Wykrywanie fosforylacji Rab10 przez aktywność LRRK2 przy użyciu SDS-PAGE ze znacznikiem wiążącym fosforany
14 grudnia 2017
Niniejsze badanie opisuje prostą metodę wykrywania endogennych poziomów fosforylacji Rab10 przez bogatą w leucynę kinazę powtórzeniową 2.
Ogólnym celem tego eksperymentu jest wykrycie fosforylacji Rab10 przez LRRK2 za pomocą SDS-PAGE ze znacznikiem wiążącym fosforany. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad chorobą Parkinsona, takie jak to, w jaki sposób mutacje chorobowe w LRRK2 wpływają na fosforylację Rab10. Główną zaletą tej techniki jest to, że można z grubsza oszacować stechiometrię fosforylacji Rab10 za pomocą prostego western blot.
Wiele kroków tego protokołu jest dość standardowych i są wystarczająco szczegółowo opisane w protokole tekstowym dołączonym do tego filmu. W tym miejscu chcemy pokazać kroki, które najbardziej korzystają z instrukcji wizualnych. Przygotować płytki z transfekowanych komórek HEK293 zgodnie z opisem w protokole tekstowym.
Gdy płytki są na lodzie, odessać i wyrzucić pożywkę. Następnie ostrożnie dodaj dwa mililitry DPBS do rogu każdej płytki i kołysz płytkami, aby rozprowadzić roztwór. Następnie wyjmij i wyrzuć DPBS.
Następnie do każdej płytki dodaj 100 mikrolitrów buforu do lizy. Przechylić płytkę i użyć skrobaka, aby rozprowadzić bufor i uwolnić lizat komórkowy. Następnie odessać lizaty i przenieść je do probówek do mikrofugowania wstępnie schłodzonych na lodzie i odczekać 10 minut.
Następnie zbierz lizaty komórkowe wolne od zanieczyszczeń, odwirowując probówki i przenosząc supernatanty do nowych probówek na lodzie. Następnie zmierz stężenia białek w oczyszczonych lizatach za pomocą testu Bradforda. Aby uzyskać dane dotyczące stężenia, należy przygotować 100 mikrolitrów próbek lizatów do analizy żelu.
Przygotuj gęstsze lizaty do pomiaru endogennego Rab10 w porównaniu z nadekspresją hemaglutyniny Rab10. Przygotowanie próbek należy zakończyć, inkubując je w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie przechowuj próbki w temperaturze poniżej minus 20 stopni Celsjusza, aż będą potrzebne, przez okres do sześciu miesięcy lub dłużej.
Aby rozpocząć, przygotuj komórki SDS-PAGE zgodnie z protokołem tekstowym. Następnie załaduj żel do zbiornika i zabezpiecz go spinaczami do segregatorów. Następnie napełnić zbiornik działającym buforem i usunąć pęcherzyki powietrza ze studzienek i pod żelem za pomocą igły dołączonej do strzykawki.
Teraz dodaj chlorek manganu do próbek i odwiruj je w dół, aby usunąć osady. Następnie załaduj żel równymi objętościami próbki, 10 mikrogramów białka w celu analizy nadekspresji hemaglutyniny Rab10 lub 30 mikrogramów białka w celu analizy endogennego Rab10. Załadować puste tory buforem do próbek zawierającym chlorek manganu.
Uzupełnij również marker masy cząsteczkowej buforem i chlorkiem manganu, aby uzyskać taką samą objętość jak próbki. Teraz zacznij uruchamiać żel pod napięciem 50 woltów. Po stosie próbek zwiększ napięcie do 120, aby uzyskać separację.
Gdy przód barwnika dotrze do dna żeli, zabij napięcie. Następnie umyj żel trzy razy w następujący sposób. Załaduj żel separacyjny do kąpieli z czystym buforem transferowym z dodatkiem EDTA i SDS.
Następnie pozwól mu kołysać się na shakerze przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po trzech praniach wykonaj jeszcze jedno pranie za pomocą bufora transferowego z dodatkiem SDS, ale bez EDTA. Następnie przenieś żel za pomocą mokrego zbiornika.
Załaduj zbiornik do pojemnika z pianką wypełnionego lodowatą wodą, podłącz zbiornik do zasilania i rozpocznij transfer. Długi transfer z wydajnym chłodzeniem jest niezbędny do zabiegu. Po transferze sprawdź transfer, barwiąc membranę Pąsem S, a następnie umyj w TBST zgodnie z protokołem tekstowym.
Następnie zastosuj blok. Zanurz blot w mlecznym TBST i kołysz blotem na shakerze przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie usuń i wyrzuć roztwór blokujący i nałóż pierwszorzędowy roztwór przeciwciała.
Teraz kołysz membraną przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia usuń roztwór przeciwciała pierwotnego. Następnie umyj membranę świeżym TBST trzy razy, tak jak poprzednio.
Po przepłukaniu zanurzyć blot w wtórnym roztworze przeciwciał i inkubować membranę na kołysce przez około godzinę w temperaturze pokojowej. Po inkubacji ponownie trzykrotnie przemyć membranę TBST. Teraz rozwiń membranę.
Dodaj jeden mililitr roztworu ECL do dużego arkusza folii plastikowej. Następnie umieść membranę w ECL i szybko odwróć ją, aby zwilżyć obie strony. Następnie podnieś membranę i pozwól jej spłynąć.
Po odsączeniu pozwól, aby jedna krawędź dotykała ręcznika papierowego przez około pięć sekund, aby pomóc usunąć nadmiar roztworu. Następnie owiń membranę sztywną, przezroczystą folią bez zmarszczek i przenieś ją na czarną tackę w celu obrazowania. Komórki HEK293 transfekowano hemaglutyniną Rab10 typu dzikiego i 3xFLAG-LRRK2.
Badano kinazę typu dzikiego nieaktywną w rodzinnych mutacjach LRRK2 w chorobie Parkinsona. Konadekspresja LRRK2 i Rab10 spowodowała znaczne przesunięcie pasma w żelu P-tag. W przeciwieństwie do tego, koekspresja z nieaktywnym mutantem kinazy nie powodowała żadnych zmian w ruchliwości Rab10, co sugeruje, że kinaza jest przyczyną przesunięcia pasma.
Ponadto, zgodnie z oczekiwaniami, wszystkie rodzinne mutacje PD zwiększyły przesunięcie pasma. System żelowy P-tag wykorzystano również do analizy mysich komórek fibroblastów embrionalnych 3T3-szwajcarskich albinosów traktowanych inhibitorem LRRK2. Przesunięcie pasma odpowiadające fosforylowanemu endogennemu Rab10 zniknęło, gdy komórki potraktowano GSK2578215A.
Ten sam test przeprowadzono również przy użyciu ludzkich komórek A549. W tych eksperymentach skuteczność inhibitora LRRK2 została potwierdzona przy użyciu przeciwciała anty-p seryny 935 LRRK2, które jest dobrze znanym markerem hamowania LRRK2. Po opanowaniu ta technika potrzebuje tylko dodatkowych 14 minut w porównaniu ze zwykłą procedurą western blotting, która polega na myciu żeli przed transferem.
Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak spektrometria mas, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, czy mutanty FPD fosforylują tę samą resztę Rab10. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się badaniami nad chorobą Parkinsona do zbadania endogennych poziomów fosforylacji Rab10 w hodowanych komórkach, a także w tkankach. Nie zapominaj, że praca z mikrocystyną dodaną do buforu do lizy może być niezwykle niebezpieczna, a podczas przygotowywania lizatów komórkowych należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiednich środków ochrony osobistej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia metodę wykrywania endogennej fosforylacji Rab10 przez LRRK2 z wykorzystaniem elektroforezy SDS-PAGE z zastosowaniem znacznika wiążącego grupę fosforanową. Technika ta ma istotne znaczenie dla zrozumienia wpływu mutacji LRRK2 w badaniach nad chorobą Parkinsona.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Biochemia
Wprowadzenie
- Rab10 jest substratem białka LRRK2, które bierze udział w patogenezie choroby Parkinsona.
- Zrozumienie fosforylacji białka Rab10 może dostarczyć informacji na temat roli LRRK2 w procesach neurodegeneracyjnych.
- Obecne metody badania fosforylacji mogą być złożone i czasochłonne.
- Celem niniejszego badania jest uproszczenie procesu detekcji.
Cel badania
- Opracowanie prostej metody wykrywania fosforylacji białka Rab10.
- Ocena wpływu mutacji LRRK2 na poziom fosforylacji Rab10.
- Przedstawienie wizualnego przewodnika po kluczowych etapach eksperymentu.
Zastosowane metody
- Transfekcja komórek HEK293 białkiem LRRK2.
- Zastosowanie SDS-PAGE do rozdziału białek.
- Wykorzystanie znacznika wiążącego fosforany do detekcji.
- Analiza Western blot w celu oszacowania stechiometrii.
Główne wyniki
- Metoda ta pozwala na oszacowanie stechiometrii fosforylacji Rab10.
- Instrukcje wizualne ułatwiają zrozumienie protokołu.
- Wyniki wskazują na wpływ mutacji LRRK2 na poziomy fosforylacji.
- Podejście to może wspomóc dalsze badania nad chorobą Parkinsona.
Wnioski
- Opracowana metoda jest skuteczna w badaniu fosforylacji Rab10.
- Stanowi ona wartościowe narzędzie dla badaczy analizujących mechanizmy związane z LRRK2.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej technice w celu eksploracji celów terapeutycznych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejsza metoda umożliwia wykrywanie endogennej fosforylacji Rab10 przez LRRK2, będącej kluczowym zdarzeniem w patogenezie choroby Parkinsona, z wykorzystaniem znacznika wiążącego grupę fosforanową w celu przepokonania ograniczeń przeciwciał specyficznych dla fosforylacji. Stanowi ona szybkie, niezależne od przeciwciał podejście do oceny aktywności kinazy LRRK2 oraz skuteczności inhibitorów w modelach komórkowych, wspierając walidację celu i ograniczanie ryzyka mechanistycznego w procesie poszukiwania leków na neurodegenerację. Technika ta ułatwia ilościowe porównanie stanów fosforylacji w różnych zaburzeniach genetycznych i farmakologicznych, dostarczając informacji niezbędnych do podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu programów badawczych nakierowanych na LRRK2.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie fosforylacji substratów LRRK2 w celu walidacji Rab10 jako funkcjonalnego wskaźnika aktywności kinazy w modelach istotnych dla przebiegu choroby.
- Wartość operacyjna: Zapewnia prosty test oparty na immunoblotingu do porównywania mutantów LRRK2 typu dzikiego i patogennych w celu potwierdzenia celu.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowe przesunięcia ruchomości proporcjonalne do stechiometrii fosforylacji, co umożliwia analizę zależności dawka-odpowiedź inhibitorów LRRK2.
- Wartość operacyjna: Wymaga jedynie standardowej infrastruktury do SDS-PAGE i western blot, co pozwala na szybką adaptację w różnych laboratoriach w celu przesiewowego badania związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wykrywa endogenną fosforylację Rab10 w wielu typach komórek (HEK293, A549, fibroblasty mysie), co potwierdza translacyjną istotność międzygatunkową.
- Wartość operacyjna: Potwierdza oddziaływanie inhibitorów LRRK2 (np. GSK2578215A) na cel poprzez zanik sygnału fosforylacji, dostarczając informacji na temat przedklinicznej farmakodynamiki.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kaskadę walidacji celów LRRK2, od wstępnego testowania hipotez w systemach nadekspresji po modulację endogennych szlaków w modelach chorobowych, wspierając przejście od identyfikacji wiodących związków do wyboru kandydata przedklinicznego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez powiązanie aktywności kinazy LRRK2 ze stanem fosforylacji Rab10 w kontekstach komórkowych.
- Przesiewanie: Umożliwia ocenę wpływu związków na poziomy fosforylacji przy użyciu standaryzowanych ilości białka (10–30 µg) i odczytów przesunięcia mobilności.
- Analityka: Zapewnia półilościowe szacunki stechiometrii na podstawie intensywności przesunięcia prążka, co ułatwia porównywanie różnych warunków bez zastosowania spektrometrii mas.
- Badania translacyjne: Wykazuje wrażliwość inhibitorów w komórkach ludzkich i gryzoni, potwierdzając ciągłość translacyjną sygnalizacji LRRK2-Rab10.
- Zastosowanie w przedsiębiorstwie: Możliwość ponownego wykorzystania w różnych liniach komórkowych, tkankach i typach perturbacji (mutanty, inhibitory, aktywatory) jako modułowa platforma detekcyjna.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w sygnalizacji LRRK2, dostarczając bezpośrednich dowodów na fosforylację substratu.
- Wartość operacyjna: Wydłuża standardowy western blotting jedynie o 14 minut, minimalizując wpływ na przepustowość przy jednoczesnym zwiększeniu zawartości danych.
- Wartość strategiczna: Poprawia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez korelację modulacji LRRK2 z funkcjonalną sygnalizacją w dół kaskady.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację modulatorów LRRK2 z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o zaangażowanie docelowej ścieżki sygnałowej.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w lizie komórek, przygotowaniu testów kinaz oraz optymalizacji metody western blot.
- Zależne od dostępu do odczynnika z tagiem wiążącym fosforan oraz chlorku manganu do przygotowania żelu.
- Wymaga standaryzacji ilości naniesionego białka (10 µg dla białek nadeksponowanych, 30 µg dla endogennego Rab10) we wszystkich grupach eksperymentalnych.
- Adaptacja metody do tkanek pierwotnych może wymagać optymalizacji warunków lizy w celu zachowania stanu fosforylacji.
- Metoda ogranicza się do wykrywania przesunięć mobilności indukowanych fosforylacją; nie identyfikuje konkretnych miejsc fosforylacji bez zastosowania metod komplementarnych.
