Name: Badanie metabolizmu glukozy in vivo u myszy karmionych dietą wysokotłuszczową przy użyciu doustnego testu tolerancji glukozy (OGTT) i testu tolerancji insuliny (ITT) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Poznaj metody oceny metabolizmu glukozy u myszy karmionych dietą wysokotłuszczową przy użyciu testów OGTT i ITT. Protokoły te umożliwiają badanie insulinooporności in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Te badania były wspierane przez Medyczny Fundusz Naukowy Burmistrza Miasta Wiednia oraz Österreichische Gesellschaft für Laboratoriumsmedizin und Klinische Chemie.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Medycznego w Wiedniu i przeprowadzone zgodnie z Federacją Europejskich Stowarzyszeń Badań nad Zwierzętami Laboratoryjnymi (FELASA). Należy pamiętać, że wszystkie procedury opisane w tym protokole powinny być wykonywane tylko po zatwierdzeniu przez instytucje i rządy, a także przez personel biegły technicznie.
1. Myszy karmione HFD
UWAGA: Utrzymuj wszystkie myszy C57BL/6J w 12-godzinnym cyklu jasnym/ciemnym z wolnym dostępem do jedzenia i wody.
<ol>
	<li>W wieku 6 tygodni umieść myszy na 8-12 tygodni na HFD (40-60% kalorii tłuszczu), aby wywołać otyłość, jednocześnie karmiąc szczupłą grupę kontrolną dietą niskotłuszczową (LFD) (10% kalorii tłuszczu).</li>
	<li>Określ masę ciała myszy co tydzień. Krzywe wagowe powinny wykazywać podobne wzorce w obu grupach, z większym nachyleniem w grupie karmionej HFD.</li>
</ol>
2. OGTT
UWAGA: Jeśli podczas OGTT co 15 minut wybierane są punkty czasowe pobierania krwi, eksperyment powinien być przeprowadzony z maksymalnie 15 myszami równolegle, aby mieć co najmniej 1 minutę czasu obsługi na mysz.
<ol>
	<li>Przygotowania w dniu poprzedzającym OGTT
	<ol>
		<li>Przenieś myszy do klatki ze świeżą ściółką i pościj je przez noc przed badaniem (14 godzin), upewniając się, że myszy mają dostęp do wody pitnej (np. usuń jedzenie o 18:00 na godzinę rozpoczęcia następnego ranka o 8:00). 
		UWAGA: Poszczenie myszy przez noc jest standardowym podejściem, jednak krótszy post (5-6 godzin) jest bardziej fizjologiczny dla myszy (szczegóły w Dyskusji).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowania w dniu eksperymentu (ale przed eksperymentem)
	<ol>
		<li>Przygotować 10 ml 20% roztworu glukozy (rozpuścić D-(+)-glukozę w wodzie destylowanej). 
		UWAGA: Wszystkie odczynniki, które są podawane zwierzętom, muszą być klasy farmakologicznej i sterylne.</li>
		<li>Przygotować 96-dołkową płytkę do pobierania osocza, wypełniając po jednym dołku dla każdego punktu pobierania próbek i każdej myszy, 5 μl NaEDTA (0,5 M EDTA, pH 8,0 w 0,9% NaCl, przechowywanie w temperaturze pokojowej). Podczas eksperymentu przechowuj tę płytkę na lodzie. 
		UWAGA: Zobacz Dodatkowe Rysunek 1, aby uzyskać szczegółową listę kontrolną.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierz masę ciała wszystkich myszy i zaznacz ich ogony trwałym markerem, aby myszy były łatwe do odróżnienia (np. mysz 1 = 1 kreska, mysz 2 = 2 kreski itp.).</li>
	<li>Pomiar stężenia glukozy i pobieranie próbek krwi (<silna klasa="xfig">Rysunek 2)
	<ol>
		<li>Ostrożnie odetnij 1-2 mm końcówki ogona ostrymi nożyczkami ("Wariant A" w <silna klasa="xfig">Rysunek 2). Zawsze wycieraj pierwszą kroplę krwi, aby uniknąć hemolizy lub zanieczyszczenia płynem tkankowym przed pobraniem nowych próbek krwi do oznaczania stężenia glukozy we krwi. Pobrać małą próbkę krwi (~ 3 μL) do pomiaru podstawowego poziomu glukozy we krwi (= punkt czasowy 0) za pomocą glukometru. 
		UWAGA: Sprawdź i dostosuj liczbę naładowania pasków testowych na glukometrze. 
		UWAGA: Jako alternatywną metodę pobierania krwi, naciąć boczną żyłę ogonową myszy ostrym ostrzem skalpela ("Wariant B" w <silna klasa = "xfig">Ryc. 2). Boczna żyła ogonowa jest zwykle dostępna w około jednej trzeciej długości ogona od końca ogona, przesuwając się w kierunku podstawy ogona w przypadku wielu próbek. Zaleca się stosowanie kremu znieczulającego miejscowo. Zatrzymaj przepływ krwi, wywierając nacisk palcem na tkankę miękką przez co najmniej 30 sekund, zanim zwierzę wróci do klatki.</li>
		<li>Pobrać próbkę krwi (około 30 μl) za pomocą świeżej rurki kapilarnej (utrzymać rurkę kapilarną poziomo). Opróżnij rurkę kapilarną za pomocą pipety, umieszczając końcówkę pipety na górze końca rurki kapilarnej i ostrożnie wpychając zebraną krew do dołka z 96-dołkową płytką, unikając pęcherzyków powietrza. Powtórz tę procedurę dla wszystkich myszy - pojedynczo. 
		UWAGA: Jako alternatywę dla pobierania krwi przez rurkę kapilarną, należy użyć pipety dostosowanej do odpowiedniej objętości (np. 30 μl) w celu pobrania krwi lub pobrać kroplę krwi z ogona na folii parafinowej i pipetować ją do roztworu EDTA. Bezwzględnie unikaj kontaktu wazeliny z paskami testowymi krwi lub glukometru, ponieważ może to wpłynąć na późniejsze pomiary glukozy i insuliny. 
		UWAGA: OGTT jest bardzo stresujący dla myszy: szczupłe myszy mogą stracić około 15% masy ciała podczas nocnego postu. Dodatkowo pobieranie próbek krwi w różnych punktach czasowych prowadzi do znacznej utraty krwi. Dla łatwiejszego pobierania próbek krwi można dokładnie masować ogon myszy wazeliną. 
		UWAGA: Wytyczne instytucjonalne mogą ograniczać dopuszczalną ilość krwi pobranej w określonym czasie. Objętości pobierania próbek i punkty czasowe powinny być dostosowane tak, aby nie przekraczały dozwolonych maksymalnych ilości. Masa ciała myszy powinna być wykorzystana do obliczenia całkowitej dozwolonej ilości pobranej krwi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obliczyć wymaganą objętość roztworu glukozy w przeliczeniu na masę ciała (1 g glukozy/kg masy ciała; można ją zwiększyć do 3 g/kg), która ma być podawana przez zgłębnik doustny dla każdej myszy. Na przykład mysz o masie ciała 30 g potrzebowałaby 150 μl 20% roztworu glukozy, aby podać 30 mg glukozy. 
	UWAGA: Standardową procedurą jest oparcie dawki glukozy na wadze myszy. Jeśli dostępne są dane dotyczące składu ciała, dawkę glukozy dla OGTT należy obliczyć na podstawie beztłuszczowej masy ciała (szczegółowe informacje znajdują się w Dyskusji).</li>
	<li>Podawanie glukozy
	<ol>
		<li>Przygotuj wcześniej wszystko, co jest potrzebne podczas całego eksperymentu (minutnik, karta zapisu eksperymentu, monitor i paski glukozy, naczynia włosowate, strzykawki, roztwór glukozy, płytka 96-dołkowa, skalpel, kalkulator, waga, marker permanentny, bibuły, pipeta z końcówką i rękawiczki).</li>
		<li>W przypadku aplikacji glukozy przytrzymaj mysz, mocno chwytając ją za kark. Nałóż wystarczająco twardą warstwę na skórę wokół szyi, aby zapobiec wykręceniu się myszy z więzów i odpowiednio odchylić głowę do tyłu. Upewnij się również, że mysz może prawidłowo oddychać. 
		UWAGA: Po rozpoczęciu podawania glukozy bardzo ważne jest dobre zarządzanie czasem.</li>
		<li>Ostrożnie podać roztwór glukozy (w oparciu o krok 2.5) bezpośrednio do żołądka za pomocą igły do karmienia. Ostrożnie skierować igłę do karmienia przez usta w kierunku przełyku. Pozwól myszy połknąć igłę: igła całkowicie zapada się w dolnej części przełyku/żołądka myszy. Następnie wstrzyknąć roztwór glukozy (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3a).
		<ol>
			<li>Jeśli napotkany zostanie jakikolwiek opór lub jeśli zwierzę natychmiast zacznie się szarpać, wycofaj igłę i zmień jej położenie. Uruchom stoper natychmiast po pierwszym zgłębniku i podawaj glukozę wszystkim pozostałym myszom w odstępach 1-minutowych. 
			UWAGA: Pomocne może być nałożenie kropli roztworu glukozy bezpośrednio z igły do karmienia do pyska myszy, co pobudzi lizanie i połykanie, ułatwiając w ten sposób wprowadzenie igły do karmienia. Nie należy wywierać nacisku podczas wkładania igły do karmienia, ponieważ może to poważnie zranić zwierzę.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po 15 minutach zmierz poziom glukozy we krwi za pomocą glukometru i dodatkowo pobierz próbki krwi (~30 μL) (zgodnie ze szczegółowym opisem w kroku 2.4) każdej myszy w tej samej kolejności, w jakiej zostały wstrzyknięte. 
	UWAGA: Zarządzanie czasem jest bardzo ważne; Postępuj tak dokładnie, jak to możliwe, w tych samych odstępach czasu, co w przypadku zgłębnika. Pozwól myszom poruszać się tak swobodnie, jak to możliwe i ogranicz krępowanie do minimum podczas całej procedury, aby zmniejszyć stres, który może zmienić wyniki. Jedną ręką wydoić ogon, a drugą zebrać krew.</li>
	<li>Powtórz krok 2.7 w wybranych punktach czasowych w zależności od oczekiwanych rezultatów (np. po 30, 45, 60, 90, 120, 150 i 180 minutach od podania glukozy). Jeśli wybrane punkty czasowe są dłuższe niż 120 minut, upewnij się, że myszy mają dostęp do wody pitnej. Upewnij się, że myszy mają zawsze dostęp do wody pitnej. Po zakończeniu eksperymentu umieść myszy w ich domowych klatkach wyposażonych w jedzenie i wodę. 
	UWAGA: OGTT jest bardzo wyczerpujący dla myszy. Dlatego należy odczekać co najmniej 1 tydzień przed wykonaniem kolejnego badania metabolicznego, takiego jak ITT.</li>
	<li>Po doświadczeniu odwirować próbki krwi w temperaturze 2 500 x g, 30 min, 4 °C. Przenieść supernatant (osocze) do pustych studzienek płytki i przechowywać go w temperaturze -20 °C do czasu analizy.
	<ol>
		<li>Zapisać hemolizę próbek, jeśli są obecne (patrz punkt 3).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznaczyć poziom insuliny w osoczu za pomocą dostępnego w handlu zestawu ELISA (patrz tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta zestawu. 
	UWAGA: W zależności od stanu czczo, jak również od metabolizmu badanych myszy, mogą wystąpić trudności podczas tego testu: poziomy insuliny na czczo przez noc (punkt czasowy 0) są bardzo niskie, a zatem bliskie granicy wykrywalności. Aby uniknąć tego problemu, należy podwoić zalecaną objętość osocza i odpowiednio zmniejszyć o połowę wynik testu ELISA. Z drugiej strony, jeśli myszy osiągną szczyt insuliny podczas OGTT, szczególnie u myszy karmionych HFD, poziomy insuliny mogą przekroczyć granicę wykrywalności: rozcieńczyć próbkę (np. 10-krotnie 0,9% NaCl) i powtórzyć test ELISA. Hemoliza w próbkach osocza może prowadzić do degradacji insuliny, co skutkuje spadkiem wartości odczytu. Degradacja zależy od czasu, temperatury i stężenia hemoglobiny w próbce. Zawsze przechowuj hemolizowane próbki w niskiej temperaturze lub na lodzie, aby zmniejszyć degradację insuliny.</li>
</ol>
3. ITT
UWAGA: Te same środki ostrożności opisane dla OGTT (obchodzenie się z myszami, krwią, glukometrem i użyciem wazeliny) muszą być również stosowane podczas wykonywania ITT. Na przykład wszystkie wstrzyknięcia powinny być wykonywane w ciągu 15 minut w odstępach 1-minutowych, jeśli równolegle testowanych jest 15 myszy. W przypadku ITT późniejsze pobieranie próbek krwi za pomocą kapilar jest opcjonalne.
<ol>
	<li>Przygotowania przed eksperymentem
	<ol>
		<li>Pościć myszy przez co najmniej 2 godziny przed wstrzyknięciem insuliny, upewniając się, że myszy mają dostęp do wody pitnej (np. usuń jedzenie o 8:00 rano, przetestuj myszy 2-5 godzin później).</li>
		<li>Rozcieńczyć insulinę w stosunku 1:1000 w 0,9% NaCl (zapas: 100 U/ml insuliny; stężenie robocze 0,1 U/ml) i przygotować 20% glukozy (roztwór D-(+)-glukozy rozpuszczony w wodzie destylowanej) do podania, jeśli myszy staną się hipoglikemiczne. 
		UWAGA: ITT jest zwykle wykonywany po krótkim poście, aby uniknąć hipoglikemii, która w przeciwnym razie może wystąpić u zwierząt na czczo przez noc. Wszystkie odczynniki, które są podawane zwierzętom, muszą być klasy farmakologicznej i sterylne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierz masę ciała myszy, zaznacz ogon, odetnij końcówkę ogona ostrymi nożyczkami i zmierz podstawowy poziom glukozy we krwi, jak opisano wcześniej dla OGTT w kroku 2.4.</li>
	<li>Wstrzyknięcie insuliny
	<ol>
		<li>Aby wstrzyknąć insulinę dootrzewnowo (0,75 j. insuliny/kg masy ciała, obliczone wcześniej), należy unieruchomić mysz metodą karkówki.</li>
		<li>Dla każdego zwierzęcia należy używać świeżej, sterylnej igły o rozmiarze 27 lub 30, aby uniknąć dyskomfortu i ryzyka zakażenia w miejscu wstrzyknięcia. 
		UWAGA: Sterylizacja skóry może wydłużyć czas podawania insuliny, a tym samym może powodować dodatkowe zaburzenia u zwierzęcia. Dlatego nie jest to zalecane.</li>
		<li>Przechyl głowę myszy w dół pod niewielkim kątem, aby odsłonić brzuszną stronę zwierzęcia. Umieść sterylną igłę skosem do góry i pod kątem 30 ° w prawym dolnym kwadrancie brzucha zwierzęcia (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3b). Uruchom stoper natychmiast po wstrzyknięciu pierwszej myszy. 
		UWAGA: Małe dawki ITT (0,1 U/kg) mogą być wykonywane w celu specyficznej oceny wrażliwości wątroby na insulinę. Jeśli chodzi o OGTT, obliczanie objętości wstrzyknięcia na podstawie masy ciała jest standardową procedurą, podczas gdy preferowane jest oparcie dawki na beztłuszczowej masie ciała, jeśli dostępne są dane dotyczące składu ciała.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierz poziom glukozy we krwi w wybranych punktach czasowych (np. po 15, 30, 45, 60 i 90 minutach). 
	UWAGA: Ponieważ insulina ma krótki okres połowicznego zaniku wynoszący ~10 minut u myszy13, późne różnice po podaniu insuliny (np. po 2 godzinach) mogą nie odzwierciedlać bezpośredniego wpływu działania insuliny. Podawać 20% roztwór glukozy w przypadku, gdy mysz stanie się hipoglikemiczna (poziom glukozy we krwi poniżej 35 mg/dl) i jest zagrożona śmiercią.</li>
	<li>Po upływie ostatnich punktów czasowych umieść myszy z powrotem w ich domowych klatkach przygotowanych z dużą ilością jedzenia i wody.</li>
</ol>

<ol><li>Qatanani, M., Lazar, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+obesity-associated+insulin+resistance%3A+many+choices+on+the+menu%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of obesity-associated insulin resistance: many choices on the menu.</a> Genes Dev. 21 (12), 1443-1455 (2007).</li>
<li>Wilcox, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+and+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Biochem+Rev%22%5BJournal%5D)">Insulin and insulin resistance.</a> Clin Biochem Rev. 26 (2), 19-39 (2005).</li>
<li>Reaven, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+insulin+resistance+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of insulin resistance in human disease.</a> Physiol Rev. 75 (3), 473-486 (1995).</li>
<li>Kahn, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+2+diabetes%3A+when+insulin+secretion+fails+to+compensate+for+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Type 2 diabetes: when insulin secretion fails to compensate for insulin resistance.</a> Cell. 92 (5), 593-596 (1998).</li>
<li>Gregor, M. F., Hotamisligil, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+mechanisms+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Inflammatory mechanisms in obesity.</a> Annu Rev Immunol. 29, 415-445 (2011).</li>
<li>Odegaard, J. I., Chawla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleiotropic+actions+of+insulin+resistance+and+inflammation+in+metabolic+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pleiotropic actions of insulin resistance and inflammation in metabolic homeostasis.</a> Science. 339 (6116), 172-177 (2013).</li>
<li>Srinivasan, K., Ramarao, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+in+type+2+diabetes+research%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Med+Res%22%5BJournal%5D)">Animal models in type 2 diabetes research: an overview.</a> Indian J Med Res. 125 (3), 451-472 (2007).</li>
<li>Surwit, R. S., Kuhn, C. M., Cochrane, C., McCubbin, J. A., Feinglos, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet-induced+type+II+diabetes+in+C57BL%2F6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Diet-induced type II diabetes in C57BL/6J mice.</a> Diabetes. 37 (9), 1163-1167 (1988).</li>
<li>Winzell, M. S., Ahren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+high-fat+diet-fed+mouse%3A+a+model+for+studying+mechanisms+and+treatment+of+impaired+glucose+tolerance+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">The high-fat diet-fed mouse: a model for studying mechanisms and treatment of impaired glucose tolerance and type 2 diabetes.</a> Diabetes. 53, Suppl 3. S215-S219 (2004).</li>
<li>Ayala, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+operating+procedures+for+describing+and+performing+metabolic+tests+of+glucose+homeostasis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Standard operating procedures for describing and performing metabolic tests of glucose homeostasis in mice.</a> Dis Model Mech. 3 (9-10), 525-534 (2010).</li>
<li>Jais, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heme+oxygenase-1+drives+metaflammation+and+insulin+resistance+in+mouse+and+man%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Heme oxygenase-1 drives metaflammation and insulin resistance in mouse and man.</a> Cell. 158 (1), 25-40 (2014).</li>
<li>Teperino, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+partial+agonism+drives+Warburg-like+metabolism+in+muscle+and+brown+fat%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hedgehog partial agonism drives Warburg-like metabolism in muscle and brown fat.</a> Cell. 151 (2), 414-426 (2012).</li>
<li>Cresto, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Half+life+of+injected+125I-insulin+in+control+and+ob%2Fob+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+Lat+Am%22%5BJournal%5D)">Half life of injected 125I-insulin in control and ob/ob mice.</a> Acta Physiol Lat Am. 27 (1), 7-15 (1977).</li>
<li>First report of the BVA/FRAME/RSPCA/UFAW joint working group on refinement. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+blood+from+laboratory+mammals+and+birds%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Removal of blood from laboratory mammals and birds.</a> Lab Anim. 27 (1), 1-22 (1993).</li>
<li>McGuill, M., Rowan, A. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/ilarjournal/article/31/4/5/655393/Biological-Effects-of-Blood-Loss-Implications-for">Biological Effects of Blood Loss: Implications for Sampling Volumes and Techniques.</a> ILAR. 31 (4), 5-18 (1989).</li>
<li>Hoff, J. <a target="_blank" href="http://www.osa.sunysb.edu/dlar/newitems/mouseblood.pdf">Methods of Blood Collection in the Mouse.</a> Lab Animal. 29 (10), 47-53 (2000).</li>
<li>NIH. National Institute of Health - Guidelines for Survival Bleeding of Mice and Rats. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://oacu.od.nih.gov/ARAC/survival.pdf">http://oacu.od.nih.gov/ARAC/survival.pdf</a> (2017).</li>
<li>Jacobson, L., Ansari, T., McGuinness, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counterregulatory+deficits+occur+within+24+h+of+a+single+hypoglycemic+episode+in+conscious%2C+unrestrained%2C+chronically+cannulated+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Counterregulatory deficits occur within 24 h of a single hypoglycemic episode in conscious, unrestrained, chronically cannulated mice.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 290 (4), E678-E684 (2006).</li>
<li>Guariguata, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+estimates+of+diabetes+prevalence+for+2013+and+projections+for+2035%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Res+Clin+Pract%22%5BJournal%5D)">Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035.</a> Diabetes Res Clin Pract. 103 (2), 137-149 (2014).</li>
<li>Freeman, H. C., Hugill, A., Dear, N. T., Ashcroft, F. M., Cox, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+nicotinamide+nucleotide+transhydrogenase%3A+a+new+quantitive+trait+locus+accounting+for+glucose+intolerance+in+C57BL%2F6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Deletion of nicotinamide nucleotide transhydrogenase: a new quantitive trait locus accounting for glucose intolerance in C57BL/6J mice.</a> Diabetes. 55 (7), 2153-2156 (2006).</li>
<li>Pelleymounter, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+obese+gene+product+on+body+weight+regulation+in+ob%2Fob+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Effects of the obese gene product on body weight regulation in ob/ob mice.</a> Science. 269 (5223), 540-543 (1995).</li>
<li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+the+diabetes+gene+encodes+the+leptin+receptor%3A+identification+of+a+mutation+in+the+leptin+receptor+gene+in+db%2Fdb+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Evidence that the diabetes gene encodes the leptin receptor: identification of a mutation in the leptin receptor gene in db/db mice.</a> Cell. 84 (3), 491-495 (1996).</li>
<li>Rossini, A. A., Like, A. A., Dulin, W. E., Cahill, G. F. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+beta+cell+toxicity+by+streptozotocin+anomers%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Pancreatic beta cell toxicity by streptozotocin anomers.</a> Diabetes. 26 (12), 1120-1124 (1977).</li>
<li>Bailey, C. J., Flatt, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormonal+control+of+glucose+homeostasis+during+development+and+ageing+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolism%22%5BJournal%5D)">Hormonal control of glucose homeostasis during development and ageing in mice.</a> Metabolism. 31 (3), 238-246 (1982).</li>
<li>Shi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexually+different+actions+of+leptin+in+proopiomelanocortin+neurons+to+regulate+glucose+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Sexually different actions of leptin in proopiomelanocortin neurons to regulate glucose homeostasis.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (3), E630-E639 (2008).</li>
<li>Collins, S., Martin, T. L., Surwit, R. S., Robidoux, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+vulnerability+to+diet-induced+obesity+in+the+C57BL%2F6J+mouse%3A+physiological+and+molecular+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Behav%22%5BJournal%5D)">Genetic vulnerability to diet-induced obesity in the C57BL/6J mouse: physiological and molecular characteristics.</a> Physiol Behav. 81 (2), 243-248 (2004).</li>
<li>Heijboer, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sixteen+hours+of+fasting+differentially+affects+hepatic+and+muscle+insulin+sensitivity+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Sixteen hours of fasting differentially affects hepatic and muscle insulin sensitivity in mice.</a> J Lipid Res. 46 (3), 582-588 (2005).</li>
<li>Kohsaka, A., Bass, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sense+of+time%3A+how+molecular+clocks+organize+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">A sense of time: how molecular clocks organize metabolism.</a> Trends Endocrinol Metab. 18 (1), 4-11 (2007).</li>
<li>Drucker, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incretin+action+in+the+pancreas%3A+potential+promise%2C+possible+perils%2C+and+pathological+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Incretin action in the pancreas: potential promise, possible perils, and pathological pitfalls.</a> Diabetes. 62 (10), 3316-3323 (2013).</li>
<li>Andrikopoulos, S., Blair, A. R., Deluca, N., Fam, B. C., Proietto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+glucose+tolerance+test+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Evaluating the glucose tolerance test in mice.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 295 (6), E1323-E1332 (2008).</li>
<li>Ahren, B., Winzell, M. S., Pacini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+augmenting+effect+on+insulin+secretion+by+oral+versus+intravenous+glucose+is+exaggerated+by+high-fat+diet+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The augmenting effect on insulin secretion by oral versus intravenous glucose is exaggerated by high-fat diet in mice.</a> J Endocrinol. 197 (1), 181-187 (2008).</li>
<li>Bowe, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+phenotyping+guidelines%3A+assessing+glucose+homeostasis+in+rodent+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Metabolic phenotyping guidelines: assessing glucose homeostasis in rodent models.</a> J Endocrinol. 222 (3), G13-G25 (2014).</li>
<li>Arioli, V., Rossi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Errors+related+to+different+techniques+of+intraperitoneal+injection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Errors related to different techniques of intraperitoneal injection in mice.</a> Appl Microbiol. 19 (4), 704-705 (1970).</li>
<li>Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraperitoneal+injection+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Intraperitoneal injection of mice.</a> Appl Microbiol. 17 (2), 250-251 (1969).</li>
<li>Heikkinen, S., Argmann, C. A., Champy, M. F., Auwerx, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+glucose+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol.+Chapter%22%5BJournal%5D)">Evaluation of glucose homeostasis.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter. , Chapter 29 Unit 29B 23(2007).</li>
<li>Muniyappa, R., Lee, S., Chen, H., Quon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+approaches+for+assessing+insulin+sensitivity+and+resistance+in+vivo%3A+advantages%2C+limitations%2C+and+appropriate+usage%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Current approaches for assessing insulin sensitivity and resistance in vivo: advantages, limitations, and appropriate usage.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (1), E15-E26 (2008).</li>
<li>McGuinness, O. P., Ayala, J. E., Laughlin, M. R., Wasserman, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+experiment+in+centralized+mouse+phenotyping%3A+the+Vanderbilt+experience+and+recommendations+for+evaluating+glucose+homeostasis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">NIH experiment in centralized mouse phenotyping: the Vanderbilt experience and recommendations for evaluating glucose homeostasis in the mouse.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 297 (4), E849-E855 (2009).</li>
<li>Pacini, G., Omar, B., Ahren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+and+models+for+metabolic+assessment+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Diabetes+Res%22%5BJournal%5D)">Methods and models for metabolic assessment in mice.</a> J Diabetes Res. 2013, 986906(2013).</li>
<li>Polonsky, K. S., Rubenstein, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-peptide+as+a+measure+of+the+secretion+and+hepatic+extraction+of+insulin.+Pitfalls+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">C-peptide as a measure of the secretion and hepatic extraction of insulin. Pitfalls and limitations.</a> Diabetes. 33 (5), 486-494 (1984).</li>
<li>Hughey, C. C., Wasserman, D. H., Lee-Young, R. S., Lantier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approach+to+assessing+determinants+of+glucose+homeostasis+in+the+conscious+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Mamm+Genome%22%5BJournal%5D)">Approach to assessing determinants of glucose homeostasis in the conscious mouse.</a> Mamm Genome. 25 (9-10), 522-538 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ze względu na wysokie rozpowszechnienie cukrzycy i związanych z nią chorób w populacji światowej istnieje duże zapotrzebowanie na badania dotyczące mechanizmu molekularnego, zapobiegania i leczenia chorób19. Przedstawiony protokół opisuje ugruntowane metody hodowli myszy z HFD, solidnego modelu zwierzęcego wykorzystywanego do badań metabolicznych, a także przeprowadzania OGTT i ITT, które są silnymi narzędziami do oceny zmian metabolicznych całego organizmu, takich jak insulinooporność. Metody prz...

W rozwiniętym świecie otyłość i cukrzyca osiągnęły rozmiary epidemii z powodu braku aktywności fizycznej i nadmiernej konsumpcji przetworzonej żywności, co jest spowodowane szybką urbanizacją, industrializacją oraz globalizacją. Chociaż badania nad insulinoopornością i jej chorobami współistniejącymi, takimi jak hiperlipidemia i miażdżyca, zyskały na znaczeniu w ciągu ostatnich dziesięcioleci, złożone mechanizmy biologiczne, które regulują metabolizm w zdrowiu i chorobie, pozostają nie w pełni poznane i nadal istnieje pilna potrzeba nowych metod leczenia w celu zapobiegania i leczenia tych chorób1.
Insulina i jej przeciwregulacyjny hormon glukagon służą jako główne regulatory dostarczania energii komórkowej i równowagi makroskładników odżywczych, utrzymując tym samym prawidłowe stężenie glukozy we krwi w organizmie2. Glukoza sama w sobie działa jako jeden z głównych stymulatorów wydzielania insuliny przez komórki β trzustki, podczas gdy inne makroskładniki odżywcze, czynniki humoralne, a także bodźce nerwowe dodatkowo modyfikują tę odpowiedź. Insulina w konsekwencji uruchamia procesy anaboliczne w stanie odżywionym, ułatwiając dyfuzję nadmiaru glukozy we krwi do komórek mięśniowych i tłuszczowych oraz dalszą aktywację glikolizy oraz syntezy białek lub kwasów tłuszczowych. Dodatkowo insulina hamuje wydzielanie glukozy w wątrobie poprzez hamowanie glukoneogenezy. Przewlekłe nadmierne zużycie energii i metastan zapalny prowadzą do hiperinsulinemii i insulinooporności obwodowej z powodu regulacji w dół ekspresji receptora insuliny, a także zmian w dalszych szlakach sygnałowych, co skutkuje upośledzoną wrażliwością na usuwanie glukozy za pośrednictwem insuliny, a także niewystarczającym hamowaniem produkcji glukozy w wątrobie3,4,5,6.
Szeroka gama modeli zwierzęcych z genetyczną, żywieniową lub eksperymentalną indukcją choroby okazała się doskonałymi narzędziami do badania molekularnych mechanizmów insulinooporności i różnych form cukrzycy, a także chorób towarzyszących7. Doskonałym przykładem jest szeroko stosowany i dobrze ugruntowany model myszy indukowany HFD, który charakteryzuje się szybkim przyrostem masy ciała z powodu zwiększonego spożycia w diecie w połączeniu ze zmniejszoną wydajnością metaboliczną, co skutkuje insulinoopornością8,9. Zarówno w modelach zwierzęcych, jak i u ludzi, podwyższenie poziomu glukozy i insuliny we krwi na czczo, a także upośledzona tolerancja na podawanie glukozy są często stosowanymi wskaźnikami insulinooporności i innych ogólnoustrojowych zmian metabolizmu glukozy. Monitorowanie poziomu glukozy i insuliny we krwi w stanie podstawowym lub po stymulacji jest zatem łatwo dostępnymi odczytami.
Obecny protokół opisuje generowanie myszy karmionych HFD, jak również dwie często stosowane metody, doustny test tolerancji glukozy (OGTT) i test insulinooporności (ITT), które są przydatne do scharakteryzowania fenotypu metabolicznego i zbadania zmian w metabolizmie glukozy. Szczegółowo opisujemy OGTT, który ocenia usuwanie podawanego doustnie obciążenia glukozą i wydzielanie insuliny w czasie. Ponadto podajemy instrukcje, jak przeprowadzić ITT w celu zbadania działania insuliny w całym organizmie poprzez monitorowanie stężenia glukozy we krwi w odpowiedzi na bolus insuliny. Protokoły opisane w tym artykule są dobrze ugruntowane i były używane w wielu badaniach10,11,12. Oprócz niewielkich modyfikacji, które mogą pomóc w zwiększeniu sukcesu, udostępniamy wskazówki dotyczące projektowania eksperymentów i analizy danych, a także przydatne wskazówki, jak uniknąć potencjalnych pułapek. Opisane w niniejszym dokumencie protokoły mogą być bardzo potężnymi narzędziami do badania wpływu czynników genetycznych, farmakologicznych, dietetycznych i innych czynników środowiskowych na metabolizm glukozy w całym organizmie i na związane z nim zaburzenia, takie jak insulinooporność. Oprócz stymulacji glukozą lub insuliną, do stymulacji można stosować szereg innych związków w zależności od celu poszczególnych badań. Chociaż wykracza to poza zakres tego manuskryptu, na pobranych próbkach krwi można wykonać wiele innych dalszych zastosowań, takich jak analiza parametrów krwi innych niż glukoza i insulina (np. profile lipidowe i lipoproteinowe), a także szczegółowa analiza markerów metabolicznych (np. za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (PCR), analiza Western blot, oraz test immunoenzymatyczny (ELISA)). Dalsza cytometria przepływowa i sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) mogą być stosowane do badania efektów w odrębnych populacjach pojedynczych komórek, podczas gdy podejścia transkryptomiczne, proteomiczne i metabolomiczne mogą być również wykorzystywane do analizy nieukierunkowanej.
Ogólnie rzecz biorąc, udostępniamy prosty protokół do generowania mysiego modelu wywołanego HFD, jednocześnie opisując dwa potężne podejścia do badania zmian metabolicznych w całym ciele, OGTT i ITT, które mogą być użytecznymi narzędziami do badania patogenezy chorób i opracowywania nowych terapii, szczególnie w dziedzinie chorób związanych z metabolizmem, takich jak insulinooporność i cukrzyca.

<table><tbody><tr><td>Szczep myszy: C57BL/6J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>664</td><td>LFD/HFD</td></tr><tr><td>Accu Chek Performa - Glukometr</td><td>Roche</td><td>6870228</td><td>OGTT/ITT</td></tr><tr><td>Accu Chek Performa - Paski</td><td>Roche</td><td></td><td>6454038 OGTT/ITT</td></tr><tr><td>D-(+)-Roztwór glukozy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8769</td><td>OGTT</td></tr><tr><td>Actrapid - Insulina</td><td>Novo Nordisk</td><td>417642</td><td>ITT</td></tr><tr><td>Igły do karmienia wielokrotnego użytku</td><td>Fine Science Tools</td><td>#18061-22</td> OGTT; Strzykawki dozujące Omnifix-Fine o <td>rozmiarze 22 (-24 dla młodych myszy)</td></tr> <tr><td>Strzykawki dozujące</td><td>Braun</td><td>9161406V</td><td>OGTT/ITT</td></tr><tr><td>Sterican Igła do insuliny (30G x 1/3"; &oslash; 0,30 x 13 mm)</td><td>Braun</td><td>304000</td><td>ITT; chude myszy</td></tr><tr><td>Sterican (G 27 x 3/4"; &oslash; 0,40 x 20 mm)&nbsp; &nbsp;</td><td>Braun</td><td>4657705</td><td>ITT; myszy na płytkach HFD</td></tr><tr><td>96 Well PCR, bez spódnicy, elastycznych</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>SP0016</td><td>OGTT</td></tr><tr><td>Ultraczuły zestaw ELISA do insuliny u myszy</td><td>Crystam Chem</td><td>90080</td><td>OGTT</td></tr><tr><td>Dieta dla gryzoni z 60% kcal% tłuszczu</td><td>Research Diets Inc</td><td>D12492</td><td>myszy na</td></tr><tr><td>diecie HFD dla gryzoni z 10% kcal% tłuszczu.</td><td>Research Diets Inc</td><td>D12450B</td><td>myszy na LFD</td></tr><tr><td>BRAND mikro hematokryt kapilarny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR749321</td><td>OGTT/ITT</td></tr><tr><td>Wazelina - crème</td><td>Riviera</td><td>P1768677</td><td>OGTT/ITT</td></tr></tbody></table>

badanie metabolizmu glukozy in vivo u myszy karmionych dietą wysokotłuszczową przy użyciu doustnego testu tolerancji glukozy (ogtt) i testu tolerancji insuliny (itt)

Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and Insulin Tolerance Test (ITT)

Otyłość stanowi najważniejszy pojedynczy czynnik ryzyka w patogenezie cukrzycy typu 2, choroby, która charakteryzuje się opornością na wychwyt glukozy stymulowany insuliną i dużą dekompensacją ogólnoustrojowego metabolizmu glukozy. Pomimo znacznego postępu w zrozumieniu metabolizmu glukozy, molekularne mechanizmy jej regulacji w zdrowiu i chorobie pozostają niedostatecznie zbadane, a pilnie potrzebne są nowe podejścia do zapobiegania i leczenia cukrzycy. Glukoza pochodząca z diety stymuluje wydzielanie insuliny przez trzustkę, która służy jako główny regulator komórkowych procesów anabolicznych podczas stanu karmienia, a tym samym równoważy poziom glukozy we krwi w celu utrzymania ogólnoustrojowego stanu energetycznego. Przewlekłe przekarmienie wywołuje metastan zapalny, który prowadzi do zmian w sygnalizacji związanej z obwodowymi receptorami insuliny, a tym samym zmniejsza wrażliwość na usuwanie glukozy za pośrednictwem insuliny. Zdarzenia te ostatecznie skutkują podwyższonym poziomem glukozy i insuliny na czczo, a także zmniejszeniem tolerancji glukozy, które z kolei służą jako ważne wskaźniki insulinooporności. W tym miejscu przedstawiamy protokół generowania i charakterystyki metabolicznej myszy karmionych dietą wysokotłuszczową (HFD) jako często stosowany model insulinooporności indukowanej dietą. Szczegółowo ilustrujemy doustny test tolerancji glukozy (OGTT), który monitoruje obwodowe usuwanie podawanego doustnie obciążenia glukozą i wydzielanie insuliny w czasie. Dodatkowo przedstawiamy protokół testu tolerancji insuliny (ITT) do monitorowania działania insuliny w całym organizmie. Łącznie te metody i ich dalsze zastosowania stanowią potężne narzędzia do charakteryzowania ogólnego fenotypu metabolicznego myszy, a także do specyficznej oceny zmian w metabolizmie glukozy. Mogą być one szczególnie przydatne w szeroko pojętej dziedzinie badań nad insulinoopornością, cukrzycą i otyłością, aby zapewnić lepsze zrozumienie patogenezy, a także przetestować efekty interwencji terapeutycznych.

Rycina 1 przedstawia schematyczny harmonogram fenotypowania metabolicznego myszy na różnych dietach. W wieku około 6 tygodni myszy powinny zostać przeniesione na dietę bogatotłuszczową (HFD), podczas gdy grupa na diecie ubogotłuszczowej (LFD) może stanowić grupę kontrolną. Należy co tydzień oznaczać masę ciała, aby zaobserwować oczekiwany przyrost masy. Każdy rodzaj stresu (n.p., hałas lub agresywne zachowanie samców) może zakłócać przyrost masy ciał...

Obecny artykuł opisuje generację i charakterystykę metaboliczną myszy karmionych dietą wysokotłuszczową jako model insulinooporności i otyłości wywołanej dietą. Ponadto zawiera szczegółowe protokoły do wykonywania doustnego testu tolerancji glukozy i testu tolerancji insuliny, monitorując zmiany metabolizmu glukozy w całym organizmie in vivo.

Badanie metabolizmu glukozy in vivo u myszy karmionych dietą wysokotłuszczową przy użyciu doustnego testu tolerancji glukozy (OGTT) i testu tolerancji insuliny (ITT)

Obesity represents the most important single risk factor in the pathogenesis of type 2 diabetes, a disease which is characterized by a resistance to ...

Ogólnym celem tych procedur jest scharakteryzowanie ogólnego fenotypu metabolicznego myszy i specyficzna ocena zmian w metabolizmie glukozy in vivo. Metody te mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie metabolizmu. Są reprezentatywnymi i potężnymi narzędziami do badania wpływu czynników genetycznych, farmakologicznych lub dietetycznych na metabolizm glukozy in vivo.Główną zaletą tych technik jest to, że są one stosunkowo łatwe do wykonania. Dzień przed doustnym testem tolerancji glukozy przenieś myszy do klatki ze świeżą ściółką i wodą pitną, ale bez jedzenia, aby pościć je przez noc przed badaniem. Następnego dnia przygotuj 10 mililitrów 20% roztworu glukozy, rozcieńczając 45% D-glukozy w wodzie destylowanej.Następnie przygotuj płytkę do pobrania osocza, dodając pięć mikrolitrów EDTA sodu na punkt czasowy dla każdej myszy do dołków płytki 96-dołkowej. Podczas eksperymentu przechowuj tę płytkę na lodzie. Następnie zmierz masę ciała wszystkich myszy i zaznacz ich ogony trwałym markerem, aby myszy były łatwe do odróżnienia.Aby pobrać krew do pobrania próbki wyjściowej, użyj ostrych nożyczek, aby ostrożnie odciąć od jednego do dwóch milimetrów końcówki ogona. Zetrzyj pierwszą kroplę krwi, aby uniknąć hemolizy lub zanieczyszczenia płynem tkankowym przed pobraniem nowych próbek krwi do oznaczania stężenia glukozy we krwi. Pobrać małą próbkę krwi do pomiaru podstawowego poziomu glukozy we krwi za pomocą glukometru.Następnie zbierz większą próbkę krwi za pomocą świeżej rurki kapilarnej. Opróżnij rurkę kapilarną za pomocą pipety, umieszczając końcówkę pipety na górze końca rurki kapilarnej i ostrożnie wpychając zebraną krew do studzienki z 96 dołkami, unikając pęcherzyków powietrza. Przygotuj 20% D-glukozę rozpuszczoną w wodzie destylowanej.Aby podać roztwór glukozy, najpierw przytrzymaj mysz, mocno chwytając ją za kark. Nałóż wystarczająco mocno na skórę wokół szyi, aby zapobiec wykręcaniu się myszy i odchylić głowę do tyłu. Upewnij się, że mysz może prawidłowo oddychać.Następnie ostrożnie skieruj igłę do karmienia przez usta w kierunku przełyku. Pozwól myszy połknąć igłę. Po tym, jak igła zatopi się w dolnej części przełyku myszy, wstrzyknąć roztwór glukozy.Uruchom stoper natychmiast po pierwszym zgłębniku i podawaj glukozę wszystkim pozostałym myszom w jednominutowych odstępach. Po rozpoczęciu podawania glukozy bardzo ważne jest dobre zarządzanie czasem. Po 15 minutach zmierz poziom glukozy we krwi za pomocą glukometru, tak jak poprzednio.A następnie pobierz kolejną 30-mikrolitrową próbkę krwi od każdej myszy w tej samej kolejności, w jakiej zostały wstrzyknięte. Pobieranie krwi należy powtórzyć 30, 45, 60, 90, 120, 150 i 180 minut po podaniu glukozy. Upewnij się, że w tym czasie myszy mają dostęp do wody pitnej.Po zakończeniu pomiarów wróć myszy do ich klatek domowych wyposażonych w jedzenie i wodę. Następnie odwirować próbki krwi w temperaturze 2500 razy G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieść supernatant osocza do pustych studzienek płytki 96-dołkowej.A następnie przechowuj płytkę w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu analizy. Co najmniej tydzień po teście tolerancji glukozy należy pościć myszy przez co najmniej dwie godziny przed wstrzyknięciem insuliny, upewniając się, że myszy mają dostęp do wody pitnej. Rozcieńczyć podstawowy roztwór insuliny od jednego do tysiąca 0,9% chlorkiem sodu i przygotować 20% D-glukozę rozpuszczoną w wodzie destylowanej, która będzie podawana, jeśli myszy staną się hipoglikemiczne.Po zważeniu myszy i oznaczeniu ich ogonów oblicz objętość insuliny potrzebną do podania 0,75 jednostki insuliny na kilogram masy ciała. Następnie odetnij końcówkę ogona ostrymi nożyczkami i zmierz podstawowy poziom glukozy we krwi jak poprzednio. Aby wstrzyknąć insulinę dootrzewnowo, należy przytrzymać mysz metodą karku i przechylić głowę myszy w dół pod niewielkim kątem, aby odsłonić brzuszną stronę zwierzęcia.Umieścić napełnioną strzykawkę pod kątem 30 stopni w prawym dolnym kwadrancie brzucha zwierzęcia i wstrzyknąć objętość ze skosem sterylnej igły o rozmiarze 30 skierowanym do góry. Uruchom stoper natychmiast po wstrzyknięciu pierwszej myszy. Zmierz poziom glukozy we krwi w wybranych punktach czasowych.Po upływie ostatnich punktów czasowych umieść myszy z powrotem w ich domowych klatkach przygotowanych z dużą ilością jedzenia i wody. Doustny test tolerancji glukozy zastosowano w celu porównania fenotypu metabolicznego myszy karmionych dietą wysokotłuszczową przez 12 tygodni z myszami karmionymi dietą niskotłuszczową. U myszy LFD tolerujących glukozę szczytowy poziom glukozy we krwi wynoszący około 240 miligramów na decylitr został osiągnięty około 15 minut po podaniu glukozy, a natychmiast po nim nastąpił spadek w kierunku poziomu wyjściowego wskazującego na prawidłową eliminację glukozy.W przeciwieństwie do tego, myszy z HFD osiągnęły szczyt na poziomie około 320 miligramów na decylitr glukozy i prawie nie wykazywały usuwania glukozy. Ponieważ poziomy glukozy we krwi między obiema grupami różnią się w stanie na czczo, przeprowadzono obliczenie obszaru pod krzywą powyżej wyjściowego stężenia glukozy, co potwierdziło wcześniejsze wyniki. Dodatkowo poziom insuliny we krwi określono za pomocą testu ELISA insuliny.Myszy karmione HFD wykazywały podwyższony poziom insuliny na czczo w porównaniu z grupą kontrolną, a także zwiększoną odpowiedź na insulinę, co wskazuje na hiperinsulinemię kompensacyjną wywołaną przez HFD. Aby zmierzyć wrażliwość na insulinę u myszy karmionych HFD, test tolerancji insuliny przeprowadzono tydzień po doustnym teście tolerancji glukozy. W porównaniu z grupą kontrolną karmioną LFD, myszy karmione HFD wykazywały upośledzone obniżenie poziomu glukozy we krwi po podaniu insuliny, co sugeruje insulinooporność.Podczas wykonywania tej procedury szczególnie ważne jest utrzymanie dobrego zarządzania czasem, a także zmniejszenie poziomu stresu u myszy do minimum, aby uzyskać solidne, powtarzalne wyniki. Różnice w tolerancji glukozy, poziomie insuliny i wrażliwości na insulinę, które są uzyskiwane za pomocą procentu metod, mogą pomóc w połączeniu kolejnych złożonych kroków. Może to obejmować na przykład twierdzenia dotyczące hiperglikemii lub hiperinsulinemii lub eksperymenty z izolowanymi wyspami trzustkowymi.

study-vivo-glucose-metabolism-high-fat-diet-fed-mice-using-oral

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Clamp hiperinsulinemiczno-euglikemiczny, lub clamp insulinowy, jest złotym standardem w ocenie działania insuliny in vivo. Opisano metodę przeprowadzania clampów insulinowych u myszy. Obejmuje ona metodę cewnikowania tętniczego, która pozwala na wykonywanie eksperymentów na świadomych, nieskrępowanych myszach przy minimalnym stresie.

Zaciski hiperinsulinemiczno-euglikemiczne u świadomych, nieunieruchomionych myszy

Ten film pokazuje, jak przeprowadzić doustny test tolerancji glukozy na myszy laboratoryjnej.

Doustny test tolerancji glukozy (OGTT): pomiar metabolizmu glukozy u myszy

Celem tego protokołu jest przedstawienie standardowej metody przeprowadzania dożylnych testów tolerancji glukozy (IVGTT) w celu oceny kontroli glikemii u naczelnych innych niż ludzie i oceny ich statusu metabolicznego od zdrowego do dysmetabolicznego.

Charakterystyka stanu metabolicznego u naczelnych innych niż ludzie za pomocą dożylnego testu tolerancji glukozy

Ten protokół bada rolę ligandu 5 (CCL5) chemokiny (motyw C-C) w podwzgórzu, dostarczając antagonistę, MetCCL5, do mózgu myszy za pomocą systemu infuzji mózgu za pomocą mikro-pompy osmotycznej. To przejściowe zahamowanie aktywności CCL5 przerwało sygnalizację insuliny w podwzgórzu, prowadząc do nietolerancji glukozy i obwodowej ogólnoustrojowej wrażliwości na insulinę.

Badanie sygnału insuliny podwzgórzowej do obwodowej nietolerancji glukozy za pomocą systemu ciągłego wlewu leków do mózgu myszy

Częstość występowania otyłości wzrasta i zwiększa ryzyko przewlekłych chorób płuc. Aby ustalić podstawowe mechanizmy i strategie zapobiegawcze, potrzebne są dobrze zdefiniowane modele zwierzęce. W tym miejscu przedstawiamy trzy metody (test tolerancji glukozy, pletysmografia ciała i stabilizacja płuc) w celu zbadania wpływu otyłości na wyniki płucne u myszy.

Dootrzewnowy test tolerancji glukozy, pomiar czynności płuc i zespolenie płuc w celu zbadania wpływu otyłości i upośledzonego metabolizmu na wyniki płucne

W tym badaniu opisujemy system in-ovo jako obiecujące narzędzie do testowania związków insulinomimetycznych w żywym organizmie. Do głównych zalet należy zaliczyć odpowiednie przepustowości i akceptowalne koszty, które umożliwiają identyfikację fitozwiązków o właściwościach insulinomimetycznych.

Model in ovo do badania związków insulinomimetycznych

Ten protokół opisuje użycie analizatora składu ciała i systemu monitorowania metabolizmu zwierząt do charakteryzowania składu ciała i parametrów metabolicznych u myszy. Jako przykład zastosowania tych technik podaje się model otyłości wywołanej przez żywienie wysokotłuszczowe.

Analiza składu ciała i metabolicznego umieszczania w klatkach u myszy karmionych wysokotłuszczowo

Obecny artykuł opisuje szczegółowy protokół przerywanego postu izokalorycznego 2:1 w celu ochrony i leczenia przed otyłością i upośledzonym metabolizmem glukozy u myszy typu dzikiego i ob/ob.

Ocena skutków metabolicznych izokalorycznego postu przerywanego 2:1 u myszy

To badanie opisuje bezpośredni pomiar produkcji glukozy w wątrobie w mysim modelu zespołu policystycznych jajników przy użyciu stabilnego izotopowego znacznika glukozy przez żyłę ogonową zarówno na czczo, jak i w stanie bogatym w glukozę w tandemie.

Ocena produkcji glukozy w wątrobie w mysim modelu zespołu policystycznych jajników

Zacisk hiperglikemiczny służy do pomiaru uwalniania insuliny przy utrzymującym się wyższym stężeniu glukozy we krwi. Zacisk hipoglikemiczny służy do pomiaru produkcji glukozy indukowanej reakcjami przeciwregulacyjnymi. Obie metody wykorzystują tę samą procedurę chirurgiczną. W tym miejscu przedstawiamy technikę zaciskową do oceny ogólnoustrojowego metabolizmu glukozy.

Zacisk hiperglikemiczny i zacisk hipoglikemiczny u świadomych myszy

Poznaj metody oceny metabolizmu glukozy u myszy karmionych dietą wysokotłuszczową przy użyciu testów OGTT i ITT. Protokoły te umożliwiają badanie insulinooporności in vivo.

Badanie metabolizmu glukozy in vivo u myszy karmionych dietą wysokotłuszczową przy użyciu doustnego testu tolerancji glukozy (OGTT) i testu tolerancji insuliny (ITT) (Wideo) | JoVE Journal

Badanie metabolizmu glukozy in vivo u myszy karmionych dietą wysokotłuszczową przy użyciu doustnego testu tolerancji glukozy (OGTT) i testu tolerancji insuliny (ITT)

Przeglądaj więcej filmów