Name: Synteza i analiza oligo-peptoidów za pomocą spektrometrii mas (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Poznaj metodę ręcznej syntezy oligo-peptydów i analizy sekwencji monomerów za pomocą spektrometrii mas. Technika ta umożliwia początkującym badaczom charakterystykę strukturalną peptydów w standardowym laboratorium analitycznym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować panu Michaelowi Connolly'emu oraz dr. Ronaldowi Zuckermannowi (The Molecular Foundry, Lawrence Berkeley National Laboratory) za wsparcie techniczne w syntezie peptoidów. Dziękujemy wsparciu ze strony National Science Foundation (CHE-1301505). Wszystkie eksperymenty ze spektrometrią mas przeprowadzono w Chemistry Mass Spectrometry Facility na University of the Pacific.

1. Synteza Peptoid
UWAGA: Synteza rozpoczyna się od aktywacji żywicy poprzez jej pęcznienie i usunięcie grupy ochronnej. Następnie następuje wzrost łańcucha peptoidowego na żywicy, powtarzając się cykle dodawania monomerów. Pierwszym monomerem sprzężonym z żywicą jest reszta C-końcowa. Peptoid jest wydłużony od końca C do końca północnego. Po osiągnięciu pożądanej sekwencji peptoid żywica jest odcinana, a produkt peptoid oczyszczany.
<ol>
	<li>Przygotowanie odczynników UWAGA: Odczynniki ciekłe mierzone są mikropipetą, a odczynniki stałe mierzone są wagą analityczną.<ol>
		<li>Wymieszaj 6,2 mL N, N'-diizopropylkarbodiamidu (DIC) oraz 43,8 mL N,N-dimetyloformamidu (DMF), aby przygotować 0,8 M roztworu DIC/DMF.</li>
		<li>Rozpuścić 5,56 g BMA w 50,0 mL DMF, aby przygotować roztwór bma/dmf o stężeniu 0,8 m.</li>
		<li>Wymieszaj 2 mL piperydyny (Pip) i 8 mL DMF, aby uzyskać 20% roztwór Pip/DMF.</li>
		<li>Rozpuszcz 1,9 mL Npe w 13,1 mL DMF, aby uzyskać 1,0 M Npe/DMF.</li>
		<li>Rozpuszcz 1,3 mL Nme w 13,7 mL DMF, aby uzyskać 1,0 M Nme/DMF.</li>
		<li>Rozpuszcz 0,32 mL Nae w 2 mL DMF, aby uzyskać 1,0 M Nae/DMF. Uwaga: Większość chemikaliów używanych w syntezie jest niebezpieczna. Kwas trifluoroctowy (TFA), DIC, Pip i BMA są szkodliwe dla skóry, oczu i dróg oddechowych. DMF i dichlorometan (DCM) są podejrzewane o czynnikach rakotwórczych. Wszystkie reakcje powinny być przeprowadzane w okapie i stosować odpowiednie środki ochrony osobistej. Prosimy o sprawdzenie karty bezpieczeństwa materiału (MSDS) wszystkich chemikaliów używanych w syntezie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aktywacja żywicą
	<ol>
		<li>Odmierz 84 mg żywicy amidowej Rink (żywica, 0,047 mmol, ładowanie 0,56 mmol/g) i dodaj ją do zbiornika reakcyjnego z polipropylenu o pojemności 10 mL w fazie reakcyjnej stałej. Włóż tłok do naczynia.</li>
		<li>Dodaj 2 mL DMF do zbiornika reakcyjnego i zakryj naczynie zakrętką ciśnieniową. Umieść naczynie na wstrząsance i mieszaj naczynie w temperaturze pokojowej pod kątem ruchu około 12 stopni i 385 oscylacji/min przez 30 minut. Spuszczaj roztwór do pojemnika odpadów, zdejmując korek i naciskając tłok naczynia reakcyjnego.</li>
		<li>Dodaj 2 mL roztworu 20% Pip/DMF do naczynia i zakręć go. Mieszaj go na shakerze przez 2 minuty i odlej roztwór do pojemnika na odpady.</li>
		<li>Dodaj 2 mL roztworu 20% Pip/DMF do naczynia, zakryj naczynie i mieszaj w temperaturze pokojowej przez 12 minut. Zdejmij korek i spuść roztwór do pojemnika na odpady.</li>
		<li>Przemyj żywicę, dodając 1 ml DMF, zakręcając naczynie i mieszając naczynie przez 1 minutę. Zdejmij korek i odlej roztwór, naciskając tłok. Myj żywicę DMF jeszcze 4 razy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodawanie monomerów i acetylacja N-końcowa UWAGA: Każdy cykl dodawania monomerów obejmuje dwa etapy reakcji: bromoacetylację i przemieszczenie.<ol>
		<li>Przeprowadzić pierwszy cykl dodawania monomerów, aby utworzyć żywicę Nme.</li>
		<li>Wykonaj reakcję bromoacetylacji. Wymieszaj 1 mL roztworu 0,8 M BMA/DMF i 1 mL roztworu 0,8 M DIC/DMF w zlewce. Przelej mieszaninę do naczynia reakcyjnego zawierającego żywicę i zatkaj naczynie. Umieść naczynie na shakerze i mieszaj w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Zdejmij korek i spuść roztwór do pojemnika na odpady.</li>
		<li>Umyj żywicę, dodając 1 ml DMF, zakręcając naczynie, mieszając przez 1 minutę i odpuszczając roztwór przez naciskanie tłoka. Przemyj żywicę, dodając 1 ml DCM, mieszając naczynie przez 1 minutę i odpuszczając roztwór. Umyj żywicę jeszcze raz DCM, a potem dwa razy DMF.</li>
		<li>Wykonaj reakcję przemieszczenia. Dodaj 1 mL roztworu 1,0 M Nme/DMF, zakręć naczynie, mieszaj naczynie w temperaturze pokojowej przez 60 minut. Zdejmij korek i odlej roztwór, naciskając tłok.</li>
		<li>Przemyj żywicę, dodając 1 mL DMF, mieszając naczynie przez 1 minutę i odpuszczając roztwór, naciskając tłok. Przemyj żywicę, wlewając 1 mL DCM, mieszając przez 1 minutę i odpuszczając roztwór. Jeszcze raz myj DCM, a następnie myj DMF dwa razy.</li>
		<li>Powtarzaj cykle dodawania monomerów od kroków 1.3.2 do 1.3.5, aby utworzyć żywicę Nae-(Npe-Nme)4-resin. Powtarzając krok reakcji przemieszczenia (1.3.4), należy użyć specyficznego roztworu aminowego zgodnie z sekwencją peptoid. UWAGA: Łańcuch peptoidowy jest wydłużony od końca C do końca N, a reszta końcowa C jest związana z żywicą.</li>
		<li>Przeprowadz acetylację N-końcową, tworząc żywicę Ac-Nae-(Npe-Nme)4-.</li>
		<li>Wymieszaj 92 μL bezwodnika octowego, 43,5 μL N,N-diizopropyletylaminy (DIPEA) oraz 2 mL DMF w zlewce, aby uzyskać około 2 mL koktajlu acetylacyjnego.</li>
		<li>Dodaj 2 mL koktajlu acetylacyjnego do naczynia zawierającego żywicę, zatkaj naczynie i mieszaj w temperaturze pokojowej przez 60 minut. Zdejmij korek i odlej roztwór, naciskając tłok.</li>
		<li>Przemyj żywicę, dodając 1 ml DMF, mieszając naczynie przez 1 minutę i odpuszczając roztwór, naciskając tłok. Przemyj żywicę, dodając 1 ml DCM, mieszając naczynie przez 1 minutę i odpuszczając roztwór. Powtórz mycie żywicę DCM jeszcze raz, a potem myj DMF jeszcze dwa razy.</li>
		<li>Przemyj żywicę, dodając 1 ml DCM, mieszając naczynie przez 1 minutę i odpuszczając roztwór przez naciskanie tłoka. Powtarzaj pranie z DCM dwa razy. Zdejmij pokrywkę i pozwól żywicy wyschnąć na powietrzu w naczyniu reakcyjnym przez 10 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozszczepienie i oczyszczenie
	<ol>
		<li>Wymieszaj 3,8 mL TFA, 100 μL triizopropylsilanu (TIPS) oraz 100 μLH2Oklasy HPLC w zlewce, aby uzyskać 4 mL koktajlu rozszczepienia.</li>
		<li>Dodaj 4 mL świeżo przygotowanego koktajlu do naczynia zawierającego żywicę, zakręć naczynie i mieszaj w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.</li>
		<li>Zdejmij korek i zbierz roztwór filtratyczny do rurki wirówki polipropylenowej o pojemności 50 mL. Dodaj 1 mL TFA do naczynia, zakręć i mieszaj przez 1 minutę. Zbierz roztwór filtraty do tej samej rurki wirówki.</li>
		<li>Odparuj TFA, delikatnie wdmuchując strumień azotu, aż pozostanie około 1 ml lepkiego roztworu.</li>
		<li>Dodaj 15 ml eteru dietylowego do pozostałego roztworu, zatkaj rurkę wirówki i inkubuj w zamrażarce o temperaturze -20 °C przez 2 godziny aż do nocy. Prymitywny peptoid wytrąca się jako biały brył.</li>
		<li>Granuluj ciało stałe w wirówce o pojemności 4 427 x g przez 10 minut. Usuń nakrętkę rurki wirówki i ostrożnie przelać eter dietylowy do zlewki, nie tracąc przy tym ciała stałego. Uwaga: Eter dietylowy jest łatwopalnym rozpuszczalnikiem organicznym. Proszę używać wirówki bezpiecznej dla eteru dietylu.</li>
		<li>Przemyj ciało stałe, dodając 10 ml lodowatego eteru dietylowego do rurki wirówki zawierającej ciało stałe, zatkać rurkę i umieścić ją w wirówce. Wirowanie przeprowadź w ilości 4 427 x g przez 10 minut. Wyjmij rurkę wirówki z wirówki i ostrożnie przelej eter dietylowy do zlewki, nie tracąc przy tym ciała stałego.</li>
		<li>Susz ciało stałe, delikatnie dmuchając strumień azotu.</li>
		<li>Dodaj 10 ml H2Oklasy HPLC, aby rozpuścić wysuszony materiał stały. Przepuszcz roztwór przez nylonowy filtr strzykawkowy o porach 0,45 μm i zbieraj filtrat do wcześniej obciążonej rurki polipropylenowej wirówki o pojemności 50 mL.</li>
		<li>Shell zamraża roztwór, umieszczając i obracając rurkę wirówki zawierającą roztwór peptoid w kubku z 12-uncjowego, podwójnie ułożonym w warstwie z ekspandowanego polistyrenu, wypełnionym 1/3 ciekłym azotem. Liofilizuj zamrożony roztwór przez noc, aby uzyskać stały peptoid.</li>
		<li>Powtarzaj liofilizację jeszcze raz, rozpuszczając stały peptoid w 10 mL HPLC-grade H2O, zamrażając skorupę w ciekłym azocie i liofilizując przez noc. Powstały peptoid jest wystarczająco czysty do analizy sekwencji za pomocą spektrometrii masowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Pomiary MS i analiza sekwencji
UWAGA: Eksperyment MS/MS prowadzony jest w spektrometrze masowym trójkwadrupolowym sprzężonym ze źródłem jonizacji elektrospray (ESI). Zbieranie danych jest kontrolowane za pomocą oprogramowania do akwizycji danych dołączonego do instrumentu. Ogólna procedura obejmuje 1) przeprowadzenie pełnego eksperymentu spektrometrii mas i rejestrację spektrum mas, 2) wykonanie eksperymentu CID MS/MS oraz rejestrację widma MS/MS oraz 3) porównanie danych spektralnych MS/MS z teoretycznym schematem fragmentacji przewidzianym na podstawie cech strukturalnych peptoida.
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworu próbki
	<ol>
		<li>Odważ 1,0 - 2,0 mg peptoidu stałego w szklanej fiolce 3-5 mL. Dodaj 1 mL rozpuszczalnika acetonitrylu i wody (ACN/H2O, 1:1, v/v), aby rozpuścić peptoid. Daje to roztwór próbki podstawowej o stężeniu około 10-3 M.</li>
		<li>Przelej 20 μL roztworu zapasowego do rurki wirówki o pojemności 1,5 mL i dodaj 1 mL rozpuszczalnika mieszanego ACN/H2O, aby uzyskać rozcieńczony roztwór próbki o pojemności około 10-5 M.</li>
		<li>Usuń wszelkie możliwe nierozpuszczalne cząstki z rozcieńczonego roztworu próbki, wirując w 4 427 x g przez 3 minuty. Przelej około 700 μL górnej części roztworu do innej rurki wirówki o pojemności 1,5 mL, aby uzyskać roztwór roboczy peptoid MS o stężeniu około 10-5 M.</li>
		<li>Dostosuj stężenie roztworu roboczego MS na podstawie obserwowanej intensywności sygnału podczas pomiarów spektrometrią mas.</li>
		<li>Alternatywnym sposobem usunięcia ewentualnych nierozpuszczalnych cząstek z rozcieńczonego roztworu próbki jest przepuszczenie roztworu próbki przez filtr strzykawkowy o pojemności 0,20 μm i zebranie filtratu do rurki wirówki o pojemności 1,5 mL, aby uzyskać roztwór roboczy peptoid MS o pojemności około 10-5 M.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rejestracja widm mas
	<ol>
		<li>Przepuszczenie mieszanego rozpuszczalnika ACN/H2O (1:1, v/v) przez źródło jonizacji elektrospray (ESI) i ustawienie instrumentu w standardowym trybie spektrometrii mas z pełnym skanowaniem jonowym i pełnym skanowaniem w zakresie stosunku masy do ładunku (m/z) od 100 do 1500. Uwaga: Typowe parametry pracy: Napięcie igły ESI, 5 kV Napięcie kapilarne, 40 V Temperatura gazu wysychającego (azotu) wynosi 200 °C.</li>
		<li>Dodaj około 300 μL roztworu roboczego peptoid MS (około 10-5 M) do strzykawki 500 μL lub 1 mL i podłącz strzykawkę do wlotu ESI za pomocą kapilarnej rurki polieterowo-ketonowej (PEEK). Umieść strzykawkę na pompie strzykawkowej i ustaw przepływ na 10 μL/min, aby wprowadzić roztwór próbki do wlotu ESI.</li>
		<li>Włącz napięcie igły ESI, aby aktywować proces ESI, a następnie włącz detektor. Ustaw wyświetlacz w trybie profilu i zakres m/z od 100 do 1 500. Zobacz profil pasma masowego wyświetlany w oknie profilu. Szczyt m/z 1 265 (wyświetlany jako m/z 1 264,6) odpowiada jonowi peptoidu lub protonowi peptoidowi.</li>
		<li>Nagrywaj widmo MS przez 2 minuty. W "Okno Metody" użyj 2 minut jako "czasu wykonywania". Otwórz okno nagrywania, wpisz właściwą nazwę pliku i zacznij rejestrować widmo. UWAGA: Powstałe widmo mas pokazano na Rysunku 3.</li>
		<li>Optymalizuj intensywność szczytu przy m/z 1 265. Ustaw zakres m/z na 1 150 - 1 350 i dostosuj napięcie kapilarne, obserwując maksymalną intensywność w mV wyświetlaną w oknie profilu. Na przykład zwiększ napięcie kapilarne do 50 V lub więcej i obserwuj zmianę intensywności szczytowej. Optymalna maksymalna intensywność wynosi około 150–200 mV. UWAGA: Regulacja napięcia kapilarnego może znacząco zmienić ilość niektórych jonów. Zwiększenie napięcia kapilarnego może zwiększyć intensywność jonu peptoidalnego. Jednak wysokie napięcie kapilarne może również wywołać dysocjację jonu peptoidalnego w źródle jonowym i zmniejszyć obserwowaną intensywność. Regulacja temperatury gazu wysychającego może zwiększyć intensywność szczytu przy m/z 1 265, ale jest mniej skuteczna niż regulacja napięcia kapilarnego. Jeśli szczyt przy m/z 1 265 nie osiągnie optymalnej intensywności, dostosuj stężenie próbki (lub na przykład podwaj stężenie roztworu roboczego MS).</li>
		<li>Przełącz instrument na tryb MS/MS. Ustaw jon prekursora na m/z 1 265, a zakres mas MS/MS na m/z na poziomie 100 - 1 400. W "Okno Metody" użyj m/z 1 265 jako "Q1 Pierwsza Msza" i pozostaw "Q1 Ostatnia Msza" pusta. Użyj m/z 100 jako "Q3 Pierwszej Mszy" oraz m/z 1 400 jako "Q3 Ostatniej Mszy". UWAGA: W trybie MS/MS pierwsza jednostka kwadrupolowa (Q1) pełni funkcję filtra masowego izolującego jon peptoid jako jon prekursorowy, druga jednostka kwadrupolowa (Q2) to komórka kolizja, a trzecia jednostka kwadrupolowa (Q3) pełni funkcję analizatora mas.</li>
		<li>Ustaw energię zderzenia na 40 eV, a ciśnienie gazu kolizyjnego (w tym przypadku argonu) na 1,5 mTorr.</li>
		<li>Zobacz profil pasma mas wyświetlany w oknie profilu. Szczyt m/z wynoszący 1 265 odpowiada jonowi peptoid, a piki o niższych wartościach m/z reprezentują fragmenty jonu peptoidowego.</li>
		<li>Dostosuj energię kolizji, aby zoptymalizować wyświetlanie widma fragmentacji. Na przykład zwiększ energię zderzenia do 45 eV i obserwuj zmianę profilu widma. UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, zwiększenie energii kolizji zwiększa liczebność jonów fragmentów i zmniejsza obfitość jonów peptoidowych. Zwiększenie ciśnienia gazu kolizyjnego również zwiększa liczebność jonów fragmentów. Uwaga: Nie zwiększać ciśnienia gazu kolizyjnego powyżej 2 mTorr.</li>
		<li>Nagrywaj widmo MS/MS przez 2 minuty. W "Okno Metody" użyj 2 minut jako "czasu wykonywania". Otwórz okno nagrywania, wpisz właściwą nazwę pliku i zacznij rejestrować widmo.</li>
		<li>Powtórz nagranie 1-2 razy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza sekwencji Peptoid UWAGA: W warunkach CID jon peptoidowy rozpadałby się na wiązaniach amidowych wzdłuż szkieletu peptoidowego, tworząc serię fragmentów N-końcowych zwanych jonami B oraz serię fragmentów C-końcowych zwanych jonami Y<ol>
		<li>Narysuj strukturę chemiczną acetylowanego peptoidu, umieszczając N-koniec po lewej stronie, a C-koniec po prawej, i rysując przerywaną linię przy każdym wiązaniu amidowym, aby wygenerować schemat fragmentacji pokazany na Rysunku 2a. Narysuj proton z przerywanym kółkiem, aby wskazać nośnik ładunku. Zaczynając od lewej strony struktury, umieść etykiety na przerywanych liniach, aby wskazać fragmenty N-końcowe jako B1, B2 do B8. Zaczynając od prawej strony, umieść etykiety na liniach przerywanych, aby wskazać fragmenty końcowe C jako Y1, Y2 do Y8. UWAGA: Do rysowania struktury peptoid można użyć oprogramowania do rysowania chemicznego.</li>
		<li>Wyobraź sobie fragmentację na czwartym wiązaniu amidowym od lewej strony i narysuj struktury fragmentu N-końcowego oraz fragmentu C-końcowego z odpowiednimi ładunkami formalnymi, jak pokazano na Rysunku 2b. Umieść etykietę B4 na fragmencie N-terminalowym, a etykietę Y5 na fragmencie C-terminal. Oblicz wartość m/z dla B4, sumując nominalne masy elementów w strukturze, aby uzyskać wartość 580, i umieść m/z 580 na fragmencie N-końcowym. Oblicz wartość m/z Y5 i umieść m/z 685 na fragmencie C-terminal.</li>
		<li>Oblicz wartości m/z dla wszystkich ośmiu jonów B i wszystkich ośmiu jonów Y i złóż je w tabelę, jak pokazano w Tabeli 1. UWAGA: Wartości m/z fragmentów można obliczyć za pomocą oprogramowania do rysowania chemicznego.</li>
		<li>Otwórz nagrane widmo MS/MS peptoida za pomocą oprogramowania do przeglądu danych wraz z instrumentem. Ustaw preferencje etykietowania na "pokaż etykiety jonowe" i próg etykiety na 3%. Generuje to widmo MS/MS z wartościami m/z oznaczonymi na szczytach.</li>
		<li>Eksportuj dane widmowe MS/MS jako plik tekstowy w formacie CSV i odbuduj widmo za pomocą oprogramowania do przetwarzania danych. Umieść wartości m/z na szczytach. Powstałe widmo MS/MS pokazano na Rysunku 4. UWAGA: Niektóre spektrometry mas wyposażone są w oprogramowanie do przetwarzania danych zdolne do generowania widma MS/MS. W takim przypadku eksport danych widmowych MS/MS nie jest konieczny.</li>
		<li>Przypisz wartości m/z pokazane w spektrum MS/MS do tych pokazanych w Tabeli 1 , aby zidentyfikować odpowiadające mu jony B i Y. Na przykład szczyt przy m/z 580 jest identyfikowany jako B4-jon, a m/z 685 jako Y5-jon. Oznacz szczyty odpowiadającymi symbolami B i Y na widmie, jak pokazano na Rysunku 4.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Sun, J., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptoid+Polymers%3A+A+Highly+Designable+Bioinspired+Material%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Peptoid Polymers: A Highly Designable Bioinspired Material.</a> ACS Nano. 7 (6), 4715-4732 (2013).</li>
<li>Fowler, S. A., Blackwell, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+relationships+in+peptoids%3A+Recent+advances+toward+deciphering+the+structural+requirements+for+biological+function%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Biomol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Structure-function relationships in peptoids: Recent advances toward deciphering the structural requirements for biological function.</a> Org. Biomol. Chem. 7 (8), 1508-1524 (2009).</li>
<li>Chongsiriwatana, N. P., Patch, J. A., Czyzewski, A. M., Dohm, M. T., Ivankin, A., Gidalevitz, D., Zuckermann, R. N., Barron, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptoids+that+mimic+the+structure%2C+function%2C+and+mechanism+of+helical+antimicrobial+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Peptoids that mimic the structure, function, and mechanism of helical antimicrobial peptides.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105 (8), 2794-2799 (2008).</li>
<li>Kruijtzer, J. A., Nijenhuis, W. A., Wanders, N., Gispen, W. H., Liskamp, R. M., Adan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptoid-Peptide+Hybrids+as+Potent+Novel+Melanocortin+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Peptoid-Peptide Hybrids as Potent Novel Melanocortin Receptor.</a> J. Med. Chem. 48 (13), 4224-4230 (2005).</li>
<li>Liu, B., Alluri, P. G., Yu, P., Kodadek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Potent+Transactivation+Domain+Mimic+with+Activity+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A Potent Transactivation Domain Mimic with Activity in Living Cells.</a> J. Am. Chem. Soc. 127 (23), 8254-8255 (2005).</li>
<li>Patch, J. A., Barron, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helical+Peptoid+Mimics+of+Magainin-2+Amide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Helical Peptoid Mimics of Magainin-2 Amide.</a> J. Am. Chem. Soc. 125 (40), 12092-12093 (2003).</li>
<li>Ham, H. O., Park, S. H., Kurutz, J. W., Szleifer, I. G., Messersmith, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifouling+Glycocalyx-Mimetic+Peptoids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Antifouling Glycocalyx-Mimetic Peptoids.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (35), 13015-13022 (2013).</li>
<li>Olivier, G. K., Cho, A., Sanii, B., Connolly, M. D., Tran, H., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-Mimetic+Peptoid+Nanosheets+for+Molecular+Recognition%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Antibody-Mimetic Peptoid Nanosheets for Molecular Recognition.</a> ACS Nano. 7 (10), 9276-9286 (2013).</li>
<li>Olsen, C. A., Ziegler, H. L., Nielsen, H. M., Frimodt-Moeller, N., Jaroszewski, J. W., Franzyk, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial%2C+Hemolytic%2C+and+Cytotoxic+Activities+of+%CE%B2-Peptoid-Peptide+Hybrid+Oligomers%3A+Improved+Properties+Compared+to+Natural+AMPs%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial, Hemolytic, and Cytotoxic Activities of β-Peptoid-Peptide Hybrid Oligomers: Improved Properties Compared to Natural AMPs.</a> ChemBioChem. 11 (10), 1356-1360 (2010).</li>
<li>Lutz, J. -F., Ouchi, M., Liu, D. R., Sawamoto, M. <a target="_blank" href="http://science.sciencemag.org/content/341/6146/1238149.full">Sequence-Controlled Polymers.</a> Science. 341 (6146), Washington, DC. 628(2013).</li>
<li>Altuntas, E., Schubert, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Polymeromics%22%3A+Mass+spectrometry+based+strategies+in+polymer+science+toward+complete+sequencing+approaches%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">"Polymeromics": Mass spectrometry based strategies in polymer science toward complete sequencing approaches: A review.</a> Anal. Chim. Acta. 808, 56-69 (2014).</li>
<li>Paulick, M. G., Hart, K. M., Brinner, K. M., Tjandra, M., Charych, D. H., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavable+Hydrophilic+Linker+for+One-Bead-One-Compound+Sequencing+of+Oligomer+Libraries+by+Tandem+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comb.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cleavable Hydrophilic Linker for One-Bead-One-Compound Sequencing of Oligomer Libraries by Tandem Mass Spectrometry.</a> J. Comb. Chem. 8 (3), 417-426 (2006).</li>
<li>Thakkar, A., Cohen, A. S., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N., Pei, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Sequencing+of+Peptoids+and+Peptide-Peptoid+Hybrids+by+Partial+Edman+Degradation+and+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comb.+Chem%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Sequencing of Peptoids and Peptide-Peptoid Hybrids by Partial Edman Degradation and Mass Spectrometry.</a> J. Comb. Chem. 11 (2), 294-302 (2009).</li>
<li>Sarma, B. K., Kodadek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Submonomer+Synthesis+of+A+Hybrid+Peptoid-Azapeptoid+Library%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Comb+Sci%22%5BJournal%5D)">Submonomer Synthesis of A Hybrid Peptoid-Azapeptoid Library.</a> ACS Comb Sci. 14 (10), 558-564 (2012).</li>
<li>Li, X., Guo, L., Casiano-Maldonado, M., Zhang, D., Wesdemiotis, C. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ma200542p">Top-Down Multidimensional Mass Spectrometry Methods for Synthetic Polymer Analysis.</a> Macromolecules. 44 (12), 4555-4564 (2011).</li>
<li>Figliozzi, G. M., Goldsmith, R., Ng, S. C., Banville, S. C., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+N-substituted+glycine+peptoid+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Synthesis of N-substituted glycine peptoid libraries.</a> Methods Enzymol. 267, 437-447 (1996).</li>
<li>Zuckermann, R. N., Kerr, J. M., Kent, S. B. H., Moos, W. H. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja00052a076">Efficient method for the preparation of peptoids [oligo(N-substituted glycines)] by submonomer solid-phase synthesis.</a> J. Am. Chem. Soc. 114 (26), 10646-10647 (1992).</li>
<li>Utku, Y., Rohatgi, A., Yoo, B., Kirshenbaum, K., Zuckermann, R. N., Pohl, N. L. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ed100202f">Rapid Multistep Synthesis of a Bioactive Peptidomimetic Oligomer for the Undergraduate Laboratory.</a> J. Chem. Educ. 87 (6), 637-639 (2010).</li>
<li>Tran, H., Gael, S. L., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-phase+submonomer+synthesis+of+peptoid+Polymers+and+their+self-assembly+into+highly-ordered+nanosheets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Visualized+Exp%22%5BJournal%5D)">Solid-phase submonomer synthesis of peptoid Polymers and their self-assembly into highly-ordered nanosheets.</a> J. Visualized Exp. (57), e3373(2011).</li>
<li>Bolt, H. L., Cobb, S. L., Denny, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Efficient+Method+for+the+Synthesis+of+Peptoids+with+Mixed+Lysine-type%2FArginine-type+Monomers+and+Evaluation+of+Their+Anti-leishmanial+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity.</a> J Vis Exp. (117), (2016).</li>
<li>Morishetti, K. K., Russell, S. C., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1387380611003071">Tandem mass spectrometry studies of protonated and alkali metalated peptoids: Enhanced sequence coverage by metal cation addition.</a> Int. J. Mass Spectrom. 308 (1), 98-108 (2011).</li>
<li>Bogdanov, B., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+Capture+Dissociation+Studies+of+the+Fragmentation+Patterns+of+Doubly+Protonated+and+Mixed+Protonated-Sodiated+Peptoids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Electron Capture Dissociation Studies of the Fragmentation Patterns of Doubly Protonated and Mixed Protonated-Sodiated Peptoids.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25 (7), 1202-1216 (2014).</li>
<li>Ren, J., Tian, Y., Hossain, E., Connolly, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fragmentation+Patterns+and+Mechanisms+of+Singly+and+Doubly+Protonated+Peptoids+Studied+by+Collision+Induced+Dissociation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Fragmentation Patterns and Mechanisms of Singly and Doubly Protonated Peptoids Studied by Collision Induced Dissociation.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27 (4), 646-661 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zsyntetyzowano nonamerowy peptoid, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH 2, korzystając z przedstawionego protokołu. Aparat syntezy składa się z polimeryzowanego zbiornika reakcyjnego w fazie stałej z polipropylenu oraz mechanicznego wstrząsacza. Naczynia reakcyjne są dostępne komercyjnie i tanie. Mechaniczny shaker to powszechne urządzenie w laboratoriach chemicznych. Dzięki zastosowaniu zbiornika reakcyjnego przypominającego strzykawkę, roztwory można wciągać do naczynia i wypychać z niego ręcznie poruszając tłoki...

Peptoidy to klasa polimerów sterowanych sekwencją o strukturach szkieletowych naśladujących strukturę peptydów. Peptoidy mogą być syntetyzowane z różnych amin, co pozwala im wykazywać wysoce regulowane właściwości 1,2. Peptoidy były wykorzystywane jako modele molekularne w badaniach biofizycznych, traktowane jako środki terapeutyczne oraz zaprojektowane jako ligandy dla białek 3,4,5,6. Peptoidy zostały opracowane w różnorodne biologicznie aktywne związki, takie jak materiały przeciwzadrażające i mimetyczne przeciwciała, środki przeciwdrobnoustrojowe oraz inhibitory enzymów 7,8,9. Dzięki wysoce uporządkowanemu i regulowanemu charakterowi, peptoidy są również postrzegane jako rodzaj molekularnego magazynowania informacji10. Odkrycie tych różnorodnych zastosowań wymaga opracowania efektywnych metod analitycznych do charakteryzowania sekwencji i struktury peptoidów. Techniki oparte na tandemowej spektrometrii mas wykazały się obiecującymi metodami analizy właściwości sekwencyjnych polimerów sterowanych sekwencją, w tym peptoidów 11,12,13,14,15. Jednak systematyczne badania korelujące wzorce fragmentacji jonów peptoidów wynikające z badań spektrometrii masowej z informacjami strukturalnymi peptoidów są bardzo ograniczone.
Peptoidy można łatwo syntetyzować metodą fazy stałej. Dobrze opracowana metoda obejmuje iterację dwustopniowego cyklu dodawania monomerów16,17. W każdym cyklu dodawania amina wiązana żywicą jest acetylowana przez kwas halooctowy (zazwyczaj kwas bromoctowy, BMA), po czym następuje reakcja przemieszczeniowa z aminą pierwotną. Chociaż protokoły automatycznej syntezy są rutynowo stosowane w syntezie peptoidów, peptoidy można syntetyzować ręcznie z doskonałymi wydajnościami w standardowym laboratorium chemicznym 16,18,19,20.
Nasze laboratorium przyjęło metodę ręcznej syntezy peptoidów i uprościło aparaturę stosowaną w istniejących metodach. Wcześniej badaliśmy wzorce fragmentacji serii peptoidów za pomocą technik MS/MS 21,22,23. Nasze wyniki pokazują, że peptoidy wytwarzają charakterystyczne fragmentacje podczas eksperymentów z dysocjacją indukowaną kolizją (CID)21,23 lub dysocjacją elektronowo-przechwytową (ECD)22. W tym artykule pokazujemy, jak oligo-peptoidy można syntetyzować w standardowym laboratorium chemicznym, jak przeprowadzać eksperymenty CID za pomocą spektrometru masowego z potrójnym quadrupolem oraz jak analizować dane spektralne. Peptoid, który ma zostać zsyntetyzowany i scharakteryzowany, to noname z acetylacją N-końcową i amidacją C-końcową, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH 2. Struktura peptoidu pokazana jest na Rysunku 1.

<table><tbody><tr><td>ESI-potrójny spektrometr mas kwadrupolowy, Varian 320L</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td></td><td>Spektrometr mas został zakupiony od firmy Varian, Inc.</td></tr><tr><td>Stacja robocza Varian MS, wersja 6.9.2, oprogramowanie do akwizycji i przeglądu danych</td><td>Varian Inc.</td><td></td><td>Oprogramowanie jest częścią pakietu Varian 320L</td></tr><tr><td>Burrell Scientific Wrist-action shaker, Model 75 DD</td><td>Fisher Scientific International Inc.</td><td>14-400-126</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Hermle, Model Z 206 A</td><td>Hermle Labortechnik GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik do reakcji fazy stałej, 10 mL</td><td>Torviq</td><td>SF-1000</td><td></td></tr><tr><td>Kapsle ciśnieniowe dla zbiorników reakcyjnych</td><td>Torviq</td><td>PC-SF</td><td></td></tr><tr><td>Filtry strzykawkowe, pory o rozmiarze 0,2 & mu; m</td><td>Fisher Scientific Inc.</td><td>03-391-3B</td><td></td></tr><tr><td>Filtry strzykawkowe, pory o rozmiarze 0,45 & mu; m</td><td>Fisher Scientific Inc.</td><td>03-391-3A</td><td></td></tr><tr><td>Polipropylenowe wirówki ciągnące, 50 mL</td><td>VWR International, LLC.</td><td>490001-626</td><td></td></tr><tr><td>Pompy polipropylenowe do wirówek, 15 mL</td><td>VWR International, LLC.</td><td>490001-620</td><td></td></tr><tr><td>ChemBioDraw, Ultra, wersja 12.0</td><td>CambridgeSoft Corporation</td><td></td><td>CambridgeSoft jest obecnie częścią PerkinElmer Inc.</td></tr><tr><td>Kubek styropianowy, 12 uncji</td><td>Common Supermarket</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Żywica amidowa z lodowiska</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>10619</td><td></td></tr><tr><td>Piperidyna</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>02351</td><td>Wysoce toksyczny</td></tr><tr><td>N, N'-diizopropylkarbodiimid</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>00110</td><td>Wysoce toksyczny</td></tr><tr><td>Kwas bromoctowy</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>26843</td><td>Wysoce toksyczny</td></tr><tr><td>2-fenyloetylamina</td><td>VWR International, LLC.</td><td>EM8.07334.0250</td><td></td></tr><tr><td>2-Metioksyetylamina</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>241067</td><td></td></tr><tr><td>N-Boc-etylendiamina</td><td>VWR International, LLC.</td><td>AAAL19947-06</td><td></td></tr><tr><td>Bezwodnik octowy</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>252845</td><td></td></tr><tr><td>N, N-dimetyloformamid</td><td>VWR International, LLC.</td><td>BDH1117-4LG</td><td>Dalsza destylacja przed użyciem</td></tr><tr><td>N, N-diizopropyletylamina</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>00141</td><td></td></tr><tr><td>Triizopropylsilan</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>01966</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trójfluoroctowy</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>00289</td><td>Wysoce toksyczny</td></tr><tr><td>Akademicki System oczyszczania wody Millipore MILLI-Q</td><td>Korporacja Millipore</td><td>ZMQP60001</td><td>Do wytwarzania wody klasy HPLC</td></tr><tr><td>Woda klasy HPLC</td><td></td><td></td><td>Wyprodukowane w Millipore MILLI-Q&reg; Akademicki System Oczyszczania Wody</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>339USP/NF</td><td>Klasa HPLC</td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Fisher Scientific International, Inc.</td><td>A998-4</td><td>Klasa HPLC</td></tr><tr><td>Eter dietylowy</td><td>VWR International, LLC.</td><td>BDH1121-19L</td><td>Dalsza destylacja przed użyciem</td></tr><tr><td>Dichlorometan</td><td>VWR International, LLC.</td><td>BDH1113-19L</td><td>Dalsza destylacja przed użyciem</td></tr><tr><td>Gaz azotowy</td><td>Dostawa tlenu/Barnes w Fresno</td><td>NIT 50-C-F</td><td>Ultra wysoka czystość, 99,9995%</td></tr><tr><td>Gaz argon</td><td>Dostawa tlenu/Barnes w Fresno</td><td>ARG 50-C-F</td><td>Ultra wysoka czystość, 99,9995%</td></tr></tbody></table>

synteza i analiza oligo-peptoidów za pomocą spektrometrii mas

Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

Peptoidy to sekwencjonowanie sterowane oligomery naśladujące peptydy, składające się z jednostek glicyny N-alkilowanej. Wśród wielu potencjalnych zastosowań, peptoidy są postrzegane jako rodzaj molekularnego przechowywania informacji. Analiza spektrometrii mas jest uważana za metodę wyboru do sekwencjonowania peptoidów. Peptoidy można syntetyzować za pomocą chemii fazy stałej, stosując powtarzający się dwuetapowy cykl reakcji. Przedstawiamy tutaj metodę ręcznej syntezy oligo-peptoidów oraz analizę sekwencji peptoidów za pomocą technik spektrometrii masowej tandemowej (MS/MS). Próbka peptoid to nonameter składający się z naprzemiennej N-(2-metyloksyetylo)glicyny (Nme) i N-(2-fenylotyloly) glicyny (Npe), a także N-(2-aminoetylo)glicyny (Nae) na N-końcu. Wzor sekwencji peptoidu to Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, gdzie Ac to grupa acetylowa. Synteza odbywa się w komercyjnie dostępnym zbiorniku reakcyjnym w fazie stałej. Żywica amidowa lodowiska jest używana jako solidne podparcie, aby uzyskać peptoid z grupą amidową na końcu C. Powstały produkt peptoid poddawany jest analizie sekwencyjnej za pomocą spektrometru masowego trójkwadrupolowego sprzężonego ze źródłem jonizacji elektrosprayowej. Pomiar MS/MS generuje spektrum jonów fragmentów powstałych w wyniku dysocjacji naładowanego peptoidu. Jony fragmentów są sortowane na podstawie wartości ich stosunku masy do ładunku (m/z). Wartości m/z jonów fragmentów są porównywane z nominalnymi masami teoretycznie przewidywanych jonów fragmentów, zgodnie ze schematem fragmentacji peptoidów. Analiza generuje wzór fragmentacji naładowanego peptoidu. Wzór fragmentacji jest skorelowany z sekwencją monomerową neutralnego peptoidu. W tym kontekście analiza SM odczytuje informacje sekwencyjne peptoidów.

Struktura 9-merowego peptoidu z acetylacją N-końcową, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, przedstawiona jest na Rysunku 1. Peptoid był syntetyzowany ręcznie w naczyniu reakcyjnym z polipropylenem z fritem metodą fazy stałej. Żywica amidowa lodowiska (0,047 mmol, 84 mg przy ładunku 0,56 mmol/g) jest używana jako solidne podparcie, aby uzyskać peptoid z amidowanym C-terminusem. Łańcuch peptoidowy powstaje w wyniku wielokrotnego dodawania monomerów. Każ...

Opisany jest protokół ręcznej syntezy oligo-peptoidów, po którym następuje analiza sekwencji za pomocą spektrometrii mas.

Synteza i analiza oligo-peptoidów za pomocą spektrometrii mas

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

Głównym celem tej procedury jest pokazanie, jak ręcznie syntetyzować oligo-peptoidy oraz analizować ich sekwencję monomerów za pomocą technik spektrometrii mas. Metoda ta może pomóc początkującym odpowiedzieć na kluczowe pytania z dziedziny peptoidów, takie jak tworzenie peptoidów oraz jak charakteryzować ich sekwencję monomerów. Główną zaletą tej techniki jest możliwość syntetyzowania i analizy peptoidów ze specjalnymi resztami monomerów w standardowym laboratorium chemii analitycznej.Chociaż metoda ta koncentruje się na oligo-peptoidach, może być również stosowana do innych układów, takich jak peptydy i oligonukleotydy. Zazwyczaj osoby nowicjuszące w tej technice mają trudności, ponieważ osiągnięcie optymalnych warunków spektrometrii masowej jest trudne bez wizualnej demonstracji. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy chcieliśmy scharakteryzować cechy strukturalne peptoidów za pomocą tandemowej spektrometrii mas.Najpierw odważ 84 miligramy żywicy amidowej Rink i dodaj ją do naczynia do 10-mililitrowego zbiornika z polipropylenem w fazie stałej. Następnie włóż tłok do naczynia. Następnie należy dodać dwa mililitry TMF do zbiornika reakcyjnego i zakryć naczynie nakręt

synthesis-and-mass-spectrometry-analysis-of-oligo-peptoids

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Opisano szybką metodę pozwalającą na poznanie struktury polisacharydów w macierzy zewnątrzkomórkowej. Metoda ta wykorzystuje specyficzność glikozylohydrolaz oraz czułość spektrometrii mas, co umożliwia analizę niewielkich ilości materiału. Technikę tę można dostosować do bezpośredniego zastosowania w tkance.

Profilowanie masy oligosacharydów (OLIMP) wielocukrów zewnątrzkomórkowych

Metoda SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies) łączy wzbogacanie peptydów metodą powinowactwa z masową spektrometrią z rozcieńczeniem izotopem stabilnym (MRM-MS), aby zapewnić ilościowe pomiary peptydów jako substytutów odpowiadających im białek. W niniejszym opracowaniu opisujemy protokół z wykorzystaniem cząstek magnetycznych w formacie częściowo zautomatyzowanym.

Ilościowe oznaczanie białek z wykorzystaniem immunoafinityjnego wzbogacania peptydów sprzężonego ze spektrometrią mas

Opisano prostą i ogólną metodę manualnej syntezy peptoidów z wykorzystaniem podstawowego sprzętu i dostępnych komercyjnie odczynników, co umożliwia łatwą syntezę peptoidów w większości laboratoriów. Opisano syntezę, oczyszczanie i charakterystykę amfifilowego peptoidu 36-meru, a także jego samoorganizację w wysoko uporządkowane nanoarkusze.

Synteza peptoidów metodą submonomerową w fazie stałej oraz ich samoorganizacja w wysoko uporządkowane nanoarkusze

Synteza i charakterystyka trzeciorzędowej biblioteki amidów peptydów

Tutaj prezentujemy szczegółowe protokoły dla spektrometrii mas z wymianą amidu i deuteru w stanie stałym (ssHDX-MS) oraz spektrometrii mas znakowania fotolitycznego w stanie stałym (ssPL-MS) dla białek w stałych proszkach. Metody te dostarczają informacji o wysokiej rozdzielczości na temat konformacji i oddziaływań białek w amorficznym stanie stałym, które mogą być przydatne w projektowaniu preparatów.

Podejścia spektrometrii mas do badania struktury i interakcji białek w liofilizowanych proszkach

Ten protokół opisuje specyficzne techniki używane do strukturalnej charakterystyki sekwencji glikozylu na końcu redukującym (RE) i obszarze wewnętrznym heteroksylanów poprzez znakowanie RE 2 aminobenzamidem przed hydrolizą enzymatyczną (endoksylanazą), a następnie analizę powstałych oligosacharydów za pomocą spektrometrii mas (MS) i magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR).

Sekwencjonowanie heteroksylanów ścian roślin z wykorzystaniem technik enzymatycznych, chemicznych (metylacja) i fizycznych (spektrometria mas, magnetyczny rezonans jądrowy)

Ten artykuł zawiera szczegółową procedurę syntezy, oczyszczania i charakterystyki dodekamerów RNA modyfikowanych w pozycji C2'-O. Analizy fotometryczne UV-vis i dichroizmu kołowego służą do ilościowego określania i charakteryzowania aspektów strukturalnych, tj. jednoniciowych lub dwuniciowych.

Protokół syntezy w fazie stałej oligomerów RNA zawierających modyfikację 2'-O-tiofenylometylu i charakterystykę za pomocą dichroizmu kołowego

Przedstawiono protokół do syntezy kodowanych informacyjnie oligomerów peptoidowych oraz do sekwencyjnego samoorganizowania tych peptoidów w drabinki molekularne przy użyciu amin i aldehydów jako dynamicznych par kowalencyjnych reagentów oraz kwaśnych triflatów metali ziem rzadkich Lewisa jako odczynników wielozadaniowych.

Synteza peptydów niosących informacje i ich sekwencyjna dynamiczna samoorganizacja kowalencyjna

Ten protokół obejmuje szczegółową analizę składu peptydoglikanu za pomocą chromatografii cieczowej, spektrometrii mas w połączeniu z zaawansowanym oprogramowaniem do ekstrakcji cech i analizy bioinformatycznej.

Półilościowa analiza peptydoglikanu za pomocą chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i bioinformatyki

Ten protokół opisuje oparte na iSCAT przetwarzanie obrazów i śledzenie pojedynczych cząstek, które umożliwia jednoczesne badanie masy cząsteczkowej i dyfuzyjnego zachowania makrocząsteczek oddziałujących z błonami lipidowymi. Instrukcje krok po kroku dotyczące przygotowania próbki, konwersji masy na kontrast, akwizycji filmu i obróbki końcowej są dostępne wraz ze wskazówkami, aby zapobiec potencjalnym pułapkom.

Śledzenie cząstek czułych na masę w celu scharakteryzowania dynamiki makrocząsteczek związanych z błoną

Oligonukleotydowe 5′-trifosforany są wszechobecnymi składnikami w podstawowych szlakach biologicznych i są coraz częściej wykorzystywane w zastosowaniach biotechnologicznych. W tym miejscu opisano techniki rutynowej syntezy i oczyszczania oligonukleotydowych 5′-trifosforanów, zaczynając od oligonukleotydów przygotowanych standardowymi technikami syntezy automatycznej.

Chemiczna trifosforylacja oligonukleotydów

Poznaj metodę ręcznej syntezy oligo-peptydów i analizy sekwencji monomerów za pomocą spektrometrii mas. Technika ta umożliwia początkującym badaczom charakterystykę strukturalną peptydów w standardowym laboratorium analitycznym.

Synteza i analiza oligo-peptoidów za pomocą spektrometrii mas

Przeglądaj więcej filmów