Wykorzystanie analizy filogenetycznej do zbadania pochodzenia genów eukariotycznych
14 sierpnia 2018
Opisano metodę konstruowania drzewa filogenetycznego na podstawie homologii sekwencji SWEETs od eukariontów i SemiSWEETs od prokariontów. Analiza filogenetyczna jest użytecznym narzędziem do wyjaśniania ewolucyjnego pokrewieństwa między homologicznymi białkami lub genami z różnych grup organizmów.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie fitogenetyki, takie jak sposób zbierania sekwencji i wybór właściwego modelu obliczeniowego. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest bardzo łatwa do nauczenia. Ogólnie rzecz biorąc, ci, którzy są nowicjuszami w tej metodzie, mogą zmagać się po prostu dlatego, że nie wiedzą, jak obchodzić się z danymi z powodu braku podstawowej wiedzy na temat zasad i metod filogenezy.
Metoda ta została po raz pierwszy opracowana, gdy analizowaliśmy wyrównanie eukariotycznych genów SWEET. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ istnieje wiele wyborów i ustawień dla różnych aspektów wyrównania. Rozpocznij tę procedurę od wyboru 35 potencjalnych białek SWEET z jednokomórkowych organizmów eukariotycznych, jak opisano w protokole tekstowym.
Dopasuj 35 sekwencji SWEET, wprowadzając je do Clustal Omega. Skopiuj i wklej sekwencje białek w formacie FASTA do pola wejściowego lub prześlij plik sekwencji w formacie FASTA. Określ, że jest to sekwencja aminokwasów, klikając ikonę pod menu rozwijanym w sekcji kroku pierwszego.
W razie potrzeby określ format wyjściowy i inne parametry w sekcji kroku drugiego. W tym badaniu ustaw format wyjściowy jako Clustal bez liczby i pozostaw inne parametry na ustawieniach domyślnych. W większości przypadków parametry domyślne działają dobrze bez żadnej specyfikacji.
Prześlij i uruchom wyrównanie w sekcji kroku trzeciego. Wyrównanie może potrwać od kilku sekund do minut. W panelu Podsumowanie wyników kliknij prawym przyciskiem myszy łącze w polu Wyrównanie w formacie CLUSTAL i zapisz wyrównane sekwencje jako 35.clustal.
Aby otworzyć plik z wynikami wyrównania w BioEdit, kliknij Sekwencja i wybierz Edytuj nastrój w pierwszym menu rozwijanym w głównym panelu BioEdit. Następnie kliknij Edytuj pozostałości w podmenu. Zaznacz wystające sekwencje po lewej stronie wyrównania z kursorem i kliknij ikonę Usuń w menu Edycja, aby usunąć wybrane sekwencje.
Zaznacz i usuń sekwencje po prawej stronie pierwszej domeny śliny MtN3 i zapisz przycięte pierwsze sekwencje domen śliny MtN3 jako 35-1.fas. Podobnie, usuń sekwencje lewej i prawej strony drugiej domeny śliny MtN3 i zapisz ją jako 35-2.fas. Pierwszą i drugą sekwencję domen śliny MtN3 można przewidzieć z wyprzedzeniem za pomocą rytmu lub TMHMM.
Otwórz plik 35-1. fas z MEGA i kliknij Wyrównaj, gdy zostaniesz o to poproszony. W menu Edycja kliknij polecenie Zaznacz wszystko.
Następnie kliknij przycisk Wybierz sekwencje. Nazwy i sekwencje taksonów zostaną wybrane w kolorze czarnym. Wybierz polecenie Kopiuj z menu Edycja, aby skopiować sekwencje do schowka, a następnie wkleić skopiowane sekwencje do pliku doc.
W pliku doc zastąp wszystkie znaki liczb znakiem większości niż, a następnie usuń wszystkie niepowiązane znaki, aby przekonwertować je na format FASTA. Dodaj 1 na końcu każdej nazwy taksonu, aby oznaczyć je jako pierwsze sekwencje domen śliny MtN3. Przetwarzaj drugie sekwencje domen śliny MtN3 zgodnie z tą samą metodą i dodaj 2 po każdej nazwie taksonu.
Teraz połącz pierwszą i drugą sekwencję domen śliny MtN3 w formacie FASTA w pliku doc. Aby to zrobić, ponownie załaduj połączone sekwencje do Clustal Omega i wyrównaj sekwencje jak poprzednio. Zapisz wynik jako 35realigned.clustal.
Otwórz plik clustal 35realigned. w BioEdit. Usuń nierówne reszty aminokwasów na obu końcach wyrównanych sekwencji, a następnie zapisz sekwencje jako 35realigned.fas.
Kliknij przycisk Tak po wyświetleniu ostrzeżenia, że nie można zapisać niektórych niestandardowych znaków. Otwórz 35ponownie wyrównany. fas w MEGA.
Kliknij menu Dane i wybierz polecenie Eksportuj wyrównanie. Następnie zapisz wyrównanie w formacie POP jako 35. następnie do późniejszego wykorzystania w MR Base.
W międzyczasie kliknij ikonę Modele na głównym panelu MEGA. Wybierz Znajdź najlepsze modele białek DNA i kliknij OK w wyskakującym okienku. Kliknij przycisk Obliczenia, aby rozpocząć proces wyszukiwania modelu.
Otworzy się nowy panel postępu. Proces ten trwa od kilku minut do kilku dni w zależności od złożoności załadowanych sekwencji i wydajności komputera. Tabela przedstawiająca wyniki zostanie otwarta po zakończeniu procesu wyszukiwania modelu.
Najmniejszy wynik BIC zostanie wymieniony jako pierwszy, a następnie seria różnych modeli ze stopniowo rosnącymi wynikami BIC. Pierwszy model LG+G+F z najmniejszym wynikiem BIC jest zalecanym modelem dla drzewa uczenia maszynowego na podstawie 35realigned. Plik FAS.
Następnie kliknij ikonę Filogeneza na głównym panelu MEGA. Kliknij opcję Zbuduj/Przetestuj drzewo maksymalnego prawdopodobieństwa, a następnie kliknij przycisk Tak w panelu podręcznym. Otworzy się nowe okno z różnymi parametrami, które należy określić.
Najpierw ustaw wartość bootstrap w teście pola filogenezy. 500 lub 1 000 jest wystarczające w większości przypadków. W ramach modelu substytucji wybierz aminokwas jako typ podstawienia.
Celem wyboru modelu podstawiania jest oszacowanie rzeczywistej różnicy między sekwencjami na podstawie ich obecnych stanów. Wybierz LG z modelem Freqs w polu Model i metoda. W polu Rates and Patterns (Współczynniki i wzorce) wybierz opcję gamma distributed (Rozkład gamma), aby opisać różnice w różnych lokacjach, na przykład przywiązując większą wagę do zmian w wolno zmieniających się lokacjach.
W polu Podzbiór danych wybierz opcję Całkowite usunięcie, aby usunąć wszystkie kolumny zawierające łączniki. Zachowaj wszystkie inne parametry w ich stanach domyślnych. Po określeniu tych parametrów kliknij ikonę Oblicz, aby rozpocząć obliczenia.
Filogenetyczne drzewo ML zostanie zaprezentowane po zakończeniu obliczeń przy użyciu MEGA. W menu rozwijanym ikony Plik w panelu Drzewo wybierz opcję Zapisz bieżącą sesję, aby zapisać wynik. W niniejszym badaniu wynik został zapisany jako 35.mas.
W panelu Drzewo wyświetlanych jest wiele parametrów, takich jak długość kladu, styl drzewa, topologia drzewa, czcionka nazwy taksonu, rozmiar i kolor, które można ustawić na różne opcje. Zapisz końcowy plik drzewa, klikając ikonę Obraz i zapisz rysunek w różnych formatach lub skopiuj obraz jako źródło do edycji zdjęć. Kontynuuj analizę relacji między SWEETs i semiSWEETs, a także korzystając z konstrukcji drzewa filogenetycznego dopasowania sekwencji z MR Base, jak opisano w protokole tekstowym.
Drzewa filogenetyczne pokazują, że wszystkie pierwsze domeny śliny MtN3 z 35 sekwencji SWEET grupowały się w jeden klad, a drugie domeny śliny MtN3 sekwencji SWEET grupowały się w inny klad. Ponadto wyniki dopasowania SWEETs i semiSWEET pokazują, że niektóre semiSWEET z Alpha-Proteobacteria dostosowały się do pierwszej domeny śliny MtN3 sekwencji SWEET, podczas gdy semiSWEET z Methanobacteria wyrównały się z drugą domeną śliny MtN3 sekwencji SWEET. Wyniki te razem sugerują, że dwie domeny śliny MtN3 zawierające SWEET mogą pochodzić z ewolucyjnej fuzji bakteryjnego semiSWEET i archeanu.
Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu jednej godziny do kilku dni, w zależności od złożoności danych. Podczas próbowania tego protokołu ważne jest, aby wcześniej zebrać sekwencje wysokiej jakości. Po jego opracowaniu protokół ten utorował drogę naukowcom zajmującym się ewolucją do zbadania relacji między genami homologicznymi.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skonstruować drzewo filogenetyczne.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje metodę konstruowania drzewa filogenetycznego w oparciu o homologię sekwencji białek SWEET z organizmów eukariotycznych oraz SemiSWEET z prokariontów. Technika ta jest przystępna dla użytkownika i pomaga w zrozumieniu relacji ewolucyjnych między homologicznymi białkami lub genami.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Filogenetyka
- Ewolucja białek
- Analiza sekwencji
Wstęp
- Analiza filogenetyczna pomaga wyjaśnić pokrewieństwo ewolucyjne.
- Zrozumienie białek SWEET i SemiSWEET jest kluczowe dla badań ewolucyjnych.
- Osoby początkujące mogą mieć trudności z przetwarzaniem danych ze względu na brak wiedzy podstawowej.
- Demonstracje wizualne zwiększają zrozumienie metody.
Cel badania
- Przedstawienie przejrzystej metodologii konstruowania drzew filogenetycznych.
- Ułatwienie wyboru odpowiednich modeli obliczeniowych.
- Wsparcie badaczy w gromadzeniu i analizie danych sekwencyjnych.
Zastosowane metody
- Wybór 35 białek SWEET będących kandydatami z jednokomórkowych eukariotów.
- Dopasowanie sekwencji genów SWEET eukariotów.
- Wykorzystanie różnych ustawień dla aspektów dopasowania.
- Demonstracje wizualne prowadzące użytkowników przez cały proces.
Główne wyniki
- Metoda ta upraszcza proces analizy filogenetycznej.
- Stanowi ona ramy dla zrozumienia ewolucji białek.
- Przy odpowiednim prowadzeniu użytkownicy mogą efektywnie przetwarzać dane sekwencyjne.
- Pomoce wizualne znacząco poprawiają efekty uczenia się.
Wnioski
- Metoda ta jest dostępna dla badaczy rozpoczynających pracę z filogenetyką.
- Łączy ona wiedzę teoretyczną z zastosowaniem praktycznym.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej fundamentalnej metodologii.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Analiza filogenetyczna rodzin białek, takich jak transportery SWEET, umożliwia mechanistyczne ograniczanie ryzyka we wczesnej fazie odkrywania poprzez wyjaśnienie pochodzenia ewolucyjnego i dywergencji funkcjonalnej. Podejście to wspiera walidację celu, odróżniając domeny konserwatywne od innowacji specyficznych dla danej linii, co zmniejsza niejednoznaczność podczas formułowania hipotez. Wgląd w zdarzenia fuzji genów dostarcza informacji dla strategii biomarkerów translacyjnych oraz wyboru modeli przedklinicznych dla szlaków związanych z transportem.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez prześledzenie architektury domen do przodków prokariotycznych i archeonowych.
- Wartość operacyjna: Wyjaśnienie walidacji funkcjonalnych celów poprzez konserwację ewolucyjną domen MtN3 w ślinie białek SWEET.
- Wartość prognostyczna: Wsparcie segregacji portfela projektów poprzez identyfikację regionów ograniczonych ewolucyjnie, które są mniej podatne na mechanizmy kompensacyjne.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne poprzez zdefiniowanie granic domen dla konstrukcji białek chimerycznych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzację testów dzięki zastosowaniu dopasowanych sekwencyjnie domen MtN3 jako ilościowych odczytów aktywności transportera.
- Skalowalność: Ułatwia ponowne wykorzystanie platformy za pomocą potoków Clustal Omega i MEGA do przesiewowych badań rodziny SWEET u różnych gatunków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy odkrycia z walidacją przedkliniczną poprzez potwierdzenie konserwatywności domen u eukariontów i prokariontów.
- Korelacja z biomarkerami: Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez korelację dywergencji domeny SWEET z fenotypowymi wynikami transportu cukrów.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji go/no-go poprzez wskazanie ograniczeń ewolucyjnych w zakresie tolerancji mutacyjnej celu.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesu odkrywania – od testowania hipotez dotyczących celu po identyfikację wiodących cząsteczek – dostarczając kontekstu ewolucyjnego dla funkcji białek.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez wyjaśnienie, czy obserwowana funkcja białek SWEET wynika z dziedziczenia pionowego, czy z horyzontalnego transferu genów.
- Przesiewanie: Opisuje gotowość testów, w których wyrównane domeny MtN3 służą jako stabilne i mierzalne jednostki do przesiewania wysokoprzepustowego.
- Analityka: Wskazuje wyniki metody maksymalnej wiarygodności oraz wnioskowania bayesowskiego jako statystyczne miary pewności kladów w celu priorytetyzacji celów.
- Badania translacyjne: Łączy z ciągłością przedkliniczną poprzez walidację konserwacji domen jako wskaźnika zachowania funkcji w modelach chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Przedstawia workflow Clustal Omega-MEGA-MrBayes jako możliwość wielokrotnego wykorzystania w celu minimalizacji ryzyka związanego z rodzinami transporterów w różnych projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększenie pewności predykcyjnej w wyborze celu poprzez ewolucyjną redukcję ryzyka związanych z założeniami mechanicznymi.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja i powtarzalność dzięki stałym parametrom dopasowania oraz kryteriom wyboru modelu (LG+G+F).
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go dzięki ograniczeniu ryzyka niepowodzeń na późnych etapach wynikających z błędnego przypisania mechanizmu działania celu.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko na podstawie wyników ograniczeń ewolucyjnych wyprowadzonych z wsparcia kladu filogenetycznego.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy w zakresie dopasowania sekwencji, testowania modeli filogenetycznych oraz interpretacji drzew.
- Zależne od dostępu do programów Clustal Omega, MEGA oraz MrBayes w celu wykonania dopasowania i konstrukcji drzew.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w zakresie kurateli sekwencji i protokołów wyboru modelu.
- Wiąże się z koniecznością uwzględnienia adaptacji podczas stosowania metody w odniesieniu do rodzin białek innych niż transportery, o innej architekturze domen.
- Ograniczone niemożnością potwierdzenia równoważności funkcjonalnej wnioskowanych stanów przodków bez walidacji eksperymentalnej.
