTX
OSTRZEŻENIE: RTX jest neurotoksyczny i niebezpieczny. W przypadku kontaktu działa drażniąco na oczy, błony śluzowe i górne drogi oddechowe. Należy unikać wdychania oraz nosić okulary ochronne i fartuchy laboratoryjne podczas przygotowywania RTX. W przypadku kontaktu ze skórą lub po manipulowaniu substancją należy przemyć miejsce kontaktu obficie wodą.
<ol>
	<li>Dodać 1 mg proszku RTX do 20 µL mieszaniny równych objętości Tween 80 i etanolu bezwodnego (po 10 µL każdego rozpuszczalnika).</li>
	<li>Rozdzielić roztwór RTX na alikwoty (12 µL/fiolka) i przechowywać w temperaturze -20 °C przez maksymalnie 3 miesiące. Stanowi to roztwór zapasowy RTX; pozostały roztwór RTX należy utylizować poy upływie terminu ważności.</li>
	<li>Rozcieńczyć roztwór zapasowy RTX solą fizjologiczną do końcowej objętości 60 µL. Końcowe stężenie roztworu RTX powinno wynosić 0,01%, co odpowiada 1 µg RTX w 10 µL roztworu nośnika.</li>
	<li>W качестве zwierząt doświadczalnych wykorzystać 8-tygodniowe dorosłe samce myszy ICR (35-40 g) i podać im jednorazową dawkę roztworu RTX (dawki odpowiednio: 20, 50 i 10 µg/kg) drogą dosytronikalną (i.p.) za pomocą strzykawki do mikroiniekcji. Myszy znieczulono wziewnie 5% izofluranem w celu uzyskania głębokiej anestezji. Jeśli podczas wstrzykiwania RTX myszy wykazywały odruch cofania kończyn, należało wydłużyć czas podawania znieczulenia wziewnego. 
	Przykład: Jeśli mysz waży 40 g, otrzyma ona 20 µL roztworu RTX, co odpowiada dawce 50 µg/kg.</li>
	<li>Jednej grupie myszy, w ramach kontroli, podać równą objętość nośnika (10% Tween 80 i 10% etanolu bezwodnego w soli fizjologicznej).</li>
	<li>Po wstrzyknięciu RTX myszy należy przenieść do plastikowych klatek w cyklu 12 h światła/12 h ciemności, zapewniając dostęp do pożywienia i wody ad libitum.</li>
</ol>
2. Ocena zachowań neuropatycznych
UWAGA: Zwierzęta należy utrzymywać w komfortowym środowisku (krok 1.6), aby umożliwić im regenerację po iniekcji. W 7. dniu po iniekcji RTX (D7), każde zwierzę poddawane jest testowi gorącej płyty oraz testowi filamentami von Frey w tym samym dniu, aby zminimalizować błąd czasowy i zwiększyć efektywność testów behawioralnych. Zwierzęta należy przenieść do cichego pomieszczenia z utrzymywaną stabilną wilgotnością (40%) i temperaturą (27 °C) w celu optymalizacji aklimatyzacji zwierząt i ograniczenia wpływu czynników środowiskowych podczas testów behawioralnych. Nie należy niepokoić zwierząt w okresach przeprowadzania testów; testy behawioralne są planowane w odstępach tygodniowych.
<ol>
	<li>Pomiar latencji termicznej za pomocą testu gorącej płyty
	<ol>
		<li>Ostrożnie umieść zwierzę na metalowej gorącej płycie (27 cm × 29 cm) z przezroczystą klatką z Pleksiglasu (długość × szerokość × wysokość: 2 cm × 2 cm × 25 cm; Rysunek 1A). Ustaw temperaturę metalowej gorącej płyty na 52 °C.</li>
		<li>Zacznij mierzyć czas latencji termicznej zwierzęcia na gorącej płycie za pomocą wbudowanegolystycznego czasomierza płyty w momencie, gdy tylne łapy zwierzęcia dotkną powierzchni, i obserwuj reakcje tylnych łap zwierzęcia. Jeśli zwierzę wykaże drżenie, lizanie tylnych łap lub skakanie podczas przebywania na gorącej płycie, usuń je i zarejestruj czas, przez który zwierzę pozostawało na płycie. Ten przedział czasu definiuje latencję termiczną poszczególnego zwierzęcia. Zapisz latencję termiczną z dokładnością do 0,1 s.</li>
		<li>Podczas każdej sesji testowej przeprowadź trzy próby z 30-minutowymi odstępami w celu normalizacji odpowiedzi po ostatnim teście na gorącej płycie. Jeśli zwierzę nie wykaże reakcji na gorącej płycie, przerwij sesję po 25 s, aby uniknąć potencjalnego uszkodzenia tkanek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar progu mechanicznego za pomocą testu włókien von Freya
	<ol>
		<li>Umieść zwierzę na dostosowanej metalowej siatce (wymiar oczek: 5 mm × 5 mm) w półprzezroczystym cylindrycznym klatce z Pleksiglasu (średnica: 13 cm; wysokość: 12 cm) (Rysunek 1B) w celu aklimatyzacji przez co najmniej 2 h.</li>
		<li>Przykładaj włókna von Freya o różnych kalibrach do powierzchni podeszwowej tylnej łapy metodą „góra-dół”31. Rozpocznij pierwsze przyłożenie od średniej siły z zestawu włókien von Freya, utrzymując włókno przez 5-8 s.</li>
		<li>Stosuj 2-minutowy odstęp między przyłożeniami włókien, aby zoptymalizować normalizację zwierzęcia. Zmieniaj siłę nacisku włókna w zależności od ostatniej reakcji zwierzęcia. 
		UWAGA: Zestaw włókien von Freya obejmuje siły nacisku 0,064, 0,085, 0,145, 0,32, 0,39, 1,1 i 1,7 g. Na przykład, jeśli cofnięcie tylnej łapy nastąpiło przy początkowej sile 0,32 g, wówczas zastosuj 0,145 g. W przypadku braku cofnięcia łapy zastosuj siłę 0,39 g. Następnie przyłóż cztery dodatkowe włókna o różnych siłach w zależności od poprzednich reakcji, a próg mechaniczny oblicz zgodnie z opublikowanym wzorem31.</li>
		<li>Podczas każdej sesji testowej uwzględnij obie tylne łapy. Przeprowadź trzy próby dla każdej tylnej łapy. Średnią z tych sześciu progów mechanicznych określ jako średni próg mechaniczny (mg) dla każdego zwierzęcia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Schemat równowagi statycznej; A: obudowa akrylowa, B: obiekt cylindryczny na powierzchni siatki do badań z zakresu fizyki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56651/56651fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rysunek 1. Specjalnie wykonana klatka z Pleksiglasu i metalowa siatka do oceny bólu neuropatycznego w mysim modelu neuropatii małych włókien wywołanej przez rezyniferatoksynę (RTX). (A, B) Wykresy te przedstawiają sprzęt wykorzystywany do pomiaru (A) opóźnienia termiczne za pomocą metalowej płyty grzejnej (27 cm × 29 cm) z przezrozystą klatką z pleksiglasu (długość × szerokość × wysokość: 2 cm × 2 cm × 25 cm) i ocenić (B) próg mechaniczny za pomocą dostosowanej metalowej siatki (wymiary oczka: 5 mm × 5 mm) z półprzezroczystą cylindryczną klatką z pleksiglasu (średnica: 13 cm; wysokość: 12 cm) u myszy z indukowaną RTX neuropatią małych włókien. <a href="//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56651/56651fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
3. Przygotowanie biopsji skóry i ocena unerwienia IENF
<ol>
	<li>Po testach behawioralnych znieczulić zwierzęta 5% izofluranem i poddać je eutanazji poprzez perfuzję wewnątrzsercową buforem fosforanowym (PB) 0,1 M (pH 7,4), a następnie 4% paraformaldehydem (4P) w 0,1 M PB.</li>
	<li>Po perfuzji wyciąć pierwsze poduszki stóp z obu tylnych łap i poddać je dodatkowej fiksacji w 4P przez kolejne 6 h. Przenieść tkankę poduszek stóp do 0,1 M PB w temperaturze 4 °C w celu długoterminowego przechowywania.</li>
	<li>Krioprotekcyjnie zabezpieczyć poduszki stóp 30% sacharozą w PB przez noc, a następnie wykonać przekroje pionowe do powierzchni podeszwowej w plastrach o grubości 30 µm. Oznaczyć sekcje poduszek stóp sekwencyjnie, a następnie przechowywać w płynie przeciwzamrożeniu w temperaturze -20 °C. 
	UWAGA: Skład płynu przeciwzamrożeniowego to: woda destylowana, etylenoglikol, glicerol i 2x PB w stosunku 3:3:3:1.</li>
	<li>Aby zapewnić odpowiednie próbkowanie, wybrać co trzecią sekcję poduszki stopy.
	<ol>
		<li>Umieścić wybrane sekcje poduszek stóp na powlekanych szkiełkach przedmiotowych i wysuszyć na powietrzu.</li>
		<li>Przykryć szkiełko plastikową lamelką i przetworzyć zgodnie ze standardowymi procedurami immunobarwienia.
		<ol>
			<li>Zneutralizować peroksydazę w sekcjach poduszek stóp za pomocą 1% H2O2 w metanolu przez 30 min i zablokować 0,5% beztłustym mlekiem w proszku oraz 0,1% Triton X-10 w 0,5 M buforze Tris (Tris) przez 1 h.</li>
			<li>Inkubować sekcje poduszek stóp z antyserum przeciwko panaksonalnemu markerowi PGP 9.5 (pozyskane od królika; 1:10) przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
			<li>Inkubować sekcje poduszek stóp z biotynilowanym wtórnym przeciwciałem kozim anty-króliczym IgG w temperaturze pokojowej (RT) przez 1 h, a następnie inkubować z kompleksem awidyna-biotyna w RT przez 45 min.</li>
			<li>Wizualizować produkt reakcji za pomocą 0,05% roztworu 3,3'-diaminobenzydyny (DAB) przez 45 s. Następnie przemyć sekcje poduszek stóp wodą destylowaną i wysuszyć na powietrzu przed montowaniem. 
			UWAGA: Antysera pierwotne i wtórne rozcieńczono 0,5% beztłustym mlekiem w proszku w 0,5 M Tris.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przygotowanie przekrojów zrazów z DRG i ocena uszkodzonych neuronów o małej średnicy
<ol>
	<li>Przeprowadź sekcję 4th oraz 5th zwoje korzeni grzbietowych (DRG) odcinka lędźwiowego i utrwalanie przez kolejne 2 h.</li>
	<li>Krioprotekcję tkanek zwojów korzeni grzbietowych (DRG) przeprowadź przy użyciu 30% sacharozy w buforze PBS przez noc, a następnie przetnij na 8-µm grubość sekwencyjnie, umieścić na szkiełkach mikroskopowych i opisać. Przechowywać przekroje zwojów korzeni grzbietowych (DRG) w temperaturze -80 °C zamrażarka.</li>
	<li>Wykonanie barwienia immunocytochemicznego przekrojów zrazów z zwojów korzeni grzbietowych (DRG) w 80 µm-odstępy w celu zapewnienia odpowiedniego poboru próbek.
	<ol>
		<li>Przeprowadzić procedury immunobarwienia zwojów korzeni grzbietowych (DRG) analogicznie do sekcji poduszek stóp, z wyjątkiem procedur immunofluorescencyjnego podwójnego znakowania. Alternatywnie, w pierwszym etapie inkubacji z przeciwciałami dodać ATF3 (przeciwciało królicze; 1:10), będący markerem uszkodzenia, oraz peryferynę (przeciwciało mysie; 1:80), będącą markerem neuronów o małej średnicy.</li>
		<li>Inkubować skrawki zwojów korzeni grzbietowych (DRG) z mieszaniną przeciwciał pierwszorzędowych przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować przekroje zwojów korzeniowych tylnych (DRG) z przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z Texas red lub izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) (1:20), odpowiadającymi odpowiednim przeciwciałom pierwotnym, w temperaturze pokojowej przez 1 h, a następnie zamontować preparaty do ilościowej analizy.</li>
</ol>

<ol><li>Shun, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+denervation+in+type+2+diabetes%3A+correlations+with+diabetic+duration+and+functional+impairments%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Skin denervation in type 2 diabetes: correlations with diabetic duration and functional impairments.</a> Brain. 127 (Pt 7), 1593-1605 (2004).</li>
<li>Polydefkis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+time+course+of+epidermal+nerve+fibre+regeneration%3A+studies+in+normal+controls+and+in+people+with+diabetes%2C+with+and+without+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">The time course of epidermal nerve fibre regeneration: studies in normal controls and in people with diabetes, with and without neuropathy.</a> Brain. 127 (Pt 7), 1606-1615 (2004).</li>
<li>Holland, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-fiber+sensory+neuropathies%3A+clinical+course+and+neuropathology+of+idiopathic+cases%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Small-fiber sensory neuropathies: clinical course and neuropathology of idiopathic cases.</a> Ann Neurol. 44 (1), 47-59 (1998).</li>
<li>Chaudhry, V., Rowinsky, E. K., Sartorius, S. E., Donehower, R. C., Cornblath, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+neuropathy+from+taxol+and+cisplatin+combination+chemotherapy%3A+clinical+and+electrophysiological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Peripheral neuropathy from taxol and cisplatin combination chemotherapy: clinical and electrophysiological studies.</a> Ann Neurol. 35 (3), 304-311 (1994).</li>
<li>Mellgren, S. I., Nolano, M., Sommer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cutaneous+nerve+biopsy%3A+technical+aspects%2C+indications%2C+and+contribution%5BTitle%5D)+AND+%22Handb+Clin+Neurol%22%5BJournal%5D)">The cutaneous nerve biopsy: technical aspects, indications, and contribution.</a> Handb Clin Neurol. 115, 171-188 (2013).</li>
<li>Hsieh, Y. L., Chiang, H., Lue, J. H., Hsieh, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2X3-mediated+peripheral+sensitization+of+neuropathic+pain+in+resiniferatoxin-induced+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">P2X3-mediated peripheral sensitization of neuropathic pain in resiniferatoxin-induced neuropathy.</a> Exp Neurol. 235 (1), 316-325 (2012).</li>
<li>Fukuoka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-evaluation+of+the+phenotypic+changes+in+L4+dorsal+root+ganglion+neurons+after+L5+spinal+nerve+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Re-evaluation of the phenotypic changes in L4 dorsal root ganglion neurons after L5 spinal nerve ligation.</a> Pain. 153 (1), 68-79 (2012).</li>
<li>Joint Task Force of the, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((European+Federation+of+Neurological+Societies%2FPeripheral+Nerve+Society+Guideline+on+the+use+of+skin+biopsy+in+the+diagnosis+of+small+fiber+neuropathy.+Report+of+a+joint+task+force+of+the+European+Federation+of+Neurological+Societies+and+the+Peripheral+Nerve+Society%5BTitle%5D)+AND+%22J+Peripher+Nerv+Syst%22%5BJournal%5D)">European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society.</a> J Peripher Nerv Syst. 15 (2), 79-92 (2010).</li>
<li>Hsieh, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology+and+functional+diagnosis+of+small-fiber+painful+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurol+Taiwan%22%5BJournal%5D)">Pathology and functional diagnosis of small-fiber painful neuropathy.</a> Acta Neurol Taiwan. 19 (2), 82-89 (2010).</li>
<li>Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+the+skin+biopsy+method+in+studies+of+diabetic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Electroencephalogr+Clin+Neurophysiol+Suppl%22%5BJournal%5D)">Utility of the skin biopsy method in studies of diabetic neuropathy.</a> Electroencephalogr Clin Neurophysiol Suppl. 50, 553-559 (1999).</li>
<li>Kennedy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+afforded+by+the+study+of+unmyelinated+nerves+in+skin+and+other+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Opportunities afforded by the study of unmyelinated nerves in skin and other organs.</a> Muscle Nerve. 29 (6), 756-767 (2004).</li>
<li>Verdu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+and+immunohistochemical+characterization+of+cisplatin-induced+neuropathy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Physiological and immunohistochemical characterization of cisplatin-induced neuropathy in mice.</a> Muscle Nerve. 22 (3), 329-340 (1999).</li>
<li>Ko, M. H., Hu, M. E., Hsieh, Y. L., Lan, C. T., Tseng, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidergic+intraepidermal+nerve+fibers+in+the+skin+contribute+to+the+neuropathic+pain+in+paclitaxel-induced+peripheral+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropeptides%22%5BJournal%5D)">Peptidergic intraepidermal nerve fibers in the skin contribute to the neuropathic pain in paclitaxel-induced peripheral neuropathy.</a> Neuropeptides. 48 (3), 109-117 (2014).</li>
<li>Hsieh, S. T., Chiang, H. Y., Lin, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology+of+nerve+terminal+degeneration+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Pathology of nerve terminal degeneration in the skin.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 59 (4), 297-307 (2000).</li>
<li>Tseng, T. J., Hsieh, Y. L., Ko, M. H., Hsieh, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redistribution+of+voltage-gated+sodium+channels+after+nerve+decompression+contributes+to+relieve+neuropathic+pain+in+chronic+constriction+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Redistribution of voltage-gated sodium channels after nerve decompression contributes to relieve neuropathic pain in chronic constriction injury.</a> Brain Res. 1589, 15-25 (2014).</li>
<li>Hsieh, Y. L., Lin, W. M., Lue, J. H., Chang, M. F., Hsieh, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+4-methylcatechol+on+skin+reinnervation%3A+promotion+of+cutaneous+nerve+regeneration+after+crush+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Effects of 4-methylcatechol on skin reinnervation: promotion of cutaneous nerve regeneration after crush injury.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 68 (12), 1269-1281 (2009).</li>
<li>Tseng, T. J., Chen, C. C., Hsieh, Y. L., Hsieh, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+decompression+on+neuropathic+pain+behaviors+and+skin+reinnervation+in+chronic+constriction+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Effects of decompression on neuropathic pain behaviors and skin reinnervation in chronic constriction injury.</a> Exp Neurol. 204 (2), 574-582 (2007).</li>
<li>Hsieh, Y. L., Chiang, H., Tseng, T. J., Hsieh, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+cutaneous+nerve+regeneration+by+4-methylcatechol+in+resiniferatoxin-induced+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Enhancement of cutaneous nerve regeneration by 4-methylcatechol in resiniferatoxin-induced neuropathy.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 67 (2), 93-104 (2008).</li>
<li>Hsieh, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Peptidergic+Nerve+Terminals+in+the+Skin%3A+Reversal+of+Thermal+Sensation+by+Calcitonin+Gene-Related+Peptide+in+TRPV1-Depleted+Neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Role of Peptidergic Nerve Terminals in the Skin: Reversal of Thermal Sensation by Calcitonin Gene-Related Peptide in TRPV1-Depleted Neuropathy.</a> PLoS One. 7 (11), e50805(2012).</li>
<li>Neubert, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripherally+induced+resiniferatoxin+analgesia%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Peripherally induced resiniferatoxin analgesia.</a> Pain. 104 (1-2), 219-228 (2003).</li>
<li>Almasi, R., Petho, G., Bolcskei, K., Szolcsanyi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+resiniferatoxin+on+the+noxious+heat+threshold+temperature+in+the+rat%3A+a+novel+heat+allodynia+model+sensitive+to+analgesics%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Effect of resiniferatoxin on the noxious heat threshold temperature in the rat: a novel heat allodynia model sensitive to analgesics.</a> Br J Pharmacol. 139 (1), 49-58 (2003).</li>
<li>Karai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+vanilloid+receptor+1-expressing+primary+afferent+neurons+for+pain+control%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Deletion of vanilloid receptor 1-expressing primary afferent neurons for pain control.</a> J Clin Invest. 113 (9), 1344-1352 (2004).</li>
<li>Apostolidis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capsaicin+receptor+TRPV1+in+urothelium+of+neurogenic+human+bladders+and+effect+of+intravesical+resiniferatoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Urology%22%5BJournal%5D)">Capsaicin receptor TRPV1 in urothelium of neurogenic human bladders and effect of intravesical resiniferatoxin.</a> Urology. 65 (2), 400-405 (2005).</li>
<li>Helyes, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiinflammatory+and+analgesic+effects+of+somatostatin+released+from+capsaicin-sensitive+sensory+nerve+terminals+in+a+Freund%27s+adjuvant-induced+chronic+arthritis+model+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Rheum%22%5BJournal%5D)">Antiinflammatory and analgesic effects of somatostatin released from capsaicin-sensitive sensory nerve terminals in a Freund's adjuvant-induced chronic arthritis model in the rat.</a> Arthritis Rheum. 50 (5), 1677-1685 (2004).</li>
<li>Kissin, I., Bright, C. A., Bradley, E. L. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+and+long-lasting+neural+blockade+with+resiniferatoxin+prevents+inflammatory+pain+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth+Analg%22%5BJournal%5D)">Selective and long-lasting neural blockade with resiniferatoxin prevents inflammatory pain hypersensitivity.</a> Anesth Analg. 94 (5), table of contents 1253-1258 (2002).</li>
<li>Helyes, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+effect+of+anandamide+on+resiniferatoxin-induced+sensory+neuropeptide+release+in+vivo+and+neuropathic+hyperalgesia+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Inhibitory effect of anandamide on resiniferatoxin-induced sensory neuropeptide release in vivo and neuropathic hyperalgesia in the rat.</a> Life Sci. 73 (18), 2345-2353 (2003).</li>
<li>Kissin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vanilloid-induced+conduction+analgesia%3A+selective%2C+dose-dependent%2C+long-lasting%2C+with+a+low+level+of+potential+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesia+and+analgesia%22%5BJournal%5D)">Vanilloid-induced conduction analgesia: selective, dose-dependent, long-lasting, with a low level of potential neurotoxicity.</a> Anesthesia and analgesia. 107 (1), 271-281 (2008).</li>
<li>Pan, H. L., Khan, G. M., Alloway, K. D., Chen, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resiniferatoxin+induces+paradoxical+changes+in+thermal+and+mechanical+sensitivities+in+rats%3A+mechanism+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Resiniferatoxin induces paradoxical changes in thermal and mechanical sensitivities in rats: mechanism of action.</a> J Neurosci. 23 (7), 2911-2919 (2003).</li>
<li>Iadarola, M. J., Mannes, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vanilloid+agonist+resiniferatoxin+for+interventional-based+pain+control%5BTitle%5D)+AND+%22Current+topics+in+medicinal+chemistry%22%5BJournal%5D)">The vanilloid agonist resiniferatoxin for interventional-based pain control.</a> Current topics in medicinal chemistry. 11 (17), 2171-2179 (2011).</li>
<li>Zimmermann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethical+guidelines+for+investigations+of+experimental+pain+in+conscious+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Ethical guidelines for investigations of experimental pain in conscious animals.</a> Pain. 16 (2), 109-110 (1983).</li>
<li>Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+tactile+allodynia+in+the+rat+paw%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw.</a> J Neurosci Methods. 53 (1), 55-63 (1994).</li>
<li>Cliffer, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+characterization+of+Taxol-induced+large-fiber+sensory+neuropathy+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Physiological characterization of Taxol-induced large-fiber sensory neuropathy in the rat.</a> Ann Neurol. 43 (1), 46-55 (1998).</li>
<li>Lipton, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taxol+produces+a+predominantly+sensory+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Taxol produces a predominantly sensory neuropathy.</a> Neurology. 39 (3), 368-373 (1989).</li>
<li>Bennett, G. J., Xie, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+peripheral+mononeuropathy+in+rat+that+produces+disorders+of+pain+sensation+like+those+seen+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man.</a> Pain. 33 (1), 87-107 (1988).</li>
<li>Ko, M. H., Hsieh, Y. L., Hsieh, S. T., Tseng, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+demyelination+increases+metabotropic+glutamate+receptor+subtype+5+expression+in+peripheral+painful+mononeuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Nerve demyelination increases metabotropic glutamate receptor subtype 5 expression in peripheral painful mononeuropathy.</a> Int J Mol Sci. 16 (3), 4642-4665 (2015).</li>
<li>Jeftinija, S., Liu, F., Jeftinija, K., Urban, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+capsaicin+and+resiniferatoxin+on+peptidergic+neurons+in+cultured+dorsal+root+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22Regul+Pept%22%5BJournal%5D)">Effect of capsaicin and resiniferatoxin on peptidergic neurons in cultured dorsal root ganglion.</a> Regul Pept. 39 (2-3), 123-135 (1992).</li>
<li>Caudle, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resiniferatoxin-induced+loss+of+plasma+membrane+in+vanilloid+receptor+expressing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Resiniferatoxin-induced loss of plasma membrane in vanilloid receptor expressing cells.</a> Neurotoxicology. 24 (6), 895-908 (2003).</li>
<li>Acs, G., Biro, T., Acs, P., Modarres, S., Blumberg, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+activation+and+desensitization+of+sensory+neurons+by+resiniferatoxin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential activation and desensitization of sensory neurons by resiniferatoxin.</a> J Neurosci. 17 (14), 5622-5628 (1997).</li>
<li>Athanasiou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vanilloid+receptor+agonists+and+antagonists+are+mitochondrial+inhibitors%3A+how+vanilloids+cause+non-vanilloid+receptor+mediated+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Vanilloid receptor agonists and antagonists are mitochondrial inhibitors: how vanilloids cause non-vanilloid receptor mediated cell death.</a> Biochem Biophys Res Commun. 354 (1), 50-55 (2007).</li>
<li>Wu, C. H., Ho, W. Y., Lee, Y. C., Lin, C. L., Hsieh, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EXPRESS%3A+NGF-trkA+signaling+modulates+the+analgesic+effects+of+prostatic+acid+phosphatase+in+resiniferatoxin-induced+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pain%22%5BJournal%5D)">EXPRESS: NGF-trkA signaling modulates the analgesic effects of prostatic acid phosphatase in resiniferatoxin-induced neuropathy.</a> Mol Pain. 12, (2016).</li>
<li>Hsiao, T. H., Fu, Y. S., Ho, W. Y., Chen, T. H., Hsieh, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promotion+of+thermal+analgesia+and+neuropeptidergic+skin+reinnervation+by+4-methylcatechol+in+resiniferatoxin-induced+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Kaohsiung+J+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Promotion of thermal analgesia and neuropeptidergic skin reinnervation by 4-methylcatechol in resiniferatoxin-induced neuropathy.</a> Kaohsiung J Med Sci. 29 (8), 405-411 (2013).</li>
<li>Chao, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+neuropathic+pain+in+type+2+diabetes%3A+skin+denervation+and+contact+heat-evoked+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of neuropathic pain in type 2 diabetes: skin denervation and contact heat-evoked potentials.</a> Diabetes Care. 33 (12), 2654-2659 (2010).</li>
<li>Kim, S. H., Chung, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+model+for+peripheral+neuropathy+produced+by+segmental+spinal+nerve+ligation+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">An experimental model for peripheral neuropathy produced by segmental spinal nerve ligation in the rat.</a> Pain. 50 (3), 355-363 (1992).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Skuteczna terapia neuropatii drobnowłókien w klinice jest niezbędna do promowania powrotu do sprawności funkcjonalnej i jakości życia pacjentów. Obecnie brakuje przewodnika terapeutycznego ukierunkowanego na zaburzenia czucia związane z neuropatią małych włókien ze względu na brak kompleksowego zrozumienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw uszkodzenia neuronów o małej średnicy. Poprzednie modele neuropatii zwykle dotyczyły zarówno nerwów czuciowych o dużej, jak i małej średnicy; Na przykład modele neuropatii i...

Neuropatia małych włókien obejmująca ból neuropatyczny, która objawia się zwyrodnieniem IENF, jest powszechna w różnych typach schorzeń, takich jak cukrzyca, oraz w wyniku neurotoksycznego działania środków chemioterapeutycznych1,2,3,4,5. IENF są obwodowymi zakończeniami neuronów o małej średnicy zlokalizowanych w zwojach korzenia grzbietowego (DRG) i są dotknięte równolegle w przypadkach zwyrodnienia IENF6. Na przykład, zmieniona transkrypcja genetyczna somatów neuronalnych została wykazana przez regulację w górę aktywującego czynnika transkrypcyjnego-3 (ATF3)6,7. Ponadto ocena unerwienia IENFs za pomocą biopsji skóry jest przydatna w diagnostyce neuropatii drobnowłókien 5,8,9. Tradycyjnie, profile IENF w biopsji skóry zależały od immunohistochemicznej demonstracji produktu genu białka 9.5 (PGP 9.5)1,10,11. Podsumowując, profile patologiczne DRG i IENF odzwierciedlają stan funkcjonalny leżący u podstaw neuropatii małych włókien i mogą być wskaźnikiem funkcjonalnych konsekwencji tego typu neuropatii dla neuronów o małej średnicy.
Poprzednio, kilka modeli eksperymentalnych zajmowało się kwestią zwyrodnienia IENF w przypadkach neuropatii wywołanej chemioterapią12,13 oraz uszkodzenia nerwu spowodowanego uciskiem lub przecięciem14,15,16. Te eksperymentalne modele dotyczyły również nerwów o dużej średnicy; Nie można było zatem wykluczyć udziału dotkniętych nerwów o dużej średnicy w obserwowanej neuropatii małych włókien; Na przykład badanie zaburzenia czucia termicznego przez szkodliwe odstawienie zależy od funkcjonalnych włókien nerwowych ruchowych17,18,19. W związku z tym konieczne i konieczne jest ustanowienie czystego modelu neuropatii małych włókien i systematyczne badanie stanu patologicznego zarówno somatów neuronalnych, jak i ich obwodowych włókien nerwowych skórnych w neuronach o małej średnicy.
RTX jest analogiem kapsaicyny i silnym agonistą receptora waniloidowego 1 (TRPV1) o potencjale przejściowym, który pośredniczy w przetwarzaniu nocyceptywnym20,21,22. Ostatnio leczenie obwodowym RTX złagodziło ból neurogenny23,24,25, a wstrzyknięcie do zwoju RTX wywołało nieodwracalną utratę neuronów DRG22. Efekt podania peryferyjnego RTX jest zależny od dawki20,26,27, co skutkowało przejściowym odczulaniem lub zwyrodnieniem IENFs. Co ciekawe, systematyczne leczenie wysokimi dawkami RTX doprowadziło do bólu neuropatycznego28, objawu neuropatii małych włókien. Odkrycia te sugerują, że tryb leczenia i dawka RTX wywołują wyraźne patologiczne efekty i odpowiedzi neuronalne; Mianowicie, podawanie obwodowe zapobiegało przenoszeniu bólu przez efekty miejscowe<klasa SUP = "xref">29 i wpływało na somaty neuronalne, które rozwinęły zachowania neuropatyczne<klasa SUP="xref">6. Podsumowując, odkrycia te wskazują, że RTX ma efekt multipotencji i pojawiły się pytania, czy istnieje określona dawka RTX, która może systematycznie wpływać na nerwy obwodowe, takie jak obwodowe IENF i centralne somaty neuronalne. Jeśli tak, RTX może być potencjalnym środkiem, który specyficznie wpływa na neurony o małej średnicy i naśladuje neuropatię małych włókien w klinice. Na przykład cukrzyca w klinice jest skomplikowanym zagadnieniem, obejmującym zaburzenie metaboliczne i neuropatologię nerwów obwodowych, które są głównymi cechami neuropatii drobnowłóknistej. Mechanizmy neuropatii drobnowłókien związanej z DM nie mogą wykluczyć udziału zaburzenia metabolicznego, które może nie być głównym czynnikiem wpływającym na nerwy obwodowe. Dlatego neuropatia małych włókien związana z DM wymaga czysto zwierzęcego modelu, który może wykluczyć skutki systematycznego zaburzenia metabolicznego. Protokół ten opisuje dawkę roboczą RTX w celu opracowania typowego modelu neuropatii małych włókien, w tym zwyrodnienia IENF i uszkodzenia neuronów o małej średnicy, jak wykazano za pomocą zmodyfikowanej analizy barwienia immunologicznego.

<table><tbody><tr><td>Odczynnik chemiczny</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Resiniferatoxin</td><td>Sigma</td><td>R8756</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>3,3'-diaminobenzydyna</td><td>Sigma</td><td>D8001</td><td></td></tr><tr><td>kompleks awidyna-biotyna</td><td>Wektor</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</strong</td><td>>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Primary Antissurà</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peripherin</td><td>Chemicon</td><td>MAB-1527</td><td></td></tr><tr><td>ATF3</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-188</td><td></td></tr><tr><td>PGP9.5</td><td>UltraClone</td><td>RA95101</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Wtórna surowica antysurowcowa</silna></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>biotynylowana koza anty-królicza IgG</td><td>Vector</td><td>BA-1000</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red-sprzężona koza anty-mysz</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-075-146</td><td></td></tr><tr><td>Izotiocyjanian (FITC)-sprzężony z osłem anty-królik</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-095-152</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płyta grzewcza</td><td>IITC</td><td>Model 39</td><td></td></tr><tr><td>von Frey filament</td><td>Somedic Sales AB</td><td>10-600-0001</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Materiał</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shandon cover</td><td>Thermo 72110017</td><td></td><td></td></tr><tr><td>naukowy Stojak przesuwny</td><td>Thermo scientific</td><td>73310017</td><td></td></tr></tbody></table>

ustalenie mysiego modelu czystej neuropatii drobnowłóknistej z ultrasilnym agonistą przejściowego potencjału receptora waniloidowego typu 1

Establishing a Mouse Model of a Pure Small Fiber Neuropathy with the Ultrapotent Agonist of Transient Receptor Potential Vanilloid Type 1

Pacjenci z cukrzycą (DM) lub doświadczający neurotoksycznych efektów chemioterapeutyków mogą rozwinąć zaburzenia czucia z powodu zwyrodnienia i uszkodzenia neuronów czuciowych o małej średnicy, określane jako neuropatia małych włókien. Obecne modele zwierzęce neuropatii małych włókien wpływają zarówno na włókna czuciowe o dużej, jak i małej średnicy, a tym samym tworzą neuropatologię zbyt złożoną, aby prawidłowo ocenić skutki uszkodzonych włókien czuciowych o małej średnicy. Dlatego konieczne jest opracowanie eksperymentalnego modelu czystej neuropatii małych włókien, aby odpowiednio zbadać te kwestie. Protokół ten opisuje eksperymentalny model neuropatii małych włókien specyficznie wpływającej na nerwy czuciowe o małej średnicy z resyferatoksyną (RTX), ultrasilnym agonistą przejściowego potencjału receptora waniloidowego typu 1 (TRPV1), poprzez pojedynczą dawkę wstrzyknięcia dootrzewnowego, określaną jako neuropatia RTX. Ta neuropatia RTX wykazała patologiczne objawy i nieprawidłowości behawioralne, które naśladują charakterystykę kliniczną pacjentów z neuropatią małych włókien, w tym zwyrodnienie śródnaskórkowych włókien nerwowych (IENF), w szczególności uszkodzenie neuronów o małej średnicy oraz indukcję hipoalgezji termicznej i allodynii mechanicznej. W protokole tym przetestowano trzy dawki RTX (odpowiednio 200, 50 i 10 μg/kg) i stwierdzono, że krytyczna dawka RTX (50 μg/kg) jest wymagana do rozwoju typowych objawów neuropatii drobnowłóknistej i przygotowano zmodyfikowaną procedurę barwienia immunologicznego w celu zbadania zwyrodnienia IENF i uszkodzenia somy neuronalnej. Zmodyfikowana procedura jest szybka, systematyczna i ekonomiczna. Behawioralna ocena bólu neuropatycznego ma kluczowe znaczenie dla ujawnienia funkcji nerwów czuciowych o małej średnicy. Ocena progów mechanicznych u gryzoni doświadczalnych jest szczególnie trudna, a w niniejszym protokole opisano niestandardową siatkę metalową, która nadaje się do tego typu oceny u gryzoni. Podsumowując, neuropatia RTX jest nowym i łatwym do ustalenia modelem eksperymentalnym do oceny molekularnego znaczenia i interwencji leżącej u podstaw bólu neuropatycznego w celu opracowania środków terapeutycznych.

Niniejszy protokół opisuje nowy model neuropatii RTX u myszy, który specyficznie wpływa na neurony o małej średnicy, w tym powoduje degenerację IENF, co wiąże się z zaburzeniami sensorycznymi (Rycina 2). Po zastosowaniu opisanego tutaj protokołu u zwierząt stwierdzono hipoalgezję termiczną i allodynię mechaniczną w 7. dniu (D7) po wstrzyknięciu RTX. W celu opracowania tego modelu neuropatii małych włókien podano trzy dawki RTX: 200, 50 i 10 µg/kg drogą d.o. (...

To badanie ustanawia eksperymentalny model czystej neuropatii małych włókien z resiniferatoksyną (RTX). Unikalna dawka RTX (50 μg/kg) jest optymalna do opracowania modelu neuropatii małowłóknistych, który naśladuje charakterystykę pacjenta i może pomóc w zbadaniu nocyceptywnego znaczenia molekularnego leżącego u podstaw bólu neuropatycznego.

Ustalenie mysiego modelu czystej neuropatii drobnowłóknistej z ultrasilnym agonistą przejściowego potencjału receptora waniloidowego typu 1

Patients with diabetes mellitus (DM) or those experiencing the neurotoxic effects of chemotherapeutic agents may develop sensation disorders due to ...

Ogólnym celem tej specyficznej sensorycznie procedury dostarczania neurotoksyn myszom jest ustanowienie modelu neuropatii czuciowej u małych zwierząt. Technika ta pomaga ujawnić prawa urazów małych, czuciowych włókien w neuropatii czuciowej. Jego główną zaletą jest to, że jest szybki i łatwy.Myszy te mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuropatyki czuciowej, takie jak to, jaki szlak ma kluczowe znaczenie dla dużych włókien czuciowych. Na początek załóż środki ochrony osobistej i podejmij odpowiednie środki ostrożności podczas przygotowywania roztworu podstawowego Resiniferatoxin lub RTX. Rozcieńczyć jedną porcję 600 mikrolitrów w soli fizjologicznej na potrzeby eksperymentu, a resztę podzielić na 12 mikrolitrów podwielokrotności do przechowywania.W przypadku myszy testowych należy użyć ośmiotygodniowych, dorosłych samców myszy ICR o wadze od 35 do 40 gramów. Pojedynczą dawkę roztworu RTX należy podać dootrzewnowo za pomocą strzykawki do mikroiniekcji. Następnie wstrzyknij drugiej grupie myszy równą objętość nośnika, aby służyła jako kontrola.Po wykonaniu wszystkich wstrzyknięć umieść myszy w ich domowych klatkach i upewnij się, że mają dostęp do jedzenia i wody. Po siedmiu dniach zacznij przeprowadzać testy behawioralne raz w tygodniu. Wykonaj oba testy tego samego dnia w cichym pomieszczeniu testowym, w stabilnym środowisku.Zacznij od zmierzenia opóźnień termicznych zwierząt za pomocą testu płyty grzejnej. Ustaw metalową płytę grzejną na 52 stopnie Celsjusza. Następnie delikatnie umieść zwierzę w przezroczystej klatce z pleksi na gorącej płycie.Uruchom minutnik, gdy tylko tylne łapy zwierzęcia dotkną gorącej klatki. Jeśli zwierzę zacznie się trząść, lizać tylne łapy lub skakać, usuń je i zapisz, jak długo wytrzymało płytę grzewczą z dokładnością do dziesiątej części sekundy. Jeśli zwierzę nie wykazuje żadnej reakcji na płycie grzejnej, przerwij sesję po 25 sekundach, aby uniknąć potencjalnego uszkodzenia tkanek.Wykonaj trzy próby na zwierzę, z 30-minutowym odpoczynkiem między próbami. Później użyj średniego czasu z trzech testów jako ostatecznego wyniku zwierzęcia. Następnie zmierz próg czucia mechanicznego zwierzęcia.Umieść zwierzę w przezroczystej, okrągłej klatce z metalową siatką na podłogę. Po aklimatyzacji nałóż różne kalibry włókien włosów von Freya na obszar podeszwowy tylnej łapy, stosując metodę góra-dół. Do pierwszej stymulacji przyłóż filament o średniej sile przez 5 do 8 sekund.Po każdej stymulacji odczekaj dwie minuty, a następnie zastosuj kolejną siłę w oparciu o poprzednią reakcję zwierzęcia. Jeśli tylna łapa się wycofała, użyj następnego filamentu niższego kalibru. A jeśli tylna łapa się nie wycofała, użyj następnego większego włókna.Kontynuuj ten proces, aż mysz zostanie szturchnięta sześć razy. Następnie oblicz próg mechaniczny przy użyciu ustalonego wzoru. W każdym dniu testowym wykonaj trzy próby na każdej tylnej łapie.Średnią z tych sześciu progów mechanicznych należy wyrazić jako średni próg mechaniczny każdego zwierzęcia. Do eutanazji należy użyć 5% izofluranu, a następnie perfuzji dosercowej. Następnie usuń pierwsze opuszki stóp z dwóch tylnych łap i przymocuj je do 4% PFA na sześć godzin.Po utrwaleniu przenieś je do 0,1 molowego buforu fosforanowego o temperaturze 4 stopni Celsjusza. Służy to jako rozwiązanie do długoterminowego przechowywania. Przed kriosekcją namocz opuszki stóp w 30% sacharozie w PBS przez noc.Następnego dnia za pomocą kriostatu wykonaj 30-mikronowe plastry tkanki przycięte pionowo do powierzchni podeszwy. Oznacz sekcje podkładki pod stopy sekwencyjnie, a następnie przechowuj je w roztworze zapobiegającym feeze w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Podczas pobierania próbek sekcji wybierz co trzecią sekcję i przenieś ją na szkiełko powlekane w celu wyschnięcia na powietrzu.Następnie przykryj każdą stronę płytką osłonową i przetrzyj je standardową procedurą barwienia immunologicznego. Najpierw ugasić sekcje podnóżka 1% nadtlenkiem wodoru w metanolu przez 30 minut. Następnie umyj chusteczki trzykrotnie przy użyciu 0,5 molowego buforu Tris o temperaturze pokojowej.Następnie inkubuj tkanki w roztworze blokowym przez godzinę. Następnie inkubuj skrawki z surowicą anty-surowicą przeciwko markerowi pan-aksonalnemu przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnego dnia przemyj skrawki trzykrotnie buforem Tris, a następnie inkubuj skrawki w biotynylowanej anty-króliczej IgG w temperaturze pokojowej przez godzinę.Później użyj trzech płukań buforem Tris, aby usunąć niezwiązane przeciwciała. Następnie inkubuj tkanki z kompleksem biotyny awidyny w temperaturze pokojowej przez 45 minut. Aby zabarwić produkt reakcji, nałóż na krótko roztwór DAB na 45 sekund, a następnie umyj sekcje podkładki pod stopy wodą destylowaną i wysusz je na powietrzu przed montażem.Po usunięciu opuszków stóp od zwierzęcia poddanego eutanazji należy przeprowadzić sekcję czwartego i piątego DRG odcinka lędźwiowego. Następnie utrwal wypreparowane tkanki DRG przez dwie godziny w czterech procentach PFA w temperaturze pokojowej. Następnie krioprotekcjonij tkanki DRG za pomocą 30% sacharozy w PBS przez noc.Następnego dnia pokrój je na sekcje o grubości ośmiu mikronów. Umieść je na slajdach i oznacz etykietami. Przechowuj te sekcje w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Użyj tej samej metody, która jest używana w przypadku sekcji opuszki stopy, z wyjątkiem etykietowania, włącz ATF-3, marker urazu, i peryferynę, marker neuronalny o małej średnicy w pierwotnej surowicy anty-ssurowicowej i przeprowadź tę reakcję przez noc. Po umyciu skrawków należy je inkubować z odpowiednią wtórną surowicą odpornościową. Następnie, po kolejnej serii prań, zamontuj sekcje w celu określenia ilościowego.Protokół ten opisuje nowy mysi model neuropatii resiniferatoksyny, która w szczególności wpływa na neurony o małej średnicy, w tym zwyrodnienie IENF związane z zaburzeniami czuciowymi. Dawka 50 mikrogramów na kilogram została uznana za krytyczną, a wyższa dawka była często śmiertelna. Siedem dni po wstrzyknięciu RTX zwierzęta wykazywały hipoalgezję termiczną i allodynię mechaniczną.Przy dawce krytycznej doszło do zwyrodnienia IENF i wyraźnej indukcji ATF-3. Uszkodzone neurony były neuronami peryferynowo-dodatnimi o małej średnicy. Natomiast niska dawka RTX nie powodowała powstania neuropatii małych włókien i nie wykazywała zmian w unerwieniu.Niska dawka nie wykazała również żadnej indukcji ATF-3, markera uszkodzenia neuronów. W związku z tym do zastosowania opisanej metody sugeruje się dawkę krytyczną 50 mikrogramów RTX na kilogram. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ustalić czysty model neuropatii czuciowej.Po opracowaniu, technika ta utorowała drogę do badań w dziedzinie małej neuropatii czuciowej, do jej produktu wkładu uszkodzenia małych nerwów czuciowych, w rozwój bólu neuropatycznego. Nie zapominaj, że RTX jest neurotoksyczny i niebezpieczny i może działać drażniąco na oczy, błony śluzowe, górne drogi oddechowe. Unikaj inhalacji i noś okulary laboratoryjne i fartuch podczas obsługi RTX.Spłukać dużą ilością wody w przypadku kontaktu ze skórą i po użyciu.

establishing-mouse-model-pure-small-fiber-neuropathy-with-ultrapotent

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten film demonstruje testowanie funkcji nerwu czuciowego w modelu mysim poprzez chirurgiczne odnerwienie jednej strony i pozostawienie drugiej jako kontroli. Reakcja na stymulację mechaniczną potwierdza rolę nerwów czuciowych.

Testowanie funkcji nerwów czuciowych w chirurgicznie odnerwionym modelu myszy

Ten film demonstruje metodę tworzenia modelu neuropatii małych włókien u myszy przy użyciu agonisty TRPV1 resiniferatoksyny (RTX). Przedstawiono w nim etapy związane z podawaniem RTX myszom i wyjaśniono, w jaki sposób RTX indukuje śmierć neuronów w neuronach czuciowych o małej średnicy, ustanawiając w ten sposób model neuropatii.

Ustalenie mysiego modelu neuropatii małych włókien przy użyciu resiniferatoksyny

Ból neuropatyczny jest konsekwencją uszkodzenia lub choroby wpływającej na układ somatosensoryczny. "Model mankietowy" bólu neuropatycznego u myszy polega na wszczepieniu mankietu polietylenowego wokół głównej gałęzi nerwu kulszowego. Mechaniczna allodynia jest testowana przy użyciu filamentów von Freya.

Model kajdanki nerwu kulszowego bólu neuropatycznego u myszy

Ten raport przedstawia proste podejście do skutecznego wywołania eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia nerwu (EAN) przy użyciu peptydu białka mieliny zero (P0)180-199 w połączeniu z kompletnym adiuwantem Freunda i toksyną krztuścową. Przedstawiamy wyrafinowany paradygmat zdolny do dokładnej oceny zakresu deficytów funkcjonalnych i neuropatologii, które występują w tym EAN.

Proste podejście do indukcji eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia nerwu u myszy C57BL/6 w celu oceny funkcjonalnej i neuropatologicznej

Pomiar przewodnictwa nerwowego jest użytecznym narzędziem do oceny mysich modeli neurodegeneracji, ale często jest stosowany tylko do stymulacji nerwu kulszowego w kończynach tylnych. W tym miejscu opisujemy technikę pomiaru złożonego potencjału czynnościowego mięśni (CMAP) in vivo w mięśniach kończyn przednich myszy unerwionych przez splot ramienny.

In vivo (in vivo) Elektrofizjologiczny pomiar złożonego potencjału czynnościowego mięśni z kończyn przednich w mysich modelach zwyrodnienia neuronów ruchowych

Celem tej techniki jest przygotowanie wysoce wzbogaconej kultury pierwotnych neuronów ruchowych (MN) z mysiego rdzenia kręgowego. Aby ocenić konsekwencje mutacji powodujących choroby MN, opisujemy tutaj izolację tych izolowanych MN i ich transfekcję przez magnetofekcję.

Modelowanie choroby Charcota-Marie-Tootha in vitro poprzez transfekcję pierwotnych neuronów ruchowych myszy

Model inokulacji opuszki stopy jest cennym narzędziem do charakteryzowania indukowanych przez wirusy reakcji neurozapalnych in vivo. W szczególności zapewnia jasną ocenę kinetyki wirusa i związanych z nią procesów immunopatologicznych inicjowanych w obwodowym układzie nerwowym.

Model inokulacji opuszki stopy myszy do badania reakcji neurozapalnych wywołanych wirusem

Zmodyfikowana operacja to uproszczona metoda dla modelu uszkodzenia nerwu oszczędzonego u myszy lub szczura, która wymaga tylko jednego podwiązania i jednego cięcia, aby uszkodzić zarówno wspólne nerwy strzałkowe, jak i łydkowe.

Zmodyfikowany model chirurgii oszczędzonego uszkodzenia nerwu bólu neuropatycznego u myszy

Częściowe podwiązanie nerwu kulszowego wywołuje długotrwały przewlekły ból neuropatyczny, charakteryzujący się przesadnymi reakcjami na bodźce termiczne i mechaniczne. Ten mysi model bólu neuropatycznego jest powszechnie stosowany do badania innowacyjnych terapii leczenia bólu. W tym artykule szczegółowo opisano procedurę chirurgiczną w celu poprawy standaryzacji i odtwarzalności.

Częściowe podwiązanie nerwu kulszowego: mysi model przewlekłego bólu neuropatycznego w celu zbadania antynocyceptywnego działania nowych terapii

Przewlekłe uszkodzenie zwężenia dystalnego nerwu podoczodołowego u myszy wywołuje zmiany w spontanicznym zachowaniu (zwiększona aktywność pielęgnacji twarzy) i zachowaniu nocyfensyjnym w odpowiedzi na stymulację dotykową (nadreaktywność na stymulację włosów von Freya), które są oznakami trwającego bólu i allodynii oraz służy jako model dla trójdzielnego bólu neuropatycznego.

Przewlekłe uszkodzenie zwężenia dystalnego nerwu podoczodołowego (DIoN-CCI) u myszy w celu zbadania bólu neuropatycznego nerwu trójdzielnego

Protokół ten przedstawia powtarzalny model szczura wykorzystujący nerwy czuciowe do naśladowania bólu neuromimy u człowieka oraz oceny zabiegów chirurgicznych, oferując cenne narzędzie do badań nad neuromią translacyjną.

Nowy chirurgiczny model gryzonia do badania opcji leczenia bólu nerwiaka z wykorzystaniem ukierunkowanej renerwacji mięśni przez nerw odpiszczelowy

Odkryj model czystej neuropatii drobnowłóknistej u myszy z użyciem resiniferatoksyny RTX. Metoda obejmuje dożylne podanie 50 µg/kg i ocenę behawioralną, umożliwiając badanie mechanizmów bólu neuropatycznego oraz degeneracji włókien nerwowych.

Ustalenie mysiego modelu czystej neuropatii drobnowłóknistej z ultrasilnym agonistą przejściowego potencjału receptora waniloidowego typu 1 (Wideo) | JoVE Journal

Ustalenie mysiego modelu czystej neuropatii drobnowłóknistej z ultrasilnym agonistą przejściowego potencjału receptora waniloidowego typu 1

Przeglądaj więcej filmów