Name: Ustanowienie zewnątrzkomórkowego systemu hodowli kwaśnego pH (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Poznaj metodę hodowli in vitro w kwaśnym środowisku do badania mechanizmów złośliwości nowotworów. Technika ta umożliwia stabilne warunki pH i porównanie różnych mediów kwasowych w onkologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom Wydziału Badań nad Genomem i Laboratorium Biologii Systemów i Medycyny, RCAST, Uniwersytetu Tokijskiego. Szczególne podziękowania kierujemy do dr H. Aburatani, dr T. Kodamy (LSBM, RCAST, Uniwersytet Tokijski), dr K. Tomizuki, dr T. Yoshidy i dr A. 
Kunisato (Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.) za pomocne dyskusje i wsparcie. Prace te były częściowo wspierane przez Grant-in-Aid for Young Scientist (A) (26710005, T.O.), Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (26116711 i 16H01567, T.O.) oraz Grant-in-Aid for Challenging 
Badania rozpoznawcze (16K14605, T.O.) prowadzone przez Ministerstwo Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii Japonii, Fundację Naukową Takeda (T.O.), Fundację Badań nad Rakiem Kobayashi (T.O.) oraz Projekt Badań nad Rakiem i Ewolucję Terapeutyczną (P-CREATE) oraz Praktyczne Badania nad Innowacyjną Kontrolą Raka z Japońskiej Agencji Badań Medycznych i Rozwoju, AMED (T.O.).

1. Przygotowanie kwaśnego podłoża hodowlanego
<ol>
	<li>Przygotowanie pożywki kontrolnej (pH 7,4) i niskopH (pH 6,8)
	<ol>
		<li>Rozpuść 4,75 g proszku DMEM bez L-glutaminy w 500 ml wody.</li>
		<li>Przygotować 0,33 M roztwórNaHCO3 w szczelnej butelce. 
		Ostrzeżenie: Ważne jest, aby używać butelki szczelnej, ponieważ NaHCO3 emituje gaz CO2 po podgrzaniu i rozkładzie termicznym.</li>
		<li>Autoklaw pożywki i roztworu. Pozostawić te do ostygnięcia do temperatury 25 °C.</li>
		<li>Dodaj 5 ml 200 ml 200 ml L-glutaminy, 5 ml penicyliny-streptomycyny i 50 ml płodowej surowicy bydlęcej do 500 ml DMEM bez wodorowęglanu.</li>
		<li>Dla pożywki kontrolnej (pH 7,4) dodać 2,4 ml 0,33 M roztworu NaHCO3 na 100 ml DMEM bez wodorowęglanu. W przypadku podłoża o niskim pH (pH 6,8) dodać 0,6 ml 0,33 M roztworu NaHCO3 na 100 ml DMEM bez wodorowęglanu.</li>
		<li>Sprawdzić pH podłoża po 24 godzinach inkubacji w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2, 
		UWAGA: Ilość roztworu NaHCO3 należy dostosować w zależności od pH podłoża, które może się różnić w zależności od zawartości CO2 w inkubatorze i ciśnienia powietrza. Idealnie, po raz pierwszy, lepiej jest zmierzyć pH podłoża z różnymi stężeniami wodorowęglanów, aby określić odpowiednią ilość roztworu NaHCO3 do dodania do DMEM.
		<ol>
			<li>Natychmiast po wyjęciu szalki hodowlanej z inkubatora CO2 należy zebrać pożywkę hodowlaną i zmierzyć pH za pomocą pH-metru. W razie potrzeby należy utrzymać temperaturę medium na poziomie 37 °C, korzystając z łaźni wodnej. Zmierz pH podłoża trzy razy niezależnie. 
			UWAGA: Roztwór NaHCO3 należy przechowywać w temperaturze 4 °C, a każde podłoże powinno być świeżo przygotowane. Dostępne na rynku produkty, które można wykorzystać w tym badaniu, są wymienione w Tabeli Materiałów.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie kwaśnej pożywki hodowlanej indukowanej mleczanem lub HCl
	<ol>
		<li>Dodać 74 μl roztworu mleczanu lub 125 μl 1 M HCl do 100 ml pożywki kontrolnej (przygotowanej w kroku 1.1.5).</li>
		<li>Sprawdzić pH podłoża po 24 godzinach inkubacji w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2, 
		UWAGA: Ilość roztworu mleczanu lub HCl należy również dostosować do pH medium, które może się różnić w zależności od zawartości CO2 w inkubatorze i ciśnienia powietrza. Idealnie jest zmierzyć pH podłoża za pomocą seryjnych stężeń mleczanu lub HCl, aby określić odpowiednią ilość do dostosowania do pożądanego pH pożywki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Pobieranie i obróbka komórek
<ol>
	<li>Hodowlę komórek w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 należy rozpocząć co najmniej 1 tydzień przed wykonaniem eksperymentów. 
	UWAGA: Linie komórkowe użyte w tym badaniu są wymienione w Tabeli materiałów.</li>
	<li>Komórki pasażowe, gdy osiągną 70 - 90% konfluencji. Nie pozwól, aby komórki się zrosły. Zmieniaj podłoże co 2 - 3 dni podczas codziennej uprawy.</li>
	<li>Umyj komórki, dodając 5 ml PBS. Odessać PBS i dodać enzym odłączający, taki jak 1 ml trypsyny.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C, aż komórki się zaokrąglą i zaczną się odłączać.</li>
	<li>Dodać 5 ml pożywki hodowlanej do oderwanych komórek i dezaktywować enzym. Przenieść zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml i wirować przez 3 minuty przy 300 x g. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Policz żywe komórki za pomocą hemocytometru i trypanu-błękitu.</li>
	<li>Wysiew 5,0 x 105 komórek/studzienkę 10-centymetrowego naczynia w 10 ml pożywki. Inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w temperaturze 5% CO2 .</li>
	<li>Odessać pożywkę hodowlaną, przemyć komórki 5 ml PBS i dodać 10 ml kwaśnej pożywki przygotowanej w sekcji 1. Inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w temperaturze 5% CO2 .</li>
</ol>
3. Izolacja RNA
<ol>
	<li>Odessać pożywkę hodowlaną i przemyć komórki 5 ml PBS. Rozbić komórki, dodając odczynnik do ekstrakcji RNA (patrz Tabele materiałów).</li>
	<li>Krótko zeskrobać naczynie, a następnie usunąć odczynnik do ekstrakcji RNA za pomocą pipety i umieścić odczynnik do ekstrakcji RNA/lizat komórkowy w probówce o pojemności 1,5 ml. Pozostaw w temperaturze pokojowej na 5 minut.</li>
	<li>Dodać 250 μl chloroformu i energicznie wstrząsać probówką przez około 15 s. Pozostawić w temperaturze pokojowej na 5 minut i odwirować przy ≥8 000 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Ostrożnie usuń fazę wodną za pomocą pipety. Pozostaw część fazy wodnej. Umieść w kolejnej probówce o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Do fazy wodnej dodać 550 μl izopropanolu i delikatnie wymieszać. Pozostaw w temperaturze pokojowej na 5 minut. Wirować z maksymalną prędkością (≥20 000 x g) przez 20 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odlej izopropanol i dodaj 1 ml 75% etanolu do uzdatnionej wody DEPC. Delikatnie wymieszaj. Wirować przy 8 000 x g przez 5 min.</li>
	<li>Odpipetować od etanolu i pozostawić granulki do wyschnięcia na powietrzu.</li>
	<li>Dodaj około 15 - 25 μL (w zależności od wydajności) uzdatnionej wody DEPC do granulki RNA. Dokładnie wymieszaj.</li>
	<li>Zmierzyć stężenie wyizolowanego RNA, mierząc OD przy 260 nm za pomocą spektrofotometru.</li>
</ol>
4. Synteza cDNA
<ol>
	<li>Połącz następujące składniki w probówce reakcyjnej PCR: do 5 μg całkowitego RNA, 1 μl Oligo dT (50 μM) lub Random Primer Mix (60 μM), 1 μl 10 mM dNTP i woda wolna od nukleaz do całkowitej objętości 14 μL.</li>
	<li>Wymieszaj i krótko odwiruj składniki za pomocą małej wirówki stołowej (~5 s). Denaturację RNA/startera próbki przez 5 minut w temperaturze 65 °C. Odwirować krótko (~5 s) za pomocą małej wirówki stołowej i niezwłocznie umieścić próbkę na lodzie na co najmniej 1 minutę.</li>
	<li>Dodaj następujące składniki: 4 μL 5x bufor odwrotnej transkrypcji, 1 μL odwrotnej transkryptazy (200 U/μL), 1 μL inhibitora RNazy (40 U/μL). 
	UWAGA: Przykłady dostępnych na rynku zestawów przedstawiono w Tabeli Materiałów</li>
	<li>Zakryj probówkę, wymieszaj, a następnie krótko odwiruj zawartość za pomocą małej wirówki stołowej (~5 s). Inkubować połączoną mieszaninę reakcyjną w temperaturze 50-55 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Dezaktywować reakcję przez inkubację w temperaturze 80 °C przez 10 minut.</li>
</ol>
5. Pomiar ekspresji genów reagujących na kwas za pomocą PCR w czasie rzeczywistym
<ol>
	<li>Połącz następujące składniki na 384-dołkowej płytce reakcyjnej: 1 μl matrycy cDNA, 0,75 μl 10X N',N'-dimetylo-N-[4-[(E)-(3-metylo-1,3-benzotiazol-2-yliden)metylo]-1-fenylochinolino-1-ium-2-ylo]-N-propylopropano-1,3-diamina, 0,3 μL 50 μM startera do przodu, 0,3 μL 50 μM startera odwrotnego, 1 μL polimerazy Taq, 2,5 μL 10x bufor polimerazy Taq, 2,5 μL 20 mM dNTP, 16,65 μL wody. 
	UWAGA: Example dostępnych na rynku zestawów przedstawiono w Tabeli materiałów. Wykaz starterów przedstawiono w Tabeli 1. Na tym etapie można również użyć 96-dołkowej płytki reakcyjnej. Można również użyć innych sond (np. sondy Taqman).</li>
	<li>Ustaw eksperyment i następujący program PCR w systemie PCR w czasie rzeczywistym: 50 °C przez 2 minuty, 1 cykl; 95 °C przez 10 minut, 1 cykl; 95 °C przez 15 s i 60 °C przez 1 minutę, 40 cykli; 95 °C przez 15 s, 1 cykl; 60 °C przez 15 s, 1 cykl; 95 °C przez 15 s, 1 cykl.</li>
	<li>Umieścić płytkę w aparacie qPCR. Uruchom program. 
	UWAGA: Regulację w górę genów reagujących na pH MSMO1, INSIG1 i IDI1 można zmierzyć za pomocą poziomów białka.</li>
</ol>

<ol><li>Cairns, R. A., Harris, I. S., Mak, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cancer+cell+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Regulation of cancer cell metabolism.</a> Nature reviews. Cancer. 11 (2), 85-95 (2011).</li>
<li>Chang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Competition+in+the+Tumor+Microenvironment+Is+a+Driver+of+Cancer+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression.</a> Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).</li>
<li>Hsu, P. P., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+metabolism%3A+Warburg+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer cell metabolism: Warburg and beyond.</a> Cell. 134 (5), 703-707 (2008).</li>
<li>Gerweck, L. E., Seetharaman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+pH+gradient+in+tumor+versus+normal+tissue%3A+potential+exploitation+for+the+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Cellular pH gradient in tumor versus normal tissue: potential exploitation for the treatment of cancer.</a> Cancer research. 56 (6), 1194-1198 (1996).</li>
<li>Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulated+pH%3A+a+perfect+storm+for+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression.</a> Nature Rev. Cancer. 11 (9), 671-677 (2011).</li>
<li>Gatenby, R. A., Gillies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+do+cancers+have+high+aerobic+glycolysis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Why do cancers have high aerobic glycolysis?</a> Nature reviews. Cancer. 4 (11), 891-899 (2004).</li>
<li>McBrian, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+acetylation+regulates+intracellular+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Histone acetylation regulates intracellular pH.</a> Mol Cell. 49 (2), 310-321 (2013).</li>
<li>Damaghi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+acidosis+in+the+tumour+microenvironment+selects+for+overexpression+of+LAMP2+in+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Chronic acidosis in the tumour microenvironment selects for overexpression of LAMP2 in the plasma membrane.</a> Nat Commun. 6, 8752(2015).</li>
<li>Corbet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acidosis+Drives+the+Reprogramming+of+Fatty+Acid+Metabolism+in+Cancer+Cells+through+Changes+in+Mitochondrial+and+Histone+Acetylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Acidosis Drives the Reprogramming of Fatty Acid Metabolism in Cancer Cells through Changes in Mitochondrial and Histone Acetylation.</a> Cell Metab. 24 (2), 311-323 (2016).</li>
<li>Chen, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomic+analysis+of+lactic+acidosis+and+acidosis+response+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">The genomic analysis of lactic acidosis and acidosis response in human cancers.</a> PLoS genetics. 4 (12), e1000293(2008).</li>
<li>Kondo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Acidic+pH+Activates+the+Sterol+Regulatory+Element-Binding+Protein+2+to+Promote+Tumor+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Extracellular Acidic pH Activates the Sterol Regulatory Element-Binding Protein 2 to Promote Tumor Progression.</a> Cell Rep. 18 (9), 2228-2242 (2017).</li>
</ol>

Autor Ayano Kondo jest pracownikiem Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.

W tym miejscu opisaliśmy prosty system kultur o kwaśnym pH i proces jego oceny. Połączenie trzech metod średniego zakwaszenia, tj. obniżonego stężenia wodorowęglanów, dodatku mleczanu i dodatku HCl, umożliwiło nam dokładne zbadanie mechanizmu pH-odpowiedź i porównanie odpowiedzi komórkowej na inne warunki mikrośrodowiskowe guza, takie jak niedotlenienie lub głód składników odżywczych.
Kluczem tej metody jest określenie odpowiednich stężeń wodorowęglanów, mleczanów i HCl w pożywce hodo...

Mikrośrodowisko guza odgrywa kluczową rolę w progresji guza i metabolizmie komórek rakowych1,2,3. Komórki rakowe są często narażone na stany takie jak niedotlenienie, niedobór składników odżywczych i kwaśne zewnątrzkomórkowe pH (pHe). Jednak rola pHe w progresji guza nie została wyjaśniona tak obszernie, jak w przypadku niedotlenienia lub głodu składników odżywczych. pHe w tkance nowotworowej może stać się kwaśny, osiągając około pH 6,84,5. Kwaśne pH powstaje w wyniku tlenowego i beztlenowego glikolitycznego wydalania protonów (H+) i mleczanu przez proliferację komórek rakowych5,6.
Ostatnie badania wykazały, że deacetylacja histonów wywołana kwasem pHe, utlenianie kwasów tłuszczowych i egzocytoza kwaśnych lizosomów umożliwiają adaptację do silnie kwaśnego środowiska7,8,9,10. Jednak mechanizmy, poprzez które zakwaszenie zewnątrzkomórkowe wpływa na zachowanie nowotworu i tożsamość kluczowych regulatorów w mikrośrodowisku guza o kwaśnym pH, nie zostały w pełni określone. Ponadto w kilku raportach opisano różne kwaśne podłoża o pH przy użyciu niejasnych stężeń wodorowęglanu, Tris, PIPES i buforu HEPES lub mleczanu i HCl, ale istnieje niewiele doniesień wykazujących stabilność dostosowanej pożywki ani kompleksowego porównania kilku różnych kwaśnych pożywek hodowlanych7,8,9,10
Aby wyjaśnić kluczowe regulatory i zmiany metaboliczne w komórkach nowotworowych w kontekście zakwaszenia zewnątrzkomórkowego, stworzyliśmy prosty model hodowli in vitro w celu utrzymania kwaśnego pH i zbadaliśmy rolę pHe w komórkach rakowych11. Stosując tę metodę, utrzymywaliśmy kwaśną pożywkę hodowlaną o pHe wynoszącym 6,8 w temperaturze 37 °C poniżej 5% CO2 , stosując zmniejszone stężenia wodorowęglanów w pożywce. Jako pożywkę normalną i kontrolną użyto pH 7,4. pH pożywki utrzymywało się przez co najmniej 24 godziny i stopniowo spadało o 72 godziny podczas hodowli komórek raka trzustki PANC-1 i AsPC-1. Ponieważ zwiększona glikoliza przyspiesza wydalanie nie tylko protonów, ale także mleczanu7,8,9, opracowaliśmy również metodę hodowli naśladującą kwasicę wywołaną mleczanem poprzez dodanie mleczanu, a nie zmniejszenie stężenia wodorowęglanów. Dodatkowo, indukowane przez HCl kwaśne pHe w pożywce pozwala nam wykluczyć możliwość, że reakcje komórkowe na kwaśną pożywkę hodowlaną pH nie są spowodowane zmniejszonym stężeniem wodorowęglanów. Ponadto, używając różnych pożywek o pH od 6,4 do 7,4 o różnym stężeniu wodorowęglanów, możemy ocenić zakres wpływu pHe na odpowiedzi komórkowe.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium" Nissui" 2</td><td>Nissui</td><td>05919</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu Thermo Fisher</td><td>10438</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Wako</td><td>191-01305</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór L-glutaminy</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór mieszany penicyliny i streptomycyny (stabilizowany)</td> <td>Nacalai</td><td>09367-34</td><td></td></tr><tr><td>0,5 g / l-trypsyna / 0,53 mmol / l-EDTA z czerwienią fenolową</td><td>Nacalai</td><td>32778-05</td><td></td></tr><tr><td>0,5%-trypanowy roztwór niebieskiej plamy</td><td>Nacalai</td><td>29853-34</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór kwasu mlekowego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252476</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór kwasu solnego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9892</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV System syntezy pierwszej nici</td><td>Thermo Fisher</td><td>18091</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Zielony PCR Master Mix&nbsp;</td><td>Biosystemy stosowane</td><td>4368702&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td><silny>Nazwa</silny></td><td><silny>Firma</silny></td><td><silny>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Linie komórkowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PANC-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-1469</td><td></td></tr><tr><td>AsPC-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-1682</td><td></td></tr><tr><td>KMS-6</td><td>JCRB Cell Bank</td><td></td><td></td>JCRB0432</tr><tr><td></td> Bank <td></td><td></td><td>komórek TIG JCRB</td></tr><tr><td>MRC9</td><td>ATCC</td><td>CCL-212</td><td></td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>ATCC</td><td>CRL-1730</td><td></td></tr><tr><td><silny>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</strong</td></tr><tr><td>>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One spektrofotometr UV-Vis o mikroobjętości z Wi-Fi</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 5 System PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Thermo Fisher</td><td>CRL-1682</td><td></td></tr></tbody></table>

ustanowienie zewnątrzkomórkowego systemu hodowli kwaśnego ph

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Warunki mikrośrodowiska guza, takie jak niedotlenienie lub głód składników odżywczych, odgrywają kluczową rolę w progresji raka i złośliwości. Jednak rola kwaśnego zewnątrzkomórkowego pH w agresywności guza i jego mechanizmie leżącym u podstaw nie została szeroko zbadana w porównaniu z warunkami niedotlenienia lub niedoboru składników odżywczych. Ponadto dobrze zdefiniowana metoda hodowli w celu naśladowania kwaśnego mikrośrodowiska guza zewnątrzkomórkowego nie została w pełni opisana.
Tutaj prezentujemy prostą metodę hodowli in vitro do utrzymania kwaśnego zewnątrzkomórkowego pH przy użyciu zredukowanego wodorowęglanu i zwiększonych stężeń mleczanu lub HCl w pożywce hodowlanej. pH pożywki utrzymywało się przez co najmniej 24 godziny i stopniowo spadało przez 72 godziny po hodowli komórek raka trzustki PANC-1 i AsPC-1. Trzy różne kwaśne warunki środowiskowe w tym badaniu wysoce regulowane geny reagujące na pH, takie jak MSMO1, INSIG1 i IDI1, w porównaniu z niedotlenieniem lub głodem składników odżywczych. Regulacja w górę tych genów może być wykorzystana jako marker kwaśnego pH. Te proste techniki są korzystne w wyjaśnianiu mechanizmów leżących u podstaw nowotworu złośliwego w kwaśnym mikrośrodowisku guza. Dlatego nasz zewnątrzkomórkowy system hodowli kwaśnego pH umożliwia odkrycie komórkowych kwaśnych odpowiedzi pH nie tylko w komórkach nowotworowych, ale także w komórkach pierwotnych, takich jak komórki kanalików nerkowych, w odniesieniu do innych zaburzeń kwaśnych, w tym cukrzycowej kwasicy ketonowej, kwasicy mleczanowej, kwasicy kanalików nerkowych i kwasicy oddechowej.

Aby określić odpowiednie stężenie wodorowęglanów, przygotowano DMEM w zakresie 0 - 8 mM NaHCO3 (stężenie końcowe w pożywce hodowlanej), uzyskując pożywki o pH w przedziale 6,4 - 7,4 (Rysunek 1). Jako pożywkę kontrolną przygotowano DMEM z 8 mM NaHCO3 (pH 7,4), natomiast jako pożywkę o pH kwasowym zastosowano 2 mM NaHCO3 (pH 6,8), zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami wskazującymi, że pH zewnątrzkomórkowe w przypadku guzów lity...

Mikrośrodowisko kwaśnego guza odgrywa kluczową rolę w jego postępie. Aby ocenić wpływ kwaśnego zewnątrzkomórkowego pH na komórki nowotworowe in vitro, stworzyliśmy proste systemy hodowli kwasowych.

Ustanowienie zewnątrzkomórkowego systemu hodowli kwaśnego pH

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

Ogólnym celem tej prostej metody hodowli in vitro jest wyjaśnienie mechanizmów leżących u podstaw nowotworu złośliwego w kwaśnym mikrośrodowisku guza. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii nowotworów, takie jak podstawowy mechanizm progresji raka i złośliwości w odpowiedzi na mikrośrodowisko guza. Głównymi zaletami tej techniki są stabilność pH podłoża i możliwość porównania kilku kwaśnych podłoży.Implikacje tej techniki rozszerzyły się na terapię nie tylko raka, ale także zaburzeń kwaśnych, ponieważ kwasica może być związana z różnymi rodzajami chorób. Na początek rozpuść 4,75 grama mocy DMEM z L-glutaminą w 500 mililitrach wody. Przygotuj również 0,33-molowy roztwór wodorowęglanu sodu w szczelnej butelce.Autoklaw pożywki i roztworu. Po pozostawieniu tych do ostygnięcia do 25 stopni Celsjusza, dodaj pięć mililitrów 200 milimolowej L-glutaminy, pięć mililitrów penicyliny-streptomycyny i 50 mililitrów płodowej surowicy bydlęcej do 500 mililitrów DMEM bez wodorowęglanu. W przypadku pożywki kontrolnej dodaj 2,4 mililitra 0,33-molowego roztworu wodorowęglanu sodu na 100 mililitrów DMEM bez wodorowęglanu.W przypadku pożywki o niskim pH dodaj 0,6 mil

establishment-of-an-extracellular-acidic-ph-culture-system

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Eukarioty mikrobiologiczne są zarówno źródłem węgla pochodzenia fotosyntetycznego, jak i drapieżnymi gatunkami szczytowymi w stale pokrytych lodem jeziorach Antarktydy. Niniejszy raport opisuje podejście oparte na kulturach wzbogaconych w celu izolacji metabolicznie wszechstronnych eukariotów mikrobiologicznych z antarktycznego jeziora Bonney oraz ocenia potencjał asymilacji węgla nieorganicznego przy użyciu testu radioizotopowego na aktywność rybulozo-1,5-bisfosforanowej...

Ustanowienie mikrobialnych kultur wzbogaconych eukariotów z chemicznie uwarstwionego jeziora antarktycznego oraz ocena potencjału wiązania węgla

Obecny artykuł przedstawia protokół do ustanowienia systemu modelowego hodowli komórkowych in vitro do badania interakcji fakultatywnego wewnątrzkomórkowego patogenu grzyba ludzkiego Candida glabrata z ludzkimi makrofagami, co będzie użytecznym narzędziem do poszerzenia naszej wiedzy o mechanizmach wirulencji grzybów.

Stworzenie systemu in vitro do badania wewnątrzkomórkowego zachowania Candida glabrata w ludzkich makrofagach THP-1

Bakterie mogą gromadzić zarówno szkodliwe, jak i korzystne mutacje w ciągu swojego życia. W populacji komórek osobniki, które zgromadziły korzystne mutacje, mogą szybko prześcignąć swoich pobratymców. W tym miejscu przedstawiamy prostą procedurę wizualizacji konkurencji wewnątrzgatunkowej w populacji komórek bakteryjnych w czasie przy użyciu fluorescencyjnie znakowanych osobników.

Monitorowanie konkurencji wewnątrzgatunkowej w populacji komórek bakteryjnych poprzez kohodowlę szczepów znakowanych fluorescencyjnie

Pierwsza część tego artykułu pokazuje, jak wybrać zmutowane linie komórkowe wykazujące ekspresję pęcherzykowych wymienników Na+/H+ na ich błonie komórkowej. Druga część zawiera protokoły oparte na wewnątrzkomórkowych pomiarach pH i szybkim wychwytie jonów, które służą do określenia selektywności jonowej i parametrów kinetycznych tych wymienników.

Charakterystyka funkcjonalna wymienników Na+/H+ przedziałów wewnątrzkomórkowych z wykorzystaniem selekcji zabijającej protony w celu ich ekspresji w błonie komórkowej

Glikoliza jest definiującym markerem metabolicznym w wielu systemach biologicznych. Monitorowanie glikolizy poprzez pomiar zewnątrzkomórkowego strumienia H+ jest powszechne, ale wymaga korekty, aby była ilościowa i jednoznaczna. W tym miejscu pokazujemy, jak zbierać i korygować dane dotyczące strumienia zewnątrzkomórkowego, aby odróżnić oddechowe i glikolityczne źródła zakwaszenia zewnątrzkomórkowego.

Pomiar i analiza produkcji kwasu zewnątrzkomórkowego w celu określenia szybkości glikolitycznej

Interakcje między gospodarzem a mikroorganizmem jelitowym zostały ocenione przy użyciu nowatorskiego podejścia łączącego syntetyczną społeczność doustną, trawienie in vitro przewodu pokarmowego i model nabłonka jelita cienkiego. Przedstawiamy metodę, którą można zaadaptować do oceny inwazji komórek patogenów i biofilmów wielogatunkowych, a nawet do badania przeżywalności preparatów probiotycznych.

Ocena żywotności konsorcjum bakterii syntetycznych na granicy faz gospodarz-mikroorganizm w jelitach in vitro

Tutaj opisujemy protokół przygotowania i utrzymania pierwotnych hodowli komórek przysadki mózgowej z medaka (Oryzias latipes). Zoptymalizowane warunki w tym protokole uwzględniają ważne parametry, takie jak temperatura, osmolalność i pH, naśladując warunki fizjologiczne ryb, umożliwiając w ten sposób fizjologicznie bardziej znaczące wyniki.

Przygotowanie wysokiej jakości pierwotnej hodowli komórkowej z przysadki mózgowej ryb

Demonstrujemy metodę izolowania trudnych do wyhodowania członków nowego typu bakterii, Saccharibacteria, poprzez filtrowanie płytki nazębnej i wspólną hodowlę z bakteriami gospodarza.

Ustanawianie stabilnych kultur binarnych symbiotycznych bakterii sacharycznych z jamy ustnej

Tutaj prezentujemy eksperymentalny protokół ewolucji do adaptacji u termofilów, wykorzystując tanie, energooszczędne termomiksery stołowe jako inkubatory. Technika ta została zademonstrowana poprzez scharakteryzowanie adaptacji do temperatury u Sulfolobus acidocaldarius, archeonu o optymalnej temperaturze wzrostu 75 °C.

Adaptacja w ekstremalnych warunkach życia: eksperymentalna ewolucja z ekstremofilem archeonem Sulfolobus acidocaldarius

Tutaj prezentujemy protokół charakteryzujący pozakomórkowy transfer elektronów za pośrednictwem (EET) u bakterii kwasu mlekowego za pomocą trzyelektrodowego, dwukomorowego systemu bioelektrochemicznego. Ilustrujemy tę metodę za pomocą Lactiplantibacillus plantarum i mediatora redoks kwasu 1,4-dihydroksy-2-naftoesowego i podajemy dokładny opis technik elektrochemicznych stosowanych do oceny EET, w którym pośredniczy.

Charakterystyka pośredniczonego zewnątrzkomórkowego transferu elektronów u bakterii kwasu mlekowego za pomocą trójelektrodowego, dwukomorowego układu bioelektrochemicznego

Poznaj metodę hodowli in vitro w kwaśnym środowisku do badania mechanizmów złośliwości nowotworów. Technika ta umożliwia stabilne warunki pH i porównanie różnych mediów kwasowych w onkologii.

Ustanowienie zewnątrzkomórkowego systemu hodowli kwaśnego pH

Przeglądaj więcej filmów