Name: Wykorzystanie analizy filogenetycznej do zbadania pochodzenia genów eukariotycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Odkryj metodę analizy filogenetycznej białek SWEET przy użyciu Clustal Omega i MEGA. Technika ta ułatwia zrozumienie ewolucyjnych relacji między homologicznymi genami eukariotycznymi i prokariotycznymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (31371596), Centrum Badań Biotechnologicznych, Chiński Uniwersytet Trzech Przełomów (2016KBC04) oraz Fundację Nauk Przyrodniczych prowincji Jiangsu, Chiny (BK20151424).

1. Wyrównanie sekwencji
<ol>
	<li>Zbierz sekwencje aminokwasów eukariotycznych SWEET i prokariotycznych SemiSWEET w osobnych dokumentach i wymień je w formacie FASTA. Pobierz sekwencje z baz danych National Center for Biotechnology Information (NCBI), Europejskiego Laboratorium Biologii Molekularnej (EMBL) i Japońskiego Banku Danych DNA (DDBJ) według wyszukiwania podobieństw za pomocą narzędzia Basic Local Alignment Search Tool (BLAST).
	<ol>
		<li>W przykładowych plikach zbierz 228 przypuszczalnych sekwencji białek SWEET posiadających dwie domeny MtN3/śliny (7 helis transbłonowych) eukariontów i 57 sekwencji białek SemiSWEET posiadających pojedynczą domenę MtN3/śliny (3 helisy transbłonowe) prokariontów13.</li>
		<li>Aby uprościć ten proces, wybierz 35 potencjalnych białek SWEET z jednokomórkowych organizmów eukariotycznych spośród 228 przypuszczalnych SWEET do budowy drzewa filogenetycznego. Sekwencje te są dołączone po to, aby czytelnik mógł ćwiczyć na rzeczywistym zestawie danych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dopasuj 35 sekwencji SWEET, wprowadzając je do Clustal Omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/).
	<ol>
		<li>Skopiuj i wklej sekwencje białek w formacie FASTA do pola wejściowego lub prześlij plik sekwencji w formacie FASTA. Określ, że jest to sekwencja aminokwasów, klikając ikonę pod menu rozwijanym w sekcji "KROK 1".</li>
		<li>W razie potrzeby określ format wyjściowy i inne parametry w sekcji "KROK 2". W tym badaniu ustaw format wyjściowy jako "clustal bez numeru" i pozostaw inne parametry na ustawieniach domyślnych. W większości przypadków parametry domyślne działają dobrze bez żadnej specyfikacji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Prześlij i uruchom wyrównanie w sekcji "KROK 3". Wyrównanie może potrwać od kilku sekund do minut. W panelu "Podsumowanie wyników" kliknij prawym przyciskiem myszy link pod "Wyrównanie w formacie CLUSTAL" i zapisz wyrównane sekwencje jako "35.clustal" (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Otwórz plik wyników wyrównania w BioEdit.
	<ol>
		<li>W głównym panelu BioEdit kliknij "Sekwencja" i wybierz "Edytuj nastrój" w pierwszym menu rozwijanym, a następnie kliknij "Edytuj pozostałości" w podmenu (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2).</li>
		<li>Zaznacz wystające sekwencje po lewej stronie wyrównania z kursorem (wybrana sekwencja będzie pokazana na czarno) i kliknij ikonę "Usuń" w menu "Edycja", aby usunąć wybrane sekwencje (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
		<li>Zaznacz i usuń wystające sekwencje po prawej stronie pierwszej domeny MtN3/śliny, a następnie zapisz przycięte pierwsze sekwencje MtN3/domeny śliny jako 35-I.fas (<silna klasa="xfig">Rysunek 4). Podobnie, usuń wystające sekwencje po lewej i prawej stronie drugiej domeny MtN3/śliny i zapisz ją jako 35-II.fas. Pierwszą i drugą sekwencję MtN3/domeny śliny można przewidzieć z wyprzedzeniem za pomocą RHYTHM (http://proteinformatics.charite.de/rhythm/inndex.php?site=helix) lub TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Otwórz plik 35-I.fas za pomocą MEGA i kliknij "wyrównaj", gdy zostaniesz o to poproszony. W menu "Edycja" kliknij "Zaznacz wszystko", a następnie kliknij "Wybierz sekwencje"; nazwy i sekwencje taksonów zostaną zaznaczone kolorem czarnym (Rysunek 5).
	<ol>
		<li>Wybierz "Kopiuj" z menu "Edycja", aby skopiować sekwencje do schowka, a następnie wklej skopiowane sekwencje do pliku doc.</li>
		<li>W pliku doc zamień cały ciąg "#" na ">", a następnie usuń wszystkie niepowiązane znaki, aby przekonwertować je na format FASTA. Dodaj "-I" na końcu każdej nazwy taksonu, aby oznaczyć je jako pierwsze sekwencje domen MtN3/śliny. Przetwarzaj drugą sekwencję domen MtN3/śliny zgodnie z tą samą metodą i dodaj "-II" po każdej nazwie taksonu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Połącz pierwszą i drugą sekwencję domeny MtN3/śliny w formacie FASTA w pliku doc.
	<ol>
		<li>Załaduj ponownie połączone sekwencje do Clustal Omega i wyrównaj sekwencje zgodnie z powyższym opisem. Zapisz wynik jako "35 realigned.clustal".</li>
		<li>Otwórz plik "35 realigned.clustal" w BioEdit, usuń nierówne (wystające) reszty aminokwasowe na obu końcach wyrównanych sekwencji, a następnie zapisz sekwencje jako "35 realigned.fas". Kliknij "Tak" po wyświetleniu ostrzeżenia, że niektórych niestandardowych znaków nie można zapisać.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Obliczanie drzewa filogenetycznego
<ol>
	<li>Otwórz "35 realigned.fas" w MEGA.
	<ol>
		<li>Kliknij menu "Dane" i wybierz "Eksportuj wyrównanie", a następnie zapisz wyrównanie w formacie PAUP (nexus) jako "35.nex" do późniejszego wykorzystania w MrBayes (Rysunek 6).</li>
		<li>W międzyczasie kliknij ikonę "Modele" na głównym panelu MEGA, wybierz "Znajdź najlepsze modele DNA/białka (ML)" i kliknij "OK" w wyskakującym okienku. Kliknij "Compute", aby rozpocząć proces wyszukiwania modelu (Rysunek 7). Otworzy się nowy panel postępu; Proces ten trwa od kilku minut do kilku dni, w zależności od złożoności załadowanych sekwencji i wydajności komputera. 
		UWAGA: Tabela przedstawiająca wyniki otworzy się po zakończeniu procesu wyszukiwania modelu ( Rysunek 8). Najmniejszy wynik BIC zostanie wymieniony jako pierwszy, a następnie seria różnych modeli ze stopniowo rosnącymi wynikami BIC. Pierwszy model "LG+G+F" z najmniejszym wynikiem BIC jest zalecanym modelem dla drzewa ML opartym na pliku "35 realigned.fas".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kliknij ikonę "Filogeneza" na głównym panelu MEGA, kliknij "Zbuduj/Przetestuj drzewo maksymalnego prawdopodobieństwa", a następnie kliknij "Tak" w panelu wyskakującym. Otworzy się nowe okno z różnymi parametrami, które należy określić (Rysunek 9).
	<ol>
		<li>Najpierw ustaw wartość bootstrap w teście pola filogenezy; 500 lub 1,000 jest wystarczające w większości przypadków. W modelu podstawiania wybierz "aminokwas" jako typ podstawienia. Celem wyboru modelu podstawiania jest oszacowanie rzeczywistej różnicy między sekwencjami na podstawie ich obecnych stanów3.</li>
		<li>Wybierz "LG z częstotliwościami. (+F) model" (LG+F) w polu modelu/metody. W polu współczynniki i wzorzec wybierz "Rozkład gamma" (G), aby opisać różnice szybkości między lokalizacjami, tj. przywiązując większą wagę do zmian w wolno ewoluujących lokalizacjach3. W polu podzbioru danych wybierz opcję "Całkowite usunięcie", aby usunąć wszystkie kolumny zawierające łączniki.</li>
		<li>Zachowaj wszystkie inne parametry w ich domyślnych stanach (Rysunek 9). Po określeniu tych parametrów kliknij ikonę "Oblicz", aby rozpocząć obliczenia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Prezentacja drzewa filogenetycznego
UWAGA: Filogenetyczne drzewo ML zostanie zaprezentowane po zakończeniu obliczeń przy użyciu MEGA (<silna klasa="xfig">Rysunek 10).
<ol>
	<li>Z menu rozwijanego ikony "Plik" w panelu drzewa wybierz "Zapisz bieżącą sesję", aby zapisać wynik (.mas jest domyślnym typem pliku). W niniejszym badaniu wynik został zapisany jako "35.mas". W panelu drzewa wyświetlanych jest wiele parametrów, w tym długość kladu, styl drzewa, topologia drzewa, czcionka nazwy taksonu, rozmiar i kolor, które można ustawić na różne opcje.</li>
	<li>Zapisz końcowy plik drzewa, klikając ikonę obrazu, i zapisz rysunek w różnych formatach lub skopiuj obraz jako źródło do edycji zdjęć.</li>
</ol>
4. Analiza relacji między SWEETs i SemiSWEETs za pomocą dopasowania sekwencji
UWAGA: Ten krok może nie być potrzebny w zwykłej analizie sekwencji.
<ol>
	<li>Dopasuj 228 eukariotycznych SŁODYCZY i 57 prokariotycznych SemiSWEET w Clustal Omega, jak opisano powyżej. Wyniki wyrównania można wyświetlić w Jalview, który jest zintegrowany z Clustal Omega i skopiować w celu zapisania w edytorze zdjęć (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 11). 
	UWAGA: W przykładowym dopasowaniu niektóre SemiSWEET z α-Proteobacteria są wyrównane z pierwszą domeną MtN3 / ślina sekwencji SWEET, podczas gdy SemiSWEET z Methanobacteria (archeony) są wyrównane z drugą domeną MtN3 / ślina sekwencji SWEET.</li>
</ol>
5. Budowa drzewa filogenetycznego z MrBayesem
<ol>
	<li>W przypadku wnioskowań bayesowskich z MrBayesem otwórz plik wykonywalny MrBayes, a interfejs DOS pojawi się w nowym oknie. Pierwszym krokiem jest odczytanie pliku danych nexusa. Wpisz "execute 35.nex" po monicie (pamiętaj, aby zapisać plik 35.nex w tym samym katalogu, w którym znajduje się plik wykonywalny MrBayes, lub wskazać ścieżkę pliku przed jego przesłaniem). Komunikat "pomyślny odczyt macierzy" zostanie wyświetlony po ostatnim z wymienionych taksonów (Rysunek 12). Plik 35.nex został już przygotowany i zapisany w MEGA (patrz 2.1 powyżej).</li>
	<li>Ustal model ewolucyjny.
	<ol>
		<li>Po wyświetleniu monitu wpisz "prset aamodelpr = fixed(lg); lset rates = g". "lg" i "g" odpowiadają modelowi "LG" i "G", który jest osadzony w MEGA. Po pomyślnym ustawieniu modelu wpisz "mcmc nchains = 4 ngen = 5 000 000" po wyświetleniu monitu. Użycie wpisu "nchains=4" oznacza łączną liczbę jednego łańcucha chłodniczego i trzech łańcuchów gorących dla sprzężenia Metropolis. "ngen = 5 000 000" oznacza uruchomienie 5 000 000 generacji sprzężenia Metropolis w celu konwergencji łańcuchów zimnych i gorących. W tym badaniu średnie odchylenie standardowe częstości podziału poniżej 0,01 uznano za zbieżność łańcuchów gorących i zimnych.</li>
		<li>Należy pamiętać, że liczba ngen nie może być dokładnie przewidziana na początku procesu i zwykle musi być dostosowana w oparciu o zmianę średniego odchylenia standardowego częstości podziału. Ponadto liczba ngen dla konwergencji może być inna za każdym razem podczas uruchamiania programu na podstawie tych samych danych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom analizę: Ten krok trwa od kilku minut do kilku dni, w zależności od złożoności danych wejściowych i wydajności komputera. Po zakończeniu wstępnie ustawionych obliczeń pojawi się pytanie "Kontynuować analizę (tak/nie)?" Jeśli po monicie zostanie wpisane "no", przetwarzanie zostanie zatrzymane (Rysunek 13), w przeciwnym razie będzie kontynuować obliczenia po wprowadzeniu liczby kolejnych generacji. Po zakończeniu obliczeń (ze średnim odchyleniem standardowym częstości podziału <0,01 lub 0,05) zatrzymaj obliczenia, wpisując "nie" po monicie zapytania. 
	UWAGA: 0,01 to ścisłe kryterium, 0,05 to umiarkowane i zwykle wystarczające.</li>
	<li>Podsumuj próbki: Wpisz "sump" po monicie, aby podsumować próbki parametrów modelu (Rysunek 14). Następnie wpisz "sumt relburnin=yes burninfrac=0.25" po wyświetleniu monitu, aby podsumować próbki drzewa. Szczegółowe informacje na temat budowy drzewa filogenetycznego zostaną wyświetlone jak w Rysunek 15, a następnie dwie figury drzewa, które pojawią się w kodzie ASC II na ekranie, jedna pokazująca wiarygodność kladu, a druga pokazująca długość gałęzi. W tym samym czasie plik drzewa o nazwie "35.nex.con" zostanie automatycznie zapisany.</li>
	<li>Dla lepszej prezentacji drzewa filogenetycznego otwórz plik drzewa "35.nex.con" za pomocą narzędzia FigTree (http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/), wybierz styl lub rozmiar do wyświetlenia wyniku (Rysunek 16), a nawet edytuj go w edytorze zdjęć, aby był bardziej przyjazny dla czytelnika.</li>
</ol>

<ol><li>Nei, M., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNei%2C+M+%22Molecular+Evolution+and+Phylogenetics%22">Molecular Evolution and Phylogenetics</a>. , Oxford University Press. Oxford. (2000).</li>
<li>Foth, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+analysis+to+uncover+organellar+origins+of+nuclear-encoded+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic analysis to uncover organellar origins of nuclear-encoded genes.</a> Methods Mol Biol. 390, 467-488 (2007).</li>
<li>Baldauf, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogeny+for+the+faint+of+heart%3A+a+tutorial%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Phylogeny for the faint of heart: a tutorial.</a> Trends Genet. 19, 345-351 (2003).</li>
<li>Feng, D. F., Doolittle, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+sequence+alignment+as+a+prerequisite+to+correct+phylogenetic+trees%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Evol%22%5BJournal%5D)">Progressive sequence alignment as a prerequisite to correct phylogenetic trees.</a> J Mol Evol. 25, 351-360 (1987).</li>
<li>Persson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatics+in+protein+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22EXS%22%5BJournal%5D)">Bioinformatics in protein analysis.</a> EXS. 88, 215-231 (2000).</li>
<li>Sievers, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+scalable+generation+of+high-quality+protein+multiple+sequence+alignments+using+Clustal+Omega%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega.</a> Mol Syst Biol. 7, 539(2011).</li>
<li>Sievers, F., Higgins, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustal+omega%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Clustal omega.</a> Curr Protoc Bioinformatics. 48, 1-16 (2014).</li>
<li>Yang, Z., Rannala, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+phylogenetics%3A+principles+and+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Molecular phylogenetics: principles and practice.</a> Nat Rev Genet. 13, 303-314 (2012).</li>
<li>Hall, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+accuracies+of+several+phylogenetic+methods+using+protein+and+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Comparison of the accuracies of several phylogenetic methods using protein and DNA sequences.</a> Mol Biol Evol. 22, 792-802 (2005).</li>
<li>Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEGA6%3A+Molecular+Evolutionary+Genetics+Analysis+version+6.0%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0.</a> Mol Biol Evol. 30, 2725-2729 (2013).</li>
<li>Ronquist, F., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22357727">MrBayes 3.2: efficient Bayesian phylogenetic inference and model choice across a large model space.</a> Syst Biol. 61, 539-542 (2012).</li>
<li>Chen, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugar+transporters+for+intercellular+exchange+and+nutrition+of+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sugar transporters for intercellular exchange and nutrition of pathogens.</a> Nature. 468, 527-532 (2010).</li>
<li>Xuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+oligomerization+for+bacterial+and+plant+SWEET+sugar+transporter+family%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Functional role of oligomerization for bacterial and plant SWEET sugar transporter family.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110, 3685-3694 (2013).</li>
<li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+evidence+for+a+fusion+of+archaeal+and+bacterial+SemiSWEETs+to+form+eukaryotic+SWEETs+and+identification+of+SWEET+hexose+transporters+in+the+amphibian+chytrid+pathogen+Batrachochytrium+dendrobatidis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic evidence for a fusion of archaeal and bacterial SemiSWEETs to form eukaryotic SWEETs and identification of SWEET hexose transporters in the amphibian chytrid pathogen Batrachochytrium dendrobatidis.</a> FASEB J. 30, 3644-3654 (2016).</li>
<li>Holder, M. T., Zwickl, D. J., Dessimoz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+robustness+of+phylogenetic+methods+to+among-site+variability+in+substitution+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Evaluating the robustness of phylogenetic methods to among-site variability in substitution processes.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363, 4013-4021 (2008).</li>
<li>Alfaro, M. E., Holder, M. T. <a target="_blank" href="http://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.ecolsys.37.091305.110021?journalCode=ecolsys">The Posterior and the Prior in Bayesian Phylogenetics.</a> Annu Rev Ecol Evol Syst. 37, 19-42 (2006).</li>
<li>Suchard, M., Rambaut, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Many-core+algorithms+for+statistical+phylogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Many-core algorithms for statistical phylogenetics.</a> Bioinformatics. 25, 1370-1376 (2009).</li>
<li>Zierke, S., Bakos, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FPGA+acceleration+of+the+phylogenetic+likelihood+function+for+Bayesian+MCMC+inference+methods%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">FPGA acceleration of the phylogenetic likelihood function for Bayesian MCMC inference methods.</a> BMC Bioinformatics. 11, 184(2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W badaniach biologicznych coraz popularniejsze staje się tworzenie drzewa filogenetycznego opartego na sekwencjach nukleotydów lub aminokwasów8. Ogólnie rzecz biorąc, istnieją trzy krytyczne etapy praktyki, w tym wyrównanie sekwencji, ocena wyrównanych sekwencji za pomocą odpowiedniej metody lub algorytmu oraz wizualizacja wyniku obliczeniowego jako drzewa filogenetycznego. W prezentowanym badaniu przeprowadzono trzy rundy dopasowywania sekwencji: po pierwsze, sekwencje białka SWEET, w tym pierwsz...

Sekwencje DNA lub RNA zawierają informacje genetyczne dla podstawowych fenotypów, które mogą być analizowane metodami fizjologicznymi i biochemicznymi lub obserwowane za pomocą dowodów morfologicznych i kopalnych. W pewnym sensie informacja genetyczna jest bardziej wiarygodna niż ocena fenotypów zewnętrznych, ponieważ ta pierwsza jest podstawą dla drugiej. W badaniach ewolucyjnych dowody kopalne są bardzo bezpośrednie i przekonujące. Jednak wiele organizmów, takich jak mikroorganizmy, ma niewielkie szanse na uformowanie skamieniałości podczas długich epok geologicznych. Dlatego informacje molekularne, takie jak sekwencje nukleotydowe i sekwencje aminokwasów z pokrewnych istniejących organizmów, są cenne dla badania relacji ewolucyjnych1. W niniejszym badaniu zapewniono proste wprowadzenie podstawowej wiedzy filogenetycznej i łatwy do nauczenia się protokół dla nowicjuszy, którzy muszą samodzielnie skonstruować drzewo filogenetyczne.
Zarówno sekwencje DNA (nukleotydowe), jak i białkowe (aminokwasowe) mogą być używane do wnioskowania o filogenetycznych związkach między homologicznymi genami, organellami, a nawet organizmami2. Bardziej prawdopodobne jest, że sekwencje DNA ulegną zmianom zachodzącym podczas ewolucji. W przeciwieństwie do tego, sekwencje aminokwasów są znacznie bardziej stabilne, biorąc pod uwagę, że synonimiczne mutacje w sekwencjach nukleotydowych nie powodują mutacji w sekwencjach aminokwasów. W rezultacie, sekwencje DNA są przydatne do porównywania homologicznych genów z blisko spokrewnionych organizmów, podczas gdy sekwencje aminokwasów są odpowiednie dla homologicznych genów z odległych organizmów3.
Analiza filogenetyczna rozpoczyna się od dopasowania sekwencji aminokwasów lub nukleotydów4 pobranych z bazy danych sekwencjonowania genomu z adnotacjami5 wymienionych w formacie FASTA, tj. przypuszczalnych lub wyrażonych sekwencji białek, sekwencji RNA lub sekwencji DNA. Warto zauważyć, że bardzo ważne jest zebranie wysokiej jakości sekwencji do analizy, a do analizy powiązań filogenetycznych można wykorzystać tylko sekwencje homologiczne. Do wyrównywania sekwencji można wykorzystać wiele różnych platform, takich jak Clustal W, Clustal X, Muscle, T-coffee, MAFFT. Najczęściej używanym jest Clustal Omega6,7 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/), z którego można korzystać online lub można go pobrać bezpłatnie. Narzędzie do wyrównywania ma wiele parametrów, które użytkownik może dostosować przed rozpoczęciem wyrównania, ale parametry domyślne działają dobrze w większości przypadków. Po zakończeniu procesu wyrównane sekwencje powinny zostać zapisane w odpowiednim formacie dla następnego kroku. Powinny być one następnie edytowane lub przycinane za pomocą oprogramowania do edycji, takiego jak BioEdit, ponieważ konstrukcja drzewa filogenetycznego przez MEGA wymaga, aby sekwencje były równej długości (w tym zarówno skróty aminokwasów, jak i łączniki). W wyrównanej sekwencji dowolna pozycja bez aminokwasu lub nukleotydu jest reprezentowana przez łącznik "-"). Ogólnie rzecz biorąc, wszystkie wystające aminokwasy lub nukleotydy na obu końcach wyrównania powinny zostać usunięte. Ponadto kolumny zawierające źle wyrównane sekwencje w wyrównaniu mogą zostać usunięte, ponieważ przekazują niewiele cennych informacji, a czasami mogą dawać mylące lub fałszywe informacje3. Kolumny zawierające jeden lub więcej łączników można usunąć w tym momencie lub na późniejszym etapie budowy drzewa. Alternatywnie można je wykorzystać do obliczeń filogenetycznych. Po zakończeniu wyrównywania i przycinania sekwencji wyrównane sekwencje należy zapisać w formacie FASTA lub żądanym formacie do późniejszego wykorzystania.
Wiele platform oprogramowania udostępnia funkcje budowy drzew przy użyciu różnych metod lub algorytmów. Ogólnie rzecz biorąc, metody te można sklasyfikować jako metody macierzy odległości lub metody danych dyskretnych. Metody macierzy odległości są proste i szybkie do obliczenia, podczas gdy metody danych dyskretnych są skomplikowane i czasochłonne. W przypadku bardzo blisko spokrewnionych taksonów o wysokim stopniu współdzielenia identyczności sekwencji aminokwasów lub nukleotydów stosuje się metodę macierzy odległości (Neighbor Joining: NJ; Metoda grup par nieważonych ze średnią arytmetyczną: UPGMA) jest odpowiednia; w przypadku daleko spokrewnionych taksonów – metodę danych dyskretnych (maksymalne prawdopodobieństwo: ML; Maksymalna oszczędność: MP; Wnioskowanie bayesowskie) jest optymalne3,8. W tym badaniu metody uczenia maszynowego w MEGA (6.0.6) i wnioskowaniu bayesowskim (MrBayes 3.2) zostały zastosowane do konstruowania drzew filogenetycznych9. Idealnie, gdy stosuje się odpowiedni model i parametry, wyniki uzyskane za pomocą różnych metod mogą być spójne, a tym samym bardziej wiarygodne i przekonujące.
Dla drzewa filogenetycznego ML zbudowanego przy użyciu MEGA10, plik sekwencji wyrównanej w formacie FASTA musi zostać przesłany do programu. Pierwszym krokiem jest więc wybór optymalnego modelu podstawiania dla wgrywanych danych. Wszystkie dostępne modele substytucji są porównywane na podstawie przesłanych sekwencji, a ich końcowe wyniki zostaną pokazane w tabeli wyników. Wybierz model z najmniejszym wynikiem Bayesowskiego kryterium informacyjnego (BIC) (wymienionym jako pierwszy w tabeli), ustaw parametry uczenia maszynowego zgodnie z zalecanym modelem i rozpocznij obliczenia. Czas obliczeń waha się od kilku minut do kilku dni, w zależności od złożoności załadowanych danych (długość sekwencji i liczba taksonów) oraz wydajności komputera, na którym uruchamiane są programy. Po zakończeniu obliczeń drzewo filogenetyczne zostanie wyświetlone w nowym oknie. Zapisz plik jako "FileName.mat". Po ustawieniu parametrów określających wygląd drzewa, zapisz jeszcze raz. Korzystając z tej metody, MEGA może generować figury drzewa filogenetycznego klasy publikacji.
Do budowy drzewa za pomocą MrBayes11, pierwszym krokiem jest przekształcenie wyrównanej sekwencji, która zwykle jest wyświetlana w formacie FASTA, w format nexus (.nex jako typ pliku). Przekształcanie plików FASTA do formatu nexus można przetwarzać w MEGA. Następnie wyrównaną sekwencję w formacie nexus można przesłać do MrBayes. Po pomyślnym przekazaniu pliku określ szczegółowe parametry obliczeń drzewa. Parametry te obejmują szczegóły, takie jak model podstawiania aminokwasów, współczynniki zmienności, numer łańcucha dla sprzężenia Monte Carlo łańcucha Markowa (MCMC), liczba ngen, średnie odchylenie standardowe częstości podziału i tak dalej. Po określeniu tych parametrów rozpocznij obliczenia. Na koniec na ekranie zostaną wyświetlone dwie figury drzewa w kodzie ASC II, jedna pokazująca wiarygodność kladu, a druga pokazująca długość gałęzi.
Wynik drzewa zostanie automatycznie zapisany jako "FileName.nex.con". Ten plik drzewa może być otwierany i edytowany przez FigTree, a rysunek wyświetlany w FigTree może być dalej modyfikowany, aby był bardziej odpowiedni do publikacji.
W tym badaniu, jako przykład, analizowano 228 białek SWEET, w tym 35 SWEETs od jednokomórkowych eukariontów i 57 SemiSWEETs od prokariontów. Zarówno SWEETs, jak i SemiSWEET zostały scharakteryzowane jako transportery glukozy, fruktozy lub sacharozy przez błony12,13. Analiza filogenetyczna sugeruje, że dwie domeny MtN3/śliny zawierające SWEETs mogą pochodzić z ewolucyjnej fuzji bakterii SemiSWEET i archeon14.

<table><tbody><tr><td>Adobe Illustration</td><td></td><td></td>, <td>narzędzie graficzne opracowane przez Adobe Systems Software Ireland Ltd. Copyright &copy; 2017</td></tr><tr><td>BioEdit</td><td></td><td></td><td>edytor wyrównania sekwencji biologicznych napisany dla systemu Windows 95/98/NT/2000/XP/7. Prawa autorskie &copy; Tom Hall</td></tr><tr><td>Clustal Omega</td><td></td><td></td><td>to pakiet do tworzenia wielu dopasowań sekwencji aminokwasów lub nukleotydów.&nbsp; http://www.clustal.org/</td></tr> <tr><td>CorelDRAW</td><td></td><td></td><td>to oprogramowanie do projektowania graficznego. Prawa autorskie &copy; 2017 Corel Corporation</td></tr><tr><td>FigTree</td><td></td><td></td><td>, graficzna przeglądarka drzew filogenetycznych zaprojektowana przez Uniwersytet w Edynburgu</td></tr><tr><td>MEGA</td><td></td><td></td><td>MolecularEvolutionary Genetics Analysis w wersji 6.0 http://www.megasoftware.net/home</td></tr><tr><td>MrBayes</td><td></td><td></td><td>, bayesowskie narzędzie do wnioskowania filogenetycznego</td></tr><tr><td>NVIDIA</td><td></td><td></td><td>Firma projektuje procesory graficzne (GPU) dla rynku gier i profesjonalnych. Prawa autorskie i kopia korporacyjna; 2017</td></tr><tr><td>PAUP</td><td></td><td></td><td>Analiza filogenetyczna z wykorzystaniem oszczędności. Program Davida Swofforda implementuje metodę maksymalnego prawdopodobieństwa w wielu modelach nukleotydowych.</td></tr><tr><td>Photoshop</td><td></td><td></td><td>, edytor grafiki rastrowej opracowany i opublikowany przez Adobe Systems Software Ireland Ltd. Copyright &copy; 2017</td></tr><tr><td>RHYTHM</td><td></td><td></td><td>to oparte na wiedzy przewidywanie kontaktów hekix. Charit&eacute; Berlin &ndash; Protein Formatics Group - Copyright 2007-2009</td></tr><tr><td>TMHMM</td><td></td><td></td><td>narzędzie do przewidywania helis transbłonowych w białkach. http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/</td></tr> <tr><td>Compter</td><td></td><td></td><td>4 GB pamięci, Core 2 lub szybszy procesor. Okna 7, Windows 10</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie analizy filogenetycznej do zbadania pochodzenia genów eukariotycznych

Using Phylogenetic Analysis to Investigate Eukaryotic Gene Origin

Analiza filogenetyczna wykorzystuje sekwencje nukleotydów lub aminokwasów lub inne parametry, takie jak sekwencje domen i trójwymiarowa struktura, do skonstruowania drzewa pokazującego ewolucyjne relacje między różnymi taksonami (jednostkami klasyfikacyjnymi) na poziomie molekularnym. Analiza filogenetyczna może być również wykorzystana do zbadania relacji domenowych w obrębie pojedynczego taksonu, szczególnie w przypadku organizmów, które przeszły znaczne zmiany w morfologii i fizjologii, ale dla których badaczom brakuje dowodów kopalnych ze względu na długą historię ewolucyjną organizmów lub niedobór fosylizacji.
W tym tekście opisany jest szczegółowy protokół korzystania z metody filogenetycznej, w tym wyrównanie sekwencji aminokwasów za pomocą Clustal Omega, a następnie budowa drzewa filogenetycznego przy użyciu zarówno Maksymalnego Prawdopodobieństwa (ML) Molekularnej Analizy Genetyki Ewolucyjnej (MEGA), jak i Wnioskowania Bayesowskiego za pomocą MrBayes. Aby zbadać pochodzenie genów eukariotycznych cukrów w końcu zostanie wyeksportowanych (SWEET), przeanalizowano 228 genów SWEETs, w tym 35 białek SWEET od jednokomórkowych eukariontów i 57 białek półsłodkich od prokariontów. Co ciekawe, SemiSWEETs znaleziono u prokariontów, ale SWEETs znaleziono u eukariontów. Dwa drzewa filogenetyczne skonstruowane przy użyciu teoretycznie odrębnych metod konsekwentnie sugerują, że pierwszy eukariotyczny gen SWEET może powstać z fuzji bakteryjnego genu SemiSWEET i archeonowego genu SemiSWEET. Warto zauważyć, że należy być ostrożnym w wyciąganiu wniosków wyłącznie na podstawie analizy filogenetycznej, chociaż jest to przydatne do wyjaśnienia podstawowych relacji między różnymi taksonami, co jest trudne lub nawet niemożliwe do dostrzeżenia za pomocą środków eksperymentalnych.

Drzewa filogenetyczne wykazują, że wszystkie pierwsze domeny MtN3/saliva z 35 sekwencji SWEET skupiły się w jednym kladzie, a drugie domeny MtN3/saliva sekwencji SWEET skupiły się w innym kladzie. Ponadto wyniki dopasowania białek SWEET i SemiSWEET pokazują, że niektóre białka SemiSWEET z $\alpha$-Proteobacteria dopasowały się do pierwszej domeny MtN3/saliva sekwencji SWEET, podczas gdy białka SemiSWEET z Methanobacteria (archeony) dopasowały się do drugiej domeny MtN3/saliva sekwencji SW...

Opisano metodę konstruowania drzewa filogenetycznego na podstawie homologii sekwencji SWEETs od eukariontów i SemiSWEETs od prokariontów. Analiza filogenetyczna jest użytecznym narzędziem do wyjaśniania ewolucyjnego pokrewieństwa między homologicznymi białkami lub genami z różnych grup organizmów.

Wykorzystanie analizy filogenetycznej do zbadania pochodzenia genów eukariotycznych

Phylogenetic analysis uses nucleotide or amino acid sequences or other parameters, such as domain sequences and three-dimensional structure, to construct ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie fitogenetyki, takie jak sposób zbierania sekwencji i wybór właściwego modelu obliczeniowego. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest bardzo łatwa do nauczenia. Ogólnie rzecz biorąc, ci, którzy są nowicjuszami w tej metodzie, mogą zmagać się po prostu dlatego, że nie wiedzą, jak obchodzić się z danymi z powodu braku podstawowej wiedzy na temat zasad i metod filogenezy.Metoda ta została po raz pierwszy opracowana, gdy analizowaliśmy wyrównanie eukariotycznych genów SWEET. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ istnieje wiele wyborów i ustawień dla różnych aspektów wyrównania. Rozpocznij tę procedurę od wyboru 35 potencjalnych białek SWEET z jednokomórkowych organizmów eukariotycznych, jak opisano w protokole tekstowym.Dopasuj 35 sekwencji SWEET, wprowadzając je do Clustal Omega. Skopiuj i wklej sekwencje białek w formacie FASTA do pola wejściowego lub prześlij plik sekwencji w formacie FASTA. Określ, że jest to sekwencja aminokwasów, klikając ikonę pod menu rozwijanym w sekcji kroku pierwszego.W razie potrzeby określ format wyjściowy i inne parametry w sekcji kroku drugiego. W tym badaniu

using-phylogenetic-analysis-to-investigate-eukaryotic-gene-origin

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Tutaj opisujemy krok po kroku proces generowania wiarygodnych filogenez z zestawów danych sekwencji nukleotydów lub aminokwasów. Niniejszy przewodnik ma na celu służyć naukowcom lub studentom, którzy nie mają doświadczenia w analizie filogenetycznej.

Praktyczny przewodnik po filogenetyce dla laików

Ten artykuł opisuje procedurę identyfikacji i charakterystyki rodziny genów w winorośli zastosowanej do rodziny Arabidopsis Tóxicos w ligazach ubikwityny Levadura (ATL) E3.

Kompleksowy przepływ pracy do metaanalizy identyfikacji i ekspresji całego genomu rodziny genów ligazy ubikwityny ATL E3 w winorośli

Celem tego protokołu jest zbadanie ewolucji i ekspresji genów kandydujących przy użyciu danych sekwencjonowania RNA.

Potok bioinformatyczny do badania ewolucji molekularnej i ekspresji genów przy użyciu sekwencji RNA

Ta analityczna platforma obliczeniowa dostarcza praktycznych wskazówek dla mikrobiologów, ekologów i epidemiologów zainteresowanych genomiką populacji bakteryjnej. W szczególności zaprezentowane tutaj prace pokazały, w jaki sposób można przeprowadzić: i) mapowanie hierarchicznych genotypów pod kierunkiem filogenezy; ii) analiza genotypów oparta na częstotliwości; iii) analizy pokrewieństwa i klonalności; iv) Identyfikacja loci akcesoryjnych różnicujących rodowód.

Eksploracja heurystyczna hierarchicznych genotypów i dodatkowych loci genomu w populacjach bakteryjnych

Opisany tutaj protokół zawiera szczegółowe instrukcje, jak analizować interesujące regiony genomu pod kątem potencjału kodowania mikrobiałek za pomocą PhyloCSF w przyjaznej dla użytkownika przeglądarce genomu UCSC. Ponadto zaleca się stosowanie kilku narzędzi i zasobów w celu dalszego zbadania charakterystyki sekwencji zidentyfikowanych mikrobiałek w celu uzyskania wglądu w ich przypuszczalne funkcje.

Zintegrowane podejście do identyfikacji mikrobiałek i analizy sekwencji

Współistnienie infekcji wirusem grypy A jest jednym z czynników uwikłanych w indukcję inwazyjnej choroby pneumokokowej podczas bezobjawowego nosicielstwa Streptococcus pneumoniae. W niniejszej pracy opisujemy metodę infekcji mieszanej z wykorzystaniem myszy noworodkowych w celu zbadania synergizmu między tymi dwoma patogenami dróg oddechowych.

Wykorzystanie obrazowania bioluminescencyjnego do badania synergizmu pomiędzy Streptococcus pneumoniae a wirusem grypy typu A u młodych myszy

Szybki, prosty i kosztowo efektywny protokół generowania pochodzących od dawcy wielowirusowych specyficznych limfocytów T cytotoksycznych (rCTL) do infuzji dla biorców allogenicznych przeszczepów komórek macierzystych krwi tworzącej (HSCT) będących w grupie ryzyka zakażeń CMV, Adv lub EBV. Ten proces wytwarzania jest zgodny z zasadami GMP i powinien zapewnić szersze wdrożenie immunoterapii limfocytami T poza wyspecjalizowanymi ośrodkami.

Generowanie wielowirusowych swoistych limfocytów T w celu zapobiegania i leczenia infekcji wirusowych po allogenicznym przeszczepieniu hematopoetycznych komórek macierzystych

Opisano doustną i wewnątrzhemokoliczną infekcję larw mchowca dużego Galleria mellonella. Owad ten może być wykorzystywany do badania czynników wirulencji bakterii entomopatogennych, a także oportunistycznych bakterii ssaków. Opisano hodowlę owadów, metody infekcji oraz przykłady analiz in vivo.

Owad Galleria mellonella jako potężny model infekcji do badania patogenezy bakteryjnej

Opisano wytwarzanie chimer węzłów chłonnych/poduszeczek tłuszczowych do badania pochodzenia komórek zrębu węzłów chłonnych. Metoda polega na izolacji węzłów chłonnych od nowonarodzonych myszy i embrionalnych poduszeczek tłuszczowych, wytworzeniu chimerycznych poduszek tłuszczowych węzłów chłonnych i ich przeniesieniu pod torebkę nerkową myszy gospodarza.

Generowanie chimer poduszeczek tłuszczowych węzłów chłonnych do badania pochodzenia komórek zrębu węzłów chłonnych

Listeria monocytogenes to Gram-dodatni patogen bakteryjny, często używany jako główny model do badania pasożytnictwa wewnątrzkomórkowego. Obrazowanie późnych etapów infekcji L. monocytogenes w kontekście małych interferujących badań przesiewowych RNA pozwala na globalne badanie szlaków komórkowych wymaganych do infekcji bakteryjnej docelowych komórek gospodarza.

Obrazowanie wydzielania InlC w celu zbadania zakażenia komórkowego patogenem bakteryjnym Listeria monocytogenes

Odkryj metodę analizy filogenetycznej białek SWEET przy użyciu Clustal Omega i MEGA. Technika ta ułatwia zrozumienie ewolucyjnych relacji między homologicznymi genami eukariotycznymi i prokariotycznymi.

Wykorzystanie analizy filogenetycznej do zbadania pochodzenia genów eukariotycznych

Przeglądaj więcej filmów