Name: Wykrywanie fosforylacji Rab10 przez aktywność LRRK2 przy użyciu SDS-PAGE ze znacznikiem wiążącym fosforany (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Poznaj metodę wykrywania fosforylacji Rab10 przez LRRK2 przy użyciu SDS-PAGE ze znacznikiem wiążącym fosforany. Technika ta umożliwia szacowanie stechiometrii fosforylacji w badaniach nad chorobą Parkinsona.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Dr. Takeshi Iwatsubo (Uniwersytet Tokijski, Japonia) za uprzejme dostarczenie plazmidów kodujących 3xFLAG-LRRK2 WT i mutantów. Dziękujemy również dr Dario Alessi (University of Dundee, Wielka Brytania) za uprzejme dostarczenie MLi-2 i plazmidu kodującego HA-Rab10. Prace te były wspierane przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (JSPS) KAKENHI Grant Number JP17K08265 (G.I.).

<ol><li>Sveinbjornsdottir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+symptoms+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">The clinical symptoms of Parkinson's disease.</a> J. Neurochem. 139 (Suppl. 1), 318-324 (2016).</li>
<li>Hernandez, D. G., Reed, X., Singleton, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+in+Parkinson+disease%3A+Mendelian+versus+non-Mendelian+inheritance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Genetics in Parkinson disease: Mendelian versus non-Mendelian inheritance.</a> J. Neurochem. 139 (Suppl. 1), 59-74 (2016).</li>
<li>Paisán-Ruíz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+the+gene+containing+mutations+that+cause+PARK8-linked+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease.</a> Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).</li>
<li>Zimprich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+LRRK2+cause+autosomal-dominant+parkinsonism+with+pleomorphic+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology.</a> Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).</li>
<li>Gilks, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+LRRK2+mutation+in+idiopathic+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">A common LRRK2 mutation in idiopathic Parkinson's disease.</a> Lancet. 365 (9457), 415-416 (2005).</li>
<li>Satake, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+association+study+identifies+common+variants+at+four+loci+as+genetic+risk+factors+for+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome-wide association study identifies common variants at four loci as genetic risk factors for Parkinson's disease.</a> Nat. Genet. 41 (12), 1303-1307 (2009).</li>
<li>Simón-Sánchez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+association+study+reveals+genetic+risk+underlying+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genome-wide association study reveals genetic risk underlying Parkinson's disease.</a> Nat. Genet. 41 (12), 1308-1312 (2009).</li>
<li>Klein, C., Ziegler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imputation+of+sequence+variants+for+identification+of+genetic+risks+for+Parkinson%27s+disease%3A+a+meta-analysis+of+genome-wide+association+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Imputation of sequence variants for identification of genetic risks for Parkinson's disease: a meta-analysis of genome-wide association studies.</a> Lancet. 377 (9766), 641-649 (2011).</li>
<li>Cookson, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+leucine-rich+repeat+kinase+2+%28LRRK2%29+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) in Parkinson's disease.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11 (12), 791-797 (2010).</li>
<li>Ozelius, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRK2+G2019S+as+a+Cause+of+Parkinson%E2%80%99s+Disease+in+Ashkenazi+Jews%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">LRRK2 G2019S as a Cause of Parkinson’s Disease in Ashkenazi Jews.</a> N. Engl. J. Med. 354 (4), 424-425 (2006).</li>
<li>Lesage, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRK2+G2019S+as+a+Cause+of+Parkinson%E2%80%99s+Disease+in+North+African+Arabs%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">LRRK2 G2019S as a Cause of Parkinson’s Disease in North African Arabs.</a> N. Engl. J. Med. 354 (4), 422-423 (2006).</li>
<li>Bouhouche, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRK2+G2019S+Mutation%3A+Prevalence+and+Clinical+Features+in+Moroccans+with+Parkinson%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Parkinsons.+Dis%22%5BJournal%5D)">LRRK2 G2019S Mutation: Prevalence and Clinical Features in Moroccans with Parkinson's Disease.</a> Parkinsons. Dis. , 1-7 (2017).</li>
<li>West, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease-associated+mutations+in+leucine-rich+repeat+kinase+2+augment+kinase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease-associated mutations in leucine-rich repeat kinase 2 augment kinase activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (46), 16842-16847 (2005).</li>
<li>Ito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTP+binding+is+essential+to+the+protein+kinase+activity+of+LRRK2%2C+a+causative+gene+product+for+familial+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">GTP binding is essential to the protein kinase activity of LRRK2, a causative gene product for familial Parkinson's disease.</a> Biochemistry. 46 (5), 1380-1388 (2007).</li>
<li>Steger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteomics+reveals+that+Parkinson%27s+disease+kinase+LRRK2+regulates+a+subset+of+Rab+GTPases%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteomics reveals that Parkinson's disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Ito, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phos-tag+analysis+of+Rab10+phosphorylation+by+LRRK2%3A+a+powerful+assay+for+assessing+kinase+function+and+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors.</a> Biochem. J. 473, 2671-2685 (2016).</li>
<li>Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E., Takiyama, K., Koike, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphate-binding+tag%2C+a+new+tool+to+visualize+phosphorylated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Phosphate-binding tag, a new tool to visualize phosphorylated proteins.</a> Mol. Cell. Proteomics. 5 (4), 749-757 (2006).</li>
<li>Database, J. S. E. Using a Hemacytometer to Count Cells. J. Vis. Exp. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells">https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells</a> (2017).</li>
<li>Ni, D., Xu, P., Gallagher, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27038386">Immunoblotting and Immunodetection.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. (114), 10.8.1-10.8.37 (2016).</li>
<li>Reith, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GSK2578215A%3B+a+potent+and+highly+selective+2-arylmethyloxy-5-substitutent-N-arylbenzamide+LRRK2+kinase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem.+Lett%22%5BJournal%5D)">GSK2578215A; a potent and highly selective 2-arylmethyloxy-5-substitutent-N-arylbenzamide LRRK2 kinase inhibitor.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 22 (17), 5625-5629 (2012).</li>
<li>Fell, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MLi-2%2C+a+potent%2C+selective+and+centrally+active+compound+for+exploring+the+therapeutic+potential+and+safety+of+LRRK2+kinase+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">MLi-2, a potent, selective and centrally active compound for exploring the therapeutic potential and safety of LRRK2 kinase inhibition.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 355, 397-409 (2015).</li>
<li>Dzamko, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+LRRK2+kinase+activity+leads+to+dephosphorylation+of+Ser%28910%29%2FSer%28935%29%2C+disruption+of+14-3-3+binding+and+altered+cytoplasmic+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization.</a> Biochem. J. 430 (3), 405-413 (2010).</li>
<li>Thévenet, J., Pescini Gobert, R., Hooft van Huijsduijnen , R., Wiessner, C., Sagot, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+LRRK2+expression+points+to+a+functional+role+in+human+monocyte+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Regulation of LRRK2 expression points to a functional role in human monocyte maturation.</a> PLoS One. 6 (6), e21519(2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu opisujemy łatwą i solidną metodę wykrywania fosforylacji Rab10 przez LRRK2 na poziomach endogennych w oparciu o metodologię znacznika P. Ponieważ obecnie dostępne przeciwciało przeciwko fosforylowanemu Rab10 działa tylko z nadekspresjami białek15, obecna metoda wykorzystująca SDS-PAGE ze znacznikiem P jest jedynym sposobem oceny endogennych poziomów fosforylacji Rab10. Ponadto obecna metoda pozwala na oszacowanie stechiometrii fosforylacji Rab10 w komórkach. Ponieważ metodologia P-ta...

PD jest jedną z najczęstszych chorób neurodegeneracyjnych, głównie dotykającą neuronów dopaminergicznych w śródmózgowiu, powodując dysfunkcję układu motorycznego u osób starszych1. Podczas gdy większość pacjentów rozwija chorobę Parkinsona w sposób sporadyczny, istnieją rodziny, które dziedziczą tę chorobę. Stwierdzono, że mutacje w kilku genach są powiązane z FPD2. Jednym z genów wywołujących FPD jest LRRK2, w którym do tej pory zgłoszono osiem mutacji missense (N1437H, R1441C/G/H/S, Y1699C, G2019S i I2020T) związanych z dominująco dziedziczonym FPD o nazwie PARK83,4,5. Kilka badań asocjacyjnych całego genomu (GWAS) sporadycznych pacjentów z chorobą Parkinsona zidentyfikowało również zmiany genomowe w locus LRRK2 jako czynnik ryzyka PD, co sugeruje, że nieprawidłowość w funkcji LRRK2 jest częstą przyczyną neurodegeneracji zarówno w przypadku sporadycznym, jak i PARK8 FPD6,7,8.
LRRK2 to duże białko (2,527 aminokwasów) składające się z domeny powtórzeń bogatej w leucynę, domeny wiążącej GTP Ras białek złożonych (ROC), C-końcówki domeny ROC (COR), domeny kinazy białkowej seryny/treoniny i domeny powtórzeń WD409. Osiem mutacji FPD znajduje się w tych domenach funkcjonalnych; N1437H i R1441C/G/H/S w domenie ROC, Y1699C w domenie COR, G2019S i I2020T w domenie kinazy. Ponieważ mutacja G2019S, która jest najczęściej spotykaną mutacją u pacjentów z PD10,11,12, zwiększa aktywność kinazy LRRK2 2-3 razy in vitro13, przypuszcza się, że nieprawidłowy wzrost fosforylacji substratu (substratów) LRRK2 jest toksyczny dla neuronów. Jednak niemożliwe było zbadanie, czy fosforylacja fizjologicznie istotnych substratów LRRK2 jest zmieniona u rodzinnych/sporadycznych pacjentów z chorobą Parkinsona z powodu braku metod oceny jej w próbkach pobranych od pacjentów.
Fosforylacja białek jest zazwyczaj wykrywana za pomocą immunoblottingu lub testu immunoenzymatycznego (ELISA) przy użyciu przeciwciał rozpoznających stan fosforylacji białek lub przez analizę spektrometryczną mas. Jednak pierwsza strategia czasami nie może być zastosowana ze względu na trudności w tworzeniu przeciwciał specyficznych dla fosforylacji. Znakowanie metaboliczne komórek radioaktywnym fosforanem jest kolejną opcją badania fizjologicznych poziomów fosforylacji, gdy przeciwciała specyficzne dla fosforylacji nie są łatwo dostępne. Wymaga to jednak dużej ilości materiałów radioaktywnych i dlatego wymaga specjalistycznego sprzętu do ochrony przed promieniowaniem14. Analiza spektrometrii mas jest bardziej czuła w porównaniu z tymi metodami immunochemicznymi i stała się popularna w analizie fosforylacji białek. Jednak przygotowanie próbki jest czasochłonne, a do analizy potrzebne są drogie instrumenty.
Podzbiór rodziny GTPazy Rab, w tym Rab10 i Rab8, został niedawno zgłoszony jako bezpośrednie fizjologiczne substraty dla LRRK2 na podstawie wyniku zakrojonej na szeroką skalę analizy fosfoproteomicznej15. Następnie wykazaliśmy, że fosforylacja Rab10 była zwiększona przez mutacje FPD w mysich fibroblastach embrionalnych i w płucach myszy knockin16. W tym raporcie zdecydowaliśmy się zastosować metodę opartą na elektroforezie w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE), w której cząsteczka P-tag jest kopolimeryzowana w żele SDS-PAGE (P-tag SDS-PAGE) w celu wykrycia endogennych poziomów fosforylacji Rab10, ponieważ nadal brakowało wysoce czułego przeciwciała specyficznego dla fosforylowanego Rab10. Nie udało nam się wykryć fosforylacji endogennego Rab8 ze względu na słabą selektywność obecnie dostępnych przeciwciał dla całkowitego Rab8. Dlatego postanowiliśmy skupić się na fosforylacji Rab10. LRRK2 fosforyluje Rab10 w Thr73, lokalizując się w środku wysoce konserwatywnego regionu "przełącznika II". Wysoka ochrona miejsc fosforylacji wśród białek Rab może być jednym z powodów, dla których przeciwciała fosfospecyficzne rozpoznające odrębne białka Rab są trudne do wytworzenia.
Fosforylacja Rab8A przez LRRK2 hamuje wiązanie Rabin8, czynnika wymiany nukleotydów guaninowych (GEF), który aktywuje Rab8A poprzez wymianę związanego GDP z GTP15. Fosforylacja Rab10 i Rab8A przez LRRK2 hamuje również wiązanie inhibitorów dysocjacji GDP (GDI), które są niezbędne do aktywacji białek Rab poprzez ekstrakcję białek Rab związanych z GDP z błon15. Podsumowując, przypuszcza się, że fosforylacja białek Rab przez LRRK2 uniemożliwia ich aktywację, chociaż dokładny mechanizm molekularny i fizjologiczne konsekwencje fosforylacji pozostają niejasne.
P-tag SDS-PAGE został wynaleziony przez Kinoshita et al. w 2006 roku: W tej metodzie, akrylamid został kowalencyjnie sprzężony z P-tag, cząsteczką wychwytującą fosforany o wysokim powinowactwie, które kopolimeryzowały w żele SDS-PAGE17. Ponieważ cząsteczki znacznika P w żelu SDS-PAGE selektywnie opóźniają ruchliwość elektroforetyczną fosforylowanych białek, SDS-PAGE ze znacznikiem P może oddzielać białka fosforylowane od niefosforylowanych (<klasa silna = "xfig">Rysunek 1). Jeśli białko będące przedmiotem zainteresowania jest fosforylowane na wielu resztach, zaobserwuje się drabinę prążków odpowiadających formom różnie fosforylowanym. W przypadku Rab10 obserwujemy tylko jedno przesunięte pasmo, co wskazuje, że Rab10 jest fosforylowany tylko w Thr73. Główną zaletą SDS-PAGE ze znacznikiem P w porównaniu z immunoblottingiem z przeciwciałami specyficznymi dla fosforylacji jest to, że fosforylowany Rab10 można wykryć przez immunoblotting z przeciwciałami niespecyficznymi dla fosforylacji (tj. Rozpoznającymi całkowity Rab10) po przeniesieniu na błony, które są na ogół bardziej specyficzne, wrażliwe i dostępne ze źródeł komercyjnych / akademickich. Kolejną zaletą stosowania P-tag SDS-PAGE jest to, że można uzyskać przybliżone oszacowanie stechiometrii fosforylacji, co jest niemożliwe przez immunoblotting za pomocą przeciwciał specyficznych dla fosforylacji lub przez metaboliczne znakowanie komórek radioaktywnymi fosforanami.
Oprócz zastosowania taniego akrylamidu P-tag i kilku drobnych modyfikacji z nim związanych, obecna metoda wykrywania fosforylacji Rab10 przez LRRK2 jest zgodna z ogólnym protokołem immunoblottingu. Dlatego powinien być prosty i łatwy do wykonania we wszystkich laboratoriach, w których immunoblotting jest powszechną praktyką, z dowolnymi rodzajami próbek, w tym oczyszczonymi białkami, lizatami komórkowymi i homogenatami tkankowymi.

<table><tbody><tr><td><silne>odczynniki</mocne></td> sól fizjologiczna buforowana fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>domowej roboty</td><td></td><td>150 mM NaCl, 8 mM Na2HPO4-12H2O, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4 in MilliQ i sterylizowane przez autoklawowanie</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Nacalai Tesque</td><td>31320-34</td><td></td></tr><tr><td>Wodorofosforan disodowy sodu 12-wodny</td><td>Wako</td><td>196-02835</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Wako</td><td>163-03545</td><td></td></tr><tr><td>Diwodorofosforan potasu</td><td>Wako</td><td>169-04245</td><td></td></tr><tr><td>2,5% Trypsyna (10X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4549</td><td>Rozcieńczyć 10-krotnie sterylnym DPBS do przygotowania roztworu roboczego</td></tr><tr><td>Zmodyfikowana pożywka Eagle firmy Dulbecco (DMEM)</td><td>Wako</td><td>044-29765</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>BioWest</td><td>S1560</td><td>Inaktywowana termicznie w temperaturze 56 & stopni; C przez 30 min</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (100X)</td><td>Wako</td><td>168-23191</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Wako</td><td>342-01375</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Wako</td><td>198-13765</td><td></td></tr><tr><td>Polietylenina HCl MAX, liniowy, Mw 40,000 (PEI MAX 40000)</td><td>PolySciences, Inc.</td><td>24765-1</td><td>Roztwór podstawowy przygotowano w 20 mM HEPES-NaOH pH 7,0 przy 1 mg/ml, a następnie pH dostosowano do 7,0 za pomocą NaOH</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenku</td><td>Wako</td><td>045-28335</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>STAR</td><td>RSP-THA500G</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>Wako</td><td>080-01066</td><td></td></tr><tr><td>Eter polioksyetyleno(10) oktylofenylowy</td><td>Wako</td><td>160-24751</td><td>Odpowiednik Triton X-100</td></tr><tr><td>Glikol etylenowy-bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N',N'-kwas tetraoctowy (EGTA)</td><td>Wako</td><td>346-01312</td><td></td></tr><tr><td>Ortowanad(V)</td><td>Wako</td><td>198-09752</td><td></td></tr><tr><td>Fluorek sodu</td><td>Kanto Chemical</td><td>37174-20</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glicerofosforowy Kwas disodowy Sól disodowa Pentahydrat</td><td>Nacalai Tesque</td><td>17103-82</td><td></td></tr><tr><td>Sód dekahydrat pirofosforanu</td><td>Kokusan Chemical</td><td>2113899</td><td></td></tr><tr><td>Microcystin-LR</td><td>Wako</td><td>136-12241</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Wako</td><td>196-00015</td><td></td></tr><tr><td>Kompletny koktajl inhibitorów proteazy bez EDTA</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td>Rozpuść jedną tabletkę w 1 ml wody, która może być przechowywana w temperaturze -20 stopni; C przez miesiąc. Użyj go w rozcieńczeniu 1:50 do lizy komórek</td></tr><tr><td>Pierce Coomassie (Bradford) Zestaw do oznaczania białek</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23200</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>Nacalai Tesque</td><td>31607-65</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Wako</td><td>075-00616</td><td></td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Wako</td><td>021-02911</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Kanto Chemical</td><td>25099-00</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Wako</td><td>056-06967</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Wako</td><td>136-01837</td><td></td></tr><tr><td>Znacznik wiążący fosforany akryloamid</td><td>Wako</td><td>AAL-107</td><td>Znacznik P akryloamid</td></tr><tr><td>40% (w/v) roztwór akrylamidu</td><td>Nacalai Tesque</td><td>06119-45</td><td>Akrylamid:Bis = 29:1</td></tr><tr><td>Tetrametyloetylenodiamina (TEMED)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>33401-72</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu (APS)</td><td>Wako</td><td>016-08021</td><td>10% (w/v) roztwór przygotowano przez rozpuszczenie proszku nadsiarczanu amonu w wodzie MilliQ</td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Wako</td><td>166-04831</td><td></td></tr><tr><td>Czterowodny chlorek manganu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3634</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Prestained Standard</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374, 1610373, 1610377</td><td>Marker masy cząsteczkowej zastosowany w protokole</td></tr><tr><td>WIDE-VIEW Prestained Protein Size Marker III</td><td>Wako</td><td>230-02461</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Nacalai Tesque</td><td>17109-64</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Protran NC 0,45</td><td>GE Healthcare</td><td>10600007</td><td>Membrana nitrocelulozowa</td></tr><tr><td>Filtr membranowy Durapore</td><td>EMD Millipore</td><td>GVHP00010</td><td>Membrana PVDF</td></tr><tr><td>Bibuły filtracyjne nr 1</td><td>Advantec</td><td>00013600</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Nacalai Tesque</td><td>28322-72</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Wako</td><td>017-00251</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td>monolaurynian polioksyetylenoesorbitanu</td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Wako</td><td>345-01865</td><td></td></tr><tr><td>Odtłuszczone mleko w proszku</td><td>Difco Laboratories</td><td>232100</td><td></td></tr><tr><td>Immunostar</td><td>Wako</td><td>291-55203</td><td>Roztwór ECL (normalna czułość)</td></tr><tr><td>Immunostar LD</td><td>Wako</td><td>290-69904</td><td>Roztwór ECL (wysoka czułość)</td></tr><tr><td>CBB roztwór barwiący</td><td>domowej roboty</td><td></td><td>1 g CBB R-250, 50% (v/v) metanol, 10% (v/v) kwas octowy w 1 l wody MilliQ</td></tr><tr><td>CBB R-250</td><td>Wako</td><td>031-17922</td><td></td></tr><tr><td>Odbarwienie CBB roztwór</td><td>domowej roboty</td><td></td><td>12% (v/v) metanolu, 7% (v/v) kwasu octowego w 1 l wody MilliQ</td></tr><tr><td><silny>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</strong</td><td>>Komentarze</td></tr><tr><td>Przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-HA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11583816001</td><td>Używany przy 0,2 &mu; g/ml do immunoblottingu.</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-Rab10</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#8127</td><td>Używane w 1:1000 do immunoblottingu. Specyficzność została potwierdzona przez CRISPR KO w Ito et al., Biochem J, 2016.</td></tr><tr><td>przeciwciało anty-pSer935</td><td>Abcam</td><td>ab133450</td><td>Stosowane w 1 &mu; g/ml do immunoblottingu.</td></tr><tr><td>przeciwciało anty-LRRK2</td><td>Abcam</td><td>ab133518</td><td>Stosowane w 1 &mu; g/ml do immunoblottingu.</td></tr><tr><td>przeciwciało anty-&alfa-tubulinowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9026</td><td>Stosowane przy 1 &mu; g/ml do immunoblottingu.</td></tr>przeciwciało <tr><td>anty-GAPDH</td><td>Santa-Cruz</td><td>sc-32233</td><td>Stosowane przy 0,02 &mu; g/ml do immunoblottingu.</td></tr><tr><td>Peroksydaza AffiniPure Sheep Anti-Mouse IgG (H + L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>515-035-003</td><td>Stosowany przy 0,16 &mu; g/ml do immunoblottingu.</td></tr><tr><td>Peroksydaza AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H + L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-035-003</td><td>Stosowany przy 0,16 &mu; g/ml do immunoblottingu.</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</strong</td><td>>Numer katalogowy</strong</td><td>>Komentarze</td></tr><tr><td>Inhibitors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GSK2578215A</td><td>MedChem Express</td><td>HY-13237</td><td>Roztwór podstawowy przygotowywano w DMSO w temperaturze 10 mM i przechowywano w temperaturze -80 ° stopni; C</td></tr><tr><td>MLi-2</td><td>Dostarczone przez dr Dario Alessi (University of Dundee)</td><td></td><td>Roztwór podstawowy przygotowywano w DMSO w temperaturze 10 mM i przechowywano w temperaturze -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Plasmids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rab10/pcDNA5 FRT TO HA</td><td>Dostarczone przez dr Dario Alessi (University of Dundee)</td><td></td><td>Ten plazmid wykazuje ekspresję amino-końcowego znakowanego HA ludzkiego Rab10.</td></tr><tr><td>LRRK2 WT/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Dostarczone przez dr Takeshi Iwatsubo (Uniwersytet Tokijski)</td><td></td><td>Ito et al., Biochemia, 46: 1380&ndash; 1388 (2007). Ten plazmid wyraża amino-końcowy 3xFLAGA znakowany ludzki LRRK2 typu dzikiego.</td></tr><tr><td>LRRK2 K1906M/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Dostarczone przez dr Takeshi Iwatsubo (Uniwersytet Tokijski)</td><td></td><td>Ito et al., Biochemia, 46: 1380&ndash; 1388 (2007). Ten plazmid eksprymuje amino-końcowy nieaktywny mutant kinazy K1906M znakowany 3xFLAG, ludzkiego LRRK2.</td></tr><tr><td>LRRK2 N1437H/p3xFLAG-CMV-10</td><td></td><td></td><td>Ten artykuł. Ten plazmid eksprymuje amino-końcowy zmutant N1437H FPD znakowany 3xFLAG ludzkiego LRRK2.</td></tr><tr><td>LRRK2 R1441C/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Dostarczone przez dr Takeshi Iwatsubo (Uniwersytet Tokijski)</td><td></td><td>Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963&ndash; 10975 (2013). Ten plazmid eksprymuje amino-końcowy mutant R1441C FPD znakowany 3xFLAG ludzkiego LRRK2.</td></tr><tr><td>LRRK2 R1441G/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Dostarczone przez dr Takeshi Iwatsubo (Uniwersytet Tokijski)</td><td></td><td>Kamikawaji et al., Biochemia, 48: 10963&ndash; 10975 (2013). Ten plazmid eksprymuje amino-końcowy mutant R1441G FPD znakowany 3xFLAGA ludzkiego LRRK2.</td></tr><tr><td>LRRK2 R1441H/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Dostarczone przez dr Takeshi Iwatsubo (Uniwersytet Tokijski)</td><td></td><td>Kamikawaji et al., Biochemistry, 48: 10963&ndash; 10975 (2013). Ten plazmid eksprymuje amino-końcowy mutant R1441H FPD znakowany 3xFLAGA ludzkiego LRRK2.</td></tr><tr><td>LRRK2 R1441S/p3xFLAG-CMV-10</td><td></td><td></td><td>Ten artykuł. Ten plazmid eksprymuje amino-końcowy mutant R1441S FPD znakowany 3xFLAG ludzkiego LRRK2.</td></tr><tr><td>LRRK2 Y1699C/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Dostarczone przez dr Takeshi Iwatsubo (Uniwersytet Tokijski)</td><td></td><td>Kamikawaji et al., Biochemia, 48: 10963&ndash; 10975 (2013). Ten plazmid eksprymuje amino-końcowego mutanta Y1699C FPD oznaczonego 3xFLAG ludzkiego LRRK2.</td></tr><tr><td>LRRK2 G2019S/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Dostarczone przez dr Takeshi Iwatsubo (Uniwersytet Tokijski)</td><td></td><td>Kamikawaji et al., Biochemia, 48: 10963&ndash; 10975 (2013). Ten plazmid eksprymuje amino-końcowy zmutant G2019S FPD G2019S ludzkiego LRRK2 znakowany amino-końcowym.</td></tr><tr><td>LRRK2 I2020T/p3xFLAG-CMV-10</td><td>Dostarczone przez dr Takeshi Iwatsubo (Uniwersytet Tokijski)</td><td></td><td>Kamikawaji et al., Biochemia, 48: 10963&ndash; 10975 (2013). Ten plazmid eksprymuje amino-końcowy zmutant I2020T FPD znakowany 3xFLAGA ludzkiego LRRK2.</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td>CO</tr><tr><td>2 inkubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Forma Series II 3110 Automatyczna</td> pipeta z płaszczem <td></td>wodnym</tr><tr><td></td><td>Drummond</td><td>Mikropipeta Pipet-Aid PA-400</td><td></td></tr><tr><td>P10</td><td>Nichiryo</td><td>00-NPX2-10</td><td>0,5&ndash; 10 &mu; L</td></tr><tr><td>Mikropipeta P200</td><td>Nichiryo</td><td>00-NPX2-200</td><td>20&ndash; 200 &mu; L</td></tr><tr><td>Mikropipeta P1000</td><td>Nichiryo</td><td>00-NPX2-1000</td><td>100&ndash; 1000 &mu; L</td></tr><tr><td>Końcówki do mikropipet P10</td><td>STAR</td><td>RST-481LCRST</td><td>Sterylne</td></tr><tr><td>końcówki do mikropipet P200</td><td>FUKAEKASEI</td><td>1201-705YS</td><td>Sterylne</td></tr><tr><td>końcówki do mikropipet P1000</td><td>STAR</td><td>RST-4810BRST</td><td>Sterylna</td></tr><tr><td>pipeta jednorazowa 5 ml</td><td>Greiner</td><td>606180</td><td>Sterylna</td></tr><tr><td>pipeta jednorazowa 10 ml</td><td>Greiner</td><td>607180</td><td>Sterylna</td></tr><tr><td>pipeta jednorazowa 25 ml</td><td>Falcon</td><td>357535</td><td>Sterylny</td></tr><tr><td>hematocytometr</td><td>Szkło ołowiowe</td><td>A126</td><td>Ulepszony mikroskop Neubeuer</td></tr><tr><td></td><td>Naczynia Olympus</td><td>CKX53</td><td></td></tr><tr><td>10 cm</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td>Do hodowli tkankowych</td></tr><tr><td>Płytki 6-dołkowe</td><td>AGC Techno Glass</td><td>3810-006</td><td>Do hodowli</td></tr> <tr><td>tkankowychMieszalnik wirowy</td><td>Scientific Industries</td><td>Vortex-Genie 2</td><td></td></tr><tr><td>Skrobaki do komórek</td><td>Sumitomo Bakelit</td><td>MS-93100</td><td></td></tr><tr><td>Probówki 1,5 ml</td><td>STAR</td><td>RSV-MTT1,5</td><td></td></tr><tr><td>Probówki 15 ml AGC</td><td>Techno Glass</td><td>2323-015</td><td></td></tr><tr><td>Probówki 50 ml</td><td>AGC Techno Glass</td><td>2343-050</td><td></td></tr><tr><td>Wirówki</td><td>TOMY</td><td>MX-307</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 96-dołkowe</td><td>Greiner</td><td>655061</td><td>Nie do hodowli tkankowych</td></tr><tr><td>Czytnik płytek</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>SpectraMax M2e</td><td></td></tr><tr><td>SDS&ndash; Zbiorniki PAGE</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1010</td><td></td></tr><tr><td>Zbiorniki transferowe</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1510B</td><td></td></tr><tr><td>Płytki żelowe (zębate)</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1000-1</td><td></td></tr><tr><td>Płytki żelowe (gładkie)</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1000-2</td><td></td></tr><tr><td>Dystanse silikonowe</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1000-16</td><td></td></tr><tr><td>Grzebienie 17-dołkowe</td><td>Nihon Eido</td><td>Wykonane</td><td></td> na zamówienie</tr><tr><td>Spinki do segregatorów</td><td>Nihon Eido</td><td>NA-1000-15</td><td></td></tr><tr><td>5 mL strzykawka</td><td>Terumo</td><td>SS-05SZ</td><td></td></tr><tr><td>21G</td><td>Terumo</td><td>NN-2138R</td><td></td></tr><tr><td>Elektrownia 1000 VC</td><td>ATTO</td><td>AE-8450</td><td>Zasilacz do SDS&ndash; STRONA i transfer</td></tr><tr><td>Duże łodzie wagowe</td><td>Ina Optika</td><td>AS-DL</td><td></td></tr><tr><td>Pojemniki plastikowe</td><td>AS ONE</td><td>PS CASE No.4</td><td>10 x 80 x 50 mm</td></tr><tr><td>Wytrząsarka bujana</td><td>Titech</td><td>NR-10</td><td></td></tr><tr><td>Pudełko z pianki styrenowej</td><td>ogólne</td><td></td><td>Wymiary wewnętrzne powinny pasować do jednego zbiornika transferowego (200 x 250 x 250 mm).</td></tr><tr><td>ImageQuant LAS-4000</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>Imager wyposażony w chłodzoną kamerę CCD do wykrywania ECL</td></tr></tbody></table>

wykrywanie fosforylacji rab10 przez aktywność lrrk2 przy użyciu sds-page ze znacznikiem wiążącym fosforany

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Wykazano, że mutacje w bogatej w leucynę kinazie powtórzeniowej 2 (LRRK2) są związane z rodzinną chorobą Parkinsona (FPD). Ponieważ nieprawidłowa aktywacja aktywności kinazy LRRK2 jest związana z patogenezą PD, konieczne jest ustalenie metody oceny fizjologicznych poziomów aktywności kinazy LRRK2. Ostatnie badania wykazały, że LRRK2 fosforyluje członków rodziny GTPazy Rab, w tym Rab10, w warunkach fizjologicznych. Chociaż fosforylację endogennego Rab10 przez LRRK2 w hodowanych komórkach można było wykryć za pomocą spektrometrii mas, trudno było ją wykryć za pomocą immunoblottingu ze względu na słabą czułość obecnie dostępnych przeciwciał specyficznych dla fosforylacji dla Rab10. W tym miejscu opisujemy prostą metodę wykrywania endogennych poziomów fosforylacji Rab10 przez LRRK2 w oparciu o immunoblotting z wykorzystaniem elektroforezy w żelu poliakrylamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE) w połączeniu ze znacznikiem wiążącym fosforan (znacznik P), którym jest N-(5-(2-aminoetylokarbamoilo)pirydyno-2-ylmetylo)-N,N',N'-tris(pirydyno-2-yl-metylo)-1,3-diaminopropan-2-ol. Niniejszy protokół nie tylko stanowi przykład metodologii wykorzystującej znacznik P, ale także umożliwia ocenę, w jaki sposób mutacje, a także leczenie/podawanie inhibitorów lub jakiekolwiek inne czynniki zmieniają dalszą sygnalizację LRRK2 w komórkach i tkankach.

System nadekspresji: Fosforylacja HA-Rab10 przez 3×FLAG-LRRK2 w komórkach HEK293:
Komórki HEK293 przetransfekowano 0,266 µg dzikiego typu HA-Rab10 oraz 1,066 µg 3×FLAG-LRRK2 (dziki typ, mutant nieaktywny kinazowo (K1906M) lub mutanty FPD). Fosforylację Rab10 zbadano za pomocą P-tag SDS-PAGE, a następnie immunoblottingu z użyciem przeciwciała anty-HA (Rycina 2). 10 µg białek naniesiono na żel 10% (80 x ...

Niniejsze badanie opisuje prostą metodę wykrywania endogennych poziomów fosforylacji Rab10 przez bogatą w leucynę kinazę powtórzeniową 2.

Wykrywanie fosforylacji Rab10 przez aktywność LRRK2 przy użyciu SDS-PAGE ze znacznikiem wiążącym fosforany

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest wykrycie fosforylacji Rab10 przez LRRK2 za pomocą SDS-PAGE ze znacznikiem wiążącym fosforany. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad chorobą Parkinsona, takie jak to, w jaki sposób mutacje chorobowe w LRRK2 wpływają na fosforylację Rab10. Główną zaletą tej techniki jest to, że można z grubsza oszacować stechiometrię fosforylacji Rab10 za pomocą prostego western blot.Wiele kroków tego protokołu jest dość standardowych i są wystarczająco szczegółowo opisane w protokole tekstowym dołączonym do tego filmu. W tym miejscu chcemy pokazać kroki, które najbardziej korzystają z instrukcji wizualnych. Przygotować płytki z transfekowanych komórek HEK293 zgodnie z opisem w protokole tekstowym.Gdy płytki są na lodzie, odessać i wyrzucić pożywkę. Następnie ostrożnie dodaj dwa mililitry DPBS do rogu każdej płytki i kołysz płytkami, aby rozprowadzić roztwór. Następnie wyjmij i wyrzuć DPBS.Następnie do każdej płytki dodaj 100 mikrolitrów buforu do lizy. Przechylić płytkę i użyć skrobaka, aby rozprowadzić bufor i uwolnić lizat komórkowy. Następnie odessać lizaty i przenieść je do probówek do mikrofugowania wstępnie schłodzonych na lodzie i odczekać 10 minut.Następnie zbierz lizaty komórkowe wolne od zanieczyszczeń, odwirowując probówki i przenosząc supernatanty do nowych probówek na lodzie. Następnie zmierz stężenia białek w oczyszczonych lizatach za pomocą testu Bradforda. Aby uzyskać dane dotyczące stężenia, należy przygotować 100 mikrolitrów próbek lizatów do analizy żelu.Przygotuj gęstsze lizaty do pomiaru endogennego Rab10 w porównaniu z nadekspresją hemaglutyniny Rab10. Przygotowanie próbek należy zakończyć, inkubując je w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie przechowuj próbki w temperaturze poniżej minus 20 stopni Celsjusza, aż będą potrzebne, przez okres do sześciu miesięcy lub dłużej.Aby rozpocząć, przygotuj komórki SDS-PAGE zgodnie z protokołem tekstowym. Następnie załaduj żel do zbiornika i zabezpiecz go spinaczami do segregatorów. Następnie napełnić zbiornik działającym buforem i usunąć pęcherzyki powietrza ze studzienek i pod żelem za pomocą igły dołączonej do strzykawki.Teraz dodaj chlorek manganu do próbek i odwiruj je w dół, aby usunąć osady. Następnie załaduj żel równymi objętościami próbki, 10 mikrogramów białka w celu analizy nadekspresji hemaglutyniny Rab10 lub 30 mikrogramów białka w celu analizy endogennego Rab10. Załadować puste tory buforem do próbek zawierającym chlorek manganu.Uzupełnij również marker masy cząsteczkowej buforem i chlorkiem manganu, aby uzyskać taką samą objętość jak próbki. Teraz zacznij uruchamiać żel pod napięciem 50 woltów. Po stosie próbek zwiększ napięcie do 120, aby uzyskać separację.Gdy przód barwnika dotrze do dna żeli, zabij napięcie. Następnie umyj żel trzy razy w następujący sposób. Załaduj żel separacyjny do kąpieli z czystym buforem transferowym z dodatkiem EDTA i SDS.Następnie pozwól mu kołysać się na shakerze przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po trzech praniach wykonaj jeszcze jedno pranie za pomocą bufora transferowego z dodatkiem SDS, ale bez EDTA. Następnie przenieś żel za pomocą mokrego zbiornika.Załaduj zbiornik do pojemnika z pianką wypełnionego lodowatą wodą, podłącz zbiornik do zasilania i rozpocznij transfer. Długi transfer z wydajnym chłodzeniem jest niezbędny do zabiegu. Po transferze sprawdź transfer, barwiąc membranę Pąsem S, a następnie umyj w TBST zgodnie z protokołem tekstowym.Następnie zastosuj blok. Zanurz blot w mlecznym TBST i kołysz blotem na shakerze przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie usuń i wyrzuć roztwór blokujący i nałóż pierwszorzędowy roztwór przeciwciała.Teraz kołysz membraną przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia usuń roztwór przeciwciała pierwotnego. Następnie umyj membranę świeżym TBST trzy razy, tak jak poprzednio.Po przepłukaniu zanurzyć blot w wtórnym roztworze przeciwciał i inkubować membranę na kołysce przez około godzinę w temperaturze pokojowej. Po inkubacji ponownie trzykrotnie przemyć membranę TBST. Teraz rozwiń membranę.Dodaj jeden mililitr roztworu ECL do dużego arkusza folii plastikowej. Następnie umieść membranę w ECL i szybko odwróć ją, aby zwilżyć obie strony. Następnie podnieś membranę i pozwól jej spłynąć.Po odsączeniu pozwól, aby jedna krawędź dotykała ręcznika papierowego przez około pięć sekund, aby pomóc usunąć nadmiar roztworu. Następnie owiń membranę sztywną, przezroczystą folią bez zmarszczek i przenieś ją na czarną tackę w celu obrazowania. Komórki HEK293 transfekowano hemaglutyniną Rab10 typu dzikiego i 3xFLAG-LRRK2.Badano kinazę typu dzikiego nieaktywną w rodzinnych mutacjach LRRK2 w chorobie Parkinsona. Konadekspresja LRRK2 i Rab10 spowodowała znaczne przesunięcie pasma w żelu P-tag. W przeciwieństwie do tego, koekspresja z nieaktywnym mutantem kinazy nie powodowała żadnych zmian w ruchliwości Rab10, co sugeruje, że kinaza jest przyczyną przesunięcia pasma.Ponadto, zgodnie z oczekiwaniami, wszystkie rodzinne mutacje PD zwiększyły przesunięcie pasma. System żelowy P-tag wykorzystano również do analizy mysich komórek fibroblastów embrionalnych 3T3-szwajcarskich albinosów traktowanych inhibitorem LRRK2. Przesunięcie pasma odpowiadające fosforylowanemu endogennemu Rab10 zniknęło, gdy komórki potraktowano GSK2578215A.Ten sam test przeprowadzono również przy użyciu ludzkich komórek A549. W tych eksperymentach skuteczność inhibitora LRRK2 została potwierdzona przy użyciu przeciwciała anty-p seryny 935 LRRK2, które jest dobrze znanym markerem hamowania LRRK2. Po opanowaniu ta technika potrzebuje tylko dodatkowych 14 minut w porównaniu ze zwykłą procedurą western blotting, która polega na myciu żeli przed transferem.Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak spektrometria mas, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, czy mutanty FPD fosforylują tę samą resztę Rab10. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się badaniami nad chorobą Parkinsona do zbadania endogennych poziomów fosforylacji Rab10 w hodowanych komórkach, a także w tkankach. Nie zapominaj, że praca z mikrocystyną dodaną do buforu do lizy może być niezwykle niebezpieczna, a podczas przygotowywania lizatów komórkowych należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie odpowiednich środków ochrony osobistej.

rab10-phosphorylation-detection-lrrk2-activity-using-sds-page-with

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Kinaza 2 z powtórzeniami bogatymi w leucynę (LRRK2) jest dużą, wielodomenową kinazą, której mutacje stanowią najczęstszą genetyczną przyczynę choroby Parkinsona. Analiza aktywności kinazowej tego białka okazała się kluczowym narzędziem w zrozumieniu biologii i dysfunkcji tego białka. W niniejszej pracy opisano badanie aktywności kinazowej LRRK2 oraz wybranych jej mutantów in vitro, zapewniając system eksperymentalny do badania fosforylacji domniemanych substratów oraz potencjalnej dysfunkcji...

Oznaczanie aktywności kinazy LRRK2 in vitro

Ten film demonstruje czułą technikę fosforylacji białek za pomocą testu ściągania pojedynczej cząsteczki. Funkcjonalizacja glikolu polietylenowego-biotyny i zastosowanie znakowanych przeciwciał zwiększa wykrywalność fosforylowanej tyrozyny ze swoistością.

Test jednocząsteczkowy pull-down do analizy fosforylacji białek: wysokoprzepustowa technika ilościowego określania fosforylacji białek w lizacie komórkowym

Bogate w leucynę kinazy powtórzeniowe 1 i 2 (LRRK1 i LRRK2) są wielodomenowymi białkami, które kodują zarówno domeny GTPazy, jak i kinazy, i które są fosforylowane w komórkach. W tym miejscu przedstawiamy protokół znakowania LRRK1 i LRRK2 w komórkach za pomocą ortofosforanu 32P, zapewniając w ten sposób sposób sposób sposób sposób na pomiar ich ogólnego poziomu fosforylacji komórkowej.

Znakowanie metaboliczne bogatych w leucynę kinaz powtórzeniowych 1 i 2 radioaktywnym fosforanem

Tutaj opisujemy procedurę pozwalającą na szczegółową analizę zależnej od fosforylacji aktywacji czynnika transkrypcyjnego IRF3. Osiąga się to poprzez połączenie SDS-PAGE o wysokiej rozdzielczości i natywnej PAGE sprzężonej z immunoblotami przy użyciu wielu przeciwciał fosfospecyficznych.

Metoda wysokiej rozdzielczości do monitorowania aktywacji IRF3 zależnej od fosforylacji

Testy konkurencji peptydowej są szeroko stosowane w różnych eksperymentach molekularnych i immunologicznych. W artykule opisano szczegółową metodę testu kinazy konkurującej z oligopeptydami in vitro i związane z nią procedury walidacyjne, które mogą być przydatne do znalezienia określonych miejsc fosforylacji.

Test konkurencji oligopeptydowej do oznaczania miejsca fosforylacji

Mutacje w genie bogatej w leucynę kinazy powtórzeniowej 2 (LRRK2) powodują dziedziczną chorobę Parkinsona. Opracowaliśmy łatwą i solidną metodę oceny kontrolowanej przez LRRK2 fosforylacji Rab10 w ludzkich neutrofilach krwi obwodowej. Może to pomóc w identyfikacji osób ze zwiększoną aktywnością szlaku kinazy LRRK2.

Izolacja neutrofili ludzkiej krwi obwodowej w celu zbadania szlaku kinazy LRRK2 związanego z chorobą Parkinsona poprzez ocenę fosforylacji Rab10

Celem tego protokołu jest etykietowanie, wzbogacanie i identyfikowanie substratów kinazy białkowej CK2 ze złożonej próbki biologicznej, takiej jak lizat komórkowy lub homogenat tkankowy. W tym celu metoda ta wykorzystuje unikalne aspekty biologii CK2.

Identyfikacja nowych substratów kinazy CK2 przy użyciu wszechstronnego podejścia biochemicznego

Scharakteryzowaliśmy nowe białko kinazy za pomocą solidnych podejść biochemicznych: analiza Western Blot z dedykowanym specyficznym przeciwciałem na różnych liniach komórkowych i tkankach, interakcje za pomocą eksperymentów z koimmunoprecypitacją, aktywność kinazy wykryta przez Western Blot przy użyciu przeciwciała specyficznego dla fosfy oraz znakowanie γ[32P] ATP.

Charakterystyka na poziomie molekularnym przy użyciu solidnych podejść biochemicznych nowego białka kinazy

Ten protokół opisuje szybką i bardzo czułą kwantyfikację danych z sensora rezonansu rezonansu (FRET) za pomocą przenośnego analizatora FRET wykonanego na zamówienie. Urządzenie zostało wykorzystane do wykrywania maltozy w krytycznym zakresie temperatur, który maksymalizuje czułość wykrywania, umożliwiając praktyczną i efektywną ocenę zawartości cukru.

Bardzo czuła i szybka detekcja fluorescencji za pomocą przenośnego analizatora FRET

To badanie opisuje techniki biofizyczne, biochemiczne i molekularne do scharakteryzowania aktywności opiekuńczej Escherichia coli HdeB w warunkach kwaśnego pH. Metody te zostały z powodzeniem zastosowane do innych opiekuńczych chroniących przed kwasami, takich jak HdeA, i mogą być modyfikowane tak, aby działały w przypadku innych białek opiekuńczych i warunków stresu.

Wykrywanie zależnej od pH aktywności Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro i In Vivo

Poznaj metodę wykrywania fosforylacji Rab10 przez LRRK2 przy użyciu SDS-PAGE ze znacznikiem wiążącym fosforany. Technika ta umożliwia szacowanie stechiometrii fosforylacji w badaniach nad chorobą Parkinsona.

Wykrywanie fosforylacji Rab10 przez aktywność LRRK2 przy użyciu SDS-PAGE ze znacznikiem wiążącym fosforany

Przeglądaj więcej filmów